CN102994474B - 一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其应用 - Google Patents

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本发明公布了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其应用，属于遗传工程领域。本发明以嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）JN21(CCTCC NO:M 2011231)淀粉酶为母本，采用分子生物学技术对嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列进行定点突变。在此改造条件下，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶在50°C的半衰期由对照（突变前）例的15.3min提高到43.8min。利用此策略可以显著提高淀粉酶的热稳定性，为其工业化生产提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。

Description

一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其方法，具体涉及一种热稳定性提高的碱性淀粉酶突变体及其制备方法。
背景技术
淀粉酶是最早用于工业生产的酶制剂，是迄今用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。碱性淀粉酶在高pH环境下具有稳定性和活性，因而在工业生产中有较高的应用价值，现已用于纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品等行业。但来源于野生菌株未经改造的碱性淀粉酶在热稳定性等方面存在一定局限性，限制了其应用范围。因此基于已得到的碱性淀粉酶在大肠中的表达平台，利用定点突变，对碱性淀粉酶进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的碱性淀粉酶。
发明内容
本发明提供了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，其特征在于，对淀粉酶结构域A、B、C内的一个或多个氨基酸进行替换，提高了淀粉酶的热稳定性。
所述淀粉酶突变体是以SEQ ID NO.1为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合得到的突变体。
能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的载体也属于本专利要求保护的范围。
能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系也属于本专利要求保护的范围。
本发明还提供一种制备所述淀粉酶突变体的方法，是将淀粉酶催化部位一个或多个氨基酸通过PCR或化学全合成的方法进行替换。
具体而言，是以SEQ ID NO.1为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合。
所述制备所述淀粉酶突变体的方法，具体步骤如下：
1）根据嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ(图1)；
2）利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌淀粉酶（SEQ ID NO.1）进行模拟，获得淀粉酶空间结构；
3）通过对淀粉酶的氨基酸序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点；
4）设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
5）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。
表1淀粉酶突变引物序列
本发明提供的碱性淀粉酶突变体热稳定性显著提高，在50°C的半衰期提高到43.8min，提高了2.9倍。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该碱性淀粉酶突变体应用于纺织、洗涤剂、制革等领域，可以在耐温耐碱环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：pAmyQ的质粒图谱。
具体实施方式
实施例1：淀粉酶热稳定性定点突变分析与方法
通过对淀粉酶序列以及3D空间结构进行分析，确定活性中心与酶的热稳定性提高有关的几个氨基酸残基（Pro 58,His 199,Gln 216,Asn 292,Pro 467）。
根据嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成后，克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ。
针对不同位点的定点突变，设计相对应的定点突变引物（表1）。利用定点突变引物及重组质粒pAmyQ，对淀粉酶进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒pAmyQ进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得单点突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，进行诱导表达，获得单点突变后的重组淀粉酶。以单点突变后获得的重组质粒为模板进行下一轮的突变，获得组合突变后的重组淀粉酶。
实施例2：淀粉酶热稳定性定点突变分析与方法
DNS法测定碱性淀粉酶酶活
1、DNS试剂的配制：称取3.25g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入500mL容量瓶，加入2mol/L氢氧化钠溶液162.5mL，再加入22.5g丙三醇，摇匀，定容至500mL，储存于棕色瓶放置在4°C冰箱中待用。
2、葡萄糖标准曲线的制作：配制0.2g/L-1.0g/L不同浓度的葡萄糖溶液。取1mL不同浓度的葡萄糖与同体积的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴10min。用冷水冷却，定容至10mL，A540测定吸光值。以葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
3、将1mL 2%的可溶性淀粉加入到试管中，加入1.5mL pH 9.5的缓冲液，混匀，50°C预热5min，加入0.2mL稀释好的酶液，反应5min。取1mL反应液与同体积的DNS试剂混匀，沸水浴煮沸15min，用冷水冷却，定容至10mL，混匀后，以没有加酶液但加入当量的去离子水的反应体系作为对照，测定A540吸光值。
淀粉酶在50°C的热稳定性测定
将淀粉酶置于50°C进行孵育，采用3）的方法，定期测定其剩余酶活。绘制剩余酶活的ln值与时间的曲线，根据曲线的斜率得到该温度下的热失活常数k，淀粉酶的半衰期即为ln 2与k的比值。
表2单点突变重组酶在50°C的热稳定性
酶活力单位定义：在pH 9.5，50°C条件下，1min降解可溶性淀粉产生1μmol还原物质（以葡萄糖计算）所需要的酶量，为1个酶活单位（U）。
实施例3：淀粉酶在50°C的热稳定性测定分析
通过测定发现，单突变体P58A,H199L,Q216V，N292W和P467V在50°C的半衰期（表2）都有提高，其中Q216V效果最显著，半衰期提高至原来的2倍。在此基础上优选H199L、Q216V、P467V进行组合突变，获得H199L/Q216V，H199V/P467V，Q216V/P467V，H199L/Q216V/P467V四个突变体,通过测定发现，它们在50°C的半衰期（表3）都有提高，其中H199L/Q216V/P467三突变体的效果最显著，半衰期提高至原来的2.9倍。该淀粉酶在碱性条件下具有较强的热稳定性。
表3优选位点组合突变重组酶在50°C的热稳定性

Claims (9)

1.一种热稳定提高的淀粉酶突变体，其特征在于以SEQ ID NO.1所示序列为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合得到的突变体。
2.权利要求1所述的淀粉酶突变体，其特征在于第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸。
3.权利要求2所述的淀粉酶突变体，其特征在于还将第467位脯氨酸替换成缬氨酸。
4.权利要求1所述的淀粉酶突变体，其特征在于第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸。
5.含有编码权利要求1所述淀粉酶突变体的基因的DNA载体。
6.含有权利要求1所述淀粉酶突变体的基因工程菌。
7.权利要求1所述淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，将淀粉酶活性位点内的一个或多个氨基酸通过PCR或化学全合成的方法进行替换，具体步骤为：以SEQ ID NO.1为出发序列，通过PCR或化学全合成的方法，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合。
8.权利要求7所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)根据嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒；
2)利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)淀粉酶进行模拟，获得淀粉酶空间结构；
3)通过对淀粉酶的序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点；
4)设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
5)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。
9.权利要求1-4任一所述淀粉酶突变体在纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品领域的应用。
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