CN107858338A

CN107858338A - 一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107858338A
Application number: CN201711220203.1A
Authority: CN
Inventors: 管武太; 李力浪; 吴炜坤; 邓子潇
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2037-11-29
Also published as: CN107858338B

Abstract

本发明公开了一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用。该脂肪酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2N突变脂肪酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的2S突变脂肪酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的3N突变脂肪酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的3S突变脂肪酶。本发明是以S8‑214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8‑214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8‑214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键，实现二硫键突变的组合优化；其中，在不同区域中/间组合二硫键效果更优。获得的突变脂肪酶的热稳定性强，特别适合在工业上应用。

Description

一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于酶工程领域，特别涉及一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用。

背景技术

耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)是一种优良的脂肪酶，对中长链脂肪酸甘油三酯(C12～C16)具有较高催化活性，被广泛应用于油脂水解、污水处理、食品加工、生物能源、化学合成以及胰腺缺乏症的治疗等多个领域，应用前景广泛。但该脂肪酶在高温下迅速失活，在工业生产中损失较大，因此改善其热稳定性对拓宽其实际应用具有十分重要的意义。

二硫键是蛋白质中唯一的共价键，约需要209.3～418.6kJ/mol的能量才能将其打断，对维持蛋白质的结构和功能具有关键的作用。二硫键增强蛋白质的结构稳定性表现在减少其构象熵，及增加其解折叠自由能，提高热力学稳定性。同时，其效应还与提高蛋白质的动力学稳定性有关。二硫键能使肽链不同区域的氨基酸残基聚集靠拢，形成高密度的氨基酸残基稳定结构。当围绕二硫键的残基为疏水氨基酸时，则形成局部的疏水中心，减少水分子的进入，防止氢键被破坏，保持高级结构的稳定。在蛋白质中构建二硫键是提高其稳定性的主要策略之一，已经成功地应用于多种脂肪酶，如圆弧青霉低温脂肪酶，南极假丝酵母脂肪酶和华根霉脂肪酶等。本实验室前期研究已筛选出能提高Lip2耐热性能的单对二硫键突变位点，S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和 S118-177。

二硫键的正确形成是蛋白质折叠的限速步骤之一，控制引入的二硫键数目非常必要。因此，在引入一定数目的二硫键时，合理地进行组合才能最大限度地提高酶分子的热稳定性能，但目前并欠缺对二硫键组合方式和组合效果的探讨。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，有针对性地进行了二硫键突变的组合优化，并提供4种组合二硫键的耐热突变脂肪酶。

本发明的另一目的在于提供所述组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法。

本发明的又一目的在于提供所述组合二硫键的耐热突变脂肪酶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶，是以S8-214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8-214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8-214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键；

所述的S8-214脂肪酶为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2二硫键突变体S8-214，具体为：在耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的解折叠和湿熔球态形成的关键区域(耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列)引入二硫键突变，其制备方法参考中国专利申请201610279266.3“一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用”。

所述的区域为β折叠头部区域，盖子1区域和β折叠尾部区域；其中，所述的 β折叠头部区域为S8-214脂肪酶的第32位到第82位氨基酸序列；所述的盖子1区域为S8-214脂肪酶的第83位到第136位氨基酸序列；所述的β折叠尾部区域为S8-214 脂肪酶的第1位到第11位氨基酸及第180位到第280位氨基酸；

所述的引入的二硫键包括二硫键S2-210(突变第2位和第210位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S14-216(突变第14位和第216位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S60-69(突变第60位和第69位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键) 和S122-196(突变第122位和第196位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)；其中，所述的效果提升较强的二硫键为二硫键S2-210或S14-216；所述的效果提升较弱的二硫键为二硫键S60-69或S122-196，其效果由强到弱的顺序分别为：S2-210、 S60-69、S14-216、S122-196。

所述的二硫键S60-69位于β折叠头部区域，二硫键S122-196位于盖子1区域和 β折叠头部区域之间，二硫键S8-214，S2-210，S14-216位于β折叠尾部区域。

所述的组合二硫键为二硫键S8-214、S2-210(2N)，二硫键S8-214、S2-210、 S14-216(3N)，二硫键S8-214、S60-69(2S)或二硫键S8-214、S60-69、S122-196 (3S)。

所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶为2N突变脂肪酶、2S突变脂肪酶、3N 突变脂肪酶或3S突变脂肪酶；其中，在与二硫键S8-214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键的脂肪酶为2S突变脂肪酶或3S突变脂肪酶，在与二硫键S8-214所在的同一区域同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键的脂肪酶为2N突变脂肪酶或3N突变脂肪酶；其中，在二硫键S8-214所在的1 个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，其效果更优。

2N突变脂肪酶的氨基酸序列如下：

VCTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAVDHASKQ IYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTG HSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQECPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDG YQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；

2S突变脂肪酶的氨基酸序列如下：

VYTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQ IYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTG HSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDG YQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；

3N突变脂肪酶的氨基酸序列如下：

VCTSTETCHIDQECYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAVDHASKQ IYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTG HSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQECPDVCKCSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDG YQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；

3S突变脂肪酶的氨基酸序列如下：

VYTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQ IYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTG HSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQENPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDG YQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI。

编码所述组合二硫键的耐热突变脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：

2N突变脂肪酶的核苷酸序列如下：

gtgtgtacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacat tggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttg agctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcag atctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaa ctttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctaca acaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggt cactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactct tggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtct gtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggt taccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccaggg ccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcg tcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；

2S突变脂肪酶的核苷酸序列如下：

gtgtacacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacat tggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttg agctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcag atctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaa ctttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctaca acaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggt cactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactct tggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagaaccccgatgtct gtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggt taccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccaggg ccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcg tcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；

3N突变脂肪酶的核苷酸序列如下：

gtgtgtacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtgttacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacat tggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttg agctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcag atctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaa ctttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctaca acaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggt cactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactct tggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtct gtaagtgttccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggt taccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccaggg ccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcg tcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；

3S突变脂肪酶的核苷酸序列如下：

gtgtacacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacat tggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttg agctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcag atctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaa ctttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctaca acaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggt cactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactct tggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagaaccccgatgtct gtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggt taccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccaggg ccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcg tcaccgagggtgtctgtggtatctaataa。

所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将二硫键进行区域组合，通过反向PCR突变，将所选出的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序；

(2)将测序正确的突变质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母X33中，得到对应的突变工程菌；

(3)将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩增繁殖培养后，转接至 BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；

(4)使用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的脂肪酶，即为组合二硫键的耐热突变脂肪酶。

步骤(1)中所述的二硫键包括二硫键S2-210、S14-216、S60-69和S122-196。

步骤(1)中所述的区域分别为β折叠头部区域(第32位到第82位氨基酸)，盖子1区域(第83位到第136位氨基酸)和β折叠尾部区域(第1位到第11位氨基酸及第180位到第280位氨基酸)。

步骤(1)中所述的将二硫键进行区域组合，其组合方法为：以S8-214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8-214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8-214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键；其中，所述的效果提升较强的二硫键为二硫键S2-210或 S14-216；所述的效果提升较弱的二硫键为二硫键S60-69或S122-196，其效果由强到弱的顺序分别为：S2-210、S60-69、S14-216、S122-196。

步骤(1)中所述的大肠杆菌工程菌优选为大肠杆菌TOP10。

步骤(2)中所述的得到对应的突变工程菌还包括进一步通过Zeocin(博来霉素)抗性平板筛选的步骤。

步骤(3)中所述的培养的条件优选为摇瓶培养96小时。

步骤(4)中所述的获取纯化后的脂肪酶后，还包括如下步骤：

(5)通过DSF荧光检测测定突变脂肪酶的熔解温度(T_m)；

(6)通过p-NPP比色法测定突变脂肪酶的热稳定性指标：15min半失活温度(T₅₀)、55或60℃下的半衰期(t_1/2)。

所述组合二硫键的耐热突变脂肪酶稳定性强，特别适合在工业上进行应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明通过在脂肪酶不同区域中实现二硫键突变的组合优化，脂肪酶的稳定性获得了显著的提升，由于充分地考虑了区域效应，不同区域的突变组合具有明显的叠加效果，能为其他蛋白质的二硫键组合或单二硫键的筛选提供思路。

(1)①本发明在脂肪酶突变体S8-214的β折叠尾部区域(第1位到第11 位氨基酸及第180位到第280位氨基酸)中引入效果提升较强的二硫键，获得突变脂肪酶2N(组合二硫键S2-210)和3N(组合二硫键S2-210、S14-216)；

②在脂肪酶突变体S8-214的β折叠头部区域(第32位到第82位氨基酸) 引入效果提升较弱的二硫键，获得突变脂肪酶2S(组合二硫键S60-69)；

③在脂肪酶突变体S8-214的β折叠头部区域(第32位到第82位氨基酸) 和盖子1区域(第83位到第136位氨基酸)中同时引入效果提升较弱的二硫键，获得突变脂肪酶3S(组合二硫键S60-69和S122-196)。

(2)亲本脂肪酶S8-214、2N、2S、3N和3S的T_m值分别为55.82、59.37、 60.75、63.27和62.76℃，T₅₀分别为51.22、57.78、59.04、59.95和63.85。S8-214、 2N和2S的55℃半衰期分别为19.11、44.43和94.95min，3N和3S的60℃半衰期分别为25.75和72.96min。突变体的热稳定性均比亲本型大幅度提高，而 2S的55℃半衰期为2N的2.14倍，3S的60℃半衰期为3N的2.85倍。

综上所述组合二硫键均大幅度改善了脂肪酶的热稳定性，而与在同区域引入效果提升较强的二硫键对比，在不同区域中引入效果提升较弱的二硫键其热稳定组合效果更明显。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

材料与试剂：pPICZαA-Lip2毕赤酵母表达载体由上海金斯瑞生物公司全基因合成与构建；质粒提取试剂盒购自Omega贸易有限公司，KOD-PLUS突变试剂盒购自东洋纺公司，Protein Thermal Shift筛选试剂盒购自Thermo公司；TOP10 大肠杆菌感受态细胞购自天根生物公司，突变引物由上海生工生物工程公司合成；PmeⅠ限制性内切酶购自NewEngland Biolabs公司；PCR产物纯化回收试剂盒购自大连宝生物公司；电转仪购自Bio-Rad公司；LLB、LLB+Zeocin、YPD、 BMGY、BMMY培养基均按照Invitrogen毕赤酵母表达试剂盒操作手册配制，镍柱纯化试剂盒购自上海生工生物工程公司，其余试剂均为国内外购买的分析纯级别。

实施例1突变脂肪酶表达质粒的构建

以表1中的模板和引物进行突变，获得4段突变氨基酸。

4段氨基酸序列如下所示：

2N突变脂肪酶的氨基酸序列如下：

2S突变脂肪酶的氨基酸序列如下：

3N突变脂肪酶的氨基酸序列如下：

3S突变脂肪酶的氨基酸序列如下：

编码所述组合二硫键的耐热脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：

2N突变脂肪酶的核苷酸序列如下：

2S突变脂肪酶的核苷酸序列如下：

3N突变脂肪酶的核苷酸序列如下：

3S突变脂肪酶的核苷酸序列如下：

表1中模板S2-210和S8-214均为实验室前期以pPICZαA-Lip2为模板进行突变构建(构建方法参考中国专利申请201610279266.3“一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用”)。每引入一对二硫键需要进行两次反向PCR。以S2-210(引物为 210+8C-F和210+8C-R)，以S8-214为模板(引物为60C-F和60C-R)进行反向突变PCR，得到2N和2S的第一次扩增引物。

表1突变引物汇总

注：表格中下划线粗斜体字母表示引入半胱氨酸突变

PCR扩增条件为：94℃2min；94℃10s、66℃30s、68℃5min，10个循环。反应体系如下表2所示。

表2 PCR反应体系

上游引物(10μM)	1.5μL
		下游引物(10μM)	1.5μL
KOD-Plus高保真酶	1μL
		模板(50ng/μL)	1μL
双蒸水	35μL
		5×SmartPCR buffer	5μL
5×dNTP(2M)	5μL
		总体系	50μL

扩增产物以DnpⅠ酶消化模板，在琼脂糖凝胶电泳检测突变条带大小后，用 T4连接酶连接环化过夜，随后使用热激法将突变质粒转入TOP10大肠杆菌感受态细胞，并涂布于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/mL)平板37℃过夜培养，挑选阳性转化子进行质粒的测序。

将测序正确的阳性转化子于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/mL)液体培养基过夜扩培后，提取质粒。以质粒为模板，分别以表1的210+214C-F和 210+214C-R、69C-F和69C-R为引物进行第二次反向突变PCR，得到2N和2S 的第二次扩增引物。

扩增产物以DnpⅠ酶消化模板，在琼脂糖凝胶电泳检测突变条带大小后，用 T4连接酶连接环化过夜，随后使用热激法将突变质粒转入TOP10大肠杆菌感受态细胞，并涂布于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/mL)平板，于37℃过夜培养，挑选阳性转化子进行质粒的提取与测序。完成2N和2S的突变后，以同样的方法构建3N和3S。

实施例2：线性化质粒电转化毕赤酵母、转化子筛选与产酶筛选

将测序正确的阳性转化子于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/mL)液体培养基过夜扩培后，提取质粒，以PmeⅠ线性化处理并纯化回收，以总量为5μg的质粒线性化产物与感受态X33毕赤酵母混合电击转化。感受态毕赤酵母的制备参照Invitrogen公司操作手册。电转程序按照Bio-Rad公司推荐参数设置。

电转完毕立刻加入1mL 1mol/L山梨醇溶液，将菌液在30℃孵育复苏1小时后，均匀涂布于YPDS+Zeocin(Zeocin浓度为200μg/ml)抗性平板上筛选，挑选单菌落获得突变工程菌株。

实施例3：工程菌摇床发酵

参考Invitrogen公司毕赤酵母表达试剂盒操作手册并稍作修改，修改内容如下：把工程菌株单菌落接种到2mL YPDS-Zeocin(Zeocin浓度为200μg/mL)液体培养基中进行纯化培养过夜，离心将细胞以BMGY液体培养基重悬并过夜培养，再接种至30mL BMMY液体培养基，以25℃、300r/min培养96小时，每天补充甲醇300uL。

实施例4：脂肪酶的分离和纯化

1)超滤浓缩

将100mL发酵液于4℃、5000r/min离心5分钟后吸取上清液，并用10kDa 超滤管于5000r/min 4℃离心50min，收集浓缩酶液。

2)一步法镍柱纯化

①用5mL的含咪唑10mM的Binding Buffer平衡镍柱，充分除去残留的乙醇；

②浓缩酶液与含咪唑120mM的Binding Buffer按照1:1比例混合后添加至镍柱中结合；

③用15mL含咪唑60mM的Washing buffer充分洗脱杂蛋白；

④用15mL含咪唑300mM的Elution Buffer洗脱目标蛋白；

⑤纯化酶液按照上述条件超滤浓缩；

得到纯化的脂肪酶，最后以还原性SDS-PAGE垂直电泳检测酶纯度。结果显示所有蛋白纯度均在90％以上。

实施例5：突变脂肪酶的T_m测定

利用荧光定量PCR仪，按照Protein Thermal Shift试剂盒推荐反应程序测定突变脂肪酶的T_m值，结果如表3所示，突变脂肪酶的T_m值均获得较大幅度的提升，而不同区域中组合较弱的二硫键与在同一区域中组合较弱二硫键相似。

表3 T_m测定结果

脂肪酶	T_m	ΔT_m
			S8-214	55.82±0.14	-
2N	59.37±0.05	3.55
			2S	60.75±0.07	4.93
3N	63.27±0.06	7.45
			3S	62.76±0.11	6.94

实施例6：突变脂肪酶热稳定性质和催化性质的测定。

T₅₀测定方法：以0.1mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中精确保温15min，以 50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液为反应体系(pH＝7.50)，精确反应 10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应5min，在20％(w/v)的碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度保温后，脂肪酶残余的相对酶活。

t_1/2测定方法：以0.1mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中55或60℃精确保温0、 5、10、15、30、45、60min，以50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液为反应体系(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应，20％(w/v)碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度保温后，脂肪酶残余的相对酶活。

以上结果如表4所示:

表4热稳定性测定结果

	T₅₀(℃)	t_1/2(min)
			S8-214^a	51.22±0.31	19.11
2N^a	57.78±0.40	44.43
			2S^a	59.04±0.07	94.95
3N^b	59.95±0.08	25.57
			3S^b	63.85±0.34	72.96

表中a表示半衰期测定温度为55℃，b表示半衰期测定温度为60℃。

突变脂肪酶的热稳定性均大幅度提升，其中不同区域中组合效果提升较弱二硫键的T₅₀值和半衰期均优于同区域中组合效果提升较强二硫键。与突变脂肪酶 2N相比，2S的T₅₀值提高1.26℃，55℃半衰期提高1.14倍；与突变脂肪酶3N相比，3S的T₅₀值提高3.9℃，60℃半衰期提高1.85倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2N突变脂肪酶

<400> 1

Val Cys Thr Ser Thr Glu Thr Cys His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn

1 5 10 15

Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly

20 25 30

Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala

35 40 45

His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg Leu

50 55 60

Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr

85 90 95

Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala

100 105 110

Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn Gly

115 120 125

Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu

130 135 140

Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly

145 150 155 160

His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys

165 170 175

Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val

180 185 190

Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln

195 200 205

Glu Cys Pro Asp Val Cys Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg

210 215 220

Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly

225 230 235 240

Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His

245 250 255

Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln

260 265 270

Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn

275 280 285

His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile

290 295 300

<210> 2

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2S突变脂肪酶

<400> 2

Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Cys His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn

1 5 10 15

Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly

20 25 30

Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala

35 40 45

His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe Cys Asp Pro Arg Leu

50 55 60

Ile Phe Asp Val Cys Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr

85 90 95

Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala

100 105 110

Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn Gly

115 120 125

Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu

130 135 140

Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly

145 150 155 160

His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys

165 170 175

Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val

180 185 190

Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln

195 200 205

Glu Asn Pro Asp Val Cys Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg

210 215 220

Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly

225 230 235 240

Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His

245 250 255

Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln

260 265 270

Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn

275 280 285

His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile

290 295 300

<210> 3

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3N突变脂肪酶

<400> 3

Val Cys Thr Ser Thr Glu Thr Cys His Ile Asp Gln Glu Cys Tyr Asn

1 5 10 15

Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly

20 25 30

Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala

35 40 45

His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg Leu

50 55 60

Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr

85 90 95

Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala

100 105 110

Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn Gly

115 120 125

Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu

130 135 140

Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly

145 150 155 160

His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys

165 170 175

Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val

180 185 190

Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln

195 200 205

Glu Cys Pro Asp Val Cys Lys Cys Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg

210 215 220

Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly

225 230 235 240

Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His

245 250 255

Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln

260 265 270

Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn

275 280 285

His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile

290 295 300

<210> 4

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3S突变脂肪酶

<400> 4

Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Cys His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn

1 5 10 15

Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly

20 25 30

Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala

35 40 45

His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe Cys Asp Pro Arg Leu

50 55 60

Ile Phe Asp Val Cys Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr

85 90 95

Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala

100 105 110

Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Cys Cys Leu Val His Asn Gly

115 120 125

Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu

130 135 140

Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly

145 150 155 160

His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys

165 170 175

Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val

180 185 190

Gly Asn Ala Cys Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln

195 200 205

Glu Asn Pro Asp Val Cys Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg

210 215 220

Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly

225 230 235 240

Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His

245 250 255

Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln

260 265 270

Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn

275 280 285

His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile

290 295 300

<210> 5

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2N突变脂肪酶的核苷酸序列

<400> 5

gtgtgtacct ctaccgagac ctgtcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60

tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120

ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttccac 180

gacccccgtc tcatctttga tgtttctggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240

atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300

atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt 360

gatgactgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420

ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480

cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540

gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgctggctt tgctaactgg 600

gtcgataaac tcttctttgg ccaggagtgt cccgatgtct gtaaggtgtc caaagaccga 660

aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720

taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780

aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840

cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900

atctaataa 909

<210> 6

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2S突变脂肪酶的核苷酸序列

<400> 6

gtgtacacct ctaccgagac ctgtcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60

tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120

ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttctgt 180

gacccccgtc tcatctttga tgtttgtggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240

atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300

atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt 360

gatgactgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420

ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480

cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540

gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgctggctt tgctaactgg 600

gtcgataaac tcttctttgg ccaggagaac cccgatgtct gtaaggtgtc caaagaccga 660

aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720

taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780

aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840

cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900

atctaataa 909

<210> 7

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3N突变脂肪酶的核苷酸序列

<400> 7

gtgtgtacct ctaccgagac ctgtcacatt gaccaggagt gttacaactt ctttgagaag 60

tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120

ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttccac 180

gacccccgtc tcatctttga tgtttctggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240

atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300

atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt 360

gatgactgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420

ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480

cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540

gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgctggctt tgctaactgg 600

gtcgataaac tcttctttgg ccaggagtgt cccgatgtct gtaagtgttc caaagaccga 660

aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720

taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780

aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840

cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900

atctaataa 909

<210> 8

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3S突变脂肪酶的核苷酸序列

<400> 8

gtgtacacct ctaccgagac ctgtcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60

tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120

ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttctgt 180

gacccccgtc tcatctttga tgtttgtggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240

atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300

atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt 360

gattgttgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420

ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480

cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540

gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgcttgttt tgctaactgg 600

gtcgataaac tcttctttgg ccaggagaac cccgatgtct gtaaggtgtc caaagaccga 660

aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720

taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780

aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840

cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900

atctaataa 909

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 210+8C-F

<400> 9

tgtcacattg accaggagtc ctacaacttc 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 210+8C-R

<400> 10

ggtctcggta gaggtacaca catggtgatg 30

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 210+214C-F

<400> 11

tgtaaggtgt ccaaagaccg aaagctcta 29

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 210+214C-R

<400> 12

gacatcggga cactcctggc ca 22

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 60C-F

<400> 13

tgtgaccccc gtctcatctt tgatgt 26

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 60C-R

<400> 14

gaactcctcg atgagctcaa cgttgg 26

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 69C-F

<400> 15

tgtggttacc tcgctgttga tcatgc 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 69C-R

<400> 16

aacatcaaag atgagacggg ggtcac 26

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 210+214+14C-F

<400> 17

tacaacttct ttgagaagta cgcccgactc 30

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 210+214+14C-R

<400> 18

acactcctgg tcaatgtgac aggtctcg 28

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 210+214+216C-F

<400> 19

ccgaatcacc caccgaggag atatc 25

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 210+214+216C-R

<400> 20

tagagctttc ggtctttgga acacttacag 30

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 122C-F

<400> 21

tgttgtcttg tccacaatgg cttcatc 27

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 122C-R

<400> 22

atcacaagta gcagtagaag agatgttagc agc 33

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 196C-F

<400> 23

tttgctaact gggtcgataa actcttcttt g 31

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 196C-R

<400> 24

acaagcgtta ccgacaatgg gctg 24

Claims

1.一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶，其特征在于：是以S8-214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8-214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8-214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键；

所述的区域为β折叠头部区域，盖子1区域和β折叠尾部区域；其中，所述的β折叠头部区域为S8-214脂肪酶的第32位到第82位氨基酸序列；所述的盖子1区域为S8-214脂肪酶的第83位到第136位氨基酸序列；所述的β折叠尾部区域为S8-214脂肪酶的第1位到第11位氨基酸及第180位到第280位氨基酸；

所述的效果提升较强的二硫键为二硫键S2-210或S14-216；

所述的效果提升较弱的二硫键为二硫键S60-69或S122-196。

2.根据权利要求1所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶，其特征在于：所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶为2N突变脂肪酶、2S突变脂肪酶、3N突变脂肪酶或3S突变脂肪酶；

2N突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2S突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3N突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

3S突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.编码权利要求2所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于：

所述的2N突变脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的2S突变脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述的3N突变脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述的3S突变脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.权利要求1所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(3)将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩增繁殖培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；

(4)使用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的组合二硫键的耐热突变脂肪酶。

5.根据权利要求4所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的将二硫键进行区域组合的方法为：以S8-214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8-214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8-214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键；其中，所述的效果提升较强的二硫键为二硫键S2-210或S14-216；所述的效果提升较弱的二硫键为二硫键S60-69或S122-196。

6.根据权利要求4所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的得到对应的突变工程菌还包括进一步通过博来霉素抗性平板筛选的步骤。

7.根据权利要求4所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的获取纯化后的脂肪酶后，还包括如下步骤：

(5)通过DSF荧光检测测定突变脂肪酶的熔解温度；

(6)通过p-NPP比色法测定突变脂肪酶的热稳定性指标：15min半失活温度、55或60℃下的半衰期。

8.权利要求1所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶在工业中的应用。