CN114107510B

CN114107510B - 基于dna三链介导构建多维dna酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN114107510B
Application number: CN202111503274.9A
Authority: CN
Inventors: 张何; 张培柔; 马思元; 傅昕
Original assignee: Hunan Institute of Engineering
Current assignee: Hunan Institute of Engineering
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: CN114107510A

Abstract

本发明提供了基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法，涉及基因检测技术领域。本发明以三链DNA为信号扩增技术核心，将杂交链式反应(HCR)扩增和G‑四链体‑血红素DNA酶酶促信号扩增整合起来。在ctDNA存在的情况下，通过三链DNA引发多维网状杂交链式反应并形成三维立体网状DNA纳米线结构，此结构具有明显的细化分层及空间分布规律，支链上延伸出低层次分支，每个分支还可再延伸出更低层次的子分支。在此基础上，通过三链DNA介导构建分子间裂分式G‑四链体‑血红素DNA酶矩阵，从而实现循环核酸的超灵敏检测，具有无酶促信号扩增及可视化检测特征，具有极大发展潜力。

Description

基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法。

背景技术

2020年全球新增癌症最多的是乳腺癌，同时2020年癌症导致的死亡病人约1000万人，其中乳腺癌死亡的病人达68.5万人。大部分乳腺癌患者在被发现时已是中、晚期阶段，其死亡率高达50％，而早期乳腺癌的长期治愈率可达90％以上。因此乳腺癌的早期发现、诊断和治疗是提高治愈率、降低死亡率的关键。

目前乳腺癌诊断方法主要有：钼靶检查、超声显像检查、活体组织检查、红外热图检测以及相关基因检测等方面，然而这些技术存在着对致密乳腺组织穿透力差、仪器装置笨重，扫描范围和方式受到限制，价格昂贵，或者具有侵袭性，不能准确追踪肿瘤的动态变化、数据缺少、灵敏度不够等困境。

近年来，循环肿瘤DNA(ctDNA)分析已成为非侵入性癌症诊断的趋势，也称为"液体活检"。ctDNA从肿瘤组织的凋亡、坏死肿瘤细胞或血液中循环的增生活跃肿瘤细胞(CTCs)释放到循环系统中，所以ctDNA携带与肿瘤一致的生物学信息。理论上是异质转移部位肿瘤DNA的混合体，可以更全面地描述肿瘤异质性。但是ctDNA在血液循环中浓度十分微量且以碎片化呈现，也是目前ctDNA检测所面临的主要挑战。

近年来新的分子生物学技术不断涌现，生物检测显示出仪器检查所不具备的优越性。基因治疗中反义基因技术利用形成三链DNA的寡核苷酸(triplex formingoligonucleotide,TFO)实现特异抑制基因表达，此项技术也被应用于循环肿瘤DNA检测领域。

G-四链体-Hemin DNA酶是近些年来迅速发展起来的一种DNA酶，具有易于复制和储存、价格低廉、便于特殊标记和操作、不易水解且热稳定性良好等优势。G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基(G)的DNA序列形成的一种特殊的DNA二级结构，当它们与氯化血红素(Hemin)结合后，可以显现出较强的过氧化物酶活性，能够催化H₂O₂参与的一些反应。目前，G-四链体-氯血红素DNA酶用于检测发展了多种生物传感器。虽然这类传感器弥补了传统仪器分析方法的不足，但仍然存在信号放大方法单一、灵敏度不足、背景值高、假阳性高等问题，在生物医学样品分析方面难以实现超灵敏序列检测。

杂交链式反应是2个DNA发夹之间的自组装杂交反应，在引发DNA存在时，通过部分互补序列重叠成一个长的双链DNA纳米线。由于不需要扩增DNA模板、信号放大不需要酶参与、假阳性率低等特点，该方法已经与多种技术相结合用于发展新型、高效生物传感器。目前存在的基因检测方法中许多新型生物传感器都具备良好的灵敏性，如：一种杂交链式反应和三链DNA支点超灵敏比色法检测循环肿瘤，检测限为0.1pM；一种基于碳点和DNA纳米树的荧光传感方法用于乳腺癌c-erbB2基因相关序列的检测，检测限为6aM；一种基于磁性复合探针解锁茎环结构的融合基因荧光分析方法检测，检测限为0.223pM。但由于血液中ctDNA的浓度过于微量，且血液环境复杂，影响因素众多，仍需寻找更好的兼具特异性、高灵敏度、操作简易、经济的新方法，当然也需要临床进一步的研究与实践。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法，通过三链DNA介导构建分子间裂分式G-四链体-血红素DNA酶矩阵，实现循环核酸的超灵敏检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于三链DNA构建分子间裂分式G-四链体-血红素DNA酶矩阵的传感体系，所述传感体系包括6条寡核苷酸探针：捕获探针Capture、H1、H2、L3、L1和L2；

其中捕获探针Capture、H1、H2和L3均包含茎环发夹结构，且在每个所述茎环发夹结构中还包括引发信号放大的DNA序列，每个所述茎环发夹结构不发生杂交反应；

L1探针的核苷酸序列中包含15个碱基的相同嘧啶和一组GGG序列；

L2探针的核苷酸序列中包含15个碱基的相同嘧啶和三组GGG序列。

优选的，所述捕获探针Capture的茎部为13个碱基、环部为11个碱基和单链末端为9个碱基；

H1和H2的茎部均为18个碱基、环部均为6个碱基和单链末端均为6个碱基；

L3的茎部为12个碱基、环部为4个碱基和单链末端为10个碱基。

本发明还提供了上述的传感体系在制备循环核酸检测试剂盒中的应用。

优选的，所述循环核酸包括循环肿瘤DNA。

优选的，当所述循环肿瘤DNA为乳腺癌ctDNA时，所述捕获探针Capture的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述L1的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，所述L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选的，所述乳腺癌ctDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种检测乳腺癌ctDNA的试剂盒，包括捕获探针Capture、H1、H2、L3、L1和L2，其中所述捕获探针Capture的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述L2的核苷酸序列如SEQID NO.7所示。

本发明还提供了一种非诊疗目的的基于上述试剂盒检测乳腺癌ctDNA的方法，包括以下步骤：(1)分别将所述捕获探针capture、H1、H2和L3加热到90℃孵育10min，梯度退火到25℃，分别得具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3；

(2)将步骤(1)得到的所述具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3与样本提取的ctDNA和Tris-Ac buffer混合成检测体系，37℃下孵育3h，而后30℃孵育4h，得孵育液；

(3)将步骤(2)所述孵育液与L1、L2、Tris-Ac buffer和hemin混匀，25℃下孵化1h，得反应液；

(4)将步骤(3)所述反应液与ABTS^2-和H₂O₂混合均匀后，25℃孵育8min，进行比色，当有绿色产生时表明所述样本中包含乳腺癌ctDNA。

优选的，步骤(2)所述检测体系以20μL计，包括：0.4μL ctDNA、1.2μL捕获探针Capture、1.2μL H1、1.2μL H2、0.8μL L3和15.2μL Tris-Ac buffer。

优选的，步骤(3)所述孵育液与L1、L2、Tris-Ac buffer和hemin的体积比为20：6：6：16：2。

有益效果：本发明以三链DNA为信号扩增技术核心，将杂交链式反应(HCR)扩增和G-四链体-血红素DNA酶酶促信号扩增整合起来。在ctDNA存在的情况下，通过三链DNA引发多维网状杂交链式反应并形成三维立体网状DNA纳米线结构，此结构具有明显的细化分层及空间分布规律，支链上延伸出低层次分支，每个分支还可再延伸出更低层次的子分支。在此基础上，通过三链DNA介导构建分子间裂分式G-四链体-血红素DNA酶矩阵，从而实现循环核酸的超灵敏检测。

本发明所述传感体系和试剂盒，设计新颖，发夹探针设计精细，协同作用强，同时该技术具有操作简单、不依赖于大型设备、超灵敏度、选择性好和抗干扰性强等优点，能够检测血液中的循环核酸，性能良好，为循环核酸检测提供了一种新的方法。整个检测体系是基于DNA纳米技术构建，属于无酶促DNA扩增技术类别，可以有效避免影响蛋白酶参与检测体系性能的多种因素的干扰，与现有的ctDNA检测方法相比(表2)，本发明所述检测方法的检测级别能达zmol/L，此检测体系对乳腺癌ctDNA的检出限远低于其他方法血液中的乳腺癌ctDNA检测浓度，因此具有稳定性强、检测性能好的特点。

附图说明

图1为基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测原理图；

图2为可行性分析；

图3为不同ctDNA浓度区间的颜色反应；

图4为定量分析。

具体实施方式

本发明所述6条寡核苷酸探针优选均具有特殊的设计思路：如捕获探针Capture的茎部为13个碱基、环部为11个碱基和单链末端为9个碱基；H1和H2的茎部均为18个碱基、环部均为6个碱基和单链末端均为6个碱基；L3的茎部为12个碱基、环部为4个碱基和单链末端为10个碱基。

在本发明中，所述的各茎环发夹结构在没有靶标存在时，具有稳定结构，并且将引发信号放大的DNA序列锁定在各发夹结构中，相互之间不发生非特异性杂交反应。当靶标序列存在时，通过立足点链置换反应打开捕获探针Capture，并进一步影响H1和H2的稳态，从而引发一维杂交链式反应产生H1和H2的链状组合，形成一维DNA纳米线。产生的一维DNA纳米线上设计有一个30个碱基的同嘌呤·同嘧啶的双链区域，能够通过Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键捕获具有同嘌呤或同嘧啶的DNA单链探针。发夹探针L3设计为发夹结构，当一维DNA纳米线未组装时，在体系里是稳定的，该探针具有两个功能部分：5’端部分含有18个同型嘧啶，能够通过序列特异的立足点链置换识别一维DNA纳米线上同嘧啶·同嘌呤双链DNA，打开发夹结构，并与之结合形成DNA三链结构；发夹结构打开后，暴露的3’端部分与靶标序列一致，能够打开捕获探针Capture从而引发构建下层DNA纳米线支链，通过层层引发，构建出三维立体网状DNA纳米线结构。设计的L1探针包含两个部分：一个部分含有15碱基的同嘧啶，能够序列特异的与多维网状DNA纳米线上同嘧啶·同嘌呤双链DNA结合，形成三链DNA，另一部分含有一组GGG序列。探针L2也包含两个功能部分：一部分含有15碱基的同嘧啶，能够序列特异的与多维网状DNA纳米线上同嘧啶·同嘌呤双链DNA结合，形成三链DNA，另一个部分包含三组GGG序列。L1和L2与多维网状DNA纳米线结合形成三链DNA且相互靠近，序列中的4组GGG序列相互靠近从而形成分子间裂分式G四链体。

本发明上述6条寡核苷酸探针的设计，结合了三链DNA引发的多维网状杂交链式反应，又通过三链DNA构建出富含G四链体的网状矩阵。在Hemin插入G四链体后形成G-四聚体-血红素DNA酶，具有明显增强的类过氧化物酶的催化活性，该酶能催化H₂O₂与2,2’-联氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)之间的反应产生绿色的阳离子自由基ABTS.⁺，在420nm处存在最大吸收峰，其吸光值与反应体系中靶标核酸(ctDNA)浓度的存在定量关系：随着浓度降低检测信号增强，主要是由于空间位阻导致的。本发明通过三链DNA引发多维网状杂交链式反应构建多维立体网状DNA纳米线结构，在高浓度的ctDNA情况下，大量HCR同时发生，在多个维度同时产生分支，导致分子间间隙狭窄，难以伸展，故影响了更低层次的支链产生和分子间裂分式G-四链体-血红素DNA酶矩阵的形成，分子相互堆积，三链DNA之间的弱氢键将竞争吸收紫外光，另一原因可能是由于结构致密导致G四链体被封闭在结构内部，无法与ABTS、H₂O₂接触，导致高靶标浓度时信号值偏低的情况。在低浓度ctDNA情况下，该体系有足够的空间进行HCR并产生更多的低层次支链，分子间裂分式G-四链体-血红素DNA酶矩阵形成良好，能够与反应底物充分接触并产生信号。

利用本发明所述传感体系，在没有靶核酸序列的情况下，引发信号放大的DNA序列被锁定在发夹结构的捕获探针Capture和L3中，没有杂交链式反应发生并且没有颜色信号变化。当靶核酸序列的存在情况下，捕获探针Capture的发夹结构被打开，引发一系列杂交反应并产生特征颜色(绿色)变化，该技术在核酸检测中具有通用性，因此可用于制备循环核酸检测试剂盒(图1)。

本发明所述循环核酸优选包括循环肿瘤DNA(ctDNA)，在本发明实施例中优选以乳腺癌ctDNA为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。在本发明实施例中，为对乳腺癌ctDNA进行检测，以PIK3CA基因为靶标，并设计了阳性对照乳腺癌ctDNA，具体的各探针的序列如表1所示，表1中下划线表示发夹茎部序列。

表1本发明使用的DNA探针序列

本发明所述试剂盒中优选还包括Tris-Ac buffer，所述Tris-Ac buffer的工作浓度优选为20mM。在本发明中，所述试剂盒中捕获探针Capture、H1、H2、L3、L1和L2的工作浓度优选均为10μM。

优选的，步骤(2)所述检测体系以20μL计，包括：0.4μL ctDNA、1.2μL捕获探针Capture、1.2μL H1、1.2μL H2、0.8μL L3和15.2μLTris-Ac buffer。

本发明在进行检测时，分别将所述捕获探针capture、H1、H2和L3加热到90℃孵育10min，梯度退火到18～25℃，分别得具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3。本发明所述梯度退火包括：捕获探针Capture：70℃5min，60℃5min，38℃10min，33℃15min和25℃30min；

L3：70℃5min，60℃5min，40℃5min，29℃10min和25℃30min；

H1和H2均为：70℃5min，60℃10min，46℃15min，35℃5min，25℃30min。本发明所述温度退火到室温，可以确保发夹结构的形成，并且在使用前优选放置在4℃保存。

得具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3后，本发明将步骤(1)得到的所述具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3与样本提取的ctDNA和Tris-Ac buffer混合成检测体系，37℃下孵育3h，而后30℃孵育4h，得孵育液。本发明所述样本优选包括血液，本发明对从血液中提取ctDNA的方法并没有特殊限定，优选包括将提取的血液首先经2000rpm离心5min，取上清液与蛋白酶K混合均匀，56℃水浴10min，再与核酸提取液混合，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液，如血液中包含ctDNA，则所述ctDNA溶解于最终得到的上清液中，以此为样品进行检测体系的构建。

本发明所述检测体系以20μL计，优选包括：样品0.4μL，1.2μL捕获探针Capture(10μM)、1.2μL H1(10μM)、1.2μL H2(10μM)、0.8μL L3(10μM)、15.2μL Tris-Ac buffer(20mM)，混合摇匀，37℃下孵育3h，然后30℃孵育4h，如所述样品中包含对应的ctDNA，则此时的孵育液可形成多维立体网状DNA纳米线结构。

得孵育液后，本发明将步骤(2)所述孵育液与L1、L2、Tris-Ac buffer和hemin混匀，25℃下孵化1h，得反应液。在本发明实施例中，优选向所述孵育液中加入L1、L2、Tris-Acbuffer和hemin，所述L1、L2、Tris-Ac buffer和hemin的加入量分别为6μL、6μL、16μL和2μL。本发明在加入所述hemin(10μM)时，优选在黑暗条件下移取。

得反应液后，本发明将步骤(3)所述反应液与ABTS^2-和H₂O₂混合均匀后，18～25℃孵育8min，进行比色，当有绿色产生时表明所述样本中包含乳腺癌ctDNA。

本发明实施例中，优选取10μL所述反应液与40μLABTS^2-(10mM)和50μL H₂O₂(8mM)充分搅拌，混合均匀，而后25℃孵育8min。

本发明对所述比色的方法并没有特殊限定，可通过肉眼观察，也可通过分光光度计进行测试。本发明实施例中优选通过UV–1800紫外分光光度计进行测试，将EP管中溶液转移(50μL)至微量比色皿中，以420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA_420nm＝A_420nm-A₀，其中A_420nm为样品测量值，A₀为ctDNA浓度为0时的背景值。

下面结合实施例对本发明提供的基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

探针来源：委托上海生工生物工程股份有限公司合成表1所示的探针和ctDNA。

1、多维立体网状DNA纳米线结构形成

捕获探针capture和发夹探针H1、H2、L3分别加热到90℃孵育10min，缓慢梯度退火到室温以确保发夹结构的形成，使用前放置在4℃保存。取干净灭菌的0.2mL EP管，依次加入ctDNA 0.4μL(10μM)，1.2μL捕获探针Capture(10μM)、1.2μL H1(10μM)、1.2μL H2(10μM)、0.8μL L3(10μM)、15.2μL Tris-Ac buffer(20mM)，混合摇匀，37℃下孵育3h，然后30℃孵育4h，形成多维立体网状DNA纳米线结构。

2、分子间裂分式G-四链体-血红素DNA酶矩阵的构建

在上述溶液中加入6μL L1(10μM)、6μL L2(10μM)、16μL Tris-Ac buffer(20mM)混匀。黑暗条件下移取2μL hemin(10μM)，25℃下孵化1h。

3、比色分析

从EP管中移取上述混合溶液10uL于另已灭菌的0.2mL EP管，加入40uL ABTS^2-(10mM)、50uL H₂O₂(8mM)，充分搅拌，25℃孵育8min。

于UV-1800紫外分光光度计进行测试，将EP管中溶液转移(50μL)至微量比色皿中。

选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA_420nm＝A_420nm-A₀，其中A420nm为样品测量值，A₀为ctDNA浓度为0时的背景值。

4、可行性分析

设置9组对比实验：

第1组为实验组，加入0.4μL 10a mol/L ctDNA溶液；

第2组为对照组1，以0.4μL缓冲溶液(Tris-Ac buffer)代替实验组的ctDNA溶液；

第3组为对照组2，以1.2μL缓冲液代替捕获探针Capture；

第4组是对照组3，以2.4μL缓冲液代替H1和H2；

第5组是对照组4，只分别加入6μL L1和L2溶液，以及2μL hemin，其他都以缓冲液代替；

第6组是对照组5，2μL缓冲液代替hemin；

第7组是ABTS的自氧化反应体系，仅加入100μL ABTS，考察ABTS在空气中氧化产生的信号干扰；

第8组是对照6，以12μL缓冲液代替L1和L2；

第9组为对照7，以1.2μL缓冲溶液代替实验组的ctDNA和L3溶液。

对照组1～7未说明的其它条件与第2组一致。

结果如图2所示，1组中加入了ctDNA，捕获探针Capture被打开并引发强的核酸探针自组装，形成G-四链体-血红素DNA酶矩阵，其吸光值明显提高；2组中未加入ctDNA，但由于L3 Tm值过低，温度过高情况下少量L3容易被打开，且L3有一段与ctDNA相同，捕获探针capture与少量L3存在杂交，并引发杂交延伸，引起一定的背景；3组中未加入捕获探针Capture，游离的L1与L2组装成极少量G四链体故而背景信号极低；4组中未加入H1和H2，未产生DNA纳米线，与第3组由于相同原因从而产生了极低的背景；5组中只加入了L1、L2和hemin，和3组因为相同原因产生了极低的背景；6组中未加入hemin，由于没有Hemin的影响，其背景信号很低；7组在缓冲溶液中，由于不存在催化剂，ABTS的自氧化反应较弱，只产生了极低的背景信号；8组中未加入L1和L2，因此不能产生G四链体，但由于ABTS的自氧化反应，从而产生了极低的背景；9组中即无ctDNA也无L3因此具备组3、5相同原因，从而产生了很低的背景信号。综上，此传感体系用于检测ctDNA是可行的。

5、定量分析

在上述实验条件下，考察基于DNA三链介导多维信号扩增矩阵的高灵敏乳腺癌循环肿瘤DNA可视化传感新技术对不同浓度乳腺癌循环肿瘤DNA(0.002zmol/L～0.002pmol/L)的响应情况。

结果如图3所示，共形成了2个颜色变化区间：乳腺癌ctDNA浓度在0.002fM～0.002pM时，随着乳腺癌ctDNA浓度增加，反应体系的颜色(绿色)逐渐加深，但颜色反应偏弱；乳腺癌ctDNA浓度在0.002zM～0.002aM时，随着乳腺癌ctDNA浓度降低，反应体系的颜色(绿色)逐渐加深，颜色反应较强。

乳腺癌ctDNA浓度在0.02～100zmol/L之间呈现良好的线性(图4)，回归方程分别为ΔA_420nm＝0.275-0.002C，线性相关系数r²＝0.990；重复6次测定0.2zmol/L ctDNA，相对标准偏差(RSD)为5.6％。与现有的ctDNA检测方法相比(表2)，本发明检测方法的检测级别能达zmol/L，此检测体系对乳腺癌ctDNA的检出限远低于其他方法血液中的乳腺癌ctDNA检测浓度。

表2不同ctDNA传感器检测性能比较

6、实际样品检测

对该技术体系检测实际样品中ctDNA的效果进行分析，通过加标法，将一定浓度的ctDNA加入实际样品中进行检测：吸取志愿者血液2mL于离心管中，2000rpm离心5min，取上清液100μL于1.5mL EP管中，加入20μL蛋白酶K混合均匀56℃水浴10min，再向上述处理好的上清液中加入50μL的核酸提取液，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，再取上述溶液的上清液于1.5mL EP管中。在上述溶液中加入一定量的ctDNA。结果如表3所示，本发明所述检测实际样本时也具有良好的准确性和再现性。

表3健康人血清中乳腺癌循环肿瘤DNA的加标回收实验结果(n＝6)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南工程学院

<120> 基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtgatttta gagagag 17

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagagagaa gagagagaga ggaactcttc tctctctaaa atcact 46

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcctctctc tctcttctct ctcttcctct agagagagaa gagagaga 48

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagagagaa gagagagaga ggaatctctc tcttctctct ctagagga 48

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctctctctt ctctctctaa aagtgatttt agagagag 38

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggttctct ctctctcctt 20

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctccttctc tctcttgggt agggcggg 28

Claims

1.一种基于三链DNA构建分子间裂分式G-四链体-血红素DNA酶矩阵的探针组，其特征在于，所述探针组包括6条寡核苷酸探针：捕获探针Capture、H1、H2、L3、L1和L2；

所述捕获探针Capture的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述H1的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述L3的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.权利要求1所述的探针组在制备循环核酸检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述循环核酸为乳腺癌ctDNA；

所述乳腺癌ctDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种检测乳腺癌ctDNA的试剂盒，其特征在于，包括捕获探针Capture、H1、H2、L3、L1和L2，其中所述捕获探针Capture的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述L3的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述L2的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；

所述乳腺癌ctDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种非诊疗目的的基于权利要求3所述试剂盒检测乳腺癌ctDNA的方法，包括以下步骤：（1）分别将所述捕获探针capture、H1、H2和L3加热到90℃孵育10 min，梯度退火到25℃，分别得具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3；

（2）将步骤（1）得到的所述具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3与样本提取的ctDNA和Tris -Ac buffer混合成检测体系，37℃下孵育3h，而后30℃孵育4h，得孵育液；

（3）将步骤（2）所述孵育液与L1、L2、Tris -Ac buffer和hemin混匀，25℃下孵化1h，得反应液；

（4）将步骤（3）所述反应液与 ABTS^2-和H₂O₂混合均匀后，25℃孵育8min，进行比色，当有绿色产生时表明所述样本中包含乳腺癌ctDNA；

所述乳腺癌ctDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述检测体系以20μL计，包括：0.4µL ctDNA、1.2 µL 捕获探针Capture、1.2 µL H1、1.2 µL H2、0.8 µL L3和15.2 µL Tris -Ac buffer。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述孵育液与L1、L2、Tris -Acbuffer和hemin的体积比为20：6：6：16：2。