CN113444714B - 一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用。一种腈水合酶的β亚基突变体，由野生型β亚基序列经突变所得，野生型β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变位点为L25F、G27Y、N59P和A173N中的至少一个。本发明通过蛋白质分子改造，显著提高了源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶在基因工程菌E.coli BL21(DE3)中的稳定性表达。以丙烯腈为底物，本发明的腈水合酶突变体在45℃下热稳定性显著提高，突变体NHAB‑B4M为NHAB的5.4倍，并且在100g/L丙烯酰胺溶液中的耐受性提高了3.6倍，具有非常大的工业应用前景。

Description

一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，NHase)是一类可催化腈类化合物水合生成酰胺类物质的生物催化剂。微生物生产的腈水合酶可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺；丙烯酰胺聚合生成的聚丙烯酰胺作为降阻剂、絮凝剂和增稠剂在石油开采、水处理以及造纸等方面广泛应用。

生物酶催化法制备丙烯酰胺相较于传统的化学催化法，具有转化效率高、产物纯度高、反应条件温和以及环境友好等优点，有逐步取代化学法的趋势。日本三菱公司利用含有腈水合酶的玫瑰色红球菌J1(CN91101323.7)催化丙烯腈生产丙烯酰胺，年产量达20万吨以上。但红球菌是一种野生菌，其生长周期较长、生产效率较低，并且仅在10～30℃条件下稳定，因此在实际生产应用中还是有一定限制。目前，生物酶催化法生产丙烯酰胺的研究重点在于高产腈水合酶菌株的发现以及对腈水合酶本身性能的改造提高。在水合反应过程中，游离细胞内的腈水合酶受到流加的丙烯腈和高浓度的丙烯酰胺溶液抑制作用以及不稳的反应温度影响，催化活性迅速下降，因此无法在一批次的水合反应中获得较高的产物浓度。工业化生产中必须进一步通过高温浓缩工序得到高浓度丙烯酰胺，这使得生产成本显著提高。为了解决这一问题，必须显著提高腈水合酶的稳定性，包括热稳定性和丙烯酰胺耐受性。

通过构建具有腈水合酶催化活性的基因工程菌株，并对腈水合酶进行蛋白质工程改造可在一定程度上解决解决丙烯酰胺生产中的实际问题。基因工程菌适应性强，发酵周期短，有利于实现大规模培养和工业化生产，且可以有效地降低生产成本。专利文献(CN104498466)公开了一种来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶(NHAB)基因序列，其对丙烯腈有较高的催化活力，但其热稳定性和产物耐受性仍不能满足工业化要求。因此，选择NHAB进行蛋白质工程改造，可获得热稳定性和产物耐受性均有提高的腈水合酶突变体，更好地应用于丙烯酰胺的大规模生产。

发明内容

本发明针对来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶，对β亚基进行理性设计，提供了多个热稳定性和产物耐受性显著提高的腈水合酶突变体，这些突变体可以用于生产丙烯酰胺。

一种腈水合酶的β亚基突变体，由野生型β亚基序列经突变所得，野生型β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变方式为以下一种：

(1)L25F、G27Y、N59P或A173N；

(2)L25F/G27Y、L25F/N59P、L25F/A173N、G27Y/N59P、G27Y/A173N或N59P/A173N；

(3)L25F/G27Y/N59P、L25F/G27Y/A173N、L25F/N59P/A173N或G27Y/N59P/A173N；

(4)L25F/G27Y/N59P/A173N。

本发明又提供了一种β亚基突变的腈水合酶突变体，包括α亚基和β亚基，其中，所述β亚基为所述的β亚基突变体。

优选的，所述的腈水合酶突变体，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明又提供了一种用于表达所述腈水合酶突变体的基因簇，所述基因簇包括分别编码α亚基、β亚基突变体以及调控蛋白p14K的基因序列。其中，编码α亚基的基因序列如SEQ ID NO.4所示，编码调控蛋白p14K的基因序列如SEQ ID NO.6所示，编码野生型β亚基的基因序列如SEQ ID NO.5所示，编码β亚基突变体的基因序列根据上述编码野生型β亚基的基因序列对突变位点相应的位置进行突变后所得。

优选的，编码α亚基的基因序列与编码β亚基突变体的基因序列之间具有第一连接序列，第一连接序列的序列为：GGAGATCATC；编码β亚基突变体的基因序列与编码调控蛋白p14K的基因序列之间具有第二连接序列，第二连接序列的序列为：TC。α亚基、β亚基及调控蛋白p14K对应的编码基因均是独立表达的，各自均有起始密码子和终止密码子，而第一连接序列和第二连接序列为非编码序列，属于RBS结合位点。

本发明又提供了包含所述基因簇的重组表达载体。

本发明又提供了包含所述重组表达载体的基因工程菌。

本发明还提供了所述的腈水合酶突变体在催化丙烯腈生产丙烯酰胺中的应用。

本发明还提供了所述的基因工程菌在催化丙烯腈生产丙烯酰胺中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：通过蛋白质分子改造，显著提高了源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶在基因工程菌E.coliBL21(DE3)中的稳定性表达。以丙烯腈为底物，本发明的腈水合酶突变体在45℃下热稳定性显著提高，突变体NHAB-B4M为NHAB的5.4倍，并且在100g/L丙烯酰胺溶液中的耐受性提高了3.6倍，具有非常大的工业应用前景。

附图说明

图1为腈水合酶NHAB催化丙烯腈生成丙烯酰胺的液相检测图谱。

图2为腈水合酶野生型NHAB和突变体的初始相对酶活以及45℃水浴热处理1h后残余酶活的结果图。

图3为腈水合酶野生型NHAB和最佳突变体NHAB-B4M在100g/L丙烯酰胺溶液孵育2h后的残余酶活结果图。

具体实施方式

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明所涉及带有腈水合酶基因的重组大肠杆菌，所用载体为pET-30a(+)，所用宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。制备化转感受态细胞的试剂盒购自TAKARA公司。

下游催化工艺所用试剂：丙烯腈购自国药集团化学试剂有限公司；乙酰胺购自上海麦克林生化科技有限公司；丙烯酰胺购自阿拉丁试剂有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138：9-37，1984)。

酶活的定义(U/mL)：每分钟催化底物丙烯腈生成1μmol丙烯酰胺所需的酶量。

腈水合酶酶活标准检测体系：适量的酶液、0.8M底物，总体系为5mL，反应介质为pH7.5的0.25M磷酸盐缓冲液。28℃反应5min，液相检测产物丙烯酰胺的生成量。

高效液相色谱(HPLC)分析测定，色谱柱型号：

QS-C18，5μm，4.6mm×250mm，流动相：甲醇：水＝5：95，流速1mL/min。检测波长：205nm，柱温：40℃。

热稳定性的测定：将野生型NHAB和突变体均重悬于pH＝7.5的PB缓冲液中，成为OD₆₀₀＝2的菌液，置于45℃水浴热处理1h后测定残余酶活，未经热处理的酶的酶活定义为100％，得到热稳定性结果。

产物耐受性的测定：将野生型NHAB和突变体置于不同浓度的丙烯酰胺溶液中孵育，28℃。隔一段时间取样，测定残余酶活，未经热处理的酶的酶活定义为100％，得到丙烯酰胺耐受性结果。

实施例1：构建野生型NHAB及突变体重组菌

委托北京擎科新业生物技术有限公司提供密码子优化和基因合成服务，来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的野生型腈水合酶NHAB基因簇，由α亚基、β亚基以及调控蛋白p14K组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3所示。基因序列如SEQ ID NO.4、NO.5、NO.6所示，其中编码α亚基的基因序列与编码β亚基的基因序列之间具有第一连接序列，第一连接序列的序列为：GGAGATCATC；编码β亚基的基因序列与编码调控蛋白p14K的基因序列之间具有第二连接序列，第二连接序列的序列为：TC。将这一基因簇克隆于pET-30a(+)质粒上，将目的基因置于酶切位点EcoRI和Hind III之间获得pET-30a(+)-NHAB重组质粒。

将重组质粒pET-30a(+)-NHAB转染到宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组基因工程菌。

将带有pET-30a(+)-NHAB重组质粒的大肠杆菌工程菌使用LB培养基进行活化与培养。

LB培养基的具体配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。固体培养基为LB培养基加入2％的琼脂。

将保存有重组菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-NHAB的甘油管划线至含有LB固体培养基(50μg/mL卡那霉素)的平皿上，37℃静置培养12h。从平皿上挑取单菌落接入含50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃、200rpm培养12h。在获得培养液后，根据质粒提取试剂盒的操作说明书进行质粒的提取。

以步骤一中提取的pET-30a(+)-NHAB质粒为模版，通过全质粒PCR向NHABβ亚基基因引入定点突变，所用引物及PCR反应体系分别见表1、表2。

表1 PCR所用引物

表2 PCR扩增体系

组分	体积(μL)
		PrimeSTAR	25
上游引物	1.0
		下游引物	1.0
质粒模板	0.5
		ddH<sub>2</sub>O	22.5

以pET-30a(+)-NHAB质粒为模板，用表1所示引物进行点突变PCR，PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件：

1)预变性：98℃5min；

2)变性：98℃10s；退火：60℃15s；延伸：72℃1min 30s；共循环35次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，目标条带用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收。回收得到的PCR产物用DPN I消化，去除模板。消化体系如表3所示。

表3消化体系

试剂	体积(μL)
		PCR扩增产物/质粒	8.5
DPNI	0.5
		10×Buffer	1

消化条件：

1)37℃：1h；

2)75℃：15min；

3)4℃保存2.0h。

消化后产物化转导入大肠杆菌BL21感受态细胞，然后，由北京擎科新业生物技术有限公司测序，将测序结果正确的质粒进行表达，获得重组菌株。过初筛和复筛最终得到四个单点突变(β亚基突变)的腈水合酶突变体NHAB-L25F、NHAB-G27Y、NHAB-N59P、NHAB-A173N。以及两点组合突变体：NHAB-L25F/G27Y、NHAB-L25F/N59P、NHAB-L25F/A173N、NHAB-G27Y/N59P、NHAB-G27Y/A173N、NHAB-N59P/A173N；三点组合突变体：NHAB-L25F/G27Y/N59P、NHAB-L25F/G27Y/A173N、NHAB-G27Y/N59P/A173N、NHAB-L25F/N59P/A173N；和四点组合突变体NHAB-L25F/G27Y/N59P/A173N。

实施例2：微生物培养与酶活测定

(1)微生物的培养

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。LB固体培养基(平板培养皿)：在LB液体培养基基础上加入20g/L琼脂粉，121℃灭菌、降温后导入培养皿，制作成平板。

将含有相关基因的工程菌E.coli BL21(DE3)接种至含50μg/mL卡那霉素的5mLLB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/mL Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.5mM，加入氯化钴至其终浓度0.4mM，18℃下诱导培养16-18h。培养结束后，将培养液4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。

(2)酶活力的测定

将培养结束后收集到的菌体细胞，用0.25M PB缓冲液(pH 7.5)洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于2倍发酵液体积的0.25M PB缓冲液(pH 7.5)中，该细胞悬液用于后续测定。

酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

腈水合酶酶活测定体系：总体系为5mL，反应介质为pH 7.5的0.25M磷酸盐缓冲液，底物为4320μL 50g/L丙烯腈，加入430μL OD600＝2的菌液，28℃下反应5min后，加入250μL4mol/L HCl终止反应。

取反应液，12000rpm离心2min，吸取上清稀释100倍后加入等量内标(5g/L乙酰胺溶液)，使用液相内标法测定产物丙烯酰胺的生成量。液相分析图谱如图1所示。图1为腈水合酶NHAB催化丙烯腈生成丙烯酰胺的液相检测图谱，出峰顺序依次是内标物、产物和底物，其中底物丙烯腈的保留时间为9.5min，内标乙酰胺的保留时间为3.7min，产物丙烯酰胺保留时间为5.3min。

实施例3：NHAB野生型及突变体的热稳定性测定

酶的热稳定性表征：酶液分别置于45℃热水浴处理60min，然后利用酶活检测体系测定残余酶活，未经过处理的酶的酶活定义为100％。NHAB初始型在45℃下60min后残余酶活仅为18％，四个单点突变中，N59P的残余酶活最高为52％，是野生型的2.9倍。将这四个点组合，得到热稳定性最好的是四点组合突变体NHAB-L25F/G27Y/N59P/A173N，在45℃下60min热处理后几乎没有酶活损失，残余酶活为96.2％，是野生型的5.4倍且发酵液粗酶活还提高了23％。野生型NHAB和所有突变体的热稳定性如图2所示。图2为腈水合酶野生型NHAB和突变体的初始相对酶活以及45℃水浴热处理1h后残余酶活的结果图，实心柱形表示初始相对酶活，以NHAB野生型为100％；条纹柱形表示45℃，1h热处理后的残余酶活。

实施例4：NHAB初始型及突变体的产物耐受性测定

酶的产物耐受性测定：将野生型NHAB和突变体置于100g/L的丙烯酰胺溶液中孵育，28℃，2h后测定残余酶活，未经热处理的酶的酶活定义为100％。NHAB浸泡2h后残余酶活仅20％，四点组合突变体NHAB-L25F/G27Y/N59P/A173N的残余酶活为72％，是野生型的3.6倍。野生型NHAB和突变体NHAB-B4M的丙烯酰胺耐受性如图3所示。图3为腈水合酶野生型NHAB和最佳突变体NHAB-B4M在100g/L丙烯酰胺溶液孵育2h后的残余酶活结果图，实心柱形表示初始相对酶活，以NHAB初始型为100％；条纹柱形表示100g/LAM，2h浸泡处理后的残余酶活。

实施例5：NHAB-B4M催化丙烯腈生成丙烯酰胺

取实施例2构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-NHAB-B4M的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取9.2g湿菌体用200mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH7.5)重悬，20℃进行水合反应，前2h以0.22g/min的流速滴加丙烯腈，后2h以0.18g/min的流速滴加。停止滴加，共反应8h。之后用气相色谱检测反应体系中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸的含量。底物转化率大于93％，丙烯酰胺浓度为300g/L，在反应体系中无丙烯酸的生成。

对比例1：NHAB催化丙烯腈生成丙烯酰胺

取实施例2构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-30a(+)-NHAB的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取9.2g湿菌体用200mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬，20℃进行水合反应，前2h以0.22g/min的流速滴加丙烯腈，后2h以0.18g/min的流速滴加。停止滴加，共反应8h。之后用气相色谱检测反应体系中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸的含量。底物转化率大于78％，丙烯酰胺浓度为250g/L，在反应体系中无丙烯酸的生成。

序列表

<110> 浙江大学杭州国际科创中心

<120> 一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 211

<212> PRT

<213> 博得特氏菌(Bordetella petrii)

<400> 1

Met Gly Gln Ser His Thr His Asp His His His Asp Gly Tyr Gln Ala

1 5 10 15

Pro Pro Glu Asp Ile Ala Leu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu

20 25 30

Val Glu Lys Gly Leu Val Asp Pro Ala Ala Met Asp Ala Val Val Gln

35 40 45

Thr Tyr Glu His Lys Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Lys Val Val Ala

50 55 60

Lys Ala Trp Val Asp Pro Ala Tyr Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asn Gly

65 70 75 80

Ser Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Phe Ser Gly Val Gln Gly Glu Asp

85 90 95

Thr Val Ile Leu Glu Asn Thr Pro Ala Val His Asn Val Phe Val Cys

100 105 110

Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Ser Leu Gly Leu Pro Pro Ala

115 120 125

Trp Tyr Lys Ala Ala Pro Tyr Arg Ser Arg Met Val Ser Asp Pro Arg

130 135 140

Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Leu Val Ile Pro Thr Asn Lys Glu Ile

145 150 155 160

Arg Val Trp Asp Thr Thr Ala Glu Leu Arg Tyr Met Val Leu Pro Glu

165 170 175

Arg Pro Ala Gly Thr Glu Gly Tyr Ser Glu Glu Gln Leu Ala Glu Leu

180 185 190

Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Gly Leu Pro Thr Gln Pro Lys

195 200 205

Pro Ser His

210

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> 博得特氏菌(Bordetella petrii)

<400> 2

Met Asn Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Ala His Gly Tyr Gly Pro Val

1 5 10 15

Tyr Arg Glu Pro Asn Glu Pro Ile Leu His Gly Glu Trp Glu Gly Arg

20 25 30

Val Leu Ala Leu Phe Pro Ala Leu Phe Ala Asn Gly Asn Phe Asn Ile

35 40 45

Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Asn Pro Ile Asp Tyr Leu

50 55 60

Lys Gly Thr Tyr Tyr Glu His Trp Ile His Ser Ile Glu Thr Leu Leu

65 70 75 80

Val Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Thr Glu Leu Ala Thr Gly Lys Ala

85 90 95

Ser Gly Lys Thr Ala Thr Pro Val Leu Thr Pro Val Met Val Asp Gly

100 105 110

Leu Leu Ser Asn Gly Ala Ser Ala Ala Arg Lys Glu Gly Val Gln Ala

115 120 125

Arg Phe Ala Val Gly Asp Lys Val Arg Val Leu Asn Lys His Pro Val

130 135 140

Gly His Thr Arg Met Pro Arg Tyr Thr Arg Gly Lys Val Gly Thr Val

145 150 155 160

Val Ile Asp His Gly Val Phe Val Thr Pro Asp Thr Ala Ala His Gly

165 170 175

Lys Gly Glu His Pro Gln His Val Tyr Thr Val Ser Phe Thr Ser Val

180 185 190

Glu Leu Trp Gly Gln Asp Ala Ser Ser Pro Lys Asp Thr Ile Arg Val

195 200 205

Asp Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Glu Pro Ala

210 215

<210> 3

<211> 144

<212> PRT

<213> 博得特氏菌(Bordetella petrii)

<400> 3

Met Lys Asp Glu Arg Phe Pro Leu Pro Glu Gly Ser Leu Lys Asp Leu

1 5 10 15

Asp Gly Pro Val Phe Asp Glu Pro Trp Gln Ser Gln Ala Phe Ala Leu

20 25 30

Val Val Ser Met His Lys Ala Gly Leu Phe Gln Trp Lys Asp Trp Ala

35 40 45

Glu Thr Phe Thr Ala Glu Ile Asp Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Glu

50 55 60

Ser Val Asn Asp Thr Tyr Tyr Arg Gln Trp Val Ser Ala Leu Glu Lys

65 70 75 80

Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu Val Thr Gly Gly Asp Val Asn Ser Arg

85 90 95

Ala Gln Glu Trp Lys Gln Ala His Leu Asn Thr Pro His Gly His Pro

100 105 110

Ile Leu Leu Ala His Ala Leu Cys Pro Pro Ala Ile Asp Pro Lys His

115 120 125

Lys His Glu Pro Gln Arg Ser Pro Ile Lys Val Val Ala Ala Met Ala

130 135 140

<210> 4

<211> 636

<212> DNA

<213> 博得特氏菌(Bordetella petrii)

<400> 4

atggggcaat cacacacaca cgaccaccat cacgacgggt accaggcacc gcctgaagac 60

attgcgctgc gggtgaaggc cttggagacc ctgctcgtcg agaaaggttt ggtcgacccg 120

gcggccatgg acgctatcgt ccaaacctat gaacacaagg tgggccctcg gaacggcgcc 180

aaggttgttg ccaaggcctg ggtggacccg gactacaagg accgcttgct gcgcgacggc 240

accgctggca ttgccgaact gggcttctct ggacgccagg gagaacacat ggtcattctg 300

gaaaacaccc ccgacgtgca caacgtcttc gtctgcaccc tgtgctcttg ctacccatgg 360

ccggtgctgg gcttgccgcc ggcctggtac aaggccccgc cctaccggtc gcgcatggtg 420

agcgacccgc gtggggtcct ggcggagttc ggtttggtga tccccaccaa caaggaaatc 480

cgcgtctggg acaccacagc cgaattgcgc tacatggtgc tgccggaaag gcccgaagga 540

accgaaggct acagcgaaga acaactggcc gaactcgtca cccgcgattc gatgatcggc 600

actggcctgc ccacccaacc caaaccttcc cactaa 636

<210> 5

<211> 657

<212> DNA

<213> 博得特氏菌(Bordetella petrii)

<400> 5

atgaacggca ttcacgacac tggcggagca catggttatg gcccggttta cagggagccg 60

aatgagccca tccttcatgg cgagtgggag ggtcgggtcc tggcattgtt tccggcgctt 120

ttcgcaaacg gcaacttcaa catcgatgag tttcgacacg gcatcgagcg catgaacccc 180

atcgactacc tgaagggaac ctactacgaa cactggatcc attccatcga aaccttgctg 240

gtcgaaaagg gtgtgctcac ggcaacggaa ctcgcgaccg gcaaggcatc tggcaagaca 300

gcgacaccgg tgctgacgcc ggtcatggtg gacggactgc tcagtaacgg agcttctgcc 360

gcccgcaagg agggggtgca ggcgcggttc gctgtgggcg acaaggttcg cgtcctcaac 420

aagcacccgg tgggccatac ccgcatgccg cgctacacgc ggggcaaagt ggggacagtg 480

gtcatcgacc atggtgtgtt cgtgacgccg gacaccgcgg cacacggaaa gggcgagcac 540

ccccagcacg tttacaccgt gagtttcacg tcggtcgaac tgtgggggca agacgcttcc 600

tcgccgaagg acacgattcg cgtcgacttg tgggatgact acctggagcc agcgtga 657

<210> 6

<211> 435

<212> DNA

<213> 博得特氏菌(Bordetella petrii)

<400> 6

atgaaagacg aacggtttcc attgccagag ggttcgctga aggacctcga tggccctgtg 60

tttgacgagc cttggcagtc ccaggcgttt gccttggtgg tcagcatgca caaggccggt 120

ctctttcagt ggaaagactg ggccgagacc ttcaccgccg aaatcgacgc ttccccggct 180

ctgcccggcg aaagcgtcaa cgacacctac taccggcaat gggtgtcggc gctggaaaag 240

ttggtggcgt cgctggggct tgtgacgggt ggagacgtca actcgcgcgc acaggagtgg 300

aaacaggccc acctcaacac cccacatggg cacccgatcc tgctggccca tgcgctttgc 360

ccgccagcga tcgaccccaa gcacaagcac gagccacaac gctcaccgat caaggtcgtt 420

gccgcaatgg cttga 435

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatgagccca tcttccatgg cgagtgggag ggtcg 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caggacccga ccctcccact cgccatggaa gatgg 35

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccttcattac gagtgggagg gtcgggtcct gg 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccactcgta atgaaggatg ggctcattcg gc 32

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acacggcatc gagcgcatgc cgcccatcga 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccttcaggta gtcgatgggc ggcatgcgct 30

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accaacgcac acggaaaggg cgagcacccc ca 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttccgtgtg cgttggtgtc cggcgtcacg aa 32

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccatcttcca ttacgagtgg gagggtcggg tcc 33

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcgtaatgg aagatgggct cattcggctc c 31

<210> 17

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggagatcatc 10

Claims (8)

1.一种β亚基突变的腈水合酶突变体，其特征在于，包括α亚基和β亚基，其中，所述β亚基为β亚基突变体，由野生型β亚基序列经突变所得，野生型β亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，突变方式为：L25F、G27Y、N59P和A173N。

2.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于，α亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.一种用于表达权利要求1所述腈水合酶突变体的基因簇，其特征在于，所述基因簇包括分别编码α亚基、β亚基突变体以及调控蛋白p14K的基因序列。

4.如权利要求3所述的基因簇，其特征在于，编码α亚基的基因序列与编码β亚基突变体的基因序列之间具有第一连接序列，第一连接序列的序列为：GGAGATCATC；编码β亚基突变体的基因序列与编码调控蛋白p14K的基因序列之间具有第二连接序列，第二连接序列的序列为：TC。

5.包含权利要求3~4任一所述基因簇的重组表达载体。

6.包含权利要求5所述重组表达载体的基因工程菌。

7.如权利要求2所述的腈水合酶突变体在催化丙烯腈生产丙烯酰胺中的应用。

8.如权利要求6所述的基因工程菌在催化丙烯腈生产丙烯酰胺中的应用。

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