CN103789292B - 一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用 - Google Patents

一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用。本发明采用易错PCR和DNA改组这两种技术相结合的定向进化策略，对本实验室构建的一株含编码赖氨酸脱羧酶基因ldc的菌株进行了改造，获得一株比酶活提高了2.01倍的突变菌株，突变使得产物1,5-戊二胺的发酵生产时间缩短了25%。本发明还提出了一种筛选赖氨酸脱羧酶的快速平板筛选方法，把每一轮的筛选过程缩短了1-2天。在突变体的氨基酸中，涉及到的氨基酸突变为Val147Phe/Glu583Gly。本发明也公开了编码赖氨酸脱羧酶突变体的DNA序列、表达载体、宿主细胞。本发明具有高效性和简便的可操作性。

Description

一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用。本发明涉及通过易错PCR及DNA改组两种体外定向进化构建的比酶活提高的赖氨酸脱羧酶突变体，具体地说涉及到利用分子生物学技术获得比酶活提高的赖氨酸脱羧酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。
背景技术
赖氨酸脱羧酶（L-lysine decarboxylase，简称LDC，EC 4.1.1.18）存在于E.coli、尸胺杆菌（Bacterium cadaveris）、Hafnia alvei等大多数微生物中，其也存在于高等植物中，如黄瓜等。赖氨酸脱羧酶作为诱导性胞内酶，需要磷酸吡哆醛作为辅酶促进脱羧反应。赖氨酸脱羧酶是生物体内可逆地催化L-赖氨酸脱羧生成1，5-戊二胺和CO2的高度专一性酶。产物1，5-戊二胺在农业、医学、工业等领域有着广泛的应用，其作为一种重要的工业化工原料，可以替代传统的由化工方法生产的生物胺——己二胺，与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料——新型尼龙，是一种环保型的、可持续发展型的、耐高温的生物塑料，有着广泛的应用前景。
酶分子体外定向进化是蛋白质工程的新策略，属于非理性设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（包括：随机突变、重组和自然选择），选择适当载体和表达系统，利用基因突变和重组，在体外改造酶基因，构建突变文库，辅以高通量筛选方案，以获得具有预期新功能的突变酶。
易错PCR是诸多体外定向进化方法中一种简便、快速、廉价的随机突变方法，其基本原理是在DNA序列中随机制造突变，即在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件（如提高Mg2+浓度，加入Mn2+，改变体系中4种dNTPs的浓度，改变Taq酶的浓度等等）改变突变频率，从而向目的基因中以一定频率引入突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。
DNA改组(DNA shuffling)，又称有性PCR(sexual PCR)。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。在理论和实践上，它都优于重复寡核苷酸引导的诱变和连续易错PCR。通过DNA改组，不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。
发明内容
本发明的目的在于提供通过定向进化构建的酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体。本发明以蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei AS1.1009）基因组为模板克隆出赖氨酸脱羧酶基因ldc，构建到pTrc99a载体上，并在大肠杆菌Escherichia ColiJM109中成功表达。继而利用易错PCR等体外分子定向进化技术，对赖氨酸脱羧酶基因ldc进行分子改良，以期获得酶活力提高或酶学性质改善的优良突变菌。目前报道的文献中，未有采用此方法来提高赖氨酸脱羧酶酶活。该方法能为任何一种脱羧酶提高其酶活性提供范例。
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、赖氨酸脱羧酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示赖氨酸脱羧酶突变体中突变的氨基酸。如Glu231Leu，表示位置231的氨基酸由亲本赖氨酸脱羧酶的Glu替换成Leu，位置的编号对应于SEQ ID NO：1中赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列编号。如Val147Phe/Glu583Gly，表示位置147和位置583的氨基酸都发生了突变。
本发明的技术方案概述如下：
通过定向进化构建的酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体，由亲本蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）AS1.1009赖氨酸脱羧酶进行定向进化，通过易错PCR，DNAShuffling和定点突变，获得赖氨酸脱羧酶突变体，亲本蜂房哈夫尼菌氨基酸序列SEQ ID NO：1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示赖氨酸脱羧酶突变体中突变的氨基酸。
在本发明中，ldc表示赖氨酸脱羧酶的原始序列（如SEQ ID NO：1所示），ldc2-41表示赖氨酸脱羧酶的突变序列（如SEQ ID NO：2所示）。
用于表达所述的赖氨酸脱羧酶及其突变体的克隆载体为pUC18、表达载体为pTrc99a；用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为大肠杆菌JM109。
本发明的实验步骤概述如下：
1、采用PCR技术以蜂房哈夫尼菌AS1.1009基因组为模板，设计引物，扩增获取赖氨酸脱羧酶基因，插入pUC18克隆载体上，转入E.coliJM109，测序鉴定ldc基因。
2、配制易错PCR反应体系：在普通PCR反应的基础上提高Mg2+浓度，添加Mn2+，改变dATP、dGTP、dCTP、dTTP配比浓度等条件。
3、把易错PCR产物及其pTrc99a表达载体用BamHI、HindIII双酶切后连接，连接产物转入E.coliJM109构建易错PCR突变体库，采用抗生素和pH指示剂筛选的方法获取赖氨酸脱羧酶活性较高的菌株。
4、分别扩增获取活性提高的几株ldc突变基因，混合后用DNaseI消化，纯化回收50-100bp左右的DNA片段。
5、纯化的片段互为引物扩增，获得含较多突变点基因，用BamHI、HindIII双酶切后连接同样双酶切的pTrc99a表达载体连接产物转入E.coliJM109，构建DNA改组文库，采用抗生素和pH指示剂筛选的方法获取赖氨酸脱羧酶活性较高的菌株。
6、含重组质粒的E.coliJM109发酵，获取的细菌溶于3倍体积的无菌乙酸钠缓冲溶液中进行超声破碎，获取超声上清。
7、本发明酶活力测定方法采用紫外吸收法。
8、本发明蛋白的含量测定采用Bradford法：1g/L的牛血清蛋白为标准液，OD595时在加入样品1h内测吸光值。
本发明的有益效果如下：
本发明中采用易错PCR及其DNA改组技术在体外对赖氨酸脱羧酶ldc基因进行定向进化实验。筛选的大肠杆菌Escherichia Coli JM109中ldc基因数个位点发生碱基突变，从而与野生型赖氨酸脱羧酶基因ldc相比，在最适温度37℃，pH6.0时突变体的比酶活是野生型酶的2.01倍。
附图说明
图1：根据南京金斯瑞生物科技有限公司测序结果确定突变氨基酸。
图2：表达载体pTrc99a-ldc的构建图。
(a)表达载体pTrc99a-ldc的构建（含trc启动子和氨苄抗性）
(b)泳道M：λ-EcoT14I digest DNA Marker(Takara)；
泳道1：pTrc99a（4.2kb，经BamHI、HindIII双酶切）；
泳道2：ldc gene by PCR(2.2kb);
泳道3：pTrc99a-ldc重组质粒（6.4kb，经BamHI、HindIII双酶切）
图3：易错PCR文库及其DNA改组文库的构建。
图4：赖氨酸脱羧酶突变体ldc2-41粗纯产物的SDS-PAGE电泳图。
泳道M：116kDa Protein Marker(Takara)
泳道1：E.coli JM109(含pTrc99a空质粒)
泳道2：83KDa的赖氨酸脱羧酶突变体ldc2-41
图5：蜂房哈夫尼菌赖氨酸脱羧酶的模拟三级结构
具体实施方式
实施例1：ldc基因的克隆
（1）碱裂解法提取峰房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009基因组DNA
将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。取1.5ml培养物12000rpm离心2min。沉淀物加入567μl的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μl10%SDS和15μl的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.加入100μl5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台中稍加干燥，重溶于20μl TE缓冲液(含RNaseA-25ng/ml)中，待作PCR扩增ldc片段的模板。
（2）ldc片段的PCR扩增
以峰房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009基因组DNA为模板，设计引物，并加入酶切位点，进行PCR反应。反应条件为：95℃预变性5min;再按如下参数循环30次，95℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，最后1个循环72℃延伸10min。
（3）ldc片段的酶切连接
用小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）胶回收试剂盒纯化PCR的产物，如图2（b）泳道2。
把经纯化的PCR产物片段和pUC18片段（经双酶切、纯化后获得的片段）连接。连接反应体系：
pUC18载体片段 2.5μL
PCR片段 6μL
10×T4连接酶Buffer 1μL
T4连接酶2.5U 0.5μL
混匀加完后的连接反应液，放置16℃连接6h后，放置4℃备用或直接用于转化反应。
（4）感受态细胞的制备
用氯化钙法制备感受态细胞。从LB平板上挑取新活化的E.coli JM109单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养3小时至OD600＝0.5左右。将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000rpm离心10分钟。弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4℃下3000rpm离心10分钟。弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
（5）连接产物转化及鉴定
从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。加入连接产物10μl，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却5分钟。向管中加入1ml LB液体培养基(含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含相应抗生素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。将挑选出的阳性克隆子提取质粒DNA，经酶切电泳，由金斯瑞生物公司测序，并核对核苷酸序列，确认与SEQ IDNO：1所示序列一致，并用相同方法将ldc连接至表达载体pTrc99a上，转化至E.coliJM109中，表达质粒命名为pTrc99a-ldc（附图2）。
实施例2：ldc基因易错PCR突变库的构建及其筛选
易错PCR反应条件为：95℃5min；95℃1min，58℃30s，72℃2min30s，30cycles，72℃10min。反应体系：
模板DNA 3μL
上游引物 2μL
下游引物 2μL
MgCl2(2.5mM) 4μL
MnCl2(5mM) 4μL
dNTPs 4μL
dCTP、dTTP(100mM) 各1μL
rTaq DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 至50μL
1%琼脂糖检测PCR结果，胶回收试剂盒回收PCR产物。稀释第一次易错PCR回收产物为模板，以P15’-CGGGATCCATGAATATCATTGCCATCATGAACG-3’、P25’-CCCAAGCTTTTATGACTTCTTCGCCGCTGAT-3’为引物，进行第二轮易错PCR，如此反复进行第三轮易错PCR。胶回收试剂盒回收第二次及第三次易错PCR产物（赖氨酸脱羧酶基因），并经过BamH I和HindIII双酶切、纯化，连接到pTrc99a载体上，重组质粒利用氯化钙转化法转化至E.coliJM109，构建随机突变体库。
大量抽提突变文库中重组质粒，氯化钙转化法转化至E.coliJM109，涂布于LB抗性平板。将LB抗性平板上长出的菌落点于LBXL平板上，培养12h，观察透明圈大小，挑取透明圈比野生型大的突变株进行比酶活测定。
实施例3：ldc基因DNA改组突变库的构建及其筛选
以实施例2中易错PCR产物作为模板，用DNaseI酶消化ldc基因，测定片段核酸浓度。
（1）重组基因的制备
用限制性内切酶BamH I和HindIII消化含有突变ldc基因的质粒片段，37℃作用2.5h，酶切产物用胶回收试剂盒纯化目的基因片段，TE溶解，
①DNaseI消化：
10mMTris-HCl（pH7.5） 466.7μL
上述易错PCR产物 36.5μL
1M Tris-HCl（pH7.5） 2.5μL
50mMMnCl2 10μL
1000倍稀释的DNaseI 0.5μL
15℃反应10min，95℃放置10min终止反应，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化，回收50-100bp左右的片段。
②无引物PCR
1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化。
③有引物PCR
2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
此步DNA改组获得的ldc基因片段与载体pTrc99a的连接转化同实施例1。具体蛋白表达效果见实施例6，加入IPTG诱导蛋白表达。
实施例4：赖氨酸脱羧酶ldc的SDS-PAGE电泳及比酶活的测定
野生型E.coli JM109/pTrc99a-ldc和突变体E.coli JM109/pTrc99a-ldc2-41于5mL的LB培养基（含氨苄抗性）中过夜培养12h，37℃，200rpm。再接种1mL至100mL的LB培养基（含氨苄抗性），37℃，200rpm，培养3h至OD6000.6～0.8，加入62.5μL of0.8M IPTG，再继续培养12h。取发酵液5mL，4℃，10000r/min离心15min。细胞沉淀用50mmol/L的醋酸盐溶液（pH6.0）洗2次，细胞悬液在冰上超声处理5min（停2s，工作3s）。4℃，8000r/min离心15min除去细胞碎片，上清液作为粗酶液用于酶活分析。粗酶液总蛋白含量采用Bradford法进行测定。通过紫外分光光度计法测定产物1，5-戊二胺的量来分析赖氨酸酶酶活的活性。根据1，5-戊二胺与2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）反应的产物溶于甲苯，而赖氨酸所形成的化合物不溶于甲苯的原理设计的。用甲苯将1，5-戊二胺与TNBS反应的产物萃取出来，在340nm下测定吸收值。作出标准曲线对照，求出1，5-戊二胺的浓度。反应混合液包括0.5mL粗酶液、0.5mL50mmol/L的L-lysine和1μL的磷酸吡哆醛，反应在37℃进行。反应1h后通过添加等体积的1mol/LK2CO3来终止反应。取150μL反应终止液加至96孔板中，于酶标仪340nm处测定1，5-戊二胺含量。37℃1min催化生成1μmol1，5-戊二胺所需的酶量定义为1个酶活单位U，比酶活为U/总蛋白含量mg。
测定上述三轮突变体的酶活，进行进一步验证。经第一轮进化后，获得最佳突变体ldc1-16，其赖氨酸脱羧酶酶活力为4516.6U/mg.，相比野生型赖氨酸脱羧酶的3327.3U/mg提高了1.4倍。
以该突变体ldc1-16为模板进行第二轮进化，通过初筛和复筛后，获得最佳突变体ldc2-41（如SEQ ID NO：2所示），赖氨酸脱羧酶酶活力为6654.6U/mg，比野生型赖氨酸脱羧酶提高了2倍。
实施例5：赖氨酸脱羧酶突变体不同底物动力学参数的测定
赖氨酸脱羧酶在赖氨酸底物浓度分别为0.75mM到12mM(0.75，1.25，2.5，5.0，7.5，12.0)时，以反应开始的30s为反应的初速度，求取km和kcat值。
实施例6：赖氨酸脱羧酶突变体摇瓶发酵验证
野生型E.coli JM109/pTrc99a-ldc和突变体E.coli JM109/pTrc99a-ldc2-41于5mL的LB培养基（含氨苄抗性）中过夜培养12h，37℃，200rpm。再接种1mL至100mL的LB培养基（含氨苄抗性），37℃，200rpm，培养3h至OD6000.6～0.8，加入62.5μL of0.8M IPTG，再继续培养12h。用50mL离心管分别收集湿菌体，8000rpm，15min。收集到的湿菌体用乙酸钠缓冲液（pH6.0）洗涤菌体两遍，并转至100mL的100g/L的L-赖氨酸转化液（pH6.0，含0.1mM的5’-磷酸吡哆醛）中。野生型E.coli JM109/pTrc99a-ldc和突变体E.coliJM109/pTrc99a-ldc2-41转化生成的1,5-戊二胺分别于6h、5h后达到终产量63.9g/L，突变体比野生型转化时间提前了1h。
实施例7：赖氨酸脱羧酶ldc突变体的三级结构预测
高酶活力突变株的赖氨酸脱羧酶基因（ldc2-41）经过PCR扩增及酶切验证后送Genscript公司测序。同时在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找同源序列并进行比对，根据比对结果选择结构模拟的模板，在SWISS-MODEL数据库(http://swissmodel.expasy.org/)输入赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列和模板的PDB编号，生成模拟结构。预测突变赖氨酸脱羧酶的三级结构，如附图5。测序结果表明，突变体有3个碱基发生了突变：A438G/G439T/A1748G，相应的氨基酸改变为Val147Phe/Glu583Gly，利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示，这2个突变氨基酸分别位于第5个α螺旋和第2个η卷曲之间的转角，第21个α螺旋和第22个α螺旋之间的第2个氨基酸。

Claims (9)

1.一种赖氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶突变体的编码基因。
3.权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，用于催化L-赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。
4.权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的氨酸脱羧酶突变体的酶活力为6654.6U/mg；和/或所述的赖氨酸脱羧酶突变体的酶活力比野生型提高2倍以上；和/或所述的赖氨酸脱羧酶突变体生产1，5-戊二胺的时间缩短25％以上。
5.一种包含权利要求2所述的基因的克隆载体、表达载体或宿主细胞。
6.权利要求5所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为pUC18、所述的表达载体为pTrc99a、所述的宿主细胞为大肠杆菌JM109。
7.权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求2所述的基因酶切、连接到pTrc99a载体，得到重组质粒；
(2)所述的重组质粒转化至E.coliJM109，得到重组菌株；
(3)表达所述的重组菌株，纯化获得如SEQ ID NO：2所示的赖氨酸脱羧酶突变体。
8.权利要求7所述的赖氨酸脱羧酶突变体的制备方法，其特征在于，所述的赖氨酸脱羧酶突变体的酶活力为6654.6U/mg，和/或所述的赖氨酸脱羧酶突变体的酶活力比野生型提高2倍以上；和/或所述的赖氨酸脱羧酶突变体生产1，5-戊二胺的时间缩短25％以上。
9.权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶突变体的酶活力检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以L-赖氨酸为底物，添加磷酸吡哆醛及0.75、1.25、2.5、5.0、7.5、12.0mM赖氨酸脱羧酶突变体粗酶液，生成1,5-戊二胺；
(2)将生成的1,5-戊二胺与2,4,6-三硝基苯磺酸反应，得到的产物用甲苯萃取，并在340nm下测定吸收值；
(3)绘制标准曲线，计算1，5-戊二胺的浓度及赖氨酸脱羧酶突变体的酶活力；
其中，所述的赖氨酸脱羧酶突变体粗酶液为0.5mL，所述的L-赖氨酸为0.5mL50mmol/L，所述的磷酸吡哆醛为5μL0.2mmol/L，所述的2,4,6-三硝基苯磺酸为0.5mL10mmol/L，所述的甲苯为2mL，反应温度为37℃，反应1h后添加等体积的1mol/L K2CO3终止反应。
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