CN103820404B - 酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法 - Google Patents

酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法，利用定向进化技术对鱼腥藻脂肪氧合酶分子进行定向改造，经多轮易错PCR和DNA？Shuffling，获得了酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，酶活力为21420？U/mL，比野生型提高了2.17倍，其在50℃的半衰期t1/2提高了1.9倍。利用此策略可以显著提高脂肪氧合酶的酶活和热稳定性，解决了脂肪氧合酶活低和热稳定性较差的问题，为其工业化生产提供了基础。改造后的脂肪氧合酶更适用于工业生产和应用。

Description

酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法
技术领域
本发明涉及酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法，属于酶工程技术领域。
背景技术
脂肪氧合酶（Lipoxygenase,EC1.13.11.12,LOX）广泛存在于动植物体内，在藻类、面包酵母、真菌以及氰细菌中均发现它的存在。LOX能专一性催化含1,4-顺，顺-戊二烯双键体系的多不饱和脂肪酸氧化形成具有共轭双键的氢过氧化物，这些氢过氧化物性质活泼，是重要的化学反应中间体，在食品、医药、化工等领域有着广泛的应用前景，尤其在食品加工中具有重要的应用价值，如面粉及其制品品质改良、制备风味化合物、茶叶加工等。尽管人们早已认识到LOX在食品加工中的潜在应用价值，且LOX在自然界中广泛存在，但从自然界中直接获得不仅得率低而且纯化难，获得LOX纯酶的成本很高。因此，通过基因工程菌高效表达，且又经过简单的纯化过程获得高纯度的LOX可以解决上述问题，但微生物脂肪氧合酶自身存在催化活性低、热稳定性较差的缺陷，限制其在食品工业中的广泛应用。通过分子生物学技术对脂肪氧合酶进行分子改造，以期获得酶学性质更适用工业应用的突变酶具有重要的意义。
目前，酶分子改造的策略主要有非理性设计（定向进化）与理性设计的策略。通过理性设计和定向进化改善酶学性质一直是蛋白质工程领域中的一个研究热点。而定向进化技术是改善蛋白质性质最有效的策略之一，是在实验室中模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选），能在短期内获得具有优良性质的突变酶。经检索未见脂肪氧合酶分子定向进化研究的相关文献和专利报道。
发明内容
本发明目的是为了克服以上现有技术的缺陷，提供一种酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，其氨基酸残基序列如SEQIDNO.1所示，其在一个氨基酸位点发生突变，即第305位氨基酸由天冬酰胺替换成了天冬氨酸。
一种以上所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，包含如下步骤：
（1）脂肪氧合酶高通量筛选：测定酶活时重组脂肪氧合酶基因工程菌的破碎条件为溶菌酶添加量1.5mg/mL、溶菌酶处理时间40min、EDTA-2Na添加量2.0mmol/L、吐温-60添加量2%、－70℃冷冻37℃融解、冻融3次；
（2）易错PCR：以野生型鱼腥藻脂肪氧合酶质粒pET-32a-ana-LOX为模板，上游引物为5’-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3’，下游引物为5’-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3’，进行易错PCR扩增；易错PCR扩增产物经胶回收试剂盒回收后，限制性内切酶XhoI和SacI分别对易错PCR扩增产物和质粒pET-32a(+)进行消化、连接，转化至感受态细胞，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板，于37℃培养12h后，对转化子进行阳性克隆子鉴定，挑选突变子转移至96孔板中诱导表达，并基于96微孔板高通量筛选模型对突变子进行筛选并测序，再经过摇瓶复筛，得到突变子；
（3）DNAShuffling：采用步骤（2）得到的突变子基因为亲本基因，通过DNaseI将亲本基因随机片段化并获取50-100bp的基因片段，进行无引物PCR，组装形成大片段，最后在亲本基因扩增引物的条件下，扩增出改组基因库；对改组基因库进行XhoI和SacI酶切，并与表达载体pET-32a(+)进行连接，转化至E.coliBL21感受态细胞，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素的平板，于37℃培养12h后，对转化子进行筛选与鉴定，挑选突变子转移至96孔板中诱导表达，并基于96微孔板高通量筛选模型对突变子进行筛选并测序，再经过摇瓶复筛，获得酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体；
（4）将步骤（3）得到的脂肪氧合酶突变体的工程菌表达与纯化。
所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，步骤（1）中测定酶活的方法可以为碘化钾-淀粉法。
所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，步骤（2）中易错PCR的条件可以为：改变PCR的反应体系：Mn2+浓度为0.01-0.4mmol/L，Mg2+浓度为0.625-2.5mmol/L，dNTP浓度为0.125-0.25mmol/L，PCR反应条件：95°C5min；然后95°C30sec，55°C1min，72°C10min，共30个循环；最后72°C10min。
所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，步骤（2）中感受态细胞为可以E.coliBL21。
所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，步骤（4）中脂肪氧合酶突变体的工程菌表达与纯化方法为将含有脂肪氧合酶突变体的工程菌接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养14h；接种量体积比为2%，加入上述LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加IPTG至100μg/mL，低温16℃诱导16h，9000rpm离心20min，收集菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，检测上清液酶活，并将上清液过Ni-NTA亲和柱纯化，透析过夜即可得到纯的脂肪氧合酶突变体，其中磷酸缓冲液组成为50mMPBS与0.3MNaCl以及质量体积比为0.5％TritonX-100的混合液。
有益效果：
1．本发明首次采用定向进化技术对鱼腥藻脂肪氧合酶进行分子改造，经多轮易错PCR和DNAShuffling相结合的方法而获得酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体。利用此策略可以显著提高脂肪氧合酶的酶活和热稳定性，解决了脂肪氧合酶产量低和热稳定性较差的问题，为其工业化生产和应用提供了基础。
2.与野生型鱼腥藻脂肪氧合酶相比，本发明提供的脂肪氧合酶突变体的酶活与热稳定性同时获得了提高，酶活力为21420U/mL，提高了2.17倍，其在50℃的半衰期t1/2提高了1.9倍，催化速率提高了83%。
3．本发明通过脂肪氧合酶突变体的工程菌高效表达，且又经过简单的纯化过程获得，其生产成本降低，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为淀粉-碘化钾法与分光光度法酶活测定方法的比较图，其中(a)为淀粉-碘化钾法与分光光度法的线性关系；(b)为淀粉-碘化钾法与分光光度法的酶热失活曲线；(c)为96微孔板碘化钾-淀粉法的LOX活性高通量筛选图。
图2为DNA改组突变体酶活力及半衰期图。
图3为DNAShuffling突变体的热稳定性及最适反应温度图，其中(a)为突变体的热稳定性；(b)最适反应温度。
图4DNAShuffling突变体的三维结构模拟图。
具体实施方式：
实施例1
1.脂肪氧合酶高通量筛选体系建立
重组脂肪氧合酶基因工程菌的破碎条件为溶菌酶添加量1.5mg/mL、溶菌酶处理时间40min、EDTA-2Na添加量2.0mmol/L、吐温-60添加量2%、－70℃冷冻37℃融解、冻融3次。同时，以简单、灵敏、快速，且测定体系具备肉眼可辨的特征颜色的碘化钾-淀粉法用于LOX活性高通量筛选（图1）。对发酵得到的粗酶液分别经40℃30min、45℃20min、50℃10min、55℃5min钝化处理后，利用淀粉-碘化钾法于96孔板检测酶活，确定基于酶标仪、96微孔板和环境温度集成的热稳定性提高突变体筛选方法。
2.易错PCR突变体库的构建及突变体的筛选
以野生型鱼腥藻脂肪氧合酶质粒pET-32a-ana-LOX为模板，上游引物为5’-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3’（带下划线碱基为限制性内切酶SacI识别位点），下游引物为5’-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3’（带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点），改变PCR的反应体系：Mn2+浓度为0.01-0.4mmol/L，Mg2+浓度为0.625-2.5mmol/L浓度较适宜，dNTP浓度为0.125-0.25mmol/L，PCR反应条件：95°C5min；然后95°C30sec，55°C1min，72°C10min，共30个循环；最后72°C10min。易错PCR扩增产物经胶回收后，限制性内切酶XhoI和SacI分别对易错PCR扩增产物和质粒pET-32a(+)进行消化、连接，转化至E.coliBL21感受态细胞。涂布于LB（含100μg/mLAmp）平板，于37℃培养12h后，对转化子进行阳性克隆子鉴定，挑取转化子于96孔板中，LB装液量100μL，37℃，200rpm培养14h，再分别取40μL种子液到1mL的培养基中，37℃，200rpm培养至OD600为0.6左右，加IPTG至100μg/mL，低温16℃诱导16h后，将96孔板于4℃，3000×g离心30min，收集菌体，磷酸缓冲液悬浮菌体，利用冻融法破碎细胞，离心获得粗酶液，对粗酶液经40℃30min、45℃20min、50℃10min、55℃5min钝化处理，利用淀粉-碘化钾法于96孔板检测酶活，对突变子进行筛选并测序。
从两轮易错PCR挑选了8000转化子，筛选出在酶活力和热稳定性提高的突变体。对发酵得到的酶液分别经40℃30min、45℃20min、50℃10min、55℃5min钝化处理后，利用淀粉-碘化钾法于96孔板检测酶活，再经过摇瓶复筛，筛选出4株有活力的菌株（见表1），其中120与422在50℃下的半衰期分别提高了1.8倍和1.7倍，经过测序发现120、422，分别发生了V328A/E330G、N305D/L358I两个氨基酸的变化。
表1易错PCR突变体的活力及50℃下的半衰期
3.DNAShuffling突变体库的构建及突变体的筛选
以两轮易错PCR筛选得到的突变体的120与422及野生型为亲本基因，通过DNaseI将亲本基因随机片段化并获取50-100bp的基因片段，进行无引物PCR，组装形成大片段，最后在亲本基因扩增引物的条件下，扩增出改组基因库。对改组基因库进行XhoI和SacI酶切，并与表达载体pET-32a(+)进行连接，转化至E.coliBL21感受态细胞，涂布于含100μg/mLAmp的平板，于37℃培养12h后，对转化子进行筛选与鉴定，挑选突变子转移至96孔板中诱导表达，并基于96微孔板高通量筛选模型对突变子进行筛选并测序。
经过筛选从6000克隆子得到3株突变体D22、D111及D2221，50℃下的半衰期分别由8min提高到15.2min、16.6min和18min，其中获得一株高活力突变体D22，其酶活为21420U/mL，提高了2.17倍，其在50℃的半衰期t1/2提高了1.9倍（图2）。经过测序发现D22、D111、D2221发生的氨基酸置换为N305D、D66N/L160P及Y184H/N305D；其中D22的氨基酸残基序列如如SEQIDNO.1所示。
4.脂肪氧合酶突变体的工程菌表达和纯化
含有脂肪氧合酶突变体的工程菌接种于含有100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养14h；接种量体积比为2%，加入上述LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加IPTG至100μg/mL，低温16℃诱导16h，9000rpm离心20min，收集菌体，用磷酸缓冲液(50mMPBS与0.3MNaCl以及质量体积比为0.5％TritonX-100的混合液)重悬菌体，超声波破碎菌体，检测上清液酶活，并将上清液过Ni-NTA亲和柱纯化，透析过夜即可得到纯的脂肪氧合酶突变体。
5.突变体酶学性质测定
对纯的脂肪氧合酶突变体的热稳定性、最适温度和动力学常数进行测定。将待测酶液分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃水浴中保温30min，迅速置于冰水中，测定突变体及野生型的活力及残留活力，以测定突变体的热稳定性；将待测酶液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下测定酶活力，以测定突变体的最适反应温度。结果如图3所示，突变体D111和D2221在40℃下保温后还保持80%，在50℃下保温后D22、D111、D2221残留活力高于50%，而野生型损失了80%活力，且突变体D22，D111和D2221的最适反应温度分别为50℃、50℃、55℃，与野生型相比分别提高了5℃、5℃及10℃。
对突变体D22、D111及D2221动力学常数测定，发现D22的催化速率提高了83%（见表2）。
表2突变体的动力学常数
脂肪氧合酶活力测定：采用分光光度法测定LOX酶活。用亚油酸钠作为底物。酶反应体系中含有：pH6.0的50mM磷酸缓冲液2.79mL，酶液10μL，1.733mM亚油酸钠200μL，混匀后放入35℃水浴中并开始计时，反应3min后测定吸光度。酶活单位定义：在上述条件下以1min内3mL反应体系在234nm的吸光度增加0.001作为一个酶活力单位U。
重组酶热稳定性用酶在50℃下酶活性的半衰期t1/2来表示，即酶的活力降低到原来活力一半时所需要的时间。将纯化后的酶在50℃保温，间隔测定残余酶活，根据剩余酶活曲线计算其半衰期(t1/2)。
6.突变体的三维结构分析
采用SWISS-MODEL对突变体进行三维结构模拟。分析突变体D22酶活力及热稳定提高的原因是D22由于引入的天冬氨酸消除了组氨酸带正电的侧链对活性中心的影响，使酶-底物复合物的构象更有利于反应进行，从而使催化活性提高。同时，Asp305位于α-螺旋上，增强了与活性中心（His197，His202，His369）的静电作用，使得α-螺旋更稳定（图4）。其它突变体Asn66、Pro160、His184位于loop环上，疏水作用力及氢键的引入使得热稳定性提高。其中His197，His202，His369，Asn373，Ile455为脂肪氧合酶活性中心。
序列表
<110>南京农业大学
<120>酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法
<130>1
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>455
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla
151015
GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys
202530
ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe
354045
LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro
505560
SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro
65707580
ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle
859095
ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly
100105110
AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr
115120125
HisAsnLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp
130135140
PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu
145150155160
HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln
165170175
TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln
180185190
GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr
195200205
ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla
210215220
PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla
225230235240
ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet
245250255
LeuThrGlnGlySerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys
260265270
LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro
275280285
GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn
290295300
AspTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg
305310315320
ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys
325330335
GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer
340345350
GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu
355360365
HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn
370375380
HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp
385390395400
LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle
405410415
ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu
420425430
IleArgGluLysSerSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp
435440445
LeuMetMetSerIleAsnIle
450455
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cgcgagctcggagtgtctggtgcc24
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccgctcgagctaaatgttgatactcatcat30

Claims (1)

1.酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，其特征在于，其氨基酸残基序列如SEQIDNO.1所示，其在一个氨基酸位点发生突变，即第305位氨基酸由天冬酰胺替换成了天冬氨酸。
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