CN1238009A - 提高葡糖淀粉酶pH最适点、底物专一性和热稳定性的蛋白质工程方法 - Google Patents

Abstract

一种真菌葡糖淀粉酶，它包括Asn20Cys与Ala27Cys连接的一对突变，该突变对的两个成员间形成二硫键。该突变使此酶增加了热稳定性，减少了异麦芽糖的形成。也提供包括311—314Loop突变的真菌葡糖淀粉酶，该突变可减少异麦芽糖形成。还提供包括突变Ser411Ala的真菌葡糖淀粉酶，该突变能提高pH最适点，减少异麦芽糖的形成。还提供工程化葡糖淀粉酶中的突变组合以及与其它葡糖淀粉酶突变的组合，这些组合为工程化葡糖淀粉酶热稳定性的增加，pH最适点的提高以及异麦芽糖形成的减少提供了累积性改进作用。

Description

提高葡糖淀粉酶pH最适点、底物专一性和 热稳定性的蛋白质工程方法

发明领域

本发明领域涉及产生真菌葡糖淀粉酶突变的方法，使葡糖淀粉酶能更好地选择性产生葡萄糖而不是α-1,6键合的双糖异麦芽糖，使葡糖淀粉酶热稳定性更好，pH最适点增高，并且比野生型酶产生的葡萄糖量更多。

发明背景

葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)是一种糖酶。发现于1951年，是一种外水解酶，它从麦芽寡糖的非还原性末端上切下D-葡萄糖，攻击α-(1,4)-糖苷键，还以非常慢的速度攻击α-(1,6)-糖苷键。它是切割具有α或β构型的O-糖苷键的一百多种糖酶(EC.3.2.1)中的一种。这些酶在功能和结构上的关系表现为：在葡糖淀粉酶和几种α-淀粉酶、α-葡糖苷酶和转葡聚糖基酶(transglucanosylase)之间至少存在三个序列同源的不连续区[Svensson,1988]，并有攻击不溶性底物的糖酶的类似功能域结构[Knowles等，1987；Svensson等，1989]。泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶；EC3.2.1.3)是最重要的葡糖淀粉酶中的一种。

葡糖淀粉酶在工业上主要用于加工生产高果糖谷物增甜剂，该加工方法包括：1)用α淀粉酶将淀粉水解成中等长度的麦芽糖寡糖(糊精)；2)用葡糖淀粉酶将糊精水解成葡萄糖；以及3)用葡萄糖异构酶将葡萄糖转变成果糖。谷物增甜剂占领了美国增甜剂50％以上的市场，而用于制备该增甜剂的三种酶位列产量最高酶之中。另外葡糖淀粉酶生产的葡萄糖可结晶或用于发酵生产有机产品(如柠檬酸、抗坏血酸、赖氨酸、谷氨酸或饮料和燃料用的乙醇)。整个美国谷物产量中约有12％的谷物是用葡糖淀粉酶加工的。虽然葡糖淀粉酶已经成功地使用多年，但是如果它能够生产更多的葡萄糖而不是双糖，如果它更稳定，如果它能和葡萄糖异构酶一起在同一容器中使用的话，那么它将是更具吸引力的产品。

葡糖淀粉酶并不能从糊精生成100％葡萄糖，因为它产生了各种双糖和三糖，尤其是异麦芽糖和异麦芽三糖[Nikolov等，1989]。在高底物浓度时形成这些产生，是由于葡糖淀粉酶能够形成α-(1,6)-糖苷键。葡糖淀粉酶并不象α-淀粉酶或是葡萄糖异构酶那样稳定。GA的最适pH(pH4-4.5)低于α-淀粉酶(pH5.5-6.5)和葡萄糖异构酶(pH7-8)的最适pH。因此，葡糖淀粉酶的水解反应必须与其它酶反应分开进行，在不同的容器中、较低的温度下进行，这使得生产成本较高。

丝状真菌黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶是应用最广的葡糖淀粉酶，它的生化性质已经经过深入地分析。发现这种酶主要有两种形式：GAⅠ(616个氨基酸(以下称为AA))和GAⅡ(512AA)。它们之间的不同之处在于：GAⅠ中有吸附天然淀粉颗粒所需的104个氨基酸的C端结构域[Svensson等，1982；Svensson等，1989]。两种形式均有催化性结构域(AA1-440)，其后是富含Ser/Thr、高度O-糖基化区域(AA441-512)[Gunnarsson等，1984]。催化区的前30个残基包括在该酶的三维结构中[Aleshin等，1994；1996；Stoffer等，1995]；它们象带子那样卷绕催化结构域。与形成底物结合位点环状结构相对应的催化性结构域的四个不同区域中，在各种真菌葡糖淀粉酶中有着同源性很强的氨基酸序列[Itoh等，1987]。在黑曲霉葡糖淀粉酶中，这些区域是AA35-59、AA104-134、AA162-196和AA300-320。第二和第三区域部分或完全地覆盖了与α-淀粉酶同源的三个区域(Svensson,1988)。另外，其粗制淀粉结合结构域(AA512-616)与几种淀粉降解酶的相似结构域有很高的同源性[Svensson等，1989]。

动力学分析表明，底物结合位点由多达7个亚位点组成[Savel′ev等，1982]，在亚位点1和2之间发生水解。水解的pK_a为2.75和5.55[Savel′ev和Firsov,1982]，提示亚位点1和2处的羧酸残基提供了水解的催化性酸和碱。化学修饰试验显示，三个高度保守的残基Asp176、Glu179和Glu180被保护起来，它们在活性位点内，这提示它们中的一个或多个可能是催化性残基[Svensson等，1990]。化学修饰试验也表明，高度保守的残基Trp120是必需的，它位于亚位点4内[Clarke和svensson,1984].Trp120与米曲酶(Aspergillus oyzae)α-淀粉酶的Trp83同源[Clarke和Svensson,1984],Trp83也位于该酶的活性位点中[Matsuura等，1984]。定点诱变研究表明Glu179是催化性酸残基，而Glu400是催化性碱残基[Frandse等，1994；Harris等，1993；Sierks等，1990]。

已经对黑曲霉[Svensson等，1983；Boel等，1984]和泡盛曲霉[Nunberg等，1984]的葡糖淀粉酶进行了克隆和测序，它们有相同的一级结构。Innis等[1985]和最近Cole等[1988]已经开发了用于在酵母中表达葡糖淀粉酶的载体(分别为pGAC9和pPM18)，使之能方便地操纵和测试葡糖淀粉酶突变体。

发明概述

本发明提供一种真菌葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶；EC3.2.1)，突变Asn20Cys与Ala27Cys两者之间连接形成二硫键使得酶的热灭活性减低(热稳定性增加)、异麦芽糖形成减少。通过掺入突变Asn20Cys和Ala27Cys的连接和表13中的至少一个突变，GA还具有累积的热稳定性。包含Ser30Pro、Gly137Ala以及Asn20Cys与Ala27Cys连接的工程化GA，具有更高的热稳定性。通过包含突变Asn20Cys与Ala27Cys的连接和表13中的至少两个突变，GA还具有累积的热稳定性。

本发明还提供一种异麦芽糖形成减少的真菌葡糖淀粉酶，它包含Asn20Cys与Ala27Cys突变的连接(S-S突变)以及选自表14的至少一种突变。在一个实例中，工程化GA中包含了突变Ala27Cys与Asn20Cys的连接和311-314环状结构突变(也称为300Loop)。在另一个较佳的实例中，异麦芽糖形成减少的工程化葡糖淀粉酶包含Asn20Cys与Ala27Cys连接突变、Ser30Pro和Gly137Ala。

本发明也提供一种工程化真菌葡糖淀粉酶，它包含311-314Loop突变，该突变使异麦芽糖形成减少。在另一个实例中制备了一种真菌葡糖淀粉酶，它包含311-314Loop突变和表14中的至少一种突变，该附加突变提供了减少异麦芽糖形成的累积效果。

本发明提供一种真菌葡糖淀粉酶，它包含Ser411Ala突变，该突变提高了pH最适点并减少了异麦芽糖的形成。在一个实例中，Ser411Ala突变与表15中的至少一种突变组合，从而累积地提高了pH最适点。在一个实例中，Ser411Ala突变与表14中的至少一个突变组合，从而累积地减少了异麦芽糖的形成。

在另一个实例中，工程化真菌葡糖淀粉酶包含了突变Ser411Ala和一对突变Asn20Cys和Ala27Cys,Asn20Cys和Ala27Cys两者之间连接形成了二硫键，这些突变提高了酶的热稳定性，提高了pH最适点，并减少了异麦芽糖的形成。

在还有一个实例中，通过工程改造获得一种真菌葡糖淀粉酶，它包含Ser411Ala突变、Asn20Cys和Ala27Cys连接的突变对(突变对的两个成员间形成了二硫键)，以及311-314Loop突变，从而提高了酶的热稳定性、pH最适点，并减少了异麦芽糖的形成。

本发明提供一种通过设计突变，减少GA对α-(1,6)-糖苷键亲和力来获得异麦芽糖形成减少的真菌葡糖淀粉酶的方法。

本发明还提供一种获得热灭活性减低的真菌葡糖淀粉酶的方法，该方法是通过设计突变来减少酶的去折叠构象熵，和/或提高α螺旋的稳定性、增加二硫键、氢键、静电作用、疏水作用、范德瓦尔斯作用和堆积致密度(packing compactness)。

本发明也提供一种pH最适点提高的真菌葡糖淀粉酶，包括改变其在催化性碱Glu400微环境中的极性、电荷分布和氢键连接。

本发明还提供制备携带有至少两个累积附加突变的基因工程化葡糖淀粉酶的方法。各个突变用定点诱变产生。筛选这些单个突变，选出那些表现出提高pH最适点、降低不可逆热灭活反应速度或减少异麦芽糖形成的突变。然后进行定点诱变，以生成携带有至少两个分开的所选突变的酶。最后，对工程化酶进行筛选，筛选出那些携带对热稳定化或减少异麦芽糖形成有累积叠加作用的突变的酶(这些效果由制得的携带有至少两个分开的所选突变的酶提供)。或者，筛选工程化酶中两个突变对pH最适点、热稳定性和/或异麦芽糖形成减少有累积叠加效果，这些效果由制得的携带有至少两个分离的所选突变的酶提供。

本发明还提供适用于每种突变以及突变组合的载体以及载体转化的宿主细胞。

附图描述

在参阅了以下与附图相关的详细描述后，很容易评价并能更好地了解本发明的其它优点。

图1显示野生型(●)以及实施例1中脯氨酸取代的突变体GA:S30P(■)、D345P(_)、E408P(◇)的温度与k_d之间的关系。

图2显示野生型(○)、A27C(●)、N20C(_)、A27C/N20C(_)、A471C/T72C(□)、A27C/N20C/G137A(■)、A27C/N20C/S436P(◇)和G137A/S436P(◆)葡糖淀粉酶在pH4.5缓冲液中测定时，温度对一级热灭活速度系数的影响。

图3显示野生型(○)、A27C/N20C(●)、A471C/T72C(_)和A29C/N20C/G137A(_)葡糖淀粉酶在pH4.5、0.05M乙酸钠中以4％麦芽糖为底物、于60-76℃的初始反应速度。

图4显示温度对野生型和突变型GA活性的影响。误差条代表三次试验的标准差野生型(●)、S30P/G137A(□)、S-S/S30P/G137A(▲)。

图5A-C显示温度对野生型和突变型GA的不可逆热灭活速度系数的影响。图5A：野生型(●)、S30P(■)、G137A(△)、S30P/G137A(□)；图5B：野生型(●)、S30P(■)、S-S(六角形)、S-S/S30P(中间空心的圆圈)；图5C：野生型(●)、S30P/G137A(□)、S-S/S30P(中间空心的圆圈)、S-S/S30P/G137A(▲)。

图6A-B显示野生型(●)、S30P/G137A(□)和S-S/S30P/G137A(▲)对28％(w/v)Maltrin M100的糖化作用。

图7显示，在55℃，用野生型(◆)和突变型葡糖淀粉酶：300Loop(■)、S30P/G137A(▲)、S-S(●)、S30P/G137A/300Loop(×)、S-S/300Loop(△)糖化30％DE 10麦芽糖糊精的情况，每个反应中的酶浓度为166.67μg/mL。

图8显示，在55℃，野生型(●)以及突变型葡糖淀粉酶：Y116W(■)、Y175F(▲)、R241K(_)、S411A(◆)、S411G(六角形)对0.05M乙酸钠缓冲液(pH4.4，含有0.02％叠氮钠)中的30％(w/v)D-葡萄糖进行葡萄糖缩合12天产生异麦芽糖的情况。

图9显示，在55℃，野生型(●)以及突变型葡糖淀粉酶：Y116W(■)、Y175F(▲)、R241K(_)、S411A(◆)、S411G(六角形)对0.05M乙酸钠缓冲液(pH4.4，含有0.02％叠氮钠)中的28％(w/v)DE10麦芽糖糊精水解12天产生葡萄糖的情况。

图10显示在不同pH值下野生型(●)和S411A(■)葡糖淀粉酶在DE10麦芽糖糊精水解时的葡萄糖产生初始速度。在36℃、与25mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(指定的pH，含有0.02％叠氮钠)中的28％(w/v)麦芽糖糊精进行水解4天。

                        较佳实施例详述

本发明提供在真菌类葡糖淀粉酶中增加热稳定性、提高pH最适点和减少异麦芽糖形成的突变，该葡糖淀粉酶可提供比野生型葡糖淀粉酶更高的葡萄糖产量。在真菌类中，葡糖淀粉酶的预计结构和已知序列是高度保守的[Coutino等，1994]。尽管采用的是典型的泡盛曲霉葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶；EC3.2.1.3；本文称为GA；SEQ ID NO:1)，但是也可采用包括曲霉属在内的任何其它真菌葡糖淀粉酶。本文葡糖淀粉酶氨基酸的编号是根据典型的泡盛曲霉序列而定。对于不同的真菌种类，测得的等价氨基酸残基号码是不同的，这是该领域已知的[Coutino等，1994]。

本发明提供了一种真菌葡糖淀粉酶，系通过工程化改造包含了Asn20Cys与Ala27Cys连接的突变对(两者之间形成一个二硫键，该突变缩写为Asn20Cys/Ala27Cys或S-S))，从而使该酶的热灭活性降低(热稳定性增加)，异麦芽糖的形成减少。使热灭活性降低的其它突变归纳列在表13中。

在该酶中包含至少两个突变(例如包含突变Ser30Pro和Gly137Ala)也为GA提供了累积的热稳定性。另一个例子是用酶中的Asn20Cys/Ala27Cys工程改造成S-S，或使Gly137Ala与S-S配对。另外，表13中提出的各突变的组合，尤其是S-S与Ser30Pro的连接，也提供了累积的热稳定性。通常进行两个突变的组合，但也可构建三个突变。例如，一个工程化GA包含三个突变：Ser30Pro、Gly137Ala和Asn20Cys/Ala27Cys，从而提供了更高的热稳定性。

“Asn20Cys与Ala27Cys连接”是指一对突变，它简称为“S-S”或Asn20Cys/Ala27Cys，在这两者之间如本文实施例所述的那样形成了一个二硫键。通常这被认为是一个突变，因为两者均是形成二硫键所必需的。

“累积”通常指两个或多个突变，对待测酶活性参数的叠加(或近似附加)作用。

本发明也提供一种异麦芽糖形成减少、葡萄糖产量增加的真菌葡糖淀粉酶，它包含Asn20Cys/Ala27Cys突变(S-S突变)和至少一种选自表14的突变。在一个实例中，GA中包含Asn20Cys/Ala27Cys突变和311-314Loop(300Loop)突变。在另一个较佳的实例中，异麦芽糖形成减少的工程化葡糖淀粉酶包含Asn20Cys/Ala27Cys突变以及Ser30Pro和Gly137Ala突变。

在一个实例中，构建了311-314Loop突变的葡糖淀粉酶，以减少异麦芽糖的形成。“311-314Loop突变”指插入性GA突变，从序列Tyr311-Tyr312-Ash313-Gly314变为Tyr311-Asn-Gly-Asn-Gly-Asn-Ser-Gln-Gly314(311-314Loop；SEQ ID NO:2)。

本发明提供一种真菌葡糖淀粉酶，它包含Ser411Ala突变，该突变使得pH最适点增加，异麦芽糖的形成减少。在一个实例中，Ser411Ala突变与表15中至少一个突变组合，该组合突变累积地提高了pH最适点。在另一个实例中，Ser411Ala突变与表14中的至少一个突变组合，这些突变累积地减少了异麦芽糖的形成。

在另一个实例中，工程化真菌葡糖淀粉酶包含一个Ser411Ala突变和Asn20Cys/Ala27Cys突变对，该突变对在Asn20Cys和Ala27Cys之间形成一个二硫键，这些突变增加了热稳定性，提高了pH最适点，并且减少了异麦芽糖的形成。

在还有一个实例中，真菌葡糖淀粉酶包含Ser411Ala突变、311-314Loop突变和Asn20Cys与Ala27Cys连接的突变对，该突变对的两个成员间形成一个二硫键，这些突变组合增加了热稳定性、提高了pH最适点，并且减少了异麦芽糖的形成。

突变这样来表示：被替换的氨基酸，其后是残基编号，再后是替换的氨基酸。氨基酸缩写成三个字母或一个字母的代码。突变用本领域已知的定点诱变来产生。序列和残基编号来自野生型(WT)或非突变型酶。如下文和实施例中所述的那样进行生化分析。实施例提供了对各个突变进行性质分析的分析示范，而且还提供测定突变组合是否有累积效果的分析示范。

“热稳定性增加(或热灭活性降低)”指在65-77.5℃下突变体不可逆灭活的速度低于野生型。

本发明提供了一种获得热灭活性降低的真菌葡糖淀粉酶的方法，该方法通过设计突变以使酶在65-77.5℃的不可逆热灭活速度低于野生型。通过设计突变来减少酶的去折叠构象熵，和/或提高α螺旋的稳定性、增加二硫键、氢键、静电作用、疏水作用、范德瓦尔斯相互作用和堆积致密度，设计葡糖淀粉酶的热灭活性降低，从而达到该目的。

已经对蛋白质热稳定性的基础机理，以及影响可逆和不可逆热灭活的因素进行了深入的研究[Argos等，1979；Klibanov,1983；Wasserman,1984；Ahern和Klibanov,1985]。涉及蛋白质在高温下稳定的因素包括：1)二硫键；2)非共价键如盐桥、氢键和疏水作用；以及3)构象刚性[Nosoh和Sekiguchi,1988]。高温下发生不可逆灭活的原因包括：1)凝集作用；2)不正确结构的形成；3)二硫键的破坏；4)脱酰氨基作用(尤其是Asn-Gly序列中的Asn)；和5)Asp-X肽键的断裂。很明显，即使替换一个残基也可使蛋白质的热稳定性有很大变化[Matsumura和Aiba,1985]，因为使蛋白质三级结构稳定一般只需要自由能有很少的增加(20-30KJ/mol)[Nosoh和Sekiguchi,1988]。靠基因工程来增加酶的热稳定性(或降低不可逆热灭活性)已经在几个实例中取得成功[Perry和Wetzel,1984；Imanaka等，1986；Ahearn等，1987]。然而，对控制热稳定性的机理还不完全了解，因此不能准确地预计能促进热稳定性的氨基酸(AA)替换[Leatherbarrow和Fersht,1986；Nosoh和Sekiguchi,1988；Pakula和Sauer,1989]。而本发明的方法能更准确地预测。

“提高pH最适点”是指酶在更高的pH(高于野生型的pH最适点)下有功能。

本发明还提供一种设计pH最适点提高的真菌葡糖淀粉酶的方法，该方法是改变酶在催化性碱Glu400微环境中的极性、电荷分布和氢键连接。例如，设计突变体S411G和S411A来消除Ser411和Glu400间的氢键(参见实施例8)。

“增加选择性”是指，由于在葡萄糖高浓度下减少了不希望产生的α-(1,6)-键合副产物(可逆产物)的形成，从而减少了异麦芽糖的形成[Lee等，1976]。如上所述，GA能水解并合成α-(1,4)和α-(1,6)-糖苷键。选择性增加表明，此酶合成α1,6键合产物的速度低于野生型，如同以30％葡萄糖为底物的缩合反应中异麦芽糖形成的水平低于野生型GA所显示的那样。另外，在用28％DE10麦芽糖糊精为底物的糖化反应中，提高选择性会增加葡萄糖产量。

本发明提供一种获得异麦芽糖形成减少的真菌葡糖淀粉酶的方法，该方法通过设计突变来减少GA对α-(1,6)-糖苷键的亲和力。这些突变被设计在酶的活性位点中，以减少由于葡萄糖缩合而引起的异麦芽糖形成。所设计的这些突变具有降低的异麦芽糖合成能力同时至少部分保留了野生型酶消化α-1,4键合底物的能力，从而使异麦芽糖形成与葡萄糖形成之比低于野生型酶。这些突变被安置在并不完全保守(根据同源分析来看)的位置中。

动力学研究揭示有5-7个葡糖基结合亚位点，而且催化性位点位于亚位点1和2之间[Hiromi等，1973,Heromi等，1983,Meagher等，1989,Tanaka等，1983]。已明确泡盛曲霉X100(Aspergillus awamori varX100)葡糖淀粉酶催化结构域的三维结构，它与泡盛曲霉和黑曲霉GA相应区域有约95％的同源性[Coutinho&Reilly,1994]，它含有13个α螺旋，其中12个成对排列形成α/α桶[Aleshin等，1992,Aleshin等，1994]。活性位点位于桶中央的空穴中。另外，对葡糖淀粉酶的13个氨基酸序列的同源分析表明，5个保守区确定了此活性位点[Coutinho&Reilly,1994].GA催化的机理涉及两个羧基[Hiromi等，1966]，在泡盛曲霉或黑曲霉中它们是Glu179和Glu400[Frandsen等，1994,Harris等，1993,Sierks等，1990]。Glu179使糖苷键中的氧质子化，起广义的酸催化剂作用，而Glu400激活水(Wat500)对碳C-1作亲核攻击，起广义的碱催化剂作用[Frandsen等，1994]。葡糖淀粉酶与假四糖(pseudotetrasaccharide)(阿卡波糖和D-葡糖-二氢阿卡波糖)复合的晶体结构显示，在pH4时对假四糖有两个不同的结合构象体：pH4型和pH6型[Aleshin等，1996,Stoffer等，1995]。与假四糖前两个糖残基的结合是相同的，但是与假四糖第三和第四个糖残基的结合则有很大的不同[Stoffer等，1995]。

根据酶在基态和过渡态下与配体形成稳定复合物的能力，确定了酶的底物专一性。酶-配体复合物的稳定性受空间位阻限制、氢键、范德瓦尔斯和静电力、以及疏水接触的影响[参见Fersht,1985,Enzyme Structure and Mechanism，第2版，Freeman,San Francisco]。采用定点诱变来构建残基119和121处的突变，以改变酶和底物间的氢键连系。Ser119的原子OG与假四糖第四个糖残基的3-OH的氢键连系只发生在pH6型构象体中，而Gly121的酰胺氮与第三个糖残基的6-OH的氢键连系却发生在pH4型和pH6型二种构象体中。设计这些突变来改变酶的底物专一性(减少α-1,6缩合反应)，并同时保留野生型酶水解α-1,4键合底物的能力。Ser119不是保守的，它可被Ala代替，在其它GA中可被Pro和Glu代替。设计S119E突变型来加强酶和底物第四个糖残基间的氢键，以使pH6型构象体稳定，并为亚位点4附近提供负电荷以增加活性位点中的静电作用。设计突变型S119G来消除同一氢键，使pH6型构象体不稳定。设计突变型S119W来消除同一氢键并增加酶和pH6型构象体间的疏水作用。Gly121在所有的葡糖淀粉酶序列中是高度保守的，除梭状芽胞杆菌属G005GA外，G005GA有很高的α-1,6活性，其中的Gly被替代成Thr。由于Gly121的φ和ψ角度允许该位置有丙氨酸而不会引起构象扭变，因此设计G121A在位置121处引入β-碳以使第三个糖残基的6-OH基团离开其氢键连接位置。另外，设计双重突变G121A/S411G来研究两个底物专一性突变的叠加效果。这里，S411G显示能降低异麦芽糖产生初始速度(葡萄糖缩合反应)与葡萄糖产生初始速度(DE10麦芽糖糊精的水解)之比。

下面进一步提供用于设计增加酶选择性的突变的策略的实施例。300Loop突变：根据氨基酸序列同源性研究[Countinho和Reilly,1994]，发现根霉菌属和其它一些真菌家族的GA(与黑曲霉或泡盛曲霉的GA相比)有更长的氨基酸序列，并且在S4保守区形成了更大的环状结构或空穴。由于单独的一个突变不可能在键的水解或合成专一性上引起显著的提高，因此设计了一个插入突变型GA(命名为300Loop或311-314Loop(SEQ ID NO:2))，插入的7个氨基酸取自根霉菌属GA，因为根霉菌属GA是亚位点理论成功应用的第一种酶[Himori等，1973]。设计300Loop突变通过在S4保守区引入较大环状结构来降低酶对α-(1,6)-糖苷键的亲和力。Tvr175Phe:Tyr175在第三个保守区内。Tyr175和抑制剂D-葡糖-二氢阿卡波糖第四个残基间的最近距离为4.06_[Stoffer等，1995]。在其它几种葡糖淀粉酶中，Tyr175被Phe或Gln代替。将Tyr175变成Phe的目的是为了增加酶和底物间的疏水反应。Gly121Ala:Gly121在所有的葡糖淀粉酶序列中是高度保守的，除梭状芽胞杆菌属G005GA外(G005GA有很高的α-1,6活性，其中的Gly被替代成Thr)。由于Gly121的φ和ψ角度允许该位置有丙氨酸而不会引起构象扭变，因此设计G121A在位置121处引入一个β-碳以使第三个糖残基的6-OH基团离开其氢键连接位置。Gly121Ala和S411G(通常称为G121A/S411G)：设计此双重突变用来研究两个底物专一性突变的叠加(累积)效果。S411G能降低异麦芽糖产生(葡萄糖缩合反应，见实施例)与葡萄糖产生(麦芽糖糊精10水解)初始速度之比。

本发明提供一种工程改造真菌葡糖淀粉酶的突变然后制备携带有累积叠加突变的工程化酶的方法。最初的步骤是用定点诱变来产生单个突变，然后如实施例中所述的那样筛选各个突变。然后选出那些表现出能降低不可逆热灭活速度、或减少异麦芽糖形成或提高pH最适点的各个突变，以进行组合分析。一般来说，选择的突变至少具有野生型酶的反应速度。

如实施例所述，用定点诱变来组合突变，以确定它们的效果是否能叠加。用来产生酶(携带有至少两个分开的所选突变)定点诱变的方法如本领域已知的那样进行。然后筛选这些工程化酶对热稳定化、pH最适点或减少异麦芽糖形成的累积叠加效果。另外，筛选携带有累积突变的工程化酶对两种或多种参数的累积效果。

为了对突变体进行生化分析，用超滤、DEAE-Sephadex柱层析以及亲和柱层析(将强抑制剂阿卡波糖与载体相连)从15L批次发酵的培养上清中纯化GA[Sierks等，1989]。用标准方法(如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和窄条带两性电解质的等电点聚焦)测定获得的制备物的纯度。用280nm吸光度法或Bradford法[1976]来测定蛋白质。用葡萄糖氧化酶/邻联茴香胺试验(Sigma)测定GA活性。

选择性可以用本领域已知的任何方法来测定，但最好是测定30％(w/v)葡萄糖缩合反应(该反应在pH4.4、55℃、0.05M乙酸钠缓冲液中进行)的异麦芽糖形成初始速度，然后测定30％(w/v)DE10麦芽糖糊精水解反应(该反应在pH4.4、55℃、0.05M乙酸钠缓冲液中进行)的葡萄糖形成初始速度。根据测得的初始速度，计算出异麦芽糖形成与葡萄糖形成速率之比。

热稳定性可根据本领域已知的那样进行，但最好是将酶培育在65-77.5℃之间以2.5℃为间隔的选定温度下，然后在35℃用4％麦芽糖作为底物进行活性分析。当发现有一级衰变时，象野生型GA那样测定衰变速度系数。根据不同温度下的速度系数计算出衰变的活化能。

pH最适点可如本领域已知的那样进行测定，但最好是在45℃、在2.2-7.0范围内的16个pH值下进行，用0.025M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，以麦芽糖或麦芽糖庚糖作为底物。

糖化作用如实施例中所述那样进行测定。简而言之，将葡糖淀粉酶和作为底物的DE10麦芽糖糊精置于55℃、pH4.4、0.05M乙酸钠缓冲液中培育。在0.5-288小时内的不同时间取样测定葡萄糖的产量。

本发明提供载体，该载体包括与本文公开的各种突变序列、突变组合及突变部分的核酸序列操作性联锁的表达控制序列。本发明还提供宿主细胞，选自合适的真核和原核细胞，它们用这些载体转化。

载体可由本领域技术人员构建成含有本发明的cDNA，载体应当含有实现其序列所需转录必须的所有表达元件。载体中还可包含其它有利特性，例如用来回收不同形式的核酸的机制。这里提供一些实施例。噬菌粒是这些有益载体中的一个具体例子，因为它们既可用作质粒，又可用作噬菌体载体。其它载体例子包括：病毒(如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒)、DNA病毒、粘粒、质粒、脂质体和其它重组载体。载体也可含有用于原核生物或真核生物宿主系统的元件。本领域普通技术人员知道那个宿主系统与特定的载体相容。

载体可以用本领域已知的许多方法(磷酸钙转染、电穿孔、脂质转染、原生质体融合、polybrene转染、弹道DNA传递、乙酸锂或CaCl转化)中的任何一种来引入细胞或组织中。宿主细胞可以是任何可用载体转化，并支持酶生产的真核和原核细胞。

上述讨论为真菌葡糖淀粉酶的热稳定性和选择性突变体、设计突变的方法以及筛选突变和含有这些突变的载体的累积效果提供了事实根据。下列非限制性的实施例及其附图显示了本发明采用的方法及用途。

                           实施例

分子生物学中的通用方法：本领域已知的分子生物学标准技术(这里不作具体描述)通常按下列文献进行：Sambrook等，Molecular Cloning:a LaboratoryManual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989)；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Rose等，Methods in Yeast Genetics:A Laboratory Course Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1990)。聚合酶链反应(PCR)一般根据PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications,Academic Press,SanDiego,CA(1990)进行。寡核苷酸用本领域已知的方法合成。例如可采用AppliedBiosystems 380B DNA合成仪。

材料：酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)C468(αleu2-3 leu2-112 his 3-11his 3-15mal)以及质粒YEpPM18由Cetus所赠。阿卡波糖由Miles Laboratories所赠。所有的限制性酶购自Promega,T4 DNA连接酶和pGEM-7Z(+)(一种大肠杆菌噬菌粒载体)也来自Promega。麦芽糖(G₂)、麦芽三糖(G₃)、麦芽四糖(G₄)、麦芽五糖(G₅)、麦芽六糖(G₆)、麦芽七糖(G₇)、葡萄糖氧化酶、过氧化酶和α萘酚购自Sigma。异麦芽糖(iG₂)购自TCI America。平均聚合度(DP)分别为10、6和4的DE10麦芽糖糊精购自Grain Processing Corporation。高效薄层层析(HPTLC)板(LHPK硅胶60_,20×10cm)来自Whatman。

定点诱变：定点诱变根据Kunkel等的方法[1985]进行，采用Bio-Rad的 Muta-Gene噬菌粒体外诱变试剂盒。将编码葡糖淀粉酶催化结构域的1.7kbXhoⅠ→BamHⅠDNA片段克隆入Stratagene的pBluescriptⅡKS(+)载体中。各具体实施例中提供了用作诱变引物的寡核苷酸。通过测序确认各个突变的存在，将每个突变的GA基因片段亚克隆入YepPM18[Cole等，1988]中，并用来转化酿酒酵母菌。

酶的生产和纯化：使酵母在30℃、pH4.5、5.3LSD+His培养基中(在5.0L发酵罐中)生长72小时产生野生型(WT)和突变型酶。在48小时时，补充加入300ml水含100g葡聚糖和22g(NH₄)₂SO₄。生长后，离心培养物，除去酵母细胞，超滤浓缩上清液，用pH4.5、0.5M NaCl/0.1M NaOAc透析，再用阿卡波糖-Sepharose亲和层析纯化。GA用pH7.6、1.7M Tris-Cl洗脱，用水透析，再超滤浓缩，用pH4.5、0.05M NaOAc缓冲液透析。按照Pierce双金鸡宁酸蛋白试验[Smith等，1985]，用牛血清白蛋白作为标准，测定蛋白质浓度。

酶活性测定：在50℃，用pH4.5、0.05MNaOAc缓冲液中的4％麦芽糖作为底物测定酶活性。一个国际单位(IU)的酶活性定义为在试验条件下产生1μmol/min葡萄糖所需酶的量。酶与底物混合后，在42分钟内每隔7分钟共取出六份100μl样品，用40μl、pH7.0、4.0M Tris-Cl终止反应，用Sigma的过氧化酶-葡萄糖氧化酶/邻联茴香胺葡萄糖试验试剂盒测定葡萄糖浓度。

不可逆热灭活测定：取一式两份的40μg/ml纯化的野生型和突变型酶。在65-80℃内相隔2.5℃的6个或8个温度下进行灭活。在6个不同的时间点取样，立即放在冰上并在4℃保藏24小时。如上所述，但在35℃下测定灭活样品和未经热灭活的相应样品的残余酶活性。

葡糖淀粉酶活性的pH依赖性：45℃、在2.2-7.0范围内的16个不同的pH值下测定葡糖淀粉酶活性的pH依赖性，用0.025M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液[McIlvane,1921]，以麦芽糖或麦芽糖庚糖作为底物。加入氯化钾，使柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液的离子强度保持在0.1。在下列底物浓度下测定游离酶和酶-底物复合物的pK值：(ⅰ)小于0.2K_m，这样初始速度(ⅴ)与k_cat/K_m成比例，(ⅱ)大于10K_m,这样初始速度(ⅴ)与k_cat成比例[Sierks&Svensson,1994，参见Whitaker(1994)Principle of enzymology for the food sciences，第二版，Marceel Dekker,NY]。用Enzfitter软件，将随pH值而变的初始速度代入公式logY=log[c/(1+H/K₁+K₂/H]中，计算出游离的酶和酶-底物复合物的两个催化基团的pK值。Y是在不同pH值下测得的感兴趣的参数的观察值(即k_cat/K_m或k_cat),C是Y的pH不依赖性值(即k_cat/K_m或k_cat的最大值)，H是氢离子浓度，K₁和K₂是酶催化基团的解离常数。当表观pK₁和pK₂的数值相差不到3个pH单位时，通过公式(H⁺)₁+(H⁺)₂=K₁+4(H⁺)_opt和 ${\left(H^2\right)}_{\mathrm{opT}}=\sqrt{k_1{k}_2}$ 来调节此pK值[Whitaker,1994]。氢离子在最适pH下的浓度(H⁺)_opt通过PHopt来计算，而PH_opt等于表观pK₁和pK₂的平均值。当pH值分别等于表观pK₁和pK₂时，(H⁺)₁和(H⁺)₂(表观K₁和K₂)分别对应于氢离子浓度。

DE10麦芽糖糊精的水解(糖化)：水解在35℃和/或55℃(按文中所指)用0.05M、pH4.4乙酸钠缓冲液中作为底物的28％(w/v)DE10麦芽糖糊精进行，缓冲液中加入0.02％叠氮钠来抑制反应混合物中微生物的生长。野生型和突变型GA的酶浓度均为2.64μM。在不同时间(从0.5至288小时)取样，将样品加入相同体积的pH7.0、1M Tris-HCl缓冲液中来终止反应，因为Tris是一种已知的葡糖淀粉酶抑制剂[Clarke&Svensson,1984]。用葡萄糖氧化酶方法测定葡萄糖的产量[Rabbo&Terkildsen,1960]。将试验数据代入公式c=At(1+Bt)，测得葡萄糖产生的初始速度，其中c为产物浓度，t为时间，A(初始速度)和B通过非线性回归获得。在55℃，只用70小时前的时间点来进行计算，因为在那时野生型GA的葡萄糖产生已经衰退。

葡萄糖缩合反应：葡萄糖缩合反应在35℃和55℃下、以30％(w/v)D-葡萄糖为底物，在pH4.4、0.05M乙酸钠缓冲液中进行12天，缓冲液中加入0.02％叠氮钠来抑制反应混合物中微生物的生长。野生型和突变型GA的酶浓度均为2.64μM。在不同时间取样，将样品加入相同体积的pH7.0、1M Tris-HCl缓冲液中来终止反应。根据Robyt等描述的改良方法[Bobyt和Mukerjea,1994]，用高效薄层层析(HPTLC)和图象光密度仪测定异麦芽糖的产生。将不同稀释度样品和6份不同浓度的标准品(含有葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖)各1μl用于HPLTC平板。显影溶剂系统含有乙腈、乙酸乙酯、1-丙醇和水，其体积比为85∶20∶50∶40。在HPLTC平板上只用升高一度来显影糖类分离物。显影后，平板空气干燥，将平板浸在含有0.3％(w/v)α-萘酚和5％(v/v)H₂SO₄的EtOH溶液中，再次空气干燥，120℃培育约10分钟，使糖可视化。用图象光密度仪(Bio-Rad,Model GS-670)、分子分析软件(Bio-Rad)定量测定HPTLC平板上异麦芽糖点的密度。将试验数据代入公式c=At/(1+Bt)(前文DE10麦芽糖糊精水解中已述)中，获得异麦芽糖产生的初始速度。

                            实施例1

             通过脯氨酸取代使泡盛曲霉葡糖淀粉酶稳定

下列实施例是用于分析葡糖淀粉酶单个突变的方法和步骤的一个典型例子。为了研究控制泡盛曲霉葡糖淀粉酶热稳定性的机理，构建了三个脯氨酸取代突变。预计这些突变能通过降低酶的去折叠构象熵来增加GA稳定性。

泡盛曲霉葡糖淀粉酶(α-1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3；GA)是一种催化淀粉及相关寡糖非还原性末端释放β-葡萄糖的酶。GA用于在商业上将淀粉转变成富含葡萄糖的糖浆并确定了转变的速度限制步骤，而含高葡萄糖的糖浆经葡萄糖异构酶转变成果糖糖浆，或者GA用于发酵生产乙醇。在工业上，GA在55-60℃下使用；在更高温度下，此酶会迅速地、不可逆地失活。因此，热稳定性增加的GA突变体在工业上有益于减少反应时间和/或增加固体浓度。

以前的研究工作表明，寡聚1,6-葡糖苷酶[Suzuki等，1987]和支链淀粉酶[Suzuki等，1991]的天然稳定性与蛋白质中脯氨酸的摩尔百分数呈正相关，并且还提出了蛋白质稳定性的一般规律[Suzuki,1989]。该工作的延伸研究显示，噬菌体T4溶菌酶[Matthews等，1987]和蜡状芽胞杆菌ATCC7064寡1,6葡糖苷酶[Watanbe等，1994]可通过将脯氨酸工程改造入所选位点而稳定化，从而减少了蛋白质的去折叠构象熵。

根据结构和进化的考虑，选择三个位点(Ser30、Asp345和Glu408变为Pro)用脯氨酸代替。用克隆的泡盛曲霉基因来构建这些位点处的突变[Innis等，1985]，并在酿酒酵母菌中表达这些蛋白[Cole等，1988]。通过不同温度下它们对不可逆热灭活的抗性，来测定突变型蛋白的稳定性。如本文所示，Ser30变为Pro的突变增加了GA稳定性。然而，出乎意料的是，Glu408变为Pro的突变降低了其稳定性，而Asp345变为Pro的突变没有显著改变GA稳定性。

定点诱变：定点诱变如本文上述的那样进行。下列寡核苷酸用作诱变引物：CAGAG TCCGC GCCCG GCACC CAAGC ACCGTC(Ser30→Pro)(SEQ ID NO:3)、AAGTC CAGCG ACACA GGTGT GACCT CCAAC GAC(Asp345→Pro)(SEQ IDNO:4)、CGAGC GGAAA GCTGC GGGCC ATCAG ACTTG TC(Glu408→Pro)(SEQ ID NO:5)。

脯氨酸取代位点的选择：根据结构已知的泡盛曲霉X100 GA几乎已明确的催化结构域[Aleshin等，1992]，选择三个取代位点，它们符合下列标准：1)Ramachandran(φ,ψ)角度在脯氨酸允许值范围内[Ramachandran等，1963]。对此，取代位点处φ和ψ角度限定在宽范围内，φ=-90°到-40°,ψ=120°到180°或φ=-90°到-40°,ψ=-50°到10°。2)残基应充分暴露在溶剂中，因为认为酶核心中的残基突变更可能降低酶的催化效率。3)残基不参加与其它氨基酸的氢键形成。另外，根据其它生物GA的序列比较[Coutinho和Reilley,1994b]，只选择符合上述结构标准和不很保守的残基用于突变。在Hormoconis grisea var thermodiea和H.resiaeGamP的GA中，Ser30可匹配脯氨酸，这就使得Ser30被脯氨酸取代有特别的吸引力。

结果

比活性

在50℃、pH4.5时，没有一种脯氨酸取代的突变显著改变了野生型和突变型GA的酶比活性。这揭示，这些突变没有显著改变活性位点周围的酶结构，或其与底物的相互作用。

不可逆热稳定性

按照试验步骤中所述，使野生型和突变型GA在pH4.5下受热灭活。作残余活性百分数随灭活时间的半对数图，获得灭活速度系数(kd)。图1显示野生型及突变型GA的温度和Kd之间的关系。根据这些数据，用过渡态理论和熔解温度(Tm，在此温度下10分钟后估计50％的酶被灭活)计算热灭活的活化能(ΔG′)(表1)。可以看出，Glu408→Pro突变大大降低了GA稳定性，Asp345→Pro突变不明显改变GA稳定性，而Ser30→Pro突变则增加了GA稳定性。

应当注意，尽管表1显示Asp345→Pro突变型GA显示AG′和Tm稍有增加，但是这些变化一般不明显，或者说，Asp345→Pro突变型GA并不比野生型更稳定，因为该突变型酶在两个相差较大的温度(65℃和75℃)时的kd基本上与野生型没有区别(图1)。

在测定脯氨酸取代突变抵抗不可逆热灭活的能力时，此类突变有不同的热稳定性。与野生型GA相比，Glu408→Pro降低了GA稳定性，Asp345→Pro不明显改变GA稳定性，而Ser30→Pro突变则增加了GA稳定性(图1和表1)。

Glu408→Pro使GA不稳定。正如Schimmel和Flory于1968年首次提出并由其他人[MacArthur和Thornton,1991；Hurley等，1992]扩展的那样，脯氨酸不仅限制了其存在位点处的φ和ψ值，而且还限制了前一残基的φ和ψ值。这些报道提出，脯氨酸之前Xaa到Pro内所有残基的(φ,ψ)值应限制在大约φ=-180°到-55°,ψ=55°到180°，或φ=-180°到-55°,ψ=-30°到-70°，但Xaa-Gly除外，φ值范围仍然适用，但是延伸到包括φ=45°到180°。在公开的泡盛曲霉X100催化性结构域的结构[Aleshin等，1992]中，与泡盛曲霉GA中Glu408匹配的Asp408(φ=-65°,ψ=146°)的φ、ψ值在脯氨酸可接受的范围内。然而，前一个残基Gly407(φ=80°,ψ=-5°)的φ、ψ值却在脯氨酸前面位置的可接受范围之外。难怪Glu408→Pro会使GA不稳定。另外，X-射线晶体图揭示，密切相关的泡盛曲霉X100GA²中位置408在β链(不适合脯氨酸取代的位点)中。

Asp345(φ=-65°,ψ=-26°)和前面的Thr344(φ=-116°,ψ=178°)的φ、ψ角度值均在345位脯氨酸取代允许值范围内。然而Asp345→Pro突变型GA并没有表现出与野生型GA明显不同的稳定性。这特别出乎预料，因为345位处在一个α螺旋的N端；以前的研究显示，该位置对于脯氨酸取代是特别有利的[Watanabe等，1994]。

Ser30(φ=-49°,ψ=130°)之前是Va129(φ=-127°,ψ=46°)，两者均有可接受的φ和ψ角度值，只是Va129的ψ=46°稍稍低于30位脯氨酸取代的理想值。

总之，当在酿酒酵母菌中表达时，Glu408→Pro降低了酶的稳定性，Asp345→Pro不明显改变GA稳定性，而Ser30→Pro则大大增加了酶的稳定性。当在65℃到77.5℃之间测定时，Ser30→Pro突变型GA表现出显著降低的不可逆热灭活速度，酶活性没有降低。在65℃，呈现热灭活速度系数比野生型GA降低1.7倍，而热灭活的活化能比野生型GA增加1.6KJ/mol。

                          实施例2

                      工程改造的二硫键

下列实施例是分析葡糖淀粉酶单个突变中采用的方法和步骤的典型例子。认为GA热灭活过程是由形成不正确构象的酶所支配的[Munch和Tritsch,1990]。以前的研究支持这一假设。用定点诱变来消除脱酰胺和肽水解的位点[Chen等，1994a,b]。在pH4.5、低于70℃时，相应的突变Asn182→Ala和Asp257→Glu使不可逆热灭活速度降低，但在高于70℃时却使不可逆热灭活速度增加。因此，GA热灭活主要是由于“混乱的”结构而不是脱酰胺和肽水解所引起。而且，突变Gly137→Ala、Gly139→Ala和Gly137/139→Ala/Ala降低了螺旋的柔性，在高达75℃时通过减缓不正确结构的形成明显增加热稳定性(Chen等，1996)。

为了通过防止不正确结构的形成来改进蛋白质的热稳定性，提出了几种策略，包括引入共价键如二硫键(Perry和Wetzel,1984；Wetzel,1987；Matsumura等，1989,Clarke和Fersht,1993)。

在泡盛曲霉GA中，总共有9个半胱氨酸残基，其中8个形成了二硫键配对并假设增强了GA的折叠和稳定性，它们是残基210和213、262和270、222和449[Aleshin等，1992]以及509和604[Williamson等，1992b]。在本实施例中，在GA中引入了附加的二硫键，以研究其对热稳定性和催化活性的影响。构建两个工程二硫键突变，命名为A27C/N20C(简写为S-S)和A471C/T72C。A27C/N20C形成的新二硫键将螺旋1的C端(Asn20)和Ala27残基所在的转角连接起来，而A471C/T72C将螺旋3的N-端和30个残基的高度O-糖基化带区的末端桥连在一起。二硫键在发酵后自发形成，它们对GA的热稳定性和催化活性有不同的作用。

定点诱变：如上所述进行定点诱变。所用的寡核苷酸引物是：5′-CGT ACTGCC ATC CTG TGT AAC ATC GGG GCG GA-3′(N20C,AAT→TGT)(SEQ IDNO:6)、5′ATC GGG GCG GAC GGT TGT TGG GTG TCG GGC GCG-3′(A27C,GCT→TGT)(SEQ ID NO:7)、5′-CGA AAT GGA GAT TGC AGT CTC-3′(T72C,ACC→TGC)(SEQ ID NO:8)、5′-G AGT ATC GTG TGT ACT GGC GGC ACC-3′(A471C,GCT→TGT)(SEQ ID NO:9)，有下划线的字母表示核苷酸突变。

SDS-PAGE和巯基滴定(thio-titration)：按照Garfin[1990]的方法，用0.75mm厚的10％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。对于巯基滴定，将浓度为2mg/ml的GA在变性溶液中煮沸10分钟变性，该变性溶液含有2％SDS、0.08M磷酸钠(pH8.0)、0.5mg/ml EDTA[Habeeb,1972]，含或不含50mM DTT[Pollitt和Zalkin,1983]。用Centricon 30浓缩器(Amicon,MA,USA)浓缩变性的GA(还原的或未还原的)，将还原的GA上样于Bio-spin30层析柱(Bio-Rad,CA,USA)，该样品预先用变性溶液平衡以除去DTT。所得溶液以及未还原的变性GA样品分成两部分。一部分用于蛋白质浓度测定；另一部分用于巯基还原测定，方法是将该部分与含4mg/ml DTNB的变性溶液以30∶1的体积比混合，然后在室温下培育15分钟，测定412nm下吸光度，一个摩尔吸收值为13600M^-1cm^-1[Habeeb,1972]。

GA活性试验：如上所述，在酶动力学研究中用麦芽糖作为底物。如前所述[Chen等，1994b]，在35℃、pH4.5下浓度范围在0.2K_m至4K_m间。用ENZFITTER程序分析动力学参数。在残余酶活性试验中，条件与酶动力学研究中的条件一样，只是用一个浓度的麦芽糖(4％)作为底物。在50℃、pH4.5下以4％麦芽糖为底物进行比活性测定。一个国际单位(IU)定义为在试验条件下每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶量。为了比较野生型和突变型GA催化活性的最适温度，用4％麦芽糖作为底物，在pH4.5、不同的温度下测定活性。

不可逆热灭活：如上所述，在65℃至75℃内以2.5℃为间隔的5个不同温度下，在0.0SM NaOAC缓冲液(pH4.5)中培育40μg/ml的纯化野生型或突变型GA蛋白。在6个不同的时间点取出等份培育的酶，在冰上速冷，4℃保藏24小时，再进行残余活性测定。GA的不可逆热灭活遵循一级动力学[Chen等，1994b]。如前所述测定热灭活速度系数k_d[chen等1994b]。

突变残基的计算机模型和三维观察：参照安装在DEC3100工作站中的SSBOND程序(Hazes和Dijkastra,1988)，用泡盛曲霉X100 GA的晶体结构[Aleshin等，1992](Brookhaven蛋白质数据库中的lgly)来制作形成二硫键的泡盛曲霉GA的候选残基模型。

突变位点的选择：选择残基Asn20、Ala27和Thr72、Ala471用半胱氨酸代替。在用SSBOND程序分析了泡盛曲霉X100 GA[Aleshin等，1992]的晶体结构后，发现有132对残基能有效地作为二硫键的位点。假定甘氨酸是该位点柔性所需要的，因此排除含有甘氨酸的残基对。同样，也除去涉及氢键和静电作用的残基。根据几何分析，选择残基20与27的配对以及72和471的配对作为形成二硫键的候选位点。相关GA间的氨基酸序列比较显示，在粗糙链孢酶(Neurosporacrassa)[Coutinho和Reilly,1994b]中位置20和27间有一个二硫键，提示在泡盛曲霉GA的位置20和27之间引入二硫键不会引起不利的相互作用。另外，20/27二硫键会将螺旋1的C-端与参与底物结合的GA保守的S1片段连接在一起[Coutinho和Reilly,1994a]，形成一个环状结构，该环与对催化非常关键的含有Trp120(参与底物结合的一个残基[Sierks等，1989])的另一个环靠近。因此，预计建议的20/27二硫键通过保持催化及底物结合的正确构象而使GA稳定。

另一候选的二硫键配对在位置471和72之间。该二硫键会将螺旋3的N-端和30个残基(440-470)的富含O-糖基化的带区连接起来形成一个环状结构。该二硫键还在催化结构域和O-糖基化连接体(linker)之间形成一个附加键。已经证明，该O-糖基化连接体对于GA的热稳定性非常重要，它限制了GA去折叠肽所需的构象空间[Semimaru等，1995和Williamson等，1992]。由于这个连接，该二硫键对GA的热稳定性有整体影响。泡盛曲霉X100 GA[Aleshin等，1992]中Thr72的侧链-OH基团与Asp73的主链N原子形成氢键。然而，发现在泡盛曲霉GA中，残基73的Asp被丝氨酸代替。泡盛曲霉GA的残基72和73之间可能不存在氢键，因此用Cys代替Thr72不会干扰该作用。显然，氢键对GA来说并不重要，因为在其它GA中，Thr72被Ala、Lys或Val代替[Coutinho和Reilly,1994b]。

工程二硫键的自发形成：在GA纯化后，通过下列两种方式发现自发形成工程二硫键。

第一，在非还原的条件下进行SAS-PAGE时，突变型A471C/T72C的移动比野生型快，提示附加的二硫键形成了一个阻碍迁移的新环状结构。通过突变型cDNA的DNA测序和MALDI分析，排除了该种情况时形成截短的酶的可能性。MALDI数据显示，该突变型GA的分子量与野生型GA相同。突变A27C/N20C的迁移率与野生型GA相同，这可能是由于工程二硫键形成的附加环太小(7个残基)不能影响迁移率的缘故。

第二，巯基滴定证明了这个新的二硫键。通过比较还原剂DTT处理前后的游离巯基数，推断出突变型和野生型GA中的二硫键总数(列在表2中)。根据还原剂DTT存在下的[SH]/分子之比，野生型、A27C/N20C和A417C/T72C GA的游离巯基分别为8.6、10.9和10.4(表2)。缺乏DTT时，总数分别为0.9、0.9和1.3(表2)。这提示野生型、A27C/N20C和A471C/T72C中二硫键数目分别是4、5和5。因此，引入的半胱氨酸残基形成了二硫键而不是维持游离巯基。

酶活性和催化的最适温度：如表3所示，与野生型相比，在35℃和50℃时双重突变A27C/N20C和A471C/T72C的酶性能没有改变，而单个突变明显降低了活性。A27C/N20C和A471C/T72C突变体50℃时的比活性和35℃时的动力学参数，与野生型GA非常接近(表3)。单突变A27C的K_m稍有增加，但是k_cat值与野生型GA相同，因此，其k_cat/K_m比值降低约30％。突变N20C有相同的K_m，但是k_cat和k_cat/K_m之比均降低，50℃时比活性减少50％以上。

GA的不可逆热灭活：研究了65℃、67.5℃、70℃、72.5℃和77.5℃时野生型和突变型GA的不可逆热灭活情况，其一级不可逆热灭活系数k_d见图2。突变A27C、A27C/N20C和A471C/T72C在所测温度范围内的K_d值小于野生型GA，这意味着其活性的衰退比野生型更慢，而突变体N20C在除75℃外的所有温度下K_d值均大于野生型，这意味着N20C比野生型衰退得更快。

表4显示根据过渡态理论计算得到的野生型和突变型GA在65℃和75℃时的活化焓(Δ )、熵(Δ

)和去折叠自由能(Δ )。N20C和A27C/N20C的焓分别减少42和24KJ/mol，而A27C和A471C/T72C的焓没有发生显著改变。突变体N20C和A27C/N20C的熵分别减少115KJ/mol和75KJ/mol，而突变体A27C和A47lC/T72C的熵显示出没有显著变化。突变体A27C和A47lC/T72C在65℃和75℃时的Δ 稍稍高于野生型GA(＜0.5KJ/m01)，而A27C/N20C在65℃和75℃时的Δ 分别比野生型高1.5KJ/mol和2.2KJ/mol。突变体N20C在65℃和75℃时的Δ

分别比野生型GA少3.0KJ/mol和1.8KJ/mol。因此，与野生型GA相比，工程二硫键突变体A27C/N20C显著地提高了GA热稳定性，而单个突变体则使热稳定性稍有增加(A27C)或稍有降低(N20C)。其他二硫键突变体的热稳定性与野生型GA相同。

实施例3

突变A27C/N20C与其它突变的组合

在以前的研究中，申请人已经构建了热稳定性突变体G137A[chen等，1996]和S436P(Li等，1996)，这些突变体有组合并附加改善热稳定性的潜力。在本实施例中，将这些突变相互组合并与A27C/N20C(S-S；实施例2)组合，测试它们对热稳定性和GA活性的效果(累积/叠加效果)。

酶活性和催化最适温度：与野生型GA相比，组合突变体A27C/N20C/G137A和A27C/N20C/S436P的比活性增加，而突变体Gl37A/S436P的比活性与野生型GA相似。双重突变体A27C/N20C和A471C/T72C以及组合突变体A27C/N20C/G137改变了催化的最适温度。

在60℃至74℃温度下相对活性试验(表3)显示，野生型、突变体A27C/N20C以及A47lC/T72C分别在71℃、72℃和72.5℃有最高的活性。在60℃到67.5℃下，突变型和野生型GA有非常相似的活性。然而，当温度超过70℃时，它们的相对活性有很大的不同。突变体A27C/N20C和A27C/N20C/G137A的活性在70℃到76℃时始终高于野生型(峰值在72.5℃)，而突变体A471C/T72C在70℃到71℃以及73℃到74℃时的活性低于野生型，但在72℃(是其最适温度)时高于野生型。因此，突变体GA A27C/N20C、A47lC/T72C以及组合突变体A27C/N20C/G137A的最适温度比野生型GA高1.5℃。

GA的不可逆热灭活性：在65℃、67.5℃、70℃、72.5℃和77.5℃下研究了野生型和突变型GA的不可逆热灭活情况，其一级不可逆热灭活系数k_d见图2。突变体A27C、A27C/N20C和A47lC/T72C、A27C/N20C/G137A、A27C/N20C/S436P和G137A/S436P在所测温度范围内的k_d值小于野生型GA，这意味着其活性衰退比野生型慢，而突变体N20C在除75℃外的所有温度下的k_d值均高于野生型，这意味着N20C的活性衰退比野生型快。

表4示出了根据过渡态理论计算得到的野生型和突变型GA在65℃和75℃时的活化焓(Δ )、熵(Δ )和解折叠自由能(Δ

)。

螺旋柔性突变体G137A在与S436P或A27C/N20C组合时显示出有附加的热稳定性。S436P和A27C/N20C的组合没有显示出附加作用。

实施例4

组合突变对的进一步研究

为了进一步研究各个稳定化突变，是否能累积地使泡盛曲霉葡糖淀粉酶(GA)稳定，构建了含有热稳定化突变组合的突变型酶。以前的研究显示，下列突变使GA稳定(表现为缺乏糖类被灭活时，不可逆热灭活速度降低)：Ser30→Pro(S30P；实施例1)、Glyl37→Ala(G137A)、以及Asn20→Cys/Ala27→Cys(在残基20和27之间产生一个二硫键，为方便起见称为S-S；实施例2)。为了研究各个稳定化突变是否能累积地使GA稳定，用这三种突变制得其它组合的突变型酶。

定点诱变：用上文列出的S-S/S30P寡核苷酸和一个单链DNA模板构建了S-S/S30P/G137A组合突变体，该模板衍生自pBluescriptⅡKS(+)载体，它具有编码GA催化性结构域的1.7kb XhoI→BamHⅠDNA片段，该片段中已经含有赋予S30P和G137A氨基酸取代的突变。通过测序确认各个突变的存在，将每个突变的GA基因片段亚克隆人YEpPM18中[Cole等，1988]，转化入酿酒酵母菌。

巯基分析：将一式两份10nmol野生型、S-S/S30P和S-S/S30P/G137A突变体GA培育在0.2mM 5,5′-二硫二(2-硝基苯甲酸)、6M GdnHCl和50mM Tris(pH8)中[Fierobe等，1996]。根据用0-30μM半胱氨酸建立的标准曲线计算巯基浓度。

不可逆热灭活：使一式两份的野生型和突变型GA在65℃至80℃之间相隔2.5℃的6个或7个温度下热灭活。4℃保藏24小时后，35℃分析灭活样品的残余活性，以及相应的未灭活样品的活性[Chen等，1996]。

糖化分析：用搅拌加热模块(stirring heating block)进行糖化，一式两份，并用密封小瓶防止蒸发。用pH4.5、0.05M NaOAc中的28％(w/v)Maltrin DE10麦芽糖糊精作为底物，测定8μg/ml的野生型和突变型GA。在不同的时间取样，以pH4.5、0.05M NaoAc适当稀释，将100μl稀释样品加入40μl 4.0M tris-Cl,pH7.0中来终止反应。用葡萄糖氧化酶/邻联茴香胺试验测定葡萄糖浓度[Banks和Greenwood,1971]。

结果

酶活性

表5显示了在50℃、pH4.5、以麦芽糖为底物时野生型和突变型GA的比活性。没有一种突变体GA表现出酶活性减少，而S30P/G137A和S-S/S30P/G137A突变体在50℃时比野生型活性略高。为进一步研究这一观察结果，在35℃到68℃之间的不同温度下测定这些突变型酶的活性(表4)。S30P/G137A和S-S/S30P/G137A突变体GA在所有的测定温度下均比野生型更具活性。

巯基分析

确认Asn20→Cys/Ala27→Cys突变体GA中位置20和27之间有二硫键形成(实施例2)。表6显示对S-S/S30P和S-S/S30P/G137A组合突变体的巯基分析结果。泡盛曲霉GA在位置320处有一个游离的半胱氨酸。组合突变体GA显示出每分子的巯基含量略高于野生型，这反映出位置20和27之间距全部形成二硫键还差一些。但是，如果二硫键完全没有形成的话，则[SH]/蛋白质预计会由于加入的两个游离半胱氨酸残基而增加大约3倍。因此，我们得出结论，实际的二硫键形成为其全部形成理论值的70-80％。

不可逆热灭活

使野生型和突变型GA在pH4.5、65℃至80℃之间经受热灭活。制作残余活性对灭活时间的半对数图，获得灭活速度系数(kd)。图5显示温度对于野生型和突变型GA的kd的影响。可以看出，组合的突变体明显比单个突变型酶更稳定。另外，通过热灭活曲线的外推计算出10分钟后50％的酶被灭活的温度(Tm)，用过渡态理论计算热灭活的活化能(Δ

)。表7显示组合突变型GA的Δ

和Tm相对于野生型GA的变化(ΔΔ )。这些数据清楚地证明了，将单个稳定化突变组合起来可以累积地使酶稳定化。

糖化分析

图6显示，在55℃和65℃对野生型、S30P/G137A和S-S/S30P/G137A GA的糖化分析结果，采用工业用DE10麦芽糖糊精底物Maltrin M100(28％w/v)(来自Grain Processing Corporation)。28％w/v DE10麦芽糖糊精完全转变成葡萄糖会产生1.7lM的葡萄糖糖浆，然而，我们实验室以前的糖化分析已经证明，野生型GA在55℃下会产生大约90％的理论最大葡萄糖产量(未显示)。在55℃下没有发现野生型和突变型酶的葡萄糖产生有明显不同，但是，在65℃时突变型GA比野生型多生产8-10％，虽然两种测试的酶均不能产生象55℃时那样多的葡萄糖，可能是由于反应温度升高有热灭活的缘故。

总之，这些数据显示，在分析65℃-80℃之间抗不可逆热灭活的能力时，S30P/G137A双重突变型酶比任一种单突变GA更稳定。S-S/S30P组合的突变型GA也比S30P或S-S突变型GA稳定。S-S/S30P/G137A组合突变体是构建的GA变种中最稳定的，尤其是超过70℃在没有单糖或多糖的缓冲系统中被灭活时。糖化分析显示，在升高的温度下，突变型酶的效率比野生型GA更好。重要的是，50℃分析时没有一种组合突变型GA表现出酶活性减低。

讨论

突变位点

如实施例2所述，突变Asn20→Cys和Ala27→Cys在α螺旋l的C端和α螺旋l与2间的延伸环之间形成一个二硫键。设计S30P和G137A以减少酶的去折叠构象熵来使酶稳定，它们分别是一系列脯氨酸取代(Xaa→Pro)和Gly→Ala突变中最具稳定化作用的。Ser30位于α螺旋1和2之间延伸环状结构上Ⅱ型β转角的第二个位置，而Gly137位于第四个α螺旋的中部。

应当特别注意S30P的立置和形成突变的二硫键。位置20和27之间形成的二硫键；与位置30非常接近。形成突变的二硫键和S30P均能使GA稳定的事实提示，酶的这个区域对于不可逆热灭活非常关键，它可能代表了对于热灭活来说很重要的局部去折叠区域。而且，以前的研究者和提出，在一级序列中脯氨酸周围的四个氨基酸内不应工程改造加入二硫键[Balaji等，1989]。本实施例证明了这一规律并不是绝对的，因为巯基分析显示S-S/S30P和S-/S30P/G137A组合突变体中形成了二硫键，而热灭活研究显示突变的稳定化效果是累积的。

累积的稳定化作用

申请人以前的研究工作示，将两个稳定化突变组合起来不一定能使GA稳定[Chen等，1996]。然而，目前的研究(通过测定抗不可逆热灭活的能力)证明，将稳定化突变组合(甚至是在蛋白质中彼此相距非常近的突变)起来能够累积地使GA稳定。

S30P/G137突变体表现出在低温(65℃-70℃)时高于叠加稳定化作用，但在高温(77.5℃-80℃)时低于叠加稳定化作用(图5F和表7)。80℃,S30P/G137A组合突变体的灭活速度与S30P单突变型蛋白几乎相同。说明这两个区域对于低温热灭活均非常重要，但在高温时灭活由其它过程控制。

令人有些惊奇的是，将S30P与二硫键形成突变组合起来导致累积稳定化作用。这不仅仅是因为工程二硫键离工程脯氨酸非常近(如上所述)，而且还因为两者寻靶蛋白质的同一区域(即α螺旋1和2之间的延伸环)。原先预计二硫键或S30P可使该区域最大程度地稳定，以及该部位的进一步稳定不会再使酶功能更加稳定。如同图5B所见，事实并不是这样。突变的组合在65℃-80℃之间所有温度下均导致了差不多的叠加稳定化作用，

S-S/S30P/G137A组合突变体在低温(65℃-70℃)时并不比S30P/G137A GA更稳定，但却在较高温度(75℃-80℃)时稍微更稳定(图5C和表7)。令人感兴趣的是，S-S/S30P GA在高温时比S30P/G137A更稳定。因此，这显示出引入的二硫键高温时使GA稳定特别有效。

                          实施例5

                          工业应用

为了确定热稳定化突变S30P/G137A和S-S/S30P/G137A能否在工业条件下增强GA性能，用野生型和突变型酶进行高温糖化(图6)。糖化分析结果显示，突变型酶在65℃时的性能优于野生型；但在55℃时却不，这可能因它们的稳定性增加而致。

结论

在65℃-80℃之间分析，不可逆热灭活速度比任一单突变酶都低的事实，证明了S30P/G137A双重突变体使GA累积地稳定化。同样，S-S/S30P组合突变体也证明有累积的稳定化作用。S-S/S30P/G137A组合突变体比任何一个“双重”突变体都更稳定，尤其在温度超过70℃时。在35℃-68℃之间进行测定时，S-S/S30P组合突变体的活性与野生型相同，而S30P/G137A和S-S/S30P/G137A突变体的酶活性增加10-20％。当S30P/G137A和S-S/S30P/G137A突变体GA在65℃、1.71M葡萄糖存在下灭活时，其热灭活速度相对于野生型大约减少了3倍。另外，55℃糖化工业用底物Maltin M100时，这些突变型GA和野生型之间葡萄糖产量没见差别，而在65℃时S30P/G137A和S-S/S30P/G137A GA生产了比野生型多8-10％的葡萄糖。

                       实施例6

                   提高选择性的突变

底物与GA亚位点1和2处带电荷残基间的相互作用在底物专一性方面起着至关重要的作用，因为催化位点位于这些位点之间。因此，设计突变，并分析以确定这些区域中能提高酶反应专一性的突变所在的残基位置。此外，还设计了几个具有热稳定性以及能提高pH最适点的突变，筛选其选择性。

定点诱变：定点诱变如本文上述的那样进行。在Iowa State University NucleicAcid Facility合成下列诱变性寡核苷酸引物：5′-GGT CTC GGT GAG CCC AGGTTC AAT GTC GAT-3′(Lys108→Arg；SEQ ID NO:10),5′-GGT CTC GGT GAGCCC ATG TTC AAT GTC GAT-3′(Lys108→Met；SEQ ID NO:11),5′-GAG GACACG TAC TGG AAC GGC AAC CCG-3′(Tyr312→Trp；SEQ ID NO:12)和5′-TACCCT GAG GAC ACG TAC AAC GGC AAC GGC AAC TCG CAG GGC AAC CCGTGG TTC CTG TGC-3′(311-314Loop；SEQ ID NO:13)，下划线字母表示改变或加入的核苷酸。

结果

酶的动力学

如表11所示，在pH4.4、0.05M乙酸盐缓冲液中45℃水解G₂至G₇以及iG2的动力学参数k_cat和K_m列在表8中。311-314Loop突变体对所有α-(1,4)-键合底物的k_cat值为50-80％，而对iG₂只有30％，对所有底物的K_m值为50-75％。而Gly137→Ala/Ser30→Pro GA对所有底物的k_cat值通常比野生型GA高10-30％。Gly137→Ala/Ser30→Pro GA对所有α-(1,4)-键合底物的K_m值约为一半到两倍，而对iG₂则基本上达到野生型水平。工程改造成携带有三重突变(S-S/Gly137→Ala/Ser30→Pro)的GA对所有底物的k_cat值通常在80-120％之间，而对所有底物的K_m值为野生型GA的30-80％。S-S GA对于所有底物的k_cat值为85-100％,K_m值通常为90-110％。然而，S-S GA对于G₅和G₆的K_m值为140％和190％。Tyr→312Trp突变、组合的Ser30→Pro/Gly137→Ala双重突变、组合的S-S/Ser30→Pro/Gly137→Ala三重突变以及S-S工程化的GA的k_cat/K_m值分别为75-105％、60-110％、60-110％和60-120％。311-314Loop GA对所有α-(1,4)-键合底物的催化效率为85-120％，而对于iG₂却只有野生型GA的50％。

表8显示了野生型和突变型GA对G₂至iG₂的催化效率之比。具有311-314Loop突变和Lys108→Arg突变的工程化GA对α-(1,4)-和α-(1,6)-键合底物分别具有最高(240％)和最低(20％)的催化效率。具有Tyr312→Trp和S-S突变的工程化GA对于该比值分别显示有50％和20％的增长。所有其它突变体的该比值较低，这表明α-(1,4)-水解能力相对于α-(1,6)-水解能力比野生型GA差。

麦芽寡糖水解

具有311-314Loop突变或S-S突变的工程化GA有最高的葡萄糖平均产量(图7)。311-314Loop GA有最低的葡萄糖生产初始速度(35℃、45℃和55℃分别为野生型GA的64％、61％和82％)，这是因为比活性只有野生型GA的60％(数据未显示)。葡萄糖浓度在达到最大值后降低，因为它转变成寡糖。

葡萄糖缩合反应

分析在35℃、45℃和55℃时30％(w/v)葡萄糖缩合反应中的IG₂浓度曲线。在所有三个温度下，具有Lys108Arg突变的工程化GA有最高的iG₂平衡浓度，而具有311-314Loop突变和S-S突变的GA有最低的iG₂平衡浓度。Tyr312→Trp、Ser30→Pro/Gly137→Ala和S-S/Ser30→Pro/Gly137→Ala GA表现出与野生型GA基本相同的iG₂平衡浓度。对于所有其它测试的工程化的热稳定GA，即Ser436→Pro,S-S/Ser436→Pro,S-S/Gly137→Ala和Gly137→Ala/Ser436→Pro，它们达到的iG₂平衡浓度均高于野生型GA。表9显示在30％(w/v)葡萄糖缩合反应中iG₂形成的初始速度。在所有三个测试的反应温度下，S-S和311-314Loop突变型GA有最低的初始速度。在所有被测试的突变型GA中Lys108→Arg突变型GA在所有三个反应温度下有最高的初始速度。除了Ser30→Pro/Gly137→Ala和S-S/Ser30→Pro/Gly137→Ala以外，所有测试的热稳定GA在35℃具有比野生型GA高得多的初始速度，但是在55℃时，它们降低到只稍稍高于或是几乎等于野生型GA的速度。

就α-(1,6)-键的合成相对于α-(1,4)-键的水解的专一性研究

计算30％(w/v)葡萄糖缩合反应中iG₂产生初始速度与30％DE10麦芽糖糊精水解中葡萄糖形成初始速度之比，以评价酶就α-(1,6)-键合产物的合成相对于α-(1,6)-键合底物水解的选择性。这些iG₂/葡萄糖比值以及野生型和突变型GA的相对比值显示在表9中。在野生型和所有突变型GA中、在所有反应温度下K108R和S-S突变体分别表现出最高和最低的相对比值。因此，K108R对于α-(1,6)-键的专一性比α-(1,4)-键更高，而S-S GA对α-(1,4)-键比α-(1,6)-键更具亲和力。311-314Loop GA在这三个温度下也显示出非常低的相对比值。

                          实施例7

                     叠加选择性突变分析

用本文上述的方法筛选叠加突变的选择性，如表10、图8和9中所示。

酶的动力学：观察45℃、pH4.4下α-1,6-键合的异麦芽糖和α-1,4-键合的麦芽寡糊精(DP2-7)水解的动力学参数(k_cat和K_m)(列在表10中)。突变体Y175F具有活性。k_cat和K_m值分别为野生型的83-141％和106-171％(对于不同的测试底物)，催化效率为野生型的69-102％。突变型R241K也具有活性。突变体S411G具有高活性。其k_cat和K_m值分别为野生型的93-129％和83-203％(对于不同的测试底物)，催化效率为野生型的55-122％。突变体S411A有近似于野生型的催化效率比。突变体Y116W、R241K和S411G的催化效率比低于野生型GA。

DE10麦芽糖糊精水解：在55℃下，具有突变S411A的工程化GA在216小时时达到约95％的最高葡萄糖产量，相比较，野生型的产量大约90％(图9)。除S411A以外所有的GA均能迅速达到它们的最高葡萄糖产量。S411A的葡萄糖产量随时间延长缓慢增长。55℃下葡萄糖生产的初始速度是35℃时的5-8倍。

葡萄糖缩合反应：用葡萄糖缩合反应来研究野生型和突变型GA在葡萄糖高浓度下合成异麦芽糖的能力(图8)。在DE10麦芽糖糊精的水解中采用相同浓度(2.64μM)的葡糖淀粉酶。

在55℃，尽管野生型、R241K和Y175F的异麦芽糖产生初始速度不同，但是这三个突变型GA在最后时间点时异麦芽糖产生达到的浓度却几乎相同(图8)，这说明异麦芽糖的产生接近平衡态。S411A和S411G的异麦芽糖产生远远低于野生型，而且几乎是其在35℃时的线性。出乎意料的是，Y116W的异麦芽糖产生有不同(更低)于野生型的平衡态。55℃时的异麦芽糖产生初始速度比35℃时大5-7倍。R241K在55℃时的异麦芽糖产生初始速度低于野生型，而其从35到55℃的异麦芽糖产生初始速度增幅(约5倍)也低于野生型的增幅(约7倍)。Y116W、Y175F、S411A和S411G从35℃到55℃的异麦芽糖产生初始速度的增幅分别约为7、6和5倍。

选择性：计算异麦芽糖产生初始速度(取自葡萄糖缩合反应)与葡萄糖产生初始速度(取自DE10麦芽糖糊精水解)之比，以评价α-1,6-键合产物的合成相对于α-1,4-键合底物的选择性。该比值代表在标准化DE10麦芽糖糊精水解活性水平下GA合成异麦芽糖的能力。

突变体Y175F、S411A和S411G的异麦芽糖产生初始速度与葡萄糖产生初始速度之比在35℃时分别比野生型低12％、35％和56％，而在55℃时分别比野生型低24％、60％和62％。R241K在35℃和55℃时的比值均与野生型非常接近。

                           实施例8

                      提供pH优化的突变

用本文上述的方法筛选附加突变S411G、S411A、S411C、S411H、S411D以提高的pH最适点(如图10、表11和12所示)。

酶动力学

表11中给出了α-1,4-键合的麦芽糖和麦芽七糖、α-1,6-键合的异麦芽糖在45℃、pH4.4下水解的动力学参数k_cat和K_m。突变体S411G葡糖淀粉酶比野生型更具活性，在测试的底物上，k_cat和K_m分别增加了13-30％和11-59％。催化效率(k_cat/K_m)为野生型的71-116％。突变体S411A保留了65-74％的野生型催化效率，其k_cat稍有减少，而K_m稍有增加。突变体S411C保留了54-73％的野生型催化效率，其k_cat和K_m值均减少。由于突变体S411H和S411D的k_cat大幅度减少而K_m增加，因此它们只有6-12％的野生型催化效率，故没有测定其异麦芽糖水解的动力学参数。只有突变体S411H和S411D的麦芽糖和麦芽七糖水解的过渡态能量有较大的增量Δ(ΔG)(5.5-7.5kJ/mol)。过渡态能量较大的增量表明，将组氨酸或天冬氨酸引入位置411处会使过渡态中GA与底物的结合变得很不稳定。

GA活性的pH依赖性

根据在低浓度(小于0.2K_m)和高浓度(高于10K_m)麦芽糖下获得的初始速度，计算野生型和突变型葡糖淀粉酶在不同pH值下水解麦芽糖的动力学参数k_cat/K_m和k_cat。根据pH对麦芽糖水解的k_cat/K_m和k_cat的影响来测定游离酶以及酶-底物复合物的pK值(表12)。尽管野生型GA在所有测试的pH值下催化效率(k_cat/K_m)高于所有突变型葡糖淀粉酶，但是突变体S411G和S411A在一些pH值下的k_cat值高于野生型。非复合的和麦芽糖-复合的S411H和S411D表现出比野生型更窄的带状曲线。

测定pH对野生型、S411G和S411A GA水解麦芽七糖的影响，以进一步用长度较长的底物(long-length substrabe)来研究酶-底物复合物的pK值和最适pH的变化。令人惊奇的是，不仅仅是S411G，而且S411A在最适pH下的活性也高于野生型。野生型GA的游离酶、麦芽糖-复合形式以及麦芽七糖-复合形式的pK1值(催化碱的电离)分别为2.77、2.11和2.6。野生型GA的游离酶、麦芽糖-复合形式以及麦芽七糖-复合形式的pK2值(催化酸的电离)分别为5.80、5.85和6.78[Bakir等，1993,Hiromi等，1966,Sierks和Svensson,1994]。与野生型相比，S411G突变麦芽糖-复合形式以及麦芽七糖-复合形式的pK1值增加约0.6个单位，而S411G对任一酶-底物复合物的PK₂均没有影响，它只对游离酶的pK1和pK2有较小的影响。S411G对pK1和pK2的组合影响是使麦芽糖-复配合形式和麦芽七糖-复合形式的最适pH提高了约0.3单位。

然而，S411G突变对游离酶的最适pH却没有影响。S411A和S411C对麦芽糖水解pH依赖性有相似的作用。S411A和S411C分别使游离酶和麦芽糖-复合形式的pK₁增加0.3-0.5单位和1.21单位。令人惊奇的是，S411A和S411C也使麦芽糖-复合形式的pK₂增加约0.5单位。另外，S411A使麦芽七糖-复合形式的pK₁和pK₂分别增加1.31和0.4单位。S411H使游离酶和麦芽糖-复合形式的pK₁分别增加0.33和1.47单位；然而，它使游离酶和麦芽糖-复合形式的pK₂分别减少0.79和1.16单位。S411D使游离酶和麦芽糖-复合形式的pK1分别增加0.36和1.23单位。S411D还使麦芽糖-复合形式的pK2减少0.32单位。对于野生型、S411G和S411A来说，麦芽七糖-复合形式的pK₁、pK₂和pH_opt分别比相应的麦芽糖-复合形式高大约0.5、0.9和0.7单位。对于S411G和S411A，用长度较长的底物(麦芽七糖)获得的pH最适点增量(与野生型相比)，与用长度较短的底物(麦芽糖)获得的pH最适点增量几乎相同。

位置411处的所有5种突变体显示出，酶-底物复合物的最适pH与野生型相比有0.15-0.87单位的变化(表12)(主要是由于pK₁值增加)。与其它突变体相比，S411A是pH效果最佳的突变体。S411A使最适pH提高了0.84单位，并且还保留了高水平的催化活性(k_cat)和催化效率(k_cat/K_m)。

麦芽糖糊精10的水解

通过28％(w/v)麦芽糖糊精的水解来研究在高浓度长底物时GA活性的pH依赖性。麦芽糖糊精10是平均(主要)聚合度为10的麦芽糖糊精混合物。测定11个不同的pH值下，麦芽糖糊精10水解时野生型和S411A葡糖淀粉酶产生的葡萄糖量，并用来计算不同pH值葡萄糖产生的初始速度(图10)。葡萄糖的产量按照双曲线增加。当pH值大于6.6时，S411A的葡萄糖产生初始速度高于野生型(图10)。

在整个申请中，列出了各出版物的作者、年份以及专利号。下面列出了出版物的全部引用内容。这些出版物和专利的公开内容全部纳入本文作参考，以便更完整地描述本发明相关领域的技术状况。

本发明是以例举的方式来描述，应当理解，采用的技术名词是描述性的文字而非限制性的文字。

显然，根据上述内容可以对本发明作许多改进和变动。因此，应当理解这些改进和变动都在本发明所附的权利要求的范围之内，本发明可以实施而非具体描述而已。表l突变型GA的Δ

和Tm相对于野生型的变化GA形式                ΔΔ

(kJ/m01.)    ΔTm(℃)Ser30→Pro            1.6                1.7Asp345→Pro           0.5                0.4Glu408→Pro           -7.2               -6.7

表2经过或未经DTT还原的野生型和突变型GA中DTNB可滴定的巯基数总结酶               [SH]/分子        二硫键数目^*

         DTT+          DTT-野生型       8.6           0.9       4A27C/N20C    10.9          0.9       5A471C/T72C   10.4          1.3       5^*二硫键数目=([SH]/分子(DTT+)-[SH]/分子(DTT-))/2

                 表3

    野生型和突变型GA的催化性能

GA类型       比活性          K_m       K_cat         K_cat/K_m

            (IU/mgGA)       (mM)       (s^-1)       (s^-1mM^-1)

野生型^a   20.6±0.2^b   O.72±0.03   8.67±0.17     12.0

A27C       14.9±1.1      0.86±O.11   8.02±O.45     9.3

N20C       8.1±O.5       0.70±0.05   3.97±0.12     5.7A27C/N20C     18.3±0.7     0.90±0.08   9.6l±O.40     10.7A471C/T72C    22.7±1.5     0.87±0.07   10.17±0.40    11.6A27C/N20C/S436  22.5±1.8       N/D^c          N/D         N/DA27C/N20C/G137A 24.2±0.8       N/D            N/D         N/DGl37A/S436P    25.O±0.9      N/D            N/D         N/D

^a在摇瓶中生产制得

^b标准差

^c未进行测定

                 表4

    野生型(WT)和突变型GA在pH4.5不可逆热灭活的活化参数GA形式            Δ

             Δ              Δ

(65℃)    Δ

(75℃)

              (kJ/mol)    (J/mol·K)    (kJ/mol)    (kJ/mol)WT^a             366±l^b      769±4       105.7        98.0A27C             370±l5       780±44      106.3        98.5N20C             324±ll       654±33      102.7        96.2A27C/N20C          342±16       694±46      107.2        100.2A471C/T72C         365±9        768±26      106.0        98.3A27C/N20C/S436P    352±6        724±18      107.9        100.7A27C/N20C/G137A    362±l        751±2       108.4        100.9Gl37A/S436P       362±20       752±57      107.7        100.2

S436P^c        35l±8        723±24      106.2        99.0

G137A^d        330±6        661±17      106.5        99.9

^a用摇瓶制得

^b标准差

^cLi等，1 996

^dChen等，1996

表5野生型和突变型GA的比活GA形式                比活^a(IU/mg)野生型                 21.1±0.1S30P/Gly137A           24.0+1.2S-S/S30P               21.2+0.5S-S/S30P/G137A         24.5+0.2

^a三次或更多次试验结果获得的标准差

表6野生型和突变型GA的巯基分析GA形式    [蛋白质](μM)    [SH](μM)^a   [SH]/[蛋白质]野生型            10          8              0.8S-S/S30P          10          11             1.1S-S/S30P/G137A    10          13             1.3

^a两份分析结果的平均值

表7热灭活自由能的变化(ΔΔ

)，以及加热10分钟后相对于野生型GA50％的酶被灭活时的温度(ΔTm)GA形式              ΔΔ

(kJ/mol)  ΔTm(℃)S30P^b               1.6                 1.7G137A^c              0.8                 1.2S-S^d                1.2                 1.4S30P/G137A           4.5                 3.5S-S/S30P             3.5                 3.2S-S/S30P/G137A       4.4                 3.9

^a在65℃下算得

^b莉自Allen等8

^c得自Chen等⁶

^d得自Li等⁷

表8野生型和突变型GA在45℃、pH4.4、0.05M乙酸盐中水解麦芽寡糖DP2-7(G₂-G₇)的动力学参数

葡糖淀粉酶	G2	G3	G4	G5	G6	G7
							野生型kcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)	18.6±0.4a1.09±0.0817.1±0.9	50.8±0.60.353±0.013144±4	67.5±1.90.239±0.017282±282	61.5±0.330.094±0.002653±10	65.9±1.20.098±0.007671±36	81.5±1.80.136±0.009599±27
Lys108Argkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)b(kJ mo1-1)	17.3±0.51.52±0.1111.4±0.60.92	32.6±0.90.570±0.03857.2±2.52.10	46.6±1.60.383±0.029122±51.91	51.7±1.40.307±0.019168±63.08	55.2±1.40.276±0.016200±82.75	86.2±3.10.481±0.031179±62.74
							Tyr312Trpkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)(kJmol-1)	17.2±0.30.940±0.05918.3±0.90-0.16	36.8±0.90.343±0.028107±60.67	50.7±0.90.193±0.010262±90.17	50.7±0.80.100±0.006508±220.57	56.0±0.80.108±0.005519±200.58	63.3±0.60.103±0.003617±1-0.07
300Loopkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)(kJmol-1)	14.7±0.30.738±0.05520.0±1.2-0.35	25.9±0.60.234±0.019111±70.60	34.1±0.80.114±0.008300±17-0.14	43.0±0.60.072±0.004598±280.20	41.4±0.80.064±0.005642±470.10	41.9±0.70.083±0.005506±250.38
							Ser30Pro/Gly137Alakcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)(kJmol-1)	25.0±1.11.62±0.1115.5±1.20.27	50.2±3.00.596±0.01084.2±3.11.42	77.9±2.20.261±0.020299±16-0.15	77.7±1.60.175±0.011444±211.02	77.0±2.20.204±0017377±231.52	80.3±2.20.151±0.013533±370.31
SS/Ser30Pro/Gly137Alakcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)(kJmol-1)	23.0±0.91.66±0.0713.9±0.90.55	42.1±1.00.470±0.03289.6±4.21.26	72.0±2.10.236±0.019305±17-0.21	72.2±1.00.172±0.007420±131.16	79.5±1.70.157±0.011505±260.75	81.5±1.40.198±0.010410±151.00
							SSkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)(kJmol-1)	20.7±0.61.16±0.1017.8±1.1-0.10	40.8±0.90.394±0.025104±50.88	72.1±1.30.217±0.011331±12-0.42	76.5±0.80.132±0.005579±160.32	76.4±2.10.184±0.015414±261.28	71.8±0.60.114±0.003632±15-0.14

  ^a标准差

  ^b过渡态能量的变化Δ(ΔG)=-RTln[(k_cat/K_M)_mut/(k_cat/K_M)_wt]

                  表9

35℃,45℃和55℃时野生型和突变型葡糖淀粉酶在30％(w/v)麦芽糊精M100水解反应和30％(w/v)葡萄糖缩合反应中，葡萄糖和异麦芽糖产生的初始速度，及其相对比值

初始速度                      比值酶            葡萄糖a(G1)    异麦芽糖b(iG2)   比值            相对(μg/ml.h)×10-3 (μg/ml.h)×103 (iG2/G1)×106 比值
	35℃野生型             21.5±0.6C         289±5         13.5          1.00Lys108Arg        22.0±0.4           969±12        44.1          3.27Tyr312Trp        17.9±0.5           294±4         16.4          1.21311-314Loop       13.8±0.4           128±3          9.3          0.69Ser30Pro/Gly137Ala   27.7±0.4           298±6         10.8          0.80S-S/Ser30Pro/Gly137Ala 30.1±0.5           245±6          8.2          0.60S-S           31.8±0.6           135±3          4.2          0.31Ser436Pro        29.9±0.6           903±12        30.2          2.23S-S/Ser436Pro      31.7±0.5           824±12        26.0          1.92S-S/Gly137Ala      35.2±0.6           982±15        27.9          2.07Gly137Ala/Ser436Pro   36.6±0.7           776±10        21.2          1.57
45℃野生型             66.2±2.2          3880±60        58.7          1.00Lys108Arg       50.2±2.0          6420±110       128           2.18Tyr312Trp        52.6±2.1          3360±60        63.9          1.09311-314Loop       40.4±1.8          1430±40        35.3          0.60Ser30Pro/Gly137Ala    76.3±2.7          3690±70        48.4          0.83S-S/Ser30Pro/Gly137Ala 84.3±3.0          3520±60        41.7          0.71S-S          86.3±±3.3         963±28        11.2          0.19
	55℃野生型            156±3          4890±80         31.3          1.00Lys108Arg         101±1          8200±120        81.0          2.59Tyr312Trp         110±2          4440±70         40.5          1.29311-314Loop        128±2          1890±50         14.8          0.47Ser30Pro/Gly137Ala      157±3          7200±110        45.8          1.47S-S/Ser30Pro/Gly137Ala   167±3          5690±100        34.1          1.09S-S            164±3          1230±40          7.5          0.24Ser436Pro          218±3          4710±80         21.6          0.69S-S/Ser436Pro         NDd           5130±100         ND           NDS-S/G1y137Ala        225±3          5720±100        25.4          0.81Gly137Ala/Ser436Pro     208±3             ND             ND            ND

^a样品取自pH4.4,0.05M NaOAc缓冲液中30％(w/v)M100水解反应；葡萄糖浓度用葡萄糖氧化酶方法测定。

^b样品取自pH4.4,0.05M NaOAc缓冲液中30％(w/v)葡萄糖缩合反应；异麦芽糖浓度用HPTLC测定。

^c标准差

^d未测定

表10野生型和突变型葡糖淀粉酶水解异麦芽糖和麦芽寡湖精DP2-7的动力学参数

酶	底物
		异麦芽糖       麦芽糖      麦芽三糖      麦芽四糖       麦芽五糖     麦芽六糖     麦芽七糖 kcat/KM(G2)(iG2)        (G2)         (G3)          (G4)           (G5)         (G6)         (G7)  kcat/KM(iG2)
	野生型kcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)		6560.72±0.01b  20.4±0.2    48.2±0.7     64.5±2.9      71.8±1.9     73.7±2.1    72.3±0.923.5±0.6    1.01±0.03  0.25±0.014   0.111±0.017  0.110±0.010   0.107±0.010 0.083±0.0040.031±0.001  20.3±0.55     196±9       582±65       654±43        685±47       870±35
Y48F49Wkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)c(kJmol-1)		ND0.236±0.016                                                          1.99±0.08NDd        9.9±1.8       ND            ND           ND              ND         4.9±0.30.024±0.003                                                         0.408±0.01017.8                                                                 20.3
	Y116Wkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)(kJmol-1)		4980.69±0.02    11.7±0.2   19.4±0.3      50.9±19    50.0±1.7       53.1±1.9      56.0±1.128.8±2.5    0.98±0.06   0.20±0.01    0.20±0.02  0.132±0.014    0.143±0.017   0.118±0.0080.024±0.001 12.0±0.60     98±6         256±17     378±30         372±32        475±250.67         1.39         1.84           217         1.45           1.62            1.60
Y175Fkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)(kJmol-1)		7521.02±0.05   21.2±0.2    40.0±0.6     80.1±1.8    79.6±1.9        76.5±1.5      72.1±0.840.1±4.3    1.13±0.04   0.29±0.02   0.187±0.012 0.120±0.010    0.113±0.008    0.095±0.0040.025±0.002  18.8±0.5    136±6         429±19     666±42         677±37         761±270.55         0.20         0.97          0.81        -0.05            0.03            0.35
	R241Kkcat(s-1)KM(mM)Kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)c(kJmol-1)		2611.34±0.08b  20.1±0.3   46.8±1.0      73.5±7.2   70.7±2.1        75.8±2.7       80.6±1639.3±5.8    2.27±0.11  0.62±0.04    0.45±0.09  0.19±0.02       0.20±0.02      0.20±0.010.034±0.003   8.9±0.3     76±3         164±18    368±21           373±25         411±16-0.28         2.19        2.51           3.36       1.52             1.61            1.98
S411Kkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)kJmol-1)		6810.63±0.02    18.9±0.3    44.6±0.01    58.5±1.6   53.1±1.2        54.7±1.7        59.4±0.627.9±2.9     1.26±0.06   0.47±0.04   0.182±0.014 0.120±0009    0.115±0.012     0.104±0.0040.022±0.002  15.0±0.5     94.1±5.4     322±18     443±27          476±41          570±170.84          0.80         1.94          1.56       1.15              0.96             1.12
	S411Gkcat(s-1)KM(mM)kcat/KM(s-1mM-1)Δ(ΔG)(kJmol-1)		4020.93±0.06    23.0±0.4     55.1±1.6    59.7±1.8    75.1±2.1      75.9±4.3          84.0±2.526.2±2.7    1.59±0.08     0.50±0.04  0.092±0.010 0.094±0.010  0.125±0.024       0.132±0.0120.036±0.004  14.5±0.6       108±6      649±55      795±61        609±87            634±41-0.39        0.89            1.56       -0.29        -0.52           0.31              0.84

     ^a在45℃、pH4.4、0.05M乙酸钠缓冲液中测定

     ^b标准差

^c过渡态能量的变化Δ(ΔG)=-RTln[(k_cat/K_M)_mut/(k_cat/K_M)_wt]

^d未测定

表11野生型和突变型葡糖淀粉酶水解异麦芽糖、麦芽糖和麦芽七糖的动力学参数

底物                 野生型	突变体
		S411G         S411A            S411C            S411H       S411D
	异麦芽糖(iG2)kcat(s-1)            0.72±0.01bKM(mM)                 23.5±0.6kcat/KM(s-1mM-1)   0.031±0.001Δ(ΔG)(kJmol-1)           -		0.93±0.06    0.63±0.02        0.22±0.0126.2±2.7      27.9±2.9        12.3±0.9           NDd        NDd0.036±0.004   0.022±0.002     0.018±0.001-0.39           0.84             1.4
麦芽糖(G2)kcat(s-1)              20.4±0.2KM(mM)                 1.01±0.03kcat/KM(s-1mM-1)     20.3±0.6Δ(ΔG)(kJmol-1)            -		23.0±0.4      18.9±0.3       7.78±0.07        5.31±0.15  4.36±0.051.59±0.08      1.26±0.06      0.53±0.02        3.67±0.25  3.58±0.1114.5±0.6       15.0±0.5       14.8±0.6        1.45±0.06  1.22±0.030.89           0.80             0.83             6.98        7.43
	麦芽七糖(G7)kcat(s-1)              72.3±0.9KM(mM)                0.083±0.004kcat/KM(s-1mM-1)      870±35Δ(ΔG)(kJmol-1)            -		84.0±2.5      59.4±0.6        33.0±0.5       32.4±0.9   15.8±0.30.132±0.012   0.104±0.004    0.070±0.005    0.336±0.024 0.148±0.009634±4.1       570±17          474±25            97±5    107±1.50.84           1.12             1.60              5.81      5.54

      ^a在45℃、pH4.4、0.05M乙酸钠缓冲液中测定

      ^b标准差

      ^c过渡态能量的变化Δ(ΔG)=-RTln[(k_cat/K_M)_mut/(k_cat/K_M)_wt]

      ^d未测定

表12野生型和突变型葡糖淀粉酶在45℃水解麦芽糖和麦芽七糖的pK值和最适pH

	游离酶      酶-底物复合物     酶-底物复合物(非复合)    (与麦芽糖复合)    (与麦芽七糖复合)
		pKl     pK2   pHopt  pKl    pK2  pHopt   pKl    pK2     pHopt
	野生型S411GS4llAS411CS4IlHS41lD		2.77    5.80   4.29    2.11    5.85   3.98    260     6.78     4.693.01    5.57   4.29    2.68    5.8l   4.24    3.22    6.73     4.983.11    5.86   4.49    3.32    6.32   4.82    3.91    7.18     5.543.26    5.86   4.56    3.32    6.38   4.85    NDa      ND       ND3.10    5.01   4.05    3.58    4.69   4.13    ND       ND       ND3.13    5.72   4.42    3.34    5.53   4.44    ND       ND       ND

表13在65℃计算所得相对于野生型GA的热灭活自由能的增量(ΔΔ

) ^a 大于0表示热稳定性增加

                             表1430％(w/v)葡萄糖缩合反应中异麦芽糖形成初始速度与30％(w/v)麦芽糊精M100水解反应中葡萄糖形成初始速度的相对比值的减少量

GA形式    相对比值a
	野生型       1.00S-S        0.24S30P        0.77G137A        0.54Y175F        0.76300Loop       0.47S411A        0.40S411G        0.38S436P        0.70S-S/G137A      0.81G121A/S411G     0.44

上述所有反应在55℃、pH4.4、0.05M乙酸钠缓冲液中进行。^a比值低于1.00表示α-(1,4)-相对于α-(1,6)-键合底物中的专一性增加。

             表15

突变型葡糖淀粉酶的酶-底物复合物在45℃下

水解麦芽糖的最适pH相对于野生型的增量

GA形式    pHopt增量a
	S411G        0.26S411A        0.84S411C        0.86S411H        0.15S411D        0.46

^a野生型葡糖淀粉酶的酶-底物复合物在45℃水解麦芽糖时的pH最适点为pH3.98。参考文献

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Watanabe等人，1994.“多脯氨酸取代累积地热稳定化Bacillus cereus ATCC7064寡-1,6-葡糖苷酶”Multiple proline substitutions cumulatively thermostabilize Bacilluscereus ATCC7064 oligo-1,6-glucosidase.《(欧洲生物化学杂志》Eur.J.Biochem.226:277-283.

Wasserman.“热稳定酶的生产”Thermostable Enzyme Production.《食品工艺》Food Technol.,38,78(1984).

Wetzel,R.(1987)《生物化学发展趋势》Trends Biochem.Sci.,12,478-482.

Williamson等人(1992)《生化杂志》(Biochem.J.),282,423-428.

序列表(1)一般信息：(1)申请人：

(A)姓名Allen.Martin

       Fang.Tsuer-yun

       Li.yuxing

       Liu.Hsuan-Liang

       Chen.Hsui-Mei

       Coutinho.Pedro

       Hanzatko.Richard

       Ford.Clark(ⅱ)发明名称：提高葡糖淀粉酶pH最适点、底物专一性和热稳定性的蛋白质工程方法(ⅲ)序列数目：12(ⅳ)通信地址：

(A)收件人：Kohn&Associates

(B)街道：30500 Northwsetern HWY,

(C)城市：Farmington Hills

(D)州：Michigan

(E)国家：美国

(F)邮政编码(邮编)：48334(ⅴ)计算机可读形式：

(A)记录介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0.Version#1.30(ⅵ)本申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类：(ⅴⅲ)律师/代理人信息：

(A)姓名：Kohn,Kenneth I

(B)登记号：30.955

(C)参考/案卷号：0812.00001(ⅸ)通讯信息：

(A)电话：(248)539-5050

(B)电传：(248)539-5055(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：616氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅲ)假设：无(ⅵ)原始来源：

(A)微生物：曲霉属(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr1               5                   10                  15Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala

        20                  25                  30Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr

    35                  40                  45Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val

50                  55                  60Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn65                  70                  75                  80Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly

            85                  90                  95Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp

        100                 105                 110Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro

    115                 120                 125Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp

130                 135                 140Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg145                 150                 155                 160Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp

            165                 170                 175Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln

        180                 185                 190His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser

    195                 200                 205Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu

210                 215                 220Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser225                 230                 235                 240Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe

            245                 250                 255Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro

        260                 265                 270Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile

    275                 280                 285Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly

290                 295                 300Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys305                 310                 315                 320Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp

            325                 330                 335Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys

        340                 345                 350Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser

    355                 360                 365Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe

370                 375                 380Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu385                 390                 395                 400Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr

            405                 410                 415Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val

        420                 425                 430Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr

    435                 440                 445Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr

450                 455                 460Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr465                 470                 475                 480Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr

            485                 490                 495Ala Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro

        500                 505                 510Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly

    515                 520                 525Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu

530                 535                 540Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp545                 550                 555                 560Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu

            565                 570                 575Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser

        580                 585                 590Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr

    595                 600                 605Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg

610                 615(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：7氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Asn Gly Asn Gly Asn Ser Gln1               5(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:CAGAGTCCGC GCCCGGCACC CAAGCACCGT C    31(2)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:AAGTCCAGCG ACACAGGTGT GACCTCCAAC GAC    33(2)SEQ ID NO:5的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：32碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:CGAGCGGAAA GCTGCGGGCC ATCAGACTTG TC    32(2)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：32碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:CGTACTGCCA TCCTGTGTAA CATCGGGGCG GA    32(2)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:ATCGGGGCGG ACGGTTGTTG GGTGTCGGGC GCG    33(2)SEQ ID NO:8的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:GAGTATCGTG TGTACTGGCG GCACC             25(2)SEQ ID NO:9的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：30碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:GGTCTCGGTG AGCCCAGGTT CAATGTCGAT       30(2)SEQ ID NO:10的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：30碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=“引物”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:GGTCTCGGTG AGCCCATGTT CAATGTCGAT                                     30(2)SEQ ID NO:11的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=“引物”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:GAGGACACGT ACTGGAACGG CAACCCG                                        27(2)SEQ ID NO:12的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：60碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/描述=“引物”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:TACCCTGAGG ACACGTACAA CGGCAACGGC AACTCGCAGG GCAACCCGTG GTTCCTGTGC    60

Claims (25)

1．一种真菌葡糖淀粉酶，它包括Asn20Cys与Ala27Cys连接的一对突变，此突变对的两个成员间形成二硫键。

2．根据权利要求1所述的葡糖淀粉酶，其中突变增加了热稳定性，减少了异麦芽糖的形成。

3．根据权利要求1所述的真菌葡糖淀粉酶，它包括选自表13的至少一个突变，其中该附加的突变提供了累积的热稳定性。

4．根据权利要求1所述的真菌葡糖淀粉酶，它还包括突变Ser30Pro、Gly137Ala，其中此附加的突变提供了累积的热稳定性。

5．根据权利要求1所述的真菌葡糖淀粉酶，它包括选自表14的至少一个突变，其中该附加的突变累积地减少了异麦芽糖的形成。

6．根据权利要求1所述的真菌葡糖淀粉酶，它还包括311-314Loop突变，其中该突变累积地减少了异麦芽糖的形成。

7．一种真菌葡糖淀粉酶，它包括311-314Loop突变。

8．根据权利要求7所述的葡糖淀粉酶，其中该突变累积地减少了异麦芽糖的形成。

9．根据权利要求7所述的真菌葡糖淀粉酶，它包括选自表14的至少一个突变，其中该附加的突变累积地减少了异麦芽糖的形成。

10．一种真菌葡糖淀粉酶，它包括突变Ser411Ala。

11．根据权利要求10所述的葡糖淀粉酶，其中该突变提高了pH最适点，减少了异麦芽糖的形成。

12．根据权利要求10所述的真菌葡糖淀粉酶，它包括选自表15的至少一个突变，其中该突变使pH最适点累积性增加。

13．根据权利要求10所述的真菌葡糖淀粉酶，它包括选自表14的至少一个突变，其中该突变累积地减少了异麦芽糖的形成。

14．一种真菌葡糖淀粉酶，它包括Ser411Ala突变以及Asn20Cys与Ala27Cys连接的突变对，此突变对的两个成员之间形成二硫键。

15．根据权利要求14所述的葡糖淀粉酶，其中这些突变可增加热稳定性、提高pH最适点，并减少异麦芽糖的形成。

16．一种真菌葡糖淀粉酶，它包括Ser411Ala突变、311-314Loop突变，以及Asn20Cys与Ala27Cys连接的突变对，此突变对的两个成员之间形成二硫键。

17．根据权利要求16所述的葡糖淀粉酶，其中这些突变可增加热稳定性、提高pH最适点，并减少异麦芽糖的形成。

18．一种载体，它含有权利要求1-17所述的工程化葡糖淀粉酶的cDNA。

19．一种宿主细胞，它用权利要求18所述的载体来转化。

20．根据权利要求1-17所述的真菌葡糖淀粉酶，其中葡糖淀粉酶是曲霉属葡糖淀粉酶。

21．根据权利要求20所述的葡糖淀粉酶，其中葡糖淀粉酶是泡盛曲霉葡糖淀粉酶。

22．一种获得热灭活性降低的真菌葡糖淀粉酶的方法，该方法是通过设计突变来减少去折叠构象熵，或增加α螺旋的稳定性，或增加二硫键、氢键、静电作用、疏水作用、范德瓦尔斯作用和堆积致密度。

23．一种获得异麦芽糖形成减少的真菌葡糖淀粉酶的方法，该方法是通过设计突变来降低对α-(1,6)-糖苷键的亲和力。

24．一种获得pH最适点升高的真菌葡糖淀粉酶的方法，该方法是改变在催化性碱Glu400微环境中该酶的极性、电荷分布和氢键。

25．一种选择真菌葡糖淀粉酶突变的方法，所述方法用于构建具有累积性突变的葡糖淀粉酶，此方法步骤如下：

设计并用定点诱变产生单个突变；

筛选单个突变，选择那些至少表现出pH最适点升高、不可逆热灭活速度降低或异麦芽糖形成减少的突变；

进行定点诱变，产生携带至少两个分开的所选突变的酶，该酶的pH最适点升高，不可逆热灭活速度降低，或是异麦芽糖形成量减少；和

通过制得的至少携带有两个分开的所选突变的酶，筛检这些突变对pH最适点、热稳定化作用或异麦芽糖形成减少的累积性叠加作用。

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