CN106591271A

CN106591271A - 一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN106591271A
Application number: CN201710119423.9A
Authority: CN
Inventors: 张涛; 江波; 蒋航宇; 沐万孟; 缪铭
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2037-03-02
Also published as: US20180251748A1; US20200109391A1; CN106591271B; US10557130B2; US10815470B2

Abstract

一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。该精氨酸脱亚胺酶突变体为酶活性中心附近的甘氨酸突变为脯氨酸，即Gly292 Pro。本发明利用定点突变技术对野生型精氨酸脱亚胺酶arcA编码基因进行分子改造，得到了一种突变体酶ADI^G292P，相对于野生型精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列的第292位甘氨酸突变为脯氨酸。本发明所述的定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶与野生酶相比其酶活力提高了1.5倍，在40℃下的半衰期提高了5.43倍，解决了精氨酸脱亚胺酶催化瓜氨酸合成时，催化能力和温度稳定性低的问题，为高效合成瓜氨酸的工业化生产及医药应用奠定了基础。

Description

一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

精氨酸脱亚胺酶（Arginine deiminase，EC 3.5.3.6）简称ADI，它能将精氨酸水解，生成瓜氨酸和氨。自从1933年首次报道以来，已在乳链球菌、粪链球菌、酵母、假单胞菌、支原体、盐杆菌及部分真核细胞等中发现有该酶存在。精氨酸脱亚胺酶来源广泛，目前在细菌、古细菌及一些真核细胞中均有发现。不同微生物来源的ADI分子量范围、最适pH、最适温度等性质均有明显的差异。但这些ADI均有分解精氨酸的能力。

瓜氨酸(Citrulline)又名氨基甲酰鸟氨酸(Carbamylornithine ornithin)，由于最初是从西瓜中提取，因而得名。近年来，研究发现瓜氨酸具有清除自由基、影响人体内氮平衡、心血管系统的免疫调节等生理功能。因此，瓜氨酸在食品医药等方面的应用日益增加。由于瓜氨酸的抗衰老、增强免疫力、提高运动员肌肉力量和耐力等功能，已有加拿大公司生产的运动功能性饮料中添加瓜氨酸。同时，在欧美国家也有含有瓜氨酸的保健护肤品上市销售。

生产瓜氨酸主要有化学法、提取法、发酵法和酶法四种生产方式。其中，化学法是目前主要的生产方式，但其生产过程中产生的铜离子和硫化氢等副产物产生对环境造成不利影响。提取法和发酵法生产瓜氨酸均有产率低和成本高的问题，不利于大规模生产。而使用酶法生产瓜氨酸具有反应条件温和、转化效率高、提取工艺简单等优点，具有较高的研究和生产价值。因此，寻找催化效率更高、安全稳定的精氨酸脱亚胺酶成为酶法生产瓜氨酸的关键问题。

定点突变（sit-directed mutagenesis）是一种分子改造的主要手段，是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。与其他改善分子改造的策略相比，定点突变更为迅速、直接和节约成本，因此它是实验室常用的基因改造的手段之一。

发明内容

本发明的目的在于，通过对精氨酸脱亚胺酶的分子改造，使改造后的精氨酸脱亚胺酶的酶活和温度稳定性有所提高，最终应用于瓜氨酸的生产及医药。

本发明提供了一种定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶突变体，由粪肠球菌Enterococcus faecalis SK32.001的精氨酸脱亚胺酶基因出发，运用定点突变技术获得，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.1，该精氨酸脱亚胺酶突变体是由SEQ ID No.2的核苷酸系列所编码。

所述的氨基酸发生突变位于精氨酸脱亚胺酶蛋白结构的外部，所述的突变可能可以增加蛋白疏水相互作用或静电相互作用。

本发明的技术方案：一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.1。

所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因DNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种重组质粒，包含了所述的DNA分子。

一种宿主细胞，其含有如所述的DNA分子，或含有如所述的重组质粒。

所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列DNA的重组质粒转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到一株酶活和温度稳定性提高的突变体Gly292Pro。第292位甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro。

所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，包括如下步骤：

1、根据Enterococcus faecalis SK32.001的精氨酸脱亚胺酶arcA基因序列设计引物，以含有精氨酸脱亚胺酶序列的Enterococcus faecalis SK32.001为模板，通过PCR的方法获得含有精氨酸脱亚胺酶arcA的基因片段，与表达载体pET-28a连接构建重组质粒；

2、利用B-FITTER软件识别出酶分子中对温度稳定性有不利影响的关键氨基酸残基，然后利用SWISS-MODEL软件对亲本精氨酸脱亚胺酶进行蛋白结构模拟，获得精氨酸脱亚胺酶三级结构；通过分析对比，确定要突变的氨基酸位点为第292位甘氨酸；

3、设计突变引物，使用一步PCR法对精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列进行定点突变，将所述第292位的氨基酸进行替换，获得含精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列的重组载体；

4、将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列的重组载体通过热激转化进入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，并诱导表达，收集菌体，超声破碎细胞后使用Ni-NTA进行蛋白分离纯化，获得精氨酸脱亚胺酶突变体。

所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的应用，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体用于瓜氨酸的生产及医药。

本发明的有益效果：本发明提供的精氨酸脱亚胺酶突变体酶活和温度稳定性均有提高，其中酶活提高了1.5倍，在40℃下的半衰期提高了5.43倍。本发明优化改良了野生型的精氨酸脱亚胺酶酶活和温度稳定性较低的问题，为该酶用于瓜氨酸的生产及医药创造良好的条件。

本发明所用的精氨酸脱亚胺酶的基因arcA来自于一株可生产瓜氨酸的粪肠球菌，该菌株编号CCTCC NO：M 2011465，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，命名为SK32.001（Enterococcus faecalis SK32.001），在中国专利CN 102433290 A中已经公布。

附图说明

图1：重组质粒pET-28a-ADI^G292P的构建图谱。

图2：野生酶和突变酶的在40℃的温度稳定性。

图3：野生酶和突变酶的生物合成瓜氨酸转化率。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。

材料与试剂：所用的限制性内切酶、Solution Ⅰ连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）菌株、引物均购于生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。

实施例1：重组质粒的构建

将Enterococcus faecalis SK32.001培养至指数生长中期，取2 mL菌液10000 r/min离心10 min弃上清，溶菌酶处理30 min后按照试剂盒说明提取基因组DNA。

设计如下的引物来用于arcA的扩增：

FADI-2：5’-CGCGGATCCA TGAGTCATCC AATTAATGT-3’(含BamH I酶切位点），

RADI-2：5’-CCGCTCGAGT TAAAGATCTT CACGGT-3’（含XhoⅠ酶切位点），

PCR扩增条件：95℃变性3 min，30个循环（95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 210 s），最后72℃延伸2min。

扩增产物纯化后，用BamH I及 XhoⅠ对PCR产物及载体pET-28a-c(+)进行双酶切，分别回收酶切产物，用Solution Ⅰ连接酶16℃下连接2 h，热激转化到DH5α细胞中，待平板长出转化子后，挑取单菌落到液体培养基中，提取质粒，通过酶切验证重组质粒pET-28a-ADI。将重组质粒转化到BL21(DE3)细胞中，得到BL21(DE3)/ pET-28a-ADI工程菌。

实施例2：精氨酸脱亚胺酶突变位点的确定

使用软件B-FITTER计算出亲本精氨酸脱亚胺酶氨基酸残基的温度因子（B-factor），获得酶分子中温度因子最高的氨基酸残基；利用SWISS-MODEL软件对精氨酸脱亚胺酶蛋白结构进行模拟，获得精氨酸脱亚胺酶的三级结构模型；使用软件Discovery Studio分析温度因子最高的氨基酸残基与酶催化活性中心之间的距离和空间结构；确定要突变的氨基酸位点为第292位甘氨酸。

实施例3：定点突变

根据Enterococcus faecalis SK23.001中编码arcA的编码基因，进行引物设计。

G292P-正向引物：5’-CATCCAGAAA TCGAACCTGG CTTGGTTGTT T-3’，

G292P-反向引物：5’-TTCGATTTCT GGATGAATCG TAAATTTATC ATA-3’，

其中下划线部分代表突变体基因编码的292位甘氨酸所对应的密码子。

PCR扩增体系为：

10×Reaction Buffer	5 μL
		dNTP mix	1 μL
正向引物（100 ng/μL）	1.25μL
		反向引物（100 ng/μL）	1.25μL
模版pET-28a-ADI（10 ng）	2 μL
		pfuTurbo DNA polymerase(2.5U/μL)	1μL
ddH₂O	38.5μL
		总体积	50 μL

PCR扩增后，向反应液中加入1 μL Dpn Ⅰ限制性内切酶（10 U/μL），在37 ℃下保温1h消除模板。将PCR产物转化至大肠杆菌DH5α细胞中，涂布平板，挑取单菌落到液体培养基，提取质粒，经测序得到正确突变质粒，将构建成功的突变质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到突变株BL21(DE3)/ pET-28a-ADI^G292P。

实施例4：野生酶和突变酶的表达纯化

挑取BL21(DE3)/ pET-28a-ADI及BL21(DE3)/ pET-28a-ADI^G292P单菌落于含0.5 mmol/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、200 r/min培养12h后，转接至含0.5 mmol/L卡那霉素的LB培养基中，在37℃、200 r/min培养至OD₆₀₀在0.5~0.7范围内，加入1 mmol/L的IPTG在28℃、200 r/min条件下诱导9 h。

发酵液在10000 r/min、4 ℃下离心10 min后，弃上清，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，加入15~20 mL磷酸盐缓冲液使菌体悬浮，超声破碎15 min(功率22W，破碎1 s，间歇2 s)。在4℃、10000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，即为粗酶液，用孔径0.22 μm水系膜过滤。

用Binding Buffer对Ni^{2 +}螯合琼脂糖树脂柱进行预平衡；加入粗酶液，分别用Binding Buffer及 Washing Buffer平衡；用Elution Buffer将酶洗脱下来，回收；将回收的酶液在透析缓冲液中透析后于4 ℃冰箱中保存。

所涉及缓冲液配制：

磷酸盐缓冲液（PB）：50 mmol/L，pH 5.5；

Binding Buffer：50 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，pH 7.0；

Washing Buffer：50 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，pH 7.0，50 mmol/L 咪唑；

Elution Buffer：50 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，pH 7.0，500 mmol/L 咪唑；

透析缓冲液：50 mmol/L PB，pH 5.5，10 mmol/L EDTA。

实施例5：野生酶和突变酶的酶活和温度稳定性的测定

酶活定义：在此条件下，每分钟催化生产1μmol的瓜氨酸的酶量定义为一个酶活单位（U）。

温度稳定性：将酶液于40℃保温，分时间梯度取出样品加入底物L-精氨酸，置于45℃水浴10 min后立即煮沸终止反应，然后用HPLC检测瓜氨酸的产量，计算相对酶活。将未处理的酶液的酶活定义为100%，并以相对酶活的百分比对时间作图，评价酶的温度稳定性。得到的结果如附图2：突变体G292P的酶在40℃下半衰期比野生酶的16.9 min延长至91.8min，提高了5.43倍。

实施例6：瓜氨酸的高效合成

分别取野生酶和突变酶的湿菌体1 g加入50 mL浓度为100 g/L的L-精氨酸溶液，反应在45℃、150 r/min及pH 6.0~6.5下进行，定时取样并进行瓜氨酸产量分析。结果如附图3显示，2 h后突变酶的湿菌体使95%以上的精氨酸转化为瓜氨酸，5 h后野生酶的湿菌体使95%以上的精氨酸转化为瓜氨酸。

本实施例瓜氨酸产率为95 %以上。

本发明可在较短的时间内通过酶法转化获得较高浓度的瓜氨酸，为将来工业应用奠定基础。

序列表

<210> SEQ ID No.1

<211> 408

<212> RNA

<213> 精氨酸脱亚胺酶突变体氨基酸序列

<400> 1

MET Ser His Pro Ile Asn Val Phe Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys

5 10 15

Thr Val MET Leu His Arg Pro Gly Lys Glu Leu Glu Asn Leu MET

20 25 30

Pro Asp Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu

35 40 45

Glu Lys Ala Gln Ala Glu His Asp Ala Phe Ala Glu Leu Leu Arg

50 55 60

Ser Lys Asp Ile Glu Val Val Tyr Leu Glu Asp Leu Ala Ala Glu

65 70 75

Ala Leu Ile Asn Glu Glu Val Arg Arg Gln Phe Ile Asp Gln Phe

80 85 90

Leu Glu Glu Ala Asn Ile Arg Ser Glu Ser Ala Lys Glu Lys Val

95 100 105

Arg Glu Leu MET Leu Glu Ile Asp Asp Asn Glu Glu Leu Ile Gln

110 115 120

Lys Ala Ile Ala Gly Ile Gln Lys Gln Glu Leu Pro Lys Tyr Glu

125 130 135

Gln Glu Phe Leu Thr Asp MET Val Glu Ala Asp Tyr Pro Phe Ile

140 145 150

Ile Asp Pro MET Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Asn Phe Ala

155 160 165

Thr MET Gly His Gly Ile Ser Leu Asn His MET Tyr Ser Val Thr

170 175 180

Arg Gln Arg Glu Thr Ile Phe Gly Gln Tyr Ile Phe Asp Tyr His

185 190 195

Pro Arg Phe Ala Gly Lys Glu Val Pro Arg Val Tyr Asp Arg Ser

200 205 210

Glu Ser Thr Arg Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Ile Leu Ser Lys

215 220 225

Glu Val Val Ala Ile Gly Ile Ser Gln Arg Thr Asp Ala Ala Ser

230 235 240

Ile Glu Lys Ile Ala Arg Asn Ile Phe Glu Gln Lys Leu Gly Phe

245 250 255

Lys Asn Ile Leu Ala Phe Asp Ile Gly Glu His Arg Lys Phe MET

260 265 270

His Leu Asp Thr Val Phe Thr MET Ile Asp Tyr Asp Lys Phe Thr

275 280 285

Ile His Pro Glu Ile Glu Pro Gly Leu Val Val Tyr Ser Ile Thr

290 295 300

Glu Lys Ala Asp Gly Asp Ile Gln Ile Thr Lys Glu Lys Asp Thr

305 310 315

Leu Asp Asn Ile Leu Cys Lys Tyr Leu His Leu Asp Asn Val Gln

320 325 330

Leu Ile Arg Cys Gly Ala Gly Asn Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu

335 340 345

Gln Trp Asn Asp Gly Ser Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu

350 355 360

Val Val Val Tyr Asp Arg Asn Thr Ile Thr Asn Lys Ala Leu Glu

365 370 375

Glu Ala Gly Val Lys Leu Asn Tyr Ile Pro Gly Ser Glu Leu Val

380 385 390

Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys MET Ser MET Pro Leu Tyr Arg

395 400 405

Glu Asp Leu***

408

<210> SEQ ID No.2

<211> 1227

<212> DNA

<213> 精氨酸脱亚胺酶突变体核苷酸序列

<400> 2

atgagtcatc caattaatgt attttctgaa atcggaaaat tgaaaacagt gatgttacat 60

cgtccaggta aggaattaga aaatttaatg ccagattatc tggagagact gttgtttgat 120

gatattccgt ttttagaaaa agcacaagca gaacatgatg catttgcaga gttgttacga 180

tcaaaagata tcgaagtggt ctatttagag gacttagctg ctgaagcgtt gattaatgaa 240

gaggtccgcc gacaatttat tgaccaattc ttagaagaag ccaatattcg cagcgaatca 300

gcaaaagaaa aagttagaga gttaatgtta gaaattgacg acaacgaaga actgattcaa 360

aaagcgattg ctggcattca aaaacaagaa ttacctaaat atgagcaaga atttttaaca 420

gatatggttg aagcggatta tccattcatt attgatccaa tgcctaactt atacttcaca 480

cgtgataact ttgcgacaat gggccacggg atttctttaa atcatatgta ttcagtaact 540

cgacaacggg aaaccatttt tgggcaatac atttttgatt atcatcctcg ttttgctgga 600

aaagaggttc ctagagtcta tgatcgttca gaatcaacca gaattgaagg tggcgatgaa 660

ttaattcttt caaaagaagt ggtggccatt gggatttctc aaagaacgga cgccgcgtca 720

attgaaaaaa ttgcgagaaa tatttttgaa caaaaattag gattcaaaaa tatcttggct 780

tttgatatcg gtgaacatcg taaattcatg catttagata ccgtttttac catgattgac 840

tatgataaat ttacgattca tccagaaatc gaacctggct tggttgttta ctcgatcact 900

gaaaaagcag atggagacat ccaaattaca aaagaaaaag atacattaga taacatttta 960

tgcaaatact tgcatttaga caatgttcaa ttaatccgtt gcggcgctgg aaatttaacc 1020

gcagcagccc gggaacaatg gaacgacggt tcaaatacat tagcaattgc ccctggggaa 1080

gttgttgttt acgatcggaa tacgattacg aataaagcgc tagaagaagc aggcgtgaaa 1140

ttgaattaca ttccaggaag tgaactagta cgtggccgtg gtggccctcg ttgtatgagt 1200

atgccacttt accgtgaaga tctttaa 1227

Claims

1.一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQ IDNo.1。

2.权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因DNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种重组质粒，其特征在于包含了权利要求2所述的DNA分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于其含有如权利要求2所述的DNA分子，或含有如权利要求3所述的重组质粒。

5.根据权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列DNA的重组质粒转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到一株酶活和温度稳定性提高的突变体Gly292Pro。

6.根据权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，第292位甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro。

7.权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）根据Enterococcus faecalis SK32.001的精氨酸脱亚胺酶arcA基因序列设计引物，以含有精氨酸脱亚胺酶序列的Enterococcus faecalis SK32.001为模板，通过PCR的方法获得含有精氨酸脱亚胺酶arcA的基因片段，与表达载体pET-28a连接构建重组质粒；

2）利用B-FITTER软件识别出酶分子中对温度稳定性有不利影响的关键氨基酸残基，然后利用SWISS-MODEL软件对亲本精氨酸脱亚胺酶进行蛋白结构模拟，获得精氨酸脱亚胺酶三级结构；通过分析对比，确定要突变的氨基酸位点为第292位甘氨酸；

3）设计突变引物，使用一步PCR法对精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列进行定点突变，将所述第292位的氨基酸进行替换，获得含精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列的重组载体；

4）将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列的重组载体通过热激转化进入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，并诱导表达，收集菌体，超声破碎细胞后使用Ni-NTA进行蛋白分离纯化，获得精氨酸脱亚胺酶突变体。

8.权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的应用，其特征在于，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体用于瓜氨酸的生产及医药。