CN115851882A - 一种基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,ssDNA1通过与UiO‑66‑NH2的静电相互作用将MB分子封装在UiO‑66‑NH2容器中,一定浓度的靶标物质能够形成一定量的crRNA/Cas12a/激活剂三元复合物,从而阻止一部分ssDNA2与ssDNA1杂交形成dsDNA,而另一部分ssDNA2与ssDNA1杂交形成dsDNA能够远离UiO‑66‑NH2,在进行DPV检测后出现明显的电化学信号,利用靶标物质浓度与电化学信号之间的关系,实现对样品中靶标物质的浓度检测。本发明所述方法通过三重信号放大和精确的控释放系统,具有较高的灵敏度和选择性,良好的抗干扰能力和重复性以及可接受的实际应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域,具体涉及一种基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一种长度约为19-25个核苷酸的短非编码RNA,通过与mRNA的3’UTR结合,转录后干扰mRNA,从而负调控特定靶基因的表达。miRNAs在生物体的各种调节机制中起着重要的作用。并且它们也可以用作癌基因或肿瘤抑制因子来调节肿瘤进展或影响肿瘤侵袭。重要的是,miRNAs通过靶向与细胞增殖、周期和凋亡相关的基因和蛋白,调节药物代谢酶和转运蛋白,调节DNA损伤修复,以及影响上皮细胞向间质细胞的转化(EMT)而与癌症耐药性相关。同时,调控具有双重效应:miRNAs的失调会促进耐药性,反之,miRNAs的有效调控会降低耐药性。此外,从外泌体分泌的miRNAs作为肿瘤细胞和微环境之间的信号分子,可以运输到身体的各个部分,导致促进和赋予对治疗的耐药性或敏感性。由于miRNAs在调节癌症耐药性和其他生理过程方面具有重要价值,因此对开发有效的miRNAs检测方法的需求很大。
然而,由于其序列极短、高度同源性和低丰度的固有特性,对于miRNAs的准确和超灵敏检测来说,现在仍然是一个巨大的挑战。目前,现有技术的一些分析方法,如电化学、拉曼和荧光(FL)已被广泛用于miRNAs的检测。其中,电化学生物传感器因其操作简单、检测背景低、成本低而备受关注。然而,需要进一步提高灵敏度和特异性,因为在没有扩增的情况下,检测对象的浓度通常相当低。显然,迫切需要将新的信号放大方法和新的检测系统应用于miRNAs检测,以开发具有高灵敏度和特异性的电化学生物传感器。最近,成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统不仅在基因组编辑方面掀起了热潮,而且还引起了分子诊断技术的创新。在CRISPR/Cas系统中,当目标核酸与CRISPR RNA(crRNA)相互作用时,Cas蛋白的侧链切割活性被激活(至少每秒103次翻转),赋予CRISPR/Cas系统优异的自身信号放大能力,显著提高了对目标生物分子检测的灵敏度。考虑到CRISPR/Cas技术的高特异性和信号放大效率,将CRISPR/Cas技术扩展到电化学生物传感器是一个很好的选择。
目前,已经开发了几种用于核酸检测的基于CRISPR的电化学生物传感器,如E-CRISPR(cpf1)、E-Si-CRISPR(Cas12a)和(CRISPR)/Cas13a供电的微流控。虽然它们取得了不错的效果,但仍然存在一定的局限性。一方面,在这些方法中使用的预先组装的Cas-crRNA复合物,即使在没有靶激活剂的情况下,也会由于其非特异性切割能力而导致高的不良背景;此外,Cas9和Cas12a通常被设计用于识别和检测双链DNA(dsDNA),在这些系统中,PAM位点需要存在于dsDNA的靶序列上,这限制了核酸诊断的通用性;另一方面,大多数基于CRISPR的电化学生物传感器需要将电化学探针固定在电极表面,这是一个复杂而耗时的操作:与均相溶液相比,固定在非均相表面上的探针的空间位阻效应,将导致较差的切割效率和选择性,这对生物传感器的灵敏度和重现性是极为不利的;更糟糕的是,即使在均相溶液中,为了装载信号分子,往往需要进行氨基/羧基修饰,这进一步增加了传感器制作的难度。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足,本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,以解决现有技术中Cas12a-crRNA的预组装导致高的背景信号、电化学探针固定在电极表面的复杂而耗时的操作以及均相溶液中为了装载信号分子需要进行氨基/羧基修饰的步骤、最终使得现有基于CRISPR的电化学系统灵敏度和特异性不高的问题。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一种基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,ssDNA1通过与UiO-66-NH2的静电相互作用将MB分子封装在UiO-66-NH2容器中,当存在靶标物质时,指数扩增反应将靶标识别事件转化并扩增到T7启动子中,随后T7启动子在T7 RNA聚合酶作用下作为转录扩增的触发器来生大量的crRNA;产生的crRNA与Cas12a和激活剂形成三元复合物,Cas12a非特异性切割ssDNA的能力被激活,致使与ssDNA1完全互补的ssDNA2被切割,不能形成dsDNA,导致ssDNA1生物门不能离开UiO-66-NH2的表面,此时进行DPV检测,几乎不显示电化学信号;当不存在靶标物质时,不能形成crRNA/Cas12a/激活剂三元复合物,ssDNA2与ssDNA1杂交形成dsDNA,形成的dsDNA结构的刚性导致吸附亲和力降低,使dsDNA远离UiO-66-NH2,此时进行DPV检测,检测后出现明显的电化学信号;当存在不同浓度的靶标物质时,利用靶标物质的浓度与DPV检测后的电化学信号之间的关系,能够检测样品中靶标物质的浓度。
本发明对现有技术进行深入研究后发现,如图1A所示,具有XNYNY结构的EXPAR模板探针由五个结构域组成:靶结合区(X),两个切口核酸内切酶识别位点(N),和T7启动子的两个互补序列(Y)。在靶标物质与X区域杂交后,双链DNA在KF聚合酶Nb.BbvCI切刻酶作用下可以重复获得一定量的P和T7启动子(1A方案中的第1个循环)。同时,产物P也可以用作引物,与EXPAR模板中间的Y区组装,并引发另一个循环反应(1A方案中的循环2)。结果,产生了大量T7启动子。随后,T7启动子与crRNA模板杂交形成二聚体,二聚体在T7 RNA聚合酶的作用下被转录,产生大量的crRNA。最后,Cas12a蛋白和激活子与扩增的丰富crRNA结合产生Cas12a/crRNA/激活子三元复合物,该复合物可以激活CRISPR/Cas12a系统对ssDNA的非特异性切割能力。
基于上述技术架构,本发明提出了一种自给式crRNA介导的CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统,用于超灵敏检测靶标物质,尤其是miRNA-155。首先,ssDNA1通过与UiO-66-NH2的静电相互作用充当看门人,MB分子被完全封装在容器中,几乎不显示电化学信号。然后,自组装的Cas12a/crRNA/activator三元复合物可以切割与ssDNA1完全互补的ssDNA2,导致dsDNA形成失败(ssDNA1/ssDNA2)。结果是,ssDNA1生物门无法离开UiO-66-NH2的表面,仅观察到微弱的MB信号。相反,在没有靶标物质的情况下,未活化的Cas12a酶不能切割ssDNA2,后者将与ssDNA1杂交形成dsDNA。双链结构的刚性导致吸附亲和力降低,使得形成的dsDNA远离UiO-66-NH2,并出现明显的电化学信号。基于此思路,可以对体系中靶物质的浓度进行检测。
本发明将指数扩增反应(EXPAR)被设计为将靶标识别事件转化并扩增到T7启动子中,随后T7启动子在T7 RNA聚合酶作用下作为转录扩增的触发器来生大量的crRNA。产生的crRNA与Cas12a和激活剂形成三元复合物,Cas12a非特异性切割ssDNA的能力被激活,致使与ssDNA1完全互补的ssDNA2被切割,无法形成dsDNA,使得ssDNA1无法从UiO-66-NH2的表面脱离。最终,封装的MB信号分子不能从容器UiO-66-NH2中释放。相反,由于形成的dsDNA结构的刚性导致吸附亲和力降低,ssDNA1生物门被打开,MB信号分子从容器中逸出,产生明显的电流信号。通过三重信号放大和精确的控释放系统,使本发明所述检测方法具有较高的灵敏度和选择性,良好的抗干扰能力和重复性以及可接受的实际应用潜力。
本发明所述方法不仅能够用于实现对miRNA的检测,还能用于对核酸类物质(如RNA、单链DNA)和非核酸类物质(如蛋白质、ATP等)的浓度进行检测,仅需要对EXPAR模板上与靶标物质互补的序列进行调整,使其与靶标物质的序列互补。根据靶标物质的序列,对EXPAR模板进行调整,如果检测对象是非核酸类物质,根据适配子和反义置换策略,利用非核酸类物质对双链引物/适配体之间的竞争结合,从而产生与EXPAR模板互补的序列,进而可以达到非核酸类物质的检测,具有良好的应用前景。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明所述检测方法以单链DNA1(ssDNA1)为生物门,UiO-66-NH2为容器,开发了一种新型自供crRNA介导的CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统,用于靶标物质的超灵敏检测,尤其是对miRNA的超灵敏检测。
2、本发明所述检测方法从三个主要方面保证了其出色的特异性和高灵敏性:(1)crRNA以靶反应的形式自发转录,并且由Cas12a驱动的crRNA的加工具有高度特异性,而不需要Cas12a-crRNA的预组装,使得用于miRNA检测的显著更高的信号-背景比;(2)均相电化学系统策略简化了操作步骤,降低了检测成本,同时避免了空间位阻效应,提高了识别和响应效率;(3)三重信号放大设计与精确的生物分子门控释放策略相结合,实现了对靶标物质,尤其是对miRNA-155的高灵敏度和高特异性检测。
附图说明
图1A为靶触发的EXPAR介导的转录扩增反应;图1B为MB@UiO-66-NH2的制备;图1C为用于超灵敏检测miRNA-155的CRISPR/Cas12a驱动的受控释放均相系统的原理。
图2A为UiO-66-NH2的TEM图像;图2B为MB@UiO-66-NH2的TEM图像;图2C和图2D分别为MB@UiO-66-NH2对应的EDS元素映射数据;图2E为UiO-66-NH2和MB@UiO-66-NH2的XRD图;图2F为不同纳米材料的UV-vis吸收光谱;图2G为不同纳米材料的ζ电势。
图3A为不同实验条件下的PAGE分析,其中,“+”和“-”分别表示相应组分的存在和不存在;图3B为空白组和实验组的荧光光谱;图3C为本发明所述检测方法在不同条件下的DPV响应:无靶、10fM miRNA-155、1pM miRNA-155和100pM miRNA-155。
图4A为转录扩增时间和DPV电流响应之间的关系;图4B为MB浓度和DPV电流响应之间的关系图;图4C为ssDNA1封装时间与DPV电流响应之间的关系图;图4D为Cas12a的裂解时间与DPV电流响应之间的关系图;图4E为释放时间与DPV电流响应之间的关系图。
图5A为本发明所述检测方法在不同miRNA-155浓度(0,100μM,1μM,10μM,100μM,1μM,10μM,100μM,1nM)下的DPV曲线图;图5B为DPV响应和靶miRNA-155浓度对数的线形图。
图6A为本发明所述检测方法的选择性研究,其中,a→f分别为:空白样品、10pMmiRNA-21、10pM let-7a、10pM NC、1pM miRNA-155,以及相同浓度的前述miRNA的混合物;星号代表统计学上的显著差异,**p<0.01;图6B为本发明所述检测方法的再现性;图6C为本发明所述检测方法的稳定性;图6D为检测来自LO2、MCF-7和A549细胞的miRNA-155,其中a-d分别为空白、103cell、104cell和105cell。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
一、一种基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法
本发明在研究中发现,miRNAs因其序列短小,高度同源性和低丰度的固有特性,目前对于miRNAs的准确和超灵敏检测来说,这仍然是一个巨大的挑战。最近,一些分析方法,如电化学、拉曼和荧光(FL)已被广泛用于miRNAs的检测。其中,电化学生物传感器因其操作简单、检测背景低、响应速度快、易于微型化、成本低而备受关注。但是现有用于miRNAs检测的基于电化学的方法在实际使用中存在不少缺点,例如灵敏度和特异性需要进一步提升。为了解决现有检测方法中的缺点,本发明考虑首先检测对象中的miRNAs的浓度通常相当低,需要对其进行扩增。与传统的聚合酶链反应(PCR)检测需要热循环过程相比,等温扩增可以在等温条件下进行,并且扩增效率高,为此,本发明采用指数扩增反应(EXPAR)进行等温扩增。但只是这样还不足以保证其准确性和灵敏度,需要将EXPAR与其他工具相结合。为此,考虑采用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和其相应的Cas蛋白(CRISPR)/Cas系统,将核酸扩增与CRISPR/Cas系统相结合,以求进一步提高检测的灵敏度和特异性。但是目前大多数基于CRISPR/Cas系统都需要Cas蛋白和crRNA的预组装,这会导致较高的背景信号。此外大多数基于CRISPR的电化学生物传感器需要将电化学探针固定在电极表面,这是一个复杂而耗时的操作。与均相溶液相比,固定在非均相表面上的探针的空间位阻效应将导致较差的切割效率和选择性,这对生物传感器的灵敏度和重现性是不利的。更糟糕的是,即使在均相溶液中,为了装载信号分子,往往需要进行氨基/羧基修饰,这进一步增加了传感器制作的难度。所以,本发明以单链DNA1(ssDNA1)为生物门,UiO-66-NH2为容器,开发了一种新型自供crRNA介导的CRISPR/Cas12a驱动的控释均相电化学系统,用于miRNA的超灵敏检测。首先,crRNA以靶反应的形式自发转录,并且由Cas12a驱动的crRNA的加工具有高度特异性,而不需要Cas12a-crRNA的预组装,导致用于miRNA检测的显著更高的信噪比。其次,均相电化学系统策略简化了操作步骤,降低了检测成本,同时避免了空间位阻效应,提高了识别和响应效率。最后,三重信号放大设计与精确的生物分子门控释放策略相结合,实现了对miRNA-155的高灵敏度和高特异性检测。
(1)UiO-66-NH2的制备
将ZrCl4(0.11g)和H2BDC(0.086g)溶解在50mL DMF中。此后,将10.9mL乙酸加入溶液中并超声处理25min。随后,将混合物置于100mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中,并在120℃下水热反应16小时。最后,将沉淀物离心,用DMF和甲醇洗涤,并在烘箱中于80℃真空干燥10小时。
(2)MB@UiO-66-NH2信号探针的制备
将上述(1)制备的UiO-66-NH2(3mg)分散到1mg/mL的MB溶液中,然后在室温下振荡过夜。随后,将30μL的ssDNA1(50μM)倒入上述溶液中,并摇动3小时以通过静电吸引产生ssDNA1生物门。最后,将制备的ssDNA1封端的UiO-66-NH2(MB@UiO-66-NH2)离心,用0.1M PBS缓冲液洗涤三次,并悬浮于1.0mLPBS溶液中用于进一步测试。
(3)靶标触发的EXPAR和随后的转录扩增反应
首先,2μL EXPAR模板探针(200nM)和2μL不同浓度的miRNA-155在80℃下退火5分钟。然后,将上述产物中加入2μL 10×NEB缓冲液2、2μL 10×CutSmart、1μL 25mM dNTP、1UKlenow Fragmen、2U Nb.BbvCI、crRNA-模板(500nM)、2μL 10×RNAPol反应缓冲液、10U T7RNA聚合酶和1μL 25mM NTP在37℃下混合2小时。总体积为25μL。最后,通过加80℃下加热20分钟终止反应。
(4)Cas12a/crRNA/激活剂三元复合物组装和荧光测量
通常,将9μL无酶水,2μL buffer 1、2μL activator(1μM)、2μL Cas12a(1μM)和1μLFQ报告探针(10μM)加入到4μL上述(3)转录混合物中,并在37℃孵育40分钟。之后,加入80μL的双蒸水,并使用荧光光谱仪(PerkinElmer)在490nm激发下测量荧光。
(5)CRISPR/Cas12a介导的均相电化学系统的制备
反应系统与上述(4)部分类似,除了FQ报告探针被ssDNA2(10μM)代替,并通过在95℃加热10分钟而终止。然后,将所得溶液(10μL)与10μL MB@UiO-66-NH2在37℃下孵育60分钟后并离心。最后,将上清滴在rGO改性的丝网印刷碳电极(SPCE)上进行DPV测量。:在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中记录CV和EIS。微分脉冲伏安法(DPV)在0.1M PBS(pH=7.4)中监测,相关参数如下:脉冲振幅,50mv;脉冲宽度,0.05秒;脉冲周期,0.2s。
(6)材料和设备
氧化石墨烯(GO)购自南京先锋纳米材料有限公司(中国),磷酸盐缓冲溶液(PBS)、2-氨基对苯二甲酸(H2BDC)、乙酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯化锆(ZrCl4)和亚甲蓝(MB)购自Sigma-Aldrich。Lba Cas12a,Nb.BbvCl,Klenow片段(3’→5’外显子-),T7 RNA聚合酶从中国北京的New England BioLabs获得。dNTP混合溶液、NTP混合溶液、PAGE相关试剂(丙烯/Bis 30%溶液(29∶1)、核酸染料、TBE缓冲液、TE缓冲液、DEPC处理水、上样缓冲液和DNA分子量标准Marker购自上海生工生物技术有限公司。正常人血清从Solarbio Tech有限公司(中国北京)获得。
用场发射扫描电子显微镜(FESEM,QuattroS)、透射电子显微镜(TEM,TalosF200S)、能量色散谱(EDS)、ζ电位(Brookhaven Instruments,USA)和X射线衍射(XRD,Malvern Panalytical)研究制备的样品。用LS-55荧光分光光度计(美国)检测荧光光谱。紫外-可见吸收光谱由UV-2700紫外-可见分光光度计(SHIMADZU)记录。所有电化学测量在CHI760E电化学工作站(中国上海华晨仪器有限公司)上进行。
表1本发明实施例使用的DNA序列
二、对检测原理以及结果的讨论
1、检测原理
本发明所述检测方法的原理见附图1。具有XNYNY结构的EXPAR模板探针由五个结构域组成:靶结合区(X),两个切口核酸内切酶识别位点(N),和T7启动子的两个互补序列(Y)。在靶miRNA-155与X区域杂交后,双链DNA首先在KF和Nb.BbvCI切刻酶作用下可以重复获得一定量的P和T7启动子(附图1中A方案的第1个循环)。
同时,产物P也可以用作引物,与EXPAR模板中间的Y区组装,并引发另一个循环反应(附图1中A方案的第2个循环)。结果,产生了大量T7启动子。随后,T7启动子与crRNA模板杂交形成二聚体,二聚体在T7 RNA聚合酶的作用下被转录,产生大量的crRNA。
最后,Cas12a蛋白和激活子与扩增的丰富crRNA结合产生Cas12a/crRNA/激活子三元复合物,Cas12a对ssDNA的非特异性切割能力被激活。ssDNA1通过与UiO-66-NH2的静电相互作用充当看门人,MB分子被完全封装在容器中,几乎不显示电化学信号(附图1中的B方案)。
然后,自组装的Cas12a/crRNA/activator三元复合物可以切割与ssDNA1完全互补的ssDNA2,导致dsDNA形成失败(ssDNA1/ssDNA2)。结果是,ssDNA1生物门无法离开UiO-66-NH2的表面,仅观察到微弱的MB信号。相反,在没有miRNA-155的情况下,未活化的Cas12a酶不能切割ssDNA2,后者将与ssDNA1杂交形成dsDNA。双链结构的刚性导致吸附亲和力降低,使得形成的dsDNA远离UiO-66-NH2,出现明显的电化学信号(附图1中的C方案)。
2、信号探针的表征
用透射电镜和扫描电镜对材料的微观结构进行了表征。如图2A所示,制备的具有均匀尺寸的UiO-66-NH2具有规则的八面体状形状。在将MB装载到UiO-66-NH2中并用ssDNA1封端后,所制备的ssDNA1封端的UiO-66-NH2(MB@UiO-66-NH2)的形态(图2B)与UiO-66-NH2的形态相同,除了其表面覆盖有一薄层材料,间接表明ssDNA1吸附在UiO-66-NH2的表面上。在MB@UiO-66-NH2的EDS元素图(图2C和2D)中,可以看到碳、氮、氧、磷、硫和锆均匀地分布在材料中。特别地,仅与MB相关的S元素和仅与DNA相关的P元素的存在证明了ssDNA1在UiO-66-NH2表面上的成功吸附,并通过静电相互作用形成生物门以在UiO-66-NH2中遮盖MB。
为了进一步证明ssDNA1 bio-gate的形成,进行了XRD图案、UV-vis吸收光谱和ζ电势分析来表征MB@UiO-66-NH2。从图2E中,可以观察到MB@UiO-66-NH2的XRD数据保留了所有的衍射峰,表明MB的负载和DNA的吸附对UiO-66-NH2的晶体结构没有影响。如图2F所示,664nm处的峰被认为是MB的UV-vis特征吸收峰,但是UiO-66-NH2在该范围内没有明显的吸收峰。此外,ssDNA1封端的MB-UiO-66-NH2的紫外-可见吸收峰低于MB和MB-UiO-66-NH2,表明固态DNA1能有效地将MB信号分子包裹到UiO-66-NH2中。如图2G所示,在引入阳离子染料MB后,66-NH2的ζ电位值从+20.6mV增加到+31.4mV。正如预期的那样,MB@UiO-66-NH2的电位下降到-23.25mV,表明带负电荷的ssDNA1已经吸附在UiO-66-NH2的表面上。上述结果与EDS表征一致,这表明ssDNA1可以充当生物门并有效地封装MB信号分子。
3、本发明的可行性
通过10%PAGE研究靶触发的EXPAR介导的转录扩增反应的可行性。如图3A所示,泳道1、泳道2和泳道3分别对应于靶miRNA-155、EXPAR-模板(EXPAR-T)和crRNA-模板(crRNA-T)。当KF和Nb.BbvCI存在时,靶触发的EXPAR反应产生大量28bp产物(泳道4)。接下来,在使用KF,Nb.BbvCI和T7 RNA聚合酶进行转录反应后,出现了大约43bp的条带(泳道6),表明成功合成了crRNA。此外,还可以在泳道6中观察到高分子量条带,这是由于靶、EXPAR-T、crRNA-T和产物的杂交。在对照组(泳道5和7)中,当靶不存在时,没有新的条带。以上结果表明靶触发的EXPAR介导的转录扩增反应是可行的。
随后,通过荧光光谱实验和电化学测试验证了Cas12a的反式切割活性。如图3B所示,当miRNA-155存在时,可以形成Cas12a/crRNA/激活剂的三元复合物,并且可以有效地剪切FQ报告基因,产生明显的荧光信号(曲线b)。相反,空白组(曲线a)仅显示微弱的荧光响应。为了评估所制备的用于miRNA检测的生物传感器的可行性,用不同浓度的miRNA-155进行了一系列DPV实验(图3C)。当目标不存在时,MB的DPV响应为50.66μA。然而,当目标存在时,DPV电流降低,DPV响应随着miRNA-155浓度的增加而降低(10fM,1pM和100pM)。值得注意的是,100pM miNRA-155的电流信号(15.00μA)比无靶miNRA-155的电流信号降低了3.38倍。这是因为更多的靶导致更多的Cas12a/crRNA/激活物形成,导致更少的双链DNA(ssDNA1/ssDNA2)。因此,ssDNA1 bio-gate不能离开UiO-66-NH2的表面,并且仅观察到微弱的MB信号。上述实验表明,本发明所述方法能够成功地用于miRNA检测。
4、对本发明所述方法进行优化
为了保证本发明所述方法的最佳检测性能,本发明对转录扩增时间、信号分子MB的浓度、ssDNA1对MB的封装时间,Cas12a的剪切时间以及信号分子MB的释放时间进行了优化。如图4A所示,随着转录扩增时间从30分钟到120分钟,荧光强度不断增加,当时间超过120分钟时,荧光强度下降。因此,最佳转录扩增时间为120min。如图4B所示,当MB浓度从0.25到1.0mg/ml时,DPV信号增强,并在1.0mg/ml后趋于稳定,表明MB负载量达到饱和。有效的封装时间有利于缩短实验时间。如图4C所示,DPV信号在1至2.5小时内逐渐增强。在封装时间达到2.5小时后,电化学信号没有显著增加。因此,2.5h被证明是最佳的封装时间。接下来,本发明研究了Cas12a的切割时间,如图4D所示,随着Cas12a裂解时间的增加,电流响应迅速下降。当切割时间超过40分钟时,信号趋于稳定,表明系统中少量的ssDNA1-ssDNA2复合物导致较少的信号分子释放。因此,选择40分钟作为Cas12a的最佳切割时间。此外,本发明还优化了MB的释放时间。从图4E可以看出,释放60分钟后,电流响应几乎没有变化,封闭的MB被完全释放。因此,选择60分钟作为释放时间。
5、本发明对检测miRNA-155的性能分析
在最佳实验条件下,评估了本发明所述方法用于miRNA-155检测的性能。如图5A所示,随着miRNA-155浓度的增加,MB的峰值电流下降。在100aM至1nM范围内,峰电流和靶RNA浓度的对数之间的存在良好的线性关系(图5B插图),线性拟合方程为I=5.410LogCmiRNA-155/(pM)+25.782(R2=0.992),检测限(LOD)为27.7aM(S/N=3)。与先前描述的用于检测miRNA的方法相比时,本发明所述方法在检测范围和检测极限方面相当于或优于先前的工作(表2)。
表2与其他miRNA检测方法比较
一些miRNA种类,包括miRNA-21、let-7a、非互补序列(NC),被用于评估本发明所述方法的特异性。如图6A所示,10pM miRNA-21、10pM let-7a和10pM NC的电流响应与空白样品之间没有明显的差异。在将miRNA-21(10pM)、let-7a(10pM)和NC(10pM)与靶miRNA-155(1pM)混合后,本发明所述方法的DPV响应显著降低,这与系统中仅存在1pM靶miRNA-155的信号强度一致。结果表明,本发明所述方法具有优越的特异性。此外,本发明评估了所述方法的可重复性和稳定性。从图6B中可以看出,相同处理的五个生物传感器的DPV电流强度的差异可以忽略不计,并且相对标准偏差(RSD)仅为1.1%,这表明再现性是令人满意的。如图6C所示,在9天之后,DPV电流强度可以保持接近95.8%的初始信号,表明本发明所述方法是稳定的。
6、真实样本检测
为了验证本发明所述方法的实际应用能力,将不同浓度(1pM、100fM、10fM)的miRNA-155加入到稀释20倍的人血清样品中进行加标实验。通过标准线性校准曲线对miRNA-155的浓度进行定量,并计算回收率。如表3所示,令人满意的相对标准偏差(0.49%-1.15%)和回收率(98.07%-101.05%)表明本发明所述方法具有对复杂生物样品进行灵敏分析的能力。
表3用于人血清样品中miRNA-155检测
7、结论
综上所述,本发明提供了一种基于自供crRNA介导的CRISPR/Cas12a驱动的控释均相电化学系统用于miRNA检测的方法。与传统的均相电化学策略和CRISPR/Cas策略相比,该系统巧妙地结合了两者的优势,即前者简化的操作程序和后者高效的信号放大能力。此外,智能生物分子门控释放策略的引入保证了整个检测系统的高效、准确实施。更重要的是,我们只需要简单地调整EXPAR组分中目标识别的序列,所提出的方法可以灵活地应用于其他生物标志物的高灵敏度和特异性检测。本发明所述检测方法,并不能直接用于癌症的诊断,如果需要作出癌症的诊断还需要结合临床金标准RT-PCR,穿刺、液体活检等信息加以综合判断;本发明提供的检测方法,只是作为miRNA-155过表达的中间过程的一种参考信息。
最后需要说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案,本领域的普通技术人员应当理解,那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本技术方案的宗旨和范围,均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,其特征在于,ssDNA1通过与UiO-66-NH2的静电相互作用将MB分子封装在UiO-66-NH2容器中,当存在靶标物质时,指数扩增反应将靶标识别事件转化并扩增到T7启动子中,随后T7启动子在T7 RNA聚合酶作用下作为转录扩增的触发器来生大量的crRNA;产生的crRNA与Cas12a和激活剂形成三元复合物,Cas12a非特异性切割ssDNA的能力被激活,致使与ssDNA1完全互补的ssDNA2被切割,不能形成dsDNA,导致ssDNA1生物门无法离开UiO-66-NH2的表面;当不存在靶标物质时,不能形成crRNA/Cas12a/激活剂三元复合物,ssDNA2与ssDNA1杂交形成dsDNA,形成的dsDNA结构的刚性导致吸附亲和力降低,使dsDNA远离UiO-66-NH2,此时进行DPV检测,检测后出现明显的电化学信号;当存在不同浓度的靶标物质时,利用靶标物质的浓度与DPV检测后的电化学信号之间的关系,能够检测样品中靶标物质的浓度。
2.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
步骤1:靶标触发的EXPAR和随后的转录扩增反应:
首先,将2 μL 200 nM EXPAR模板探针分别和2 μL不同浓度的靶标物质、以及待测浓度的靶标物质样品在80℃下退火5分钟,冷却至室温;然后,将2 μL 10×NEB缓冲液2、2 μL 10×CutSmart、1 μL 25 mM dNTP、1 U Klenow Fragmen、2 U Nb.BbvCI、500 nM crRNA-模板、2 μL 10×RNAPol反应缓冲液、10 U T7 RNA聚合酶、1 μL 25 mM NTP和无酶水加入退火冷却后的产物中,使其总体积为25 μL,并于37℃下进行反应30min~180min;最后,在80℃条件下加热20分钟终止反应,得到转录产物;
步骤2:Cas12a/crRNA/ activator三元复合物的自组装和荧光测量:
将9 μL无酶水,2 μL buffer 1、2 μL 1 μM activator、2μL 1 μM Cas12a和1μL 10 μMFQ报告探针加入到4 μL步骤1得到的转录产物中,并在37 ℃孵育10~60min分钟;然后,加入80 μL的双蒸水,并使用荧光光谱仪在490 nm激发下测量荧光;
步骤3:CRISPR/Cas12a介导的均相电化学系统的制备:
将9 μL无酶水,2 μL buffer 1、2 μL 1 μM activator、2μL 1 μM Cas12a和1μL 10 μMssDNA2加入到4 μL步骤1得到的转录混合物中,并在95℃条件下加热10min终止反应;然后,将终止反应后所得的10 μL溶液与10 μL MB@ UiO-66-NH2在37℃下孵育15~90min后,经离心得上清;最后,将上清溶液滴在rGO改性的丝网印刷碳电极上进行DPV测量,得到不同浓度的靶标物质所对应的DPV曲线,并获得不同浓度靶标物质与DPV曲线之间的关系式;根据所述关系式,计算得到待测浓度样品中靶标物质的浓度。
3.根据权利要求2所述基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,其特征在于,在步骤3中,所述MB@ UiO-66-NH2采用如下方法制备:
S1:将0.11 g ZrCl4和0.086 g H2BDC溶解在50 mL DMF中,再将10.9 mL 99.5%乙酸加入其中并超声处理后得到混合物;将所述混合物置于高压釜中,并在120℃条件下进行水热反应16h得到反应产物;再将反应产物中的沉淀物离心处理,并用DMF和甲醇洗涤后,80℃下真空干燥得到UiO-66-NH2;
S2:将S1制备得到的UiO-66-NH2分散到0.25~1.5mg/mL的MB溶液中,在室温条件下振荡过夜;将30μL 50μM的ssDNA1倒入其中,并摇动1.0h~3.5h后,ssDNA1通过静电引力吸附在UiO-66-NH2表面,形成生物门将MB信号分子封装在UiO-66-NH2容器内部;离心处理并与用PBS缓冲溶液洗涤三次,并重新悬浮于PBS缓冲溶液中,得到所述MB@ UiO-66-NH2。
4.根据权利要求2所述基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,其特征在于,所述靶标物质包括核酸类物质和非核酸类物质。
5.根据权利要求4所述基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,其特征在于,对EXPAR模板上与靶标物质互补的序列进行调整,使其与靶标物质的序列互补。
6.根据权利要求5所述基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,其特征在于,根据靶标物质的序列,对EXPAR模板进行调整,当靶标物质是非核酸类物质时,根据适配子和反义置换策略,利用非核酸类物质对双链引物/适配体之间的竞争结合,产生与EXPAR模板互补的序列,从而得到用于对非核酸类物质浓度进行检测的EXPAR模板。
7.根据权利要求2所述基于CRISPR/Cas12a驱动的控释均相系统用于miRNA检测的方法,其特征在于,所述检测方法能够检测浓度100 aM~1 nM范围的靶标物质。
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