WO2020239064A1 - 一种热稳定性葡萄糖氧化酶 - Google Patents

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aspergillus niger
amino acid
thermostable
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郑斐
严婷
朱继东
徐红
孙艳
白挨玺
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南京百斯杰生物工程有限公司
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    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)

Definitions

  • Glucose oxidase (GOD, E.C 1.1.3.4) is an aerobic dehydrogenase.
  • the enzyme molecule is a dimer and contains two subunits with a molecular weight of about 160kDa. Each subunit binds a FAD molecule. It can use molecular oxygen as an electron acceptor to specifically catalyze ⁇ -D-glucose to produce gluconic acid and hydrogen peroxide.
  • GOD is widely distributed in animals, plants and microorganisms. There are certain limitations in extracting GOD from animal and plant tissues, and the amount of enzyme is not abundant, and bacterial GOD produces little enzyme. Microbial fermentation is the main source of GOD production. At present, most of the commercial products on the market are fermented by Pichia pastoris and filamentous fungi, such as Aspergillus niger and Aspergillus oryzae.
  • glucose oxidase Due to its catalytic specificity and high efficiency, glucose oxidase has been widely used in food, chemical, pharmaceutical, agriculture, feed and other fields. In recent years, it has attracted much attention and the market demand is also increasing. Due to the deoxygenation and anti-oxidation effects of glucose oxidase, it is widely used in food, medicine, and feed. In the food industry, glucose oxidase, as a food preservative, has significant effects in preventing beer aging, maintaining the original flavor of the product, and extending the shelf life. It can also be used as a flour improver and bread quality improver to improve food quality.
  • glucose oxidase electrode method and the glucose oxidase-peroxidase coupling method are commonly used to detect the glucose content in blood and serum.
  • glucose oxidase can improve animal intestinal environment, increase feed utilization rate, and promote animal growth.
  • the industry, especially the feed industry has higher and higher requirements for its existing performance, such as keeping the enzyme activity at room temperature for a long time without decreasing, It is resistant to heat and extreme pH conditions and to digestive enzymes.
  • the thermal stability of the enzyme is very important for the application of glucose oxidase. During the preparation of the enzyme and under extreme reaction conditions (high temperature), enzymes with strong heat resistance have a greater advantage. Therefore, improving the thermal stability of glucose oxidase has important practical significance for the wide promotion and application of glucose oxidase.
  • the inventors found that the wild-type glucose oxidase sequence of Aspergillus niger shown in SEQ ID NO: 1 or the Aspergillus niger glucose oxidase mutant shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 Introducing one or more pairs of disulfide bond combinations as shown in Table 1 can improve its thermal stability.
  • Table 1 The name and position of the introduced disulfide bond (the amino acid position number is based on SEQ ID NO:1)
  • the mutant Aspergillus niger glucose oxidase has a mutation in at least one of the following positions compared to the wild-type Aspergillus niger shown in SEQ ID NO:1: 14, 16, 25 , 30, 34, 37, 43, 45, 53, 67, 84, 90, 92, 94, 96, 106, 121, 135, 141, 142, 162, 167, 204, 246, 259, 315, 332, 362 , 405, 406, 420, 446, 449, 453, 477, 501, 504, 506, 509, 510, 521, 526, 528, 536, 554, 560, 572, 575, 577.
  • the mutant Aspergillus niger glucose oxidase has at least one of the following mutations compared with the wild-type Aspergillus niger shown in SEQ ID NO:1: D14E, S16A, A25V, T30V, T34V , R37K, N43D, S45T, S53C, A67Y, E84C, Q90R, A92Q, I94V, S96F, V106I, S121A, N135S, L141K, Q142K, A162T, V167I, F204L, T246C, G259A, D315K, A332S, S362T, N405 , V420E, H446R, A449M, Q453N, S477Y, S501R, T504V, Y506W, Y509E, H510N, C521A, K526R, M528L, A536L, T554
  • the mutant Aspergillus niger glucose oxidase has a mutation in at least one of the following positions compared with the wild-type Aspergillus niger shown in SEQ ID NO:1: 14, 16, 30 , 34, 37, 43, 45, 53, 67, 84, 90, 94, 106, 135, 162, 167, 204, 246, 259, 315, 332, 362, 405, 406, 420, 446, 501, 504 , 509, 510, 554, 572, 575, 577.
  • the mutant Aspergillus niger glucose oxidase has at least one of the following mutations compared with the wild-type Aspergillus niger shown in SEQ ID NO:1: D14E, S16A, T30V, T34V, R37K , N43D, S45T, S53C, A67Y, E84C, Q90R, I94V, V106I, N135S, A162T, V167I, F204L, T246C, G259A, D315K, A332S, S362T, N405K, H406D, V420E, H446R, S501E, T,504V, Y509E , T554M, S572A, I575V, E577A.
  • the mutant Aspergillus niger glucose oxidase has a mutation in at least one of the following positions compared with the wild-type Aspergillus niger shown in SEQ ID NO:1: 14, 30, 37 , 43, 45, 53, 67, 84, 90, 94, 106, 135, 162, 167, 204, 246, 259, 315, 406, 420, 446, 501, 509, 572, 577.
  • the mutant Aspergillus niger glucose oxidase has at least one of the following mutations compared with the wild-type Aspergillus niger shown in SEQ ID NO:1: D14E, T30V, R37K, N43D, S45T , S53C, A67Y, E84C, Q90R, I94V, V106I, N135S, A162T, V167I, F204L, T246C, G259A, D315K, H406D, V420E, H446R, S501R, Y509E, S572A, E577A.
  • the mutant Aspergillus niger glucose oxidase has a mutation in at least one of the following positions compared with the wild-type Aspergillus niger shown in SEQ ID NO:1: 14, 30, 37 , 43, 53, 67, 84, 90, 94, 106, 135, 162, 204, 246, 315, 446, 501, 509, 554.
  • the mutant Aspergillus niger glucose oxidase has at least one of the following mutations compared with the wild-type Aspergillus niger shown in SEQ ID NO:1: D14E, T30V, R37K, N43D, S53C , A67Y, E84C, Q90R, I94V, V106I, N135S, A162T, F204L, T246C, D315K, H446R, S501R, Y509E, T554M.
  • the amino acid sequence of the mutant Aspergillus niger glucose oxidase is SEQ ID NO. 8 or SEQ ID NO. 10.
  • thermostable glucose oxidase amino acid sequence satisfies at least one of the above items (A), (B), (C) or (E).
  • the amino acid sequence of the thermostable glucose oxidase satisfies the above item (A), (B) or (C).
  • the amino acid sequence of the thermostable glucose oxidase satisfies the above item (A).
  • the amino acid sequence of the thermostable glucose oxidase satisfies the above item (B).
  • the amino acid sequence of the thermostable glucose oxidase satisfies the above item (C).
  • thermostable glucose oxidase comprises any amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11-15, 17, 19, 21 or 23.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide that encodes the thermostable glucose oxidase.
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NO: 3-7, 16, 18, 20 or 22.
  • Another object of the present invention is to provide a host cell, which contains the polynucleotide encoding the thermostable glucose oxidase.
  • the host cell is a fungal cell, a bacterial cell or a plant cell.
  • the host cell is a yeast cell or a filamentous fungal cell.
  • the host cell is a Pichia pastoris cell or an Aspergillus niger cell.
  • Another object of the present invention is to provide the application of the thermostable glucose oxidase in the fields of food, chemical industry, medicine, agriculture or feed.
  • glucose oxidase mutant refers to one or more glucose oxidase activity contained in one or more (several) positions
  • One (several) changes in amino acid residues namely substitutions, insertions and/or deletions.
  • Substitution refers to replacing the amino acid occupying a certain position with a different amino acid
  • deletion refers to removing the amino acid occupying a certain position
  • insertion refers to adding 1-5 amino acids adjacent to the amino acid occupying a certain position and afterwards.
  • Mutation of wild-type glucose oxidase also refers to the substitution, insertion and/or deletion of amino acids in at least one position compared to wild-type glucose oxidase, preferably, the substitution of amino acids in at least one position , Such as "T30V", that is, the threonine at position 30 of wild-type glucose oxidase is replaced with valine.
  • thermo stability refers to the glucose oxidase mutant of the present invention that still maintains a certain amount of enzyme activity after a given period of time at a specific temperature.
  • increased thermostability means that after a period of time, the enzyme activity is higher compared to other glucose oxidase variants and/or wild-type glucose oxidase.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably and refer to a polymerized form of nucleotides of any length, whether ribonucleotides or deoxyribonucleotides. Such terms include, but are not limited to, single-stranded, double-stranded or triple-stranded DNA, genomic DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA hybrids or containing purine and pyrimidine bases, or other natural, chemical, or biochemically modified, unnatural Or a polymer of derivatized nucleotide bases.
  • vector refers to a polynucleotide construct designed to introduce nucleic acid into one or more cell types.
  • Vectors include cloning vectors, expression vectors, shuttle vectors, plasmids, cassettes, etc.
  • the term "gene” refers to a polynucleotide encoding a polypeptide, including regions before and after the coding region, and intervening sequences (introns) located between individual coding segments (exons).
  • percent (%) sequence identity is defined as after comparing sequences and introducing gaps when necessary to obtain the maximum percent sequence identity, without considering any conservative substitutions as part of the sequence identity, candidates The percentage of amino acid residues in the sequence that are identical to the amino acid residues in the specific peptide or polypeptide sequence. Sequence comparisons can be performed in a variety of ways within the skill of the art to determine percent amino acid sequence identity, for example, using publicly available computer software, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine the appropriate parameters for measuring the comparison, including any algorithm required to obtain the maximum comparison over the entire length of the sequence being compared.
  • the term "host cell” refers to a host suitable for an expression vector containing the DNA according to the present invention.
  • the present invention introduces one or more pairs of disulfide bonds to wild-type glucose oxidase, and after treatment at 70°C for 3 minutes, compared with wild-type glucose oxidase, its thermal stability has been significantly improved, preferably glucose oxidation
  • the enzyme activity of the enzyme mutant is increased by more than 70%, more preferably the enzyme activity of the glucose oxidase mutant is increased by more than 120%, and particularly preferably the enzyme activity of the glucose oxidase mutant is increased by 180%.
  • the present invention introduces one or more pairs of disulfide bonds to the glucose oxidase mutant.
  • Figure 1 is a plasmid map of pPIC9K-GOD-wt.
  • Table 2 The name and position of the introduced disulfide bond (the amino acid position number is based on SEQ ID NO:1)
  • the Pichia pastoris GS115 strain was cultured using YPD (1% yeast extract, 2% protein, 2% glucose, and 1.5% agar) on a plate at 30°C for 48 hours, and then a single clone was picked into 4 mL YPD liquid medium (1 % Yeast extract, 2% protein, 2% glucose), cultured at 30°C at 200rpm for 12h, then transferred to a 30mLYPD liquid medium in an Erlenmeyer flask, incubated at 30°C, 220rpm for 4-5h, the OD 600 value was detected at 1.1 After the range of –1.3, centrifuge the culture solution at 4 degrees 9,000 rpm for 2 minutes, and collect 4 mL of bacteria into a sterilized EP tube.
  • YPD 1% yeast extract, 2% protein, 2% glucose, and 1.5% agar
  • GOD catalyzes the dehydrogenation of glucose to produce H 2 O 2.
  • H 2 O 2 glucose
  • POD horseradish peroxidase
  • DH2 oxygen donor o-di(di)anisidine
  • the activity of GOD can be converted.
  • disodium hydrogen phosphate-sodium citrate buffer accurately weigh 14.32g disodium hydrogen phosphate, 8.4056g citric acid monohydrate, dissolve in 400ml distilled water, adjust the pH to 5.5 with disodium hydrogen phosphate ,spare.
  • O-dianisidine solution accurately weigh 0.1g of o-dianisidine and dissolve it in 10ml of methanol. This is the storage solution and can be effectively stored at 4°C for 3 days. Before the experiment, take 0.1ml of the storage solution and dissolve it in 12ml 0.1mol/L of the above-mentioned phosphate buffer with pH 5.5 to obtain.
  • H 2mol/L H 2 SO 4 Weigh 40.00g of H 2 SO 4 accurately, slowly add 160mL of distilled water, and dilute to 200mL for use.
  • Example 5 Determination of thermal stability of glucose oxidase mutants derived from other Aspergillus niger after introducing disulfide bonds
  • SEQ ID NO: 9 The sequence of other wild-type glucose oxidase derived from Aspergillus niger is shown in SEQ ID NO: 9, and the similarity with SEQ ID NO: 1 is 97%.
  • This wild-type glucose oxidase derived from different Aspergillus niger is a mutant with excellent heat resistance obtained by mutation screening (as described in CN 108893453), which introduces 5 mutations on the basis of wild-type to obtain GOD-M5, the specific sequence is shown in SEQ ID NO: 10 shows.
  • the disulfide bond mutants described in Example 1 can also function on glucose oxidase mutants derived from different Aspergillus niger, and further improve the thermal stability.

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Abstract

提供了一种通过在野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶或突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中引入至少一对二硫键获得的热稳定性葡萄糖氧化酶。该葡萄糖氧化酶适合应用于食品、化工、医药、农业和饲料领域中。

Description

一种热稳定性葡萄糖氧化酶 技术领域
本发明属于蛋白质工程领域，具体内容涉及来源于丝状真菌的葡萄糖氧化酶，尤其是黑曲霉葡萄糖氧化酶，此类经引入二硫键改造后，热稳定性得到提升。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD，E.C 1.1.3.4)是一种需氧脱氢酶，该酶分子为二聚体，含有两个亚基，分子量约160kDa，每个亚基结合一个FAD分子。它能利用分子氧作为电子受体，专一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛分布于动植物和微生物体内，从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富，细菌GOD产酶量少。微生物发酵法是生产GOD的主要来源。目前市场上大部分商业产品都是由毕赤酵母和丝状真菌，如黑曲霉，米曲霉等发酵生产。
葡萄糖氧化酶由于具有催化专一性和高效性的优点，在食品、化工、医药、农业、饲料等领域有比较广泛的应用，近年来倍受关注，市场需求量也越来越大。由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域中普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，提高饲料利用率，促进动物生长。随着葡萄糖氧化酶越来越多的被应用于各个领域，工业上尤其是饲料工业对其现有性能有了越来越高的要求，如在常温下较长时间保持酶活力不下降，对热和极端pH条件具有耐受性，对消化酶具有耐受性。其中酶的热稳定性对于葡萄糖氧化酶的应用非常关键，在酶的制备过程中和极端反应条件下(高温)，耐热性强的酶有着比较大的优势。因此，提高葡萄糖氧化酶热稳定性对葡萄糖氧化酶的广泛推广和应用具有重要的现实意义
发明内容
本发明人发现，通过在黑曲霉野生型葡萄糖氧化酶(例如与SEQ ID NO：1所示的黑曲霉野生型葡萄糖氧化酶具有大于80％的序列一致性者)或者突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶(例如与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶具有大于75％的序列一致性者)的氨基酸序列中的特定位置上引入一对或多对二硫键，可以提高其稳定性。
在一些实施例中，在与SEQ ID NO:1所示的黑曲霉野生型葡萄糖氧化酶具有大于80％的序列一致性的突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中特定位置上引入如表1所示的一对或多对二硫键。在一些优选实施方案中，在与SEQ ID NO:1所示的黑曲霉野生型葡萄糖氧化酶具有大于85％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的序列一致性的黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中特定位置上引入如表1所示的一对或多对二硫键。
在另一些实施方案中，在与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶具有大于75％的序列一致性的突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中特定位置上引入如表1所示的一对或多对二硫键。在一些优选实施方案中，在与SEQ ID NO:所示的突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶具有大于78％、79％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中特定位置上引入如表1所示的一对或多对二硫键。
具体而言，本发明人发现，在如SEQ ID NO:1所示的黑曲霉野生型葡萄糖氧化酶序列或如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的黑曲霉葡萄糖氧化酶突变体中分别引入如表1中所示的一对或多对二硫键组合，可以提高其热稳定性。
表1：引入二硫键名称和位置(氨基酸位置编号以SEQ ID NO:1为准)
二硫键名称 二硫键位置
A S53/T246
B A25/V250
C V20/S45
D T39/L242
E T87/P508
为本发明的目的，“引入”不限定二硫键是以任何特定的方式生成的。例如，“引入”二硫键，可以包括将待引入二硫键的葡萄糖氧化酶序列的相应位置上的氨基酸残基替换成能够形成二硫键的氨基酸残基(包括，例如，半胱氨酸残基Cys，同型半胱氨酸残基Hcy，等等)；和/或在相应位置上插入能够形成二硫键的氨基酸残基。这样的替换和/或插入可以，例如，通过本领域公知的定点诱变方法来实现。“引入”亦包括形成所述二硫键的任何一个或两个氨基酸残基是由于自然突变而产生的情况。为了生产经过如此改造的突变体，可以使用微生物细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(毕赤酵母，粟酒裂殖酵母等)和丝状真菌(如黑曲霉，米曲霉，里氏木霉等)，以及植物(如玉米，大豆，小麦等)作为宿主进行表达。
为了构建上述突变，可以在已有野生型核酸序列基础上使用常规的定点突变方法，也可以使用基因合成方法从头合成。在连接启动子和终止子后导入到宿主细胞中，在合适的培养条件下进行表达。上述方法为本领域常规方法。
基于该发现，本申请提供下述技术方案。
本发明的一个目的是提供一种热稳定性葡萄糖氧化酶，其在野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶或突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中包含至少一对引入的二硫键，其中所述野生型葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶相比，在至少一个位置上具有突变，并且，所述引入的二硫键选自：
(A)与SEQ ID NO:1的第53位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第246位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键；
(B)与SEQ ID NO:1的第25位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第250位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键；
(C)与SEQ ID NO:1的第20位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第45位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键；
(D)与SEQ ID NO:1的第39位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第242位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键；
(E)与SEQ ID NO:1的第87位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第508位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，在至少一个下述位置上具有突变：14，16，25，30，34，37，43，45，53，67，84，90，92，94，96，106，121，135，141，142，162，167，204，246，259，315，332，362，405，406，420，446，449，453，477，501，504，506，509，510，521，526，528，536，554，560，572，575，577。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，具有至少一个如下突变：D14E，S16A，A25V，T30V，T34V，R37K，N43D，S45T，S53C，A67Y，E84C，Q90R，A92Q，I94V，S96F，V106I，S121A，N135S，L141K，Q142K，A162T，V167I，F204L，T246C，G259A，D315K，A332S，S362T，N405K，H406D，V420E，H446R，A449M，Q453N，S477Y，S501R，T504V，Y506W，Y509E，H510N，C521A，K526R，M528L，A536L，T554M，V560L，S572A，I575V，E577A。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，在至少一个下述位置上具有突变：14，16，30，34，37，43，45，53，67，84，90，94，106，135，162，167，204，246，259，315，332，362，405，406，420，446，501，504，509，510，554，572，575，577。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，具有至少一个如下突变：D14E，S16A，T30V，T34V，R37K，N43D，S45T，S53C，A67Y，E84C，Q90R，I94V，V106I，N135S，A162T，V167I，F204L，T246C，G259A，D315K，A332S，S362T，N405K，H406D，V420E，H446R，S501R，T504V，Y509E，H510N，T554M，S572A，I575V，E577A。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，在至少一个下述位置上具有突变：14，30，37，43，45，53，67，84，90，94，106，135，162，167，204，246，259，315，406，420，446，501，509，572，577。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，具有至少一个如下突变：D14E，T30V，R37K，N43D，S45T，S53C，A67Y，E84C，Q90R，I94V，V106I，N135S，A162T，V167I，F204L，T246C，G259A，D315K，H406D，V420E，H446R，S501R，Y509E，S572A，E577A。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，在至少一个下述位置上具有突变：14，30，37，43，53，67，84，90，94，106，135，162，204，246，315，446，501，509，554。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，具有至少一个如下突变：D14E，T30V，R37K，N43D，S53C，A67Y，E84C，Q90R，I94V，V106I，N135S，A162T，F204L，T246C，D315K，H446R，S501R，Y509E，T554M。
在本发明的一些实施方案中，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10。
在本发明的一些实施方案中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(A)项、(B)项、(C)项或(E)项中的至少一项。
在本发明的一些实施方案中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(A)项、(B)项、(C)项或(E)项中的任意两项、三项或者全部。
在本发明的一些实施方案中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(A)项、(B)项或(C)项。
在本发明的一些实施方案中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(A)项。
在本发明的一些实施方案中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(B)项。
在本发明的一些实施方案中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(C)项。
在本发明的一些实施方案中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶包含选自下组的任一氨基酸序列：SEQ ID NOs:11-15、17、19、21或23。
在本发明的一些实施方案中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶是在毕赤酵母宿主中异源表达而得的。
在本发明的一些实施方案中，所述能够形成二硫键的氨基酸残基为半胱氨酸残基或同型半胱氨酸残基。
本发明的另一个目的是提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的热稳定性葡萄糖氧化酶。
在本发明的一些实施方案中，所述编码热稳定性葡萄糖氧化酶的多核苷酸序列，其是为在毕赤酵母中的表达而密码子优化的。
在本发明的一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：3-7、16、18、20或22中任一项所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供了一种宿主细胞，其包含所述编码热稳定性葡萄糖氧化酶的多核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述的宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。
在本发明的一些实施方案中，所述的宿主细胞为酵母细胞或丝状真菌细胞。
在本发明的一些实施方案中，所述的宿主细胞为毕赤酵母细胞或黑曲霉细胞。
本发明的再一个目的是提供所述的热稳定性葡萄糖氧化酶在食品、化工、医药、农业或饲料领域中的应用。
如本文中使用的，A，R，C，Q，N，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V，G，E分别是丙氨酸Ala，精氨酸Arg，半胱氨酸Cys，谷氨酰胺Gln，天冬酰胺Asn，亮氨酸Leu，赖氨酸Lys，甲硫氨酸Met，苯丙氨酸Phe，脯氨酸Pro，丝氨酸Ser，苏氨酸Thr，色氨酸Trp，酪氨酸Tyr，缬氨酸Val，甘氨酸Gly，谷氨酸Glu的缩写。
如本文中使用的，术语“葡萄糖氧化酶突变体”、“突变体”或“突变型葡萄糖氧化酶”是指具有葡萄糖氧化酶活性的包含在一个或多个(数个)位置的一个或多个(数个)氨基酸残基的变更，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代是指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失是指除去占据某位置的氨基酸；而插入是指在占据某位置的氨基酸邻接处且在之后添加1-5个氨基酸。对野生型葡萄糖氧化酶进行突变，也是指与野生型葡萄糖氧化酶相比，在至少一个位置上进行氨基酸的取代、插入和/或缺失，优选地，是指在至少一个位置上进行氨基酸的取代，如“T30V”，即为野生型葡萄糖氧化酶第30位苏氨酸取代为缬氨酸。
如本文中使用的，术语“热稳定性”指本发明的葡萄糖氧化酶突变体，在特定的温度下给定时间段后，仍然维持一定量的酶活。在涉及例如热稳定性的性质时，术语“热稳定性提高”指经过一段时间后，与其他葡萄糖氧化酶变体和/或野生型葡萄糖氧化酶相比，酶活性更高。
如本文中使用的，术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，指任意长度的核苷酸的聚合形式，不论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。这类术语包括但不限于单链、双链或三链DNA，基因组DNA，cDNA，RNA，DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基，或者其他天然、化学、生物化学修饰的，非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
如本文中使用的，术语“载体”指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。
如本文中使用的，术语“基因”指编码多肽的多核苷酸，包括在编码区域前后的区域，和位于单个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文中使用的，术语“百分比(％)序列一致性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。
如本文中使用的，术语“宿主细胞”指适合含有根据本发明的DNA的表达载体的宿主。
本发明的有益效果：
本发明对野生型葡萄糖氧化酶引入一对或多对二硫键，在70℃条件下处理3min后，与野生型葡萄糖氧化酶相比，其热稳定性有了显著的提高，优选地葡萄糖氧化酶突变体的酶活提高了70％以上，更优选地葡萄糖氧化酶突变体的酶活提高了120％以上，特别优选地葡萄糖氧化酶突变体的酶活提高了180％。本发明对葡萄糖氧化酶突变体引入一对或多对二硫键，在70℃条件下处理3min后，较突变体的酶活提高了34％以上；在80℃条件下处理3min后，酶活实现了从无到有的大幅提高；本发明对其他黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶突变体引入一对或多对二硫键，在80℃条件下处理3min后，较突变体的酶活提高了350％以上，显著优于现有的野生型葡萄糖氧化酶。因此，本发明的技术方案可以提高葡萄糖氧化酶的酶活性质，特别是在耐热稳定性方面，适合应用于工业化生产中，例如，应用于食品、化工、医药、农业和饲料领域中。
附图说明
图1是pPIC9K-GOD-wt质粒图谱。
图2是显示野生型及二硫键突变体热稳定性测定结果的图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
实施例1构建二硫键突变体
黑曲霉野生型葡萄糖氧化酶3D结构已发布(参见Wohlfahrt，G et al，(1999)Acta Crystallogr.，Sect.D 55:969-977)，根据3D结构文件PDB ID 1CF3作为参考，设计引入如下表所述二硫键。
表2：引入二硫键名称和位置(氨基酸位置编号以SEQ ID NO:1为准)
二硫键名称 二硫键位置
A S53C/T246C
B A25C/V250C
C V20C/S45C
D T39C/L242C
E T87C/P508C
F L9C/L245C
G G52C/G99C
H S56C/R230C
I S45C/N241C
J E63C/V224C
K Y182C/G346C
L G251C/P443C
M S191C/A479C
野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，表达载体为pPIC9K，使用酿酒酵母Alpha因子作为信号肽，将合成的葡萄糖氧化酶基因野生型序列GOD-wt(序列两端包含EcoR I和Not I酶切位点)与pPIC9K分别进行EcoR I和Not I酶切后连接转入大肠杆菌DH5α感受态，挑取转化子进行测序验证，获得野生型葡萄糖氧化酶表达质粒pPIC9K-GOD-wt如图1所示。突变体序列按照上表二硫键名称分别命名为GOD-A至GOD-M。采用全基因合成的方法合成了葡萄糖氧化酶基因GOD-wt(如SEQ ID NO：2)及突变体序列GOD-A至GOD-M，其中突变体GOD-A至GOD-E的序列如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：7所示，所述基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。合成的基因两端带有EcoR I和Not I酶切位点。
为了将葡萄糖氧化酶及突变体进行表达，参考Pichia expression kit(Invitrogen)说明书对毕赤酵母GS115和质粒进行操作。具体如下，将毕赤酵母GS115菌株使用YPD培养(1％酵母提取物、2％蛋白、2％葡萄糖和1.5％琼脂)平板30℃培养48h后，挑取单克隆到4mL YPD液体培养基(1％酵母提取物、2％蛋白、2％葡萄糖)中，30℃200rpm培养12h，随后转接到30mLYPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm培养4-5h，检测到OD 600值在1.1–1.3范围后，将培养液在4度9，000rpm离心2min，分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1mL灭菌水重悬菌体，4℃、9，000rpm离心2min，弃上清。重复上述步骤，将预冷的1mL山梨醇(1mol/L)重悬菌体；4℃、9，000rpm离心2min，弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1mol/L)重悬菌体，至此感受态制备完成。将表达质粒pPIC9K-GOD-wt和剩余13个二硫键突变体用PmeI进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法转化上述毕赤酵母GS115感受态中，将混合物均匀涂布于MDH平板上，30℃倒置培养2–3天，将平板上所有的菌落都用无菌水洗下来后涂布在含不同浓度遗传霉素的YPD(0.5mg/mL-8mg/mL)平板上筛选多拷贝的转化子。在MDH平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株命名为GOD-A，GOD-B，GOD-C，GOD-D，GOD-E，GOD-F，GOD-G，GOD-H，GOD-I，GOD-J，GOD-K，GOD-L，GOD-M。将上述筛选获得的克隆分别转接于BMGY培养基中，在30℃、250rpm振荡摇床中培养24h，再转入BMMY培养基中，维持30℃、250rpm条件，每天添加0.5％的甲醇，诱导表达120h后；9000-12000rpm离心10min以去除菌体，得到含葡萄糖氧化酶GOD-wt和其13个突变体的发酵上清液，SDS-PAGE结果显示GOD-G，GOD-I，GOD-K和GOD-L四个突变体未能表达，剩余的9个突变体都有表达。
实施例2葡萄糖氧化酶的酶活测定
在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H 2O 2，在辣根过氧化物酶(POD)的作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。根据其在540nm处吸光度的变化及标准曲线，可换算GOD的活性。酶活测定体系中包含2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3mL的 18％葡萄糖，0.lmL的90U/mL辣根过氧化物酶，35℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL，反应3min后，加入2mol/L硫酸终止反应，取出试管，测OD 540的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。
试剂和溶液
0.1mol/L pH5.5磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液：准确称取14.32g磷酸氢二钠，8.4056g一水合柠檬酸，溶解于400ml蒸馏水中，用磷酸氢二钠调节pH至5.5，备用。
邻联茴香胺溶液：准确称取0.1g邻联茴香胺，溶于10ml甲醇中，此为储存液，4℃有效保存3天。实验前取0.1ml储存液，溶于12ml 0.1mol/L，pH5.5的上述磷酸缓冲液，即得。
18％葡萄糖：准确称取9.0000g烘干至恒重的葡萄糖(AR)，溶解于少量蒸馏水中，并用蒸馏水定容至50ml，4℃保存。
2mol/L H 2SO 4：准确称取40.00g H 2SO 4，缓慢加入160mL蒸馏水中，定容至200mL，备用。
GOD标准品：购买酶活为10000单位的sigma葡萄糖氧化酶标准品，准确加入5mL蒸馏水，混匀，-20℃保存备用。
90U/mL辣根过氧化物酶：购买辣根过氧化物酶标准品(酶活力＞250units/mg，100mg)，准确加入1mL蒸馏水，充分溶解辣根过氧化物酶，-20℃保存备用。使用时取适量标准品稀释至酶活为90U/ml后使用，需现稀释现用。
酶活力的测定
(1)标准曲线的制作
将GOD标准品分别稀释成0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4U/mL，在试管中加入2.5mL邻联茴香胺溶液和0.3mL的18％葡萄糖溶液，再加入0.1mL 90U/mL辣根过氧化物酶溶液，35℃预热2min后，以15s的时间间隔加入0.1mL稀释好的GOD标准品，准确反应3min后立即加入2ml 2mol/L H 2SO 4终止反应，取出混匀，在540nm处测定吸光值，以吸光值为横坐标，标准酶活力为纵坐标，绘制标准曲线y＝Kx+b。
(2)样品的测定
在试管中加入2.5mL邻联茴香胺溶液和0.3mL的18％葡萄糖溶液，加入0.1mL 90U/mL辣根过氧化物酶溶液，35℃预热2min后，以15s的时间间隔加入0.1mL稀释好的待检样品(稀释标准为该样品的检测吸光值在线性范围内)，准确反应3min后立即加入2ml 2mol/L H 2SO 4终止反应，取出混匀，在540nm处测定吸光值A，计算酶活。
(3)酶活力的计算
X＝(K*A+b)*n
式中：
X---样品的酶活力U/ml      A---样品检测吸光值
n---酶液的稀释倍数        K----标准曲线斜率
b----标准曲线截距
实施例3葡萄糖氧化酶及其突变体的热稳定性测定
将实施例1所述发酵上清液用蒸馏水稀释至约100U/mL，在70℃条件下分别处理3min后，测定残余酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算相对酶活。热稳定性数据如图2和下表所示，结果表明二硫键的引入对突变体有显著影响，有的二硫键引入导致了突变体不能正常表达，如GOD-G，GOD-I，GOD-K和GOD-L；另外一些特定二硫键引入会导致突变体热稳定性低于野生型的热稳定性，如GOD-F，GOD-H，GOD-J和GOD-M；另有一些二硫键引入会导致突变体的热稳定性显著提高。如GOD-A，GOD-B，GOD-C，GOD-D和GOD-E的热稳定性有了显著的提高，优选地葡萄糖氧化酶突变体的残余酶活相较于野生型葡萄糖氧化酶提高了70％以上，更优选地葡萄糖氧化酶突变体的酶活提高了120％以上，特别优选地葡萄糖氧化酶突变体的酶活提高了180％。上述结果表明，合适地引入上述二硫键组合可以获得更高热稳定性的突变体。
表3：70℃酶活残余结果
Figure PCTCN2020093205-appb-000001
实施例4
F91是野生型葡萄糖氧化酶经突变筛选获得的耐热优良突变体(如US2016/0068824所述)，其在野生型基础上引入5个突变，具体序列如SEQ ID NO:8所示。为了测试实施例1中描述的二硫键突变体是否在葡萄糖氧化酶突变体上也可以发挥功能，进一步提高稳定性。按照实施例1中的方法在序列F91基础上分别引入二硫键A和B，分别命名为F19-A和F19-B使用毕赤酵母表达两个突变体，随后按照实施例3中的方法测定热稳定性，分别在70℃和80℃条件下孵育3分钟。结果如表2所示，二硫键A和B都进一步提高了突变体的热稳定性，在70℃条件下较突变体F91分别提高了34％和35％，尤其是提高了突变体在80℃下的稳定性，F91在80℃没有酶活残余，而添加二硫键后期残余酶活可以达到12％和7％，实现了从无到有的大幅提高。可以看到，发明人所提出的二硫键引入显示出可以更加有效的提高葡萄糖氧化酶突变体的热稳定性。
表4：F91引入二硫键前后酶活残余结果
Figure PCTCN2020093205-appb-000002
实施例5其它黑曲霉来源葡萄糖氧化酶突变体基础上引入二硫键后热稳定性测定
其他黑曲霉来源的野生型葡萄糖氧化酶序列如SEQ ID NO:9所示，与SEQ ID NO:1的相似度为97％。该不同黑曲霉来源的野生型葡萄糖氧化酶经突变筛选获得的耐热优良突变体(如CN 108893453所述)，其在野生型基础上引入5个突变，得到GOD-M5，具体序列如SEQ ID NO:10所示。为了测试实施例1中描述的二硫键突变体是否在不同黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶突变体上也可以发挥功能，进一步提高热稳定性。按照实施例1中的方法在序列GOD-M5基础上分别引入二硫键A和B，分别命名为GOD-M5-A和GOD-M5-B使用毕赤酵母表达两个突变体，随后按照实施例3中的方法测定热稳定性，分别在70℃和80℃条件下孵育3分钟。结果如表3所示，二硫键A和B都进一步提高了突变体的热稳定性，尤其是在80℃下较突变体GOD-M5分别提高了350％和400％。可以看到，发明人所提出的二硫键引入显示出对不同黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶突变体都具有热稳定性提高的作用。
表5：GOD-M5引入二硫键前后酶活残余结果
Figure PCTCN2020093205-appb-000003
SEQ ID NO:1 GOD-wt
Figure PCTCN2020093205-appb-000004
Figure PCTCN2020093205-appb-000005
SEQ ID NO: 2 GOD-wt
Figure PCTCN2020093205-appb-000006
Figure PCTCN2020093205-appb-000007
SEQ ID NO: 3 GOD-A
Figure PCTCN2020093205-appb-000008
SEQ ID NO: 4 GOD-B
Figure PCTCN2020093205-appb-000009
SEQ ID NO: 5 GOD-C
Figure PCTCN2020093205-appb-000010
Figure PCTCN2020093205-appb-000011
SEQ ID NO: 6 GOD-D
Figure PCTCN2020093205-appb-000012
Figure PCTCN2020093205-appb-000013
SEQ ID NO: 7 GOD-E
Figure PCTCN2020093205-appb-000014
Figure PCTCN2020093205-appb-000015
SEQ ID NO: 8 F19
Figure PCTCN2020093205-appb-000016
SEQ ID NO: 9
Figure PCTCN2020093205-appb-000017
Figure PCTCN2020093205-appb-000018
SEQ ID NO: 10 GOD-M5
Figure PCTCN2020093205-appb-000019
SEQ ID NO: 11 GOD-A
Figure PCTCN2020093205-appb-000020
SEQ ID NO: 12 GOD-B
Figure PCTCN2020093205-appb-000021
SEQ ID NO: 13 GOD-C
Figure PCTCN2020093205-appb-000022
Figure PCTCN2020093205-appb-000023
SEQ ID NO: 14 GOD-D
Figure PCTCN2020093205-appb-000024
SEQ ID NO: 15 GOD-E
Figure PCTCN2020093205-appb-000025
SEQ ID NO: 16 F19-A
Figure PCTCN2020093205-appb-000026
Figure PCTCN2020093205-appb-000027
SEQ ID NO: 17 F19-A
Figure PCTCN2020093205-appb-000028
SEQ ID NO: 18 F19-B
Figure PCTCN2020093205-appb-000029
Figure PCTCN2020093205-appb-000030
SEQ ID NO: 19 F19-B
Figure PCTCN2020093205-appb-000031
SEQ ID NO: 20 GOD-M5-A
Figure PCTCN2020093205-appb-000032
SEQ ID NO: 21 GOD-M5-A
Figure PCTCN2020093205-appb-000033
Figure PCTCN2020093205-appb-000034
SEQ ID NO: 22 GOD-M5-B
Figure PCTCN2020093205-appb-000035
SEQ ID NO: 23 GOD-M5-B
Figure PCTCN2020093205-appb-000036
Figure PCTCN2020093205-appb-000037

Claims (27)

  1. 一种热稳定性葡萄糖氧化酶，其在野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶或突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中包含至少一对引入的二硫键，其中所述野生型葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶相比，在至少一个位置上具有突变，并且，所述引入的二硫键选自：
    (A)与SEQ ID NO:1的第53位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第246位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键；
    (B)与SEQ ID NO:1的第25位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第250位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键；
    (C)与SEQ ID NO:1的第20位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第45位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键；
    (D)与SEQ ID NO:1的第39位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第242位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键；
    (E)与SEQ ID NO:1的第87位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQID NO:1的第508位对应的位置上的氨基酸残基之间形成的二硫键。
  2. 如权利要求1所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，在至少一个下述位置上具有突变：14，16，25，30，34，37，43，45，53，67，84，90，92，94，96，106，121，135，141，142，162，167，204，246，259，315，332，362，405，406，420，446，449，453，477，501，504，506，509，510，521，526，528，536，554，560，572，575，577。
  3. 如权利要求2所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，具有至少一个如下突变：D14E，S16A，A25V，T30V，T34V，R37K，N43D，S45T，S53C，A67Y，E84C，Q90R，A92Q，I94V，S96F，V106I，S121A，N135S，L141K，Q142K，A162T，V167I，F204L，T246C，G259A，D315K，A332S，S362T，N405K，H406D，V420E，H446R，A449M，Q453N，S477Y，S501R，T504V，Y506W，Y509E，H510N，C521A，K526R，M528L，A536L，T554M，V560L，S572A，I575V，E577A。
  4. 如权利要求2所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，在至少一个下述位置上具有突变：14，16，30，34，37，43，45，53，67，84，90，94，106，135，162，167，204，246，259，315，332，362，405，406，420，446，501，504，509，510，554，572，575，577。
  5. 如权利要求4所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，具有至少一个如下突变：D14E，S16A，T30V，T34V，R37K，N43D，S45T，S53C，A67Y，E84C，Q90R，I94V，V106I，N135S， A162T，V167I，F204L，T246C，G259A，D315K，A332S，S362T，N405K，H406D，V420E，H446R，S501R，T504V，Y509E，H510N，T554M，S572A，I575V，E577A。
  6. 如权利要求4所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，在至少一个下述位置上具有突变：14，30，37，43，45，53，67，84，90，94，106，135，162，167，204，246，259，315，406，420，446，501，509，572，577。
  7. 如权利要求6所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，具有至少一个如下突变：D14E，T30V，R37K，N43D，S45T，S53C，A67Y，E84C，Q90R，I94V，V106I，N135S，A162T，V167I，F204L，T246C，G259A，D315K，H406D，V420E，H446R，S501R，Y509E，S572A，E577A。
  8. 如权利要求6所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，在至少一个下述位置上具有突变：14，30，37，43，53，67，84，90，94，106，135，162，204，246，315，446，501，509，554。
  9. 如权利要求8所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型黑曲霉相比，具有至少一个如下突变：D14E，T30V，R37K，N43D，S53C，A67Y，E84C，Q90R，I94V，V106I，N135S，A162T，F204L，T246C，D315K，H446R，S501R，Y509E，T554M。
  10. 如权利要求2所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，所述突变型黑曲霉葡萄糖氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10。
  11. 如权利要求1-10中任一项所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(A)项、(B)项、(C)项或(E)项中的至少一项。
  12. 如权利要求11所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(A)项、(B)项、(C)项和(E)项中的任意两项、三项或者全部。
  13. 如权利要求11所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列至少满足上述(A)项、(B)项或(C)项。
  14. 如权利要求13所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(A)项。
  15. 如权利要求13所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(B)项。
  16. 如权利要求13所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中，所述热稳定性葡萄糖氧化酶氨基酸序列满足上述(C)项。
  17. 如权利要求1所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中，该热稳定性葡萄糖氧化酶包含选自下组的任一氨基酸序列：SEQ ID NOs:11-15、17、19、21或23。
  18. 如前述任一权利要求所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，所述热稳定性葡萄糖氧化酶是在毕赤酵母宿主中异源表达而得的。
  19. 如前述任一项权利要求所述的热稳定性葡萄糖氧化酶，其中，能够形成二硫键的氨基酸残基为半胱氨酸残基或同型半胱氨酸残基。
  20. 一种多核苷酸，其编码如权利要求1-19中任一项所述的热稳定性葡萄糖氧化酶。
  21. 权利要求20的多核苷酸，所述编码热稳定性葡萄糖氧化酶的多核苷酸序列，其是为在毕赤酵母中的表达而密码子优化的。
  22. 权利要求21的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：3-7、16、18、20或22中任一项所示的核苷酸序列。
  23. 一种宿主细胞，其包含权利要求20-22所述的多核苷酸。
  24. 权利要求23所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。
  25. 权利要求24所述的宿主细胞，其为酵母细胞或丝状真菌细胞。
  26. 权利要求25所述的宿主细胞，其为毕赤酵母细胞或黑曲霉细胞。
  27. 权利要求1-26中任一项所述的热稳定性葡萄糖氧化酶在食品、化工、医药、农业或饲料领域中的应用。
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