CN110231386A - 一种可视化检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法 - Google Patents

一种可视化检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于二氧化钛纳米矩阵‑石墨相氮化碳纳米片（TiO2‑C3N4）异质结光电材料的合成，并结合G‑四联体信号放大策略实现可视化和特异性灵敏检测端粒酶。首先利用水热法合成TiO2‑C3N4异质结，有效地促进载流子分离与空穴传输，产生的光电流密度分别比普通TiO2和原始石墨相氮化碳纳米片（g‑C3N4 NSs）显著提高12倍和35倍。同时引入了催化发夹组装（CHA）的无酶信号放大策略，在引入端粒酶后，端粒酶延伸产物特异性地触发环状CHA并导致G‑四链体/血红素DNA酶的连续形成，另外结合3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺（TMB）的氧化颜色变化和光电流的输出，实现了方便和精准的信号读出，表现出优异的灵敏度，有望在癌症诊断和治疗中提供巨大的潜在应用。

Description

一种可视化检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法
技术领域
本发明涉及端粒酶的定量检测领域，更具体的说是基于二氧化钛-石墨相氮化碳异质结以及G-四联体信号放大策略进行特异性检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法。本发明还涉及无机纳米复合材料的合成领域。
背景技术
端粒酶是一种由催化蛋白和RNA模板组成的酶，可合成染色体末端的DNA,赋予细胞复制的永生性；如果端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，而在肿瘤中被重新激活，则有可能参与恶性转化；端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用；但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂的细胞之中，才可以侦测到具有活性的端粒酶；通过蛋白质相互作用在翻译后对端粒酶活性及功能进行调控，则是目前研究端粒酶调控机制的热点之一。
基于聚合酶链式反应(PCR)的端粒酶重复序列扩增法常用于端粒酶活性的检测，此方法灵敏度较高，可以检测到几个癌细胞中的端粒酶活性，但是PCR过程操作步骤复杂，需要多个变温循环过程，且扩增过程有聚合酶的参与，容易出现非特异性扩增；等温扩增是近年出现的一类恒定温度下快速高效的核酸扩增技术，与PCR扩增相比，等温扩增无需不断变换反应温度，耗时短，扩增效率高，已被用于端粒酶活性的检测；不过这些扩增技术都需要聚合酶的参与，容易出现假阳性或假阴性信号，而且大多设计复杂，检测成本较高。
利用两种光电材料间的异质结效应，并与G-四联体信号放大策略结合，建立了一种无热循环过程、无酶扩增、无需标记的简单的端粒酶活性检测的光电化学新方法；此条件更易控制，操作更加简单，避免了有聚合酶参与的非特异性扩增的出现，提高了检测的准确性，有效降低了检测成本，提高了检测的选择性；本方法在端粒酶抑制剂筛选方面具有重要的参考价值。
发明内容
检测端粒酶活性对肿瘤、癌症的早期诊断，以及开发以端粒酶为靶标分子的抗肿瘤、抗癌药物具有重要意义。针对端粒酶检测的急迫性，本发明提供一种具有即时可视化比色显示的光电化学传感器的构建方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将氟掺杂氧化锡（FTO）导电玻璃裁剪成1 cm×5 cm尺寸，依次放入丙酮、无水乙醇、超纯水中超声处理10-20 min，然后在40-60 ℃烘箱中干燥30-60 min，随后保存以备用；
（2）以FTO导电玻璃作为基底，利用高温水热法在导电玻璃表面生长二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片（TiO2-C3N4）异质结光电材料，在上述异质结修饰FTO导电玻璃上生长葡萄糖氧化酶（GOx），得到负载葡萄糖氧化酶的二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片异质结光电材料（GOx-TiO2-C3N4）修饰FTO导电玻璃；
（3）进行细胞培养和端粒酶延伸，之后加入氯化血红素以形成端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶；
（4）将步骤（2）中制备的GOx-TiO2-C3N4修饰FTO导电玻璃作为工作阳极，铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，葡萄糖溶液作为电解液，结合步骤（2）中形成的端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶和TMB溶液，构建具有即时可视化比色显示的光电化学生物传感器。
本发明所述负载葡萄糖氧化酶的二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片异质结光电材料（GOx-TiO2-C3N4）修饰FTO导电玻璃的制备过程包括以下步骤：
（1）合成石墨相氮化碳纳米片（g-C3N4 NSs）：首先，称量1-5 g三聚氰胺粉末置于带有盖子的瓷坩埚中，在通风状态下于600 ℃下加热2-3 h，其中加热和冷却过程的速率均为3℃/min，合成黄色大块石墨相氮化碳（g-C3N4）。随后，将g-C3N4研磨至超细粉末，称取10-200mg分散在10-200 mL超纯水中，超声15-20 h。超声后得到的悬浮液以8000 r/min的速度离心，以除去剩余未剥离的g-C3N4。最后，在60 ℃真空条件下收集并浓缩上清液，得到的乳状悬浮液即为g-C3N4 NSs；
（2）制备二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片（TiO2-C3N4）异质结：5-20 mL盐酸（12M）加入5-20 mL超纯水中，室温搅拌10-30 min，加入0.2-10 mL钛酸四正丁酯溶液和1-5 mLg-C3N4 NSs溶液，继续搅拌30-60 min得到混合溶液；将处理后的干燥FTO导电玻璃以导电面向下的方式放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将上述混合溶液转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的150-200 ℃烘箱内恒温反应30-300 min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出样品，用超纯水彻底清洗3次，然后放入真空干燥箱中60 ℃干燥8-10 h；
（3）将5-10 mg·mL-1的葡萄糖氧化酶（GOx）溶液（在0.01M PBS中，pH7.4, 20 μL）滴加到TiO2-C3N4异质结修饰的FTO上，室温干燥，重复三次后放入冰箱中以备后续使用。
本发明所述进行细胞培养和端粒酶延伸以及形成端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶过程包括以下步骤：
（1）细胞培养和端粒酶提取：将人宫颈癌（HeLa）细胞加到补充有10-15％（体积比）热灭活的胎牛血清和1-5％（体积比）青霉素-链霉素溶液的杜尔贝克改良的老鹰培养基中，然后于37 ℃下在含有5-10％ CO2的潮湿气氛中培养；对于端粒酶提取，需在指数生长期收集细胞，将1×106个细胞分散在1.5 mL EP管中，用冷的PBS （0.1M，pH7.4）洗涤两次，并重悬于200-300 μL冷的CHAPS裂解缓冲液中；随后将细胞混合物在冰上孵育30-60 min，并在4 ℃以14000 rpm的转速离心20-30 min；小心收集上清液并转移至新鲜的1.5 mL EP管中，然后在-80 ℃下冷冻以供进一步使用；其中所有的管和尖端都不含核糖核酸酶；
（2）端粒酶延伸：将从一定数量的细胞中提取的端粒酶在1×CHAPS裂解缓冲液中连续稀释，然后将2-5 μL端粒酶提取物与端粒酶延伸反应缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，63 mM KCl，0.05％Tween 20，1mM N,N,N',N'-四乙酸，1 mM 碱磷酸去氧核苷酸，0.2 μM端粒酶引物和0.4 UμL-1重组核糖核酸酶抑制剂）一起在37 ℃下孵育1-2 h；然后将上述溶液在95 ℃下加热10-30 min以结束延伸反应，整个反应在光照保护下进行；
（3）端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶的形成：在实验之前，将发夹DNA1（H1）和发夹DNA2（H2）分别加热至95 ℃保持5-10 min，然后通过聚合酶链式反应（PCR）机以1 ℃/min的速度逐渐退火至室温以形成发夹结构，并储存在4 °C以备进一步使用；随后，将端粒酶延伸产物（与一系列不同数量的HeLa细胞一起温育）加入到含有300-500 nM H1和300-500 nM H2的缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mM MgCl2）中；将混合物在37 ℃下孵育40-60 min之后，分别加入5-10 mM KCl和1-5 μM氯化血红素，然后将溶液在室温下放置30-60 min以形成G-四链体/血红素DNA酶。
本发明所述即时可视化比色显示的光电化学生物传感器构建的步骤如下：用标准三电极系统中的电化学分析仪（CHI660D）测量光电流响应，将步骤（2）中GOx-TiO2-C3N4修饰的FTO导电玻璃作为工作阳极，铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，电解质溶液为150-300 μL含有5-10 mM葡萄糖的PBS溶液（50 mM，PH 7.4），在葡萄糖氧化酶的作用下产生过氧化氢，进一步促进工作电极在500 W氙灯的照射下促进载流子分离与空穴传输，实现光能向电能的转化；然后将步骤（4）形成的端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶和50-100 μLTMB加入上述电解液中一起温育，其室温下进行的HRP模拟反应催化过氧化氢产生羟基自由基氧化TMB产生无色向蓝色的可视化转变，且消耗的过氧化氢使得光电信号出现不同程度的减弱，实现定量测量端粒酶的效果。
本发明的有益效果：
（1）合成的TiO2-C3N4异质结，有效地促进载流子分离与空穴传输，增强了光电流密度；
（2）采用G-四联体和催化发夹组装的无酶信号放大策略进行核酸循环，有效实现了光电和比色信号的双重放大；
（3）通过比色/光电双模式生物传感器的联用，基于双信号输出模式，实现了端粒酶的超灵敏检测；
（4）通过改变适配体序列，可以实现癌症标志物以及核酸的可视化比色初检及精确的光电测量。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
即时可视化比色显示的光电化学生物传感器在检测端粒酶中的应用，其特征是包括以下步骤：
1．将氟掺杂氧化锡（FTO）导电玻璃裁剪成1 cm×5 cm尺寸，依次放入丙酮、无水乙醇、超纯水中超声处理10-20 min，然后在40-60 ℃烘箱中干燥30-60 min，随后保存以备用；
2．以FTO导电玻璃作为基底，利用高温水热法在导电玻璃表面生长二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片（TiO2-C3N4）异质结光电材料，在上述异质结修饰FTO导电玻璃上生长葡萄糖氧化酶（GOx），得到负载葡萄糖氧化酶的二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片异质结光电材料（GOx-TiO2-C3N4）修饰FTO导电玻璃，具体实验步骤为：（1）合成石墨相氮化碳纳米片（g-C3N4 NSs）：首先，称量1-5 g三聚氰胺粉末置于带有盖子的瓷坩埚中，在通风状态下于600 ℃下加热2 h，其中加热和冷却过程的速率均为3 ℃/min，合成黄色大块石墨相氮化碳（g-C3N4）。随后，将g-C3N4研磨至超细粉末，称取10-200 mg分散在10-200 mL超纯水中，超声18 h。超声后得到的悬浮液以8000 r/min的速度离心，以除去剩余未剥离的g-C3N4。最后，在60 ℃真空条件下收集并浓缩上清液，得到的乳状悬浮液即为g-C3N4 NSs；（2）制备二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片（TiO2-C3N4）异质结：5-20 mL盐酸（12 M）加入5-20mL超纯水中，室温搅拌10 min，加入0.2-10 mL钛酸四正丁酯溶液和1-5 mL g-C3N4 NSs溶液，继续搅拌30 min得到混合溶液；将处理后的干燥FTO导电玻璃以导电面向下的方式放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将上述混合溶液转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的150-200 ℃烘箱内恒温反应30-300 min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出样品，用超纯水彻底清洗3次，然后放入真空干燥箱中60 ℃干燥8 h；（3）将5 mg·mL-1的葡萄糖氧化酶（GOx）溶液（在0.01M PBS中，pH7.4, 20 μL）滴加到TiO2-C3N4异质结修饰的FTO上，室温干燥，重复三次后放入冰箱中以备后续使用
3．进行细胞培养和端粒酶延伸，之后加入氯化血红素以形成端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶：（1）细胞培养和端粒酶提取：将人宫颈癌（HeLa）细胞加到补充有10％（体积比）热灭活的胎牛血清和1％（体积比）青霉素-链霉素溶液的杜尔贝克改良的老鹰培养基中，然后于37 ℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中培养；对于端粒酶提取，需在指数生长期收集细胞，将1×106个细胞分散在1.5 mL EP管中，用冷的PBS （0.1M，pH7.4）洗涤两次，并重悬于200 μL冷的CHAPS裂解缓冲液中；随后将细胞混合物在冰上孵育30min，并在4 ℃以14000 rpm的转速离心20 min；小心收集上清液并转移至新鲜的1.5 mL EP管中，然后在-80 ℃下冷冻以供进一步使用；其中所有的管和尖端都不含核糖核酸酶；（2）端粒酶延伸：将从一定数量的细胞中提取的端粒酶在1×CHAPS裂解缓冲液中连续稀释，然后将2 μL端粒酶提取物与端粒酶延伸反应缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5 mM MgCl2，63 mM KCl，0.05％Tween 20，1mM N,N,N',N'-四乙酸，1 mM 碱磷酸去氧核苷酸，0.2 μM端粒酶引物和0.4 UμL-1重组核糖核酸酶抑制剂）一起在37℃下孵育1 h；然后将上述溶液在95 ℃下加热10 min以结束延伸反应，整个反应在光照保护下进行；（3）端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶的形成：在实验之前，将发夹DNA1（H1）和发夹DNA2（H2）分别加热至95 ℃保持5 min，然后通过聚合酶链式反应（PCR）机以1 ℃/min的速度逐渐退火至室温以形成发夹结构，并储存在4 °C以备进一步使用；随后，将端粒酶延伸产物（与一系列不同数量的HeLa细胞一起温育）加入到含有300nM H1和300 nM H2的缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mM MgCl2）中；将混合物在37 ℃下孵育40 min之后，分别加入5 mM KCl和1 μM氯化血红素，然后将溶液在室温下放置30min以形成G-四链体/血红素DNA酶
4.将步骤（2）中制备的GOx-TiO2-C3N4修饰FTO导电玻璃作为工作阳极，铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，葡萄糖溶液作为电解液，结合步骤（2）中形成的端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶和TMB溶液，构建具有即时可视化比色显示的光电化学生物传感器：用标准三电极系统中的电化学分析仪（CHI660D）测量光电流响应，将步骤（2）中GOx-TiO2-C3N4修饰的FTO导电玻璃作为工作阳极，铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，电解质溶液为150 μL含有5 mM葡萄糖的PBS溶液（50 mM，PH 7.4），在葡萄糖氧化酶的作用下产生过氧化氢，进一步促进工作电极在500 W氙灯的照射下促进载流子分离与空穴传输，实现光能向电能的转化；然后将步骤（3）形成的端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶和50 μL TMB加入上述电解液中一起温育，其室温下进行的HRP模拟反应催化过氧化氢产生羟基自由基氧化TMB产生无色向蓝色的可视化转变，且消耗的过氧化氢使得光电信号出现不同程度的减弱，实现定量测量端粒酶的效果。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种可视化检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctaaccct aaaactctca agggtagggc gggtagagtt ttaggg 46
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aactctaccc gccctaccct tgagagtttt agggttaggg agggtagggc gggttggg 58
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatccgtcga gcagagtt 18

Claims (1)

1.一种可视化检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法，其特征是包括以下步骤：
1.1 将氟掺杂氧化锡（FTO）导电玻璃裁剪成1 cm×5 cm尺寸，依次放入丙酮、无水乙醇、超纯水中超声处理10-30 min，然后在60-80 ℃烘箱中干燥40-60 min，随后保存以备用；
1.2 以FTO导电玻璃作为基底，合成负载葡萄糖氧化酶的二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片异质结光电材料（GOx-TiO2-C3N4）修饰FTO导电玻璃，具体操作步骤如下：（1）合成石墨相氮化碳纳米片（g-C3N4 NSs）：首先，称量1-5 g三聚氰胺粉末置于带有盖子的瓷坩埚中，在通风状态下于600 ℃下加热2-3 h，其中加热和冷却过程的速率均为3 ℃/min，合成黄色大块石墨相氮化碳（g-C3N4）；随后，将g-C3N4研磨至超细粉末，称取10-200 mg分散在10-200 mL超纯水中，超声15-20 h，超声后得到的悬浮液以8000 r/min的速度离心，以除去剩余未剥离的g-C3N4；最后，在60 ℃真空条件下收集并浓缩上清液，得到的乳状悬浮液即为g-C3N4 NSs；（2）制备二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片（TiO2-C3N4）异质结：5-20 mL盐酸（12 M）加入5-20 mL超纯水中，室温搅拌10-30 min，加入0.2-5 mL钛酸四正丁酯溶液和1-5 mL g-C3N4 NSs溶液，继续搅拌30-60 min得到混合溶液；将步骤1.1中的干燥FTO导电玻璃以导电面向下的方式放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将上述混合溶液转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的150-200 ℃烘箱内恒温反应30-300 min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出FTO，用超纯水彻底清洗3次，然后放入真空干燥箱中60-80 ℃干燥8-10 h；（3）将5-10 mg·mL-1的葡萄糖氧化酶（GOx）溶液（0.01 M PBS中，pH7.4，20-50μL）滴加到TiO2-C3N4异质结修饰的FTO上，室温下干燥，重复三次后放入冰箱中以备后续使用；
1.3 进行细胞培养和端粒酶延伸，形成端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶：（1）细胞培养和端粒酶提取：将人宫颈癌（HeLa）细胞加到补充有10-15％（体积比）热灭活的胎牛血清和1-5％（体积比）青霉素-链霉素溶液的杜尔贝克改良的老鹰培养基中，然后于37 ℃下在含有5-10％ CO2的潮湿气氛中培养；对于端粒酶提取，需在指数生长期收集细胞，将1×106个细胞分散在1.5 mL EP管中，用冷的PBS （0.1M，pH7.4）洗涤两次，并重悬于200-300 μL冷的CHAPS裂解缓冲液中；随后将细胞混合物在冰上孵育30-60 min，并在4 ℃下以14000 rpm的转速离心20-30 min，小心收集上清液并转移至新鲜的1.5 mL EP管中，然后在-80 ℃下冷冻以供进一步使用；其中所有的管和尖端都不含核糖核酸酶；（2）端粒酶延伸：将从一定数量的细胞中提取的端粒酶在1×CHAPS裂解缓冲液中连续稀释，然后将2-5 μL端粒酶提取物与端粒酶延伸反应缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5 mM MgCl2，63 mM KCl，0.05％Tween 20，1mM N,N,N',N'-四乙酸，1 mM 碱磷酸去氧核苷酸，0.2 μM端粒酶引物和0.4 UμL-1重组核糖核酸酶抑制剂）一起在37 ℃下孵育1-2 h；然后将上述溶液在95 ℃下加热10-30 min以结束延伸反应，整个反应在光照保护下进行；（3）端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶的形成：在实验之前，将发夹DNA1（H1）和发夹DNA2（H2）分别加热至95 ℃保持5-10 min，然后通过聚合酶链式反应（PCR）机以1 ℃/min的速度逐渐退火至室温以形成发夹结构，并储存在4 °C以备进一步使用；随后，将端粒酶延伸产物（与一系列不同数量的HeLa细胞一起温育）加入到含有300-500 nM H1和300-500 nM H2的缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mMMgCl2）中；将混合物在37 ℃下孵育40-60 min之后，分别加入5-10 mM KCl和1-5 μM氯化血红素，然后将溶液在室温下放置30-60 min以形成G-四链体/血红素DNA酶；
1.4 将步骤1.2中制备的GOx-TiO2-C3N4修饰FTO导电玻璃作为工作阳极，利用标准三电极体系结合步骤1.3中形成的端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶和TMB溶液，构建具有即时可视化比色显示的光电化学生物传感器：用标准三电极系统中的电化学分析仪（CHI660D）测量光电流响应，将步骤1.2中GOx-TiO2-C3N4修饰的FTO导电玻璃作为工作阳极，铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，电解质溶液为150-300 μL含有5-10 mM葡萄糖的PBS溶液（50 mM，PH 7.4），在葡萄糖氧化酶的作用下产生过氧化氢，进一步促进工作电极在500W氙灯的照射下促进载流子分离与空穴传输，实现光能向电能的转化；然后将步骤1.3形成的端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶和50-100 μL TMB加入上述电解液中一起温育，其室温下进行的HRP模拟反应催化过氧化氢产生羟基自由基氧化TMB产生无色向蓝色的可视化转变，且消耗的过氧化氢使得光电信号出现不同程度的减弱，从而实现定量测量端粒酶的效果。
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