CN116790573B

CN116790573B - 腈水合酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN116790573B
Application number: CN202311054507.0A
Authority: CN
Inventors: 于慧敏; 李付龙; 梁有向; 陈博; 王苗苗
Original assignee: Beijing Yanwei Technology Co ltd; Tsinghua University
Current assignee: Beijing Yanwei Technology Co ltd; Tsinghua University
Priority date: 2023-08-21
Filing date: 2023-08-21
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2043-08-21
Also published as: CN116790573A

Abstract

本申请提供了一种腈水合酶突变体及其应用。腈水合酶突变体为所述野生型腈水合酶的柔性环结构域上的氨基酸残基发生突变，包含突变1‑3中的任意的一项或其组合：突变1：位于野生型腈水合酶β亚基的二级结构域S1和S2之间的柔性环上的极性氨基酸突变，β亚基的152位氨基酸位点发生突变；突变2：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域H6和H7之间的柔性环上的极性氨基酸突变，β亚基的110位氨基酸位点发生突变；突变3：位于野生型腈水合酶β亚基的起始柔性环L1上的疏水性氨基酸突变，β亚基的17位氨基酸位点发生突变。本申请的腈水合酶突变体其单独或发挥协同调控效应，具有一定酶活力，具有良好的热稳定性和耐受性。

Description

腈水合酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，涉及一种腈水合酶突变体，包含该突变体的基因工程菌及其应用。

背景技术

酰胺类化合物是重要的有机合成中间体和化学品，被广泛应用于医药、农药、饲料、食品、环保、采油、材料等领域。从腈类化合物出发通过水合反应可获得相应的酰胺化合物，也是工业上制备此类化合物的重要方法之一。腈水合酶(Nitrile hydratase, 简称NHase, EC 4.2.1.84)是一类能够将腈化合物通过水合作用转化生成相应酰胺类物质的多亚基酶。利用腈水合酶催化剂，催化丙烯腈、烟腈水合生产丙烯酰胺和烟酰胺，是生物技术替代化学法工业化生产大宗化学品最成功的案例之一。

腈水合酶通常由α和β两个亚基组成(或被称之α和β亚基)，在红球菌属、诺卡氏菌、短杆菌和假单胞菌等多种微生物中均有分布。早在1980年，日本学者Asano首次在玫瑰色红球菌R. rhodochrous J1中发现此类酶并将其定义为腈水合酶(Asano Y, et al.Agricultural and Biological Chemistry, 1982, 46(5): 1165-1174.)。利用腈水合酶催化丙烯腈生产丙烯酰胺已有数十年的研究历程，所使用的生产菌株也已经历了三代，其中玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrousJ1 (Nagasawa T, et al. AppliedMicrobiology and Biotechnology, 1993,40(2-3):189-195)、红色红球菌R. ruber TH及其基因工程菌被广泛地用于工业化生产丙烯酰胺(Ma Y, et al. BioresourceTechnology, 2010,101(1):285-291)。

在催化丙烯腈的水合过程中，腈水合酶催化剂往往面临着水合反应的放热效应引起温度骤升问题，导致酶的失活以及细胞的破裂，造成经济效益下降。此外高产物浓度下对细胞的毒害作用较大，会加催化剂的失活。因此构建高稳定性、高产物耐受性的新一代催化剂是酰胺化合物工业生产的重要需求。野生型腈水合酶多数都存在稳定性、产物耐受性较差、催化活性不足等问题。为了进一步提高腈水合酶的生产性能，研究者从在酶分子层面上通过盐桥和二硫键的设计及分子伴侣的引入等多个方面进行了深入的研究，并提高了腈水合酶的稳定性(Liu Y, et al. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2016, 180(1): 3-9； Ma Y, et al. Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2012, 39(10): 1421-1430； Tian Y, et al. Journal of Microbiology andBiotechnology, 2016, 26(2): 337-346；Jiao S, et al. Applied Microbiology andBiotechnology, 2020,104 (3):1001-1012.)。

随着生物信息学技术和蛋白质晶体学科的飞速发展，计算机模拟和蛋白质晶体结构被越来越多地应用于指导蛋白质工程研究中，从而发展出半理性设计、理性设计等多种蛋白质工程手段。尽管一些腈水合酶的晶体结构已经被解析，但由于腈水合酶催化机理较为复杂，至今仍无定论，增加了理性设计和半理性设计的难度，因此关于腈水合酶改造进展较为缓慢，而为了满足工业需求，如何快速高效地获取催化性能提升的新型工业催化剂成为研究的热点和难点。这主要是由于腈水合酶催化机理较为复杂，增加了理性设计和半理性设计的难度，因此关于腈水合酶改造进展较为缓慢。

发明内容

因此，本申请的目的是在现有技术的基础上，提供一种来腈水合酶突变体。本申请腈水合酶突变体能在野生型腈水合酶的基础上，包含上述突变，其单独或发挥协同调控效应，具有一定酶活力，且具有更好的热稳定性和耐受性。

第一方面，本申请实施例提供了一种腈水合酶突变体，基于野生型腈水合酶，所述腈水合酶突变体为野生型腈水合酶的柔性环结构域上的氨基酸残基发生突变，包含突变1-3中的任意的一项或其组合：

突变1：位于野生型腈水合酶β亚基的二级结构域S1和S2之间的柔性环上的极性氨基酸突变；

突变2：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域H6和H7之间的柔性环上的极性氨基酸突变；

突变3：位于野生型腈水合酶β亚基的起始柔性环L1上的疏水性氨基酸突变。

根据本申请一个方面的实施例，野生型腈水合酶来源于玫瑰色红球菌、嗜吡啶红球菌、红色红球菌、诺卡氏菌中的任意一种。

根据本申请一个方面的实施例，腈水合酶突变体满足下列条件中的至少一项：

1）突变1中，β亚基的152位氨基酸位点发生突变；

2）突变2中，β亚基的110位氨基酸位点发生突变；

3）突变3中，β亚基的17位氨基酸位点发生突变。

根据本申请一个方面的实施例，152位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸、苏氨酸，谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺中的任意一种。

根据本申请一个方面的实施例， 110位氨基酸位点的氨基酸残基突变为丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种。

根据本申请一个方面的实施例， 17位氨基酸位点的氨基酸残基突变为丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种。

根据本申请一个方面的实施例，腈水合酶突变体包括突变1和突变3的任意组合。

根据本申请一个方面的实施例，腈水合酶突变体包括突变1和突变2的任意组合

根据本申请一个方面的实施例，腈水合酶突变体包括突变2和突变3的任意组合。

根据本申请一个方面的实施例，腈水合酶突变体包括突变1、突变2和突变3的组合。

根据本申请一个方面的实施例，腈水合酶突变体包含β亚基167位氨基酸位点的氨基酸残基突变为丝氨酸，α亚基174位的氨基酸位点的氨基酸残基突变为亮氨酸，α亚基178位的氨基酸位点的氨基酸残基突变为谷氨酸中的至少一种。

根据本申请一个方面的实施例，腈水合酶突变体包含：结构域突变，其包括：β亚基141位氨基酸位点的氨基酸残基突变为赖氨酸，143位氨基酸位点的氨基酸残基突变为赖氨酸，144位氨基酸位点的氨基酸残基突变为谷氨酸，215位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸， α亚基133位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸。

根据本申请一个方面的实施例，腈水合酶突变体包括17A/17R/17E/17D/17S/17C/17K/17H、110A/110R/110S/110T/110V/110F/110L/110I/110K、152C/152A/152T/152E/152D/152V/152S/152Q/152G中的至少一项。

根据本申请一个方面的实施例，β17S/β110R/β152C、 β17R/β110R/β152D、β17S/β110K/152C、β17S/β110R/β152C、β17S/β110R/β152C、β110K/β152T、β110K/β152D、β110R/β152T、β110K/β17E、β110K/β17C、β110K/β17D、β152S/β17H、β152S/β17E、β110K/β152S/β17E、β17A/β110K/β152G /α174L/α178E、β17E/β110R/β152S /α174L/α178E、β17S/β110V/β152S/βS141K/β143K/β144E、

β17D/β110K/β152V /α174L/α178E、β110R/β152S/β17D、

β17E/β110K/β152S /β167S/α174L/α178E、β17E/β110K/β152S/β167S/α174L/α178E/β215C/α133C/βS141K/β143K/β144E、β17R/β110S/β152Q/β167S/α174L/α178E/β215C/α133C//βS141K/β143K/β144E、β17D//β110F/β152C/β167S/α174L/α178E/β215C/α133C/βS141K/β143K/β144E中的任意一项。

第二方面，本申请实施例提供了一种分离的核酸分子，核酸分子包含编码如第一方面的腈水合酶突变体的核苷酸序列。

第三方面，本申请实施例提供了一种表达载体，其包含第二方面的核酸分子。

根据本申请一个方面的实施例，表达载体为质粒载体。

根据本申请一个方面的实施例，表达载体为pET系列、穿梭载体、噬菌体或病毒载体。

第三方面，本申请实施例提供了一种宿主细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的表达载体。

根据本申请一个方面的实施例，宿主细胞包括大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌中的任意一种。

根据本申请一个方面的实施例，宿主细胞为红色红球菌或/和大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

第四方面，本申请提供了一种催化剂，其包含第一方面的腈水合酶突变体。

根据本申请一个方面的实施例，所述催化剂为全细胞催化剂、游离蛋白催化剂或固定化酶催化剂。

第五方面，本申请实施例提供了一种酰胺类化合物的制备方法，方法包括使用第一方面或第四方面的催化剂催化腈类化合物发生水合反应，得到酰胺类化合物。

根据本申请一个方面的实施例，腈类化合物选自丙烯腈、烟腈、肉桂腈、苯乙腈或对羟基苯乙腈。

根据本申请一个方面的实施例，酰胺类物质选自丙烯酰胺、烟酰胺、肉桂酰胺、苯乙酰胺或对羟基苯乙酰胺。

本申请的技术方案至少具有以下优势：

本申请实施例的腈水合酶突变体具有上述突变位点，显著提高了腈水合酶的热稳定性、产物耐受性；将上述突变位点进一步引入到不同来源的腈水合酶中，意外地获得了本申请的腈水合酶突变位点在不同来源的腈水合酶中同样发挥调控效应，可进一步提升腈水合酶的热稳定性和产物耐受性，且具有一定的活力。

本申请实施例能够提供具有热稳定性、产物耐受性，或者催化活性的腈水合酶突变体。腈水合酶突变体在酰胺化合物的制造上是非常有用的。

本申请实施例能够进一步提供编码上述突变型腈水合酶的核酸分子、包含编码上述突变型腈水合酶的核酸分子的表达载体、包含该表达载体的转化体。本申请实施例能够进一步提供酰胺类化合物的制备方法，该方法利用了从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造、以及使用了前述腈水合酶或者使用了该培养物或该培养物的处理物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图详细说明本申请的技术方案：

图1示出了基于红色红球菌的腈水合酶空间构象的包含本申请实施例的突变1-3位点的空间位置示意图。

图2示出了野生型腈水合酶与本申请实施例的突变体M133腈水合酶的底物消耗效果图。

图3示出了野生型腈水合酶与本申请实施例的突变体M133腈水合酶的残余活力效果图。

具体实施方式

下面将详细描述本申请的各个方面的特征和示例性实施例。本发明所列举的具体实施例只作为本申请的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。

对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本申请的范畴之中。因此，在不脱离本申请的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本申请的范围内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本申请的主旨。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

在本文的所有讨论中，使用针对氨基酸的标准单字母代码。也使用标准的取代记法，即β110A意指从β亚基起始N端处第110位的氨基酸残基被丙氨酸(A)置换；或α174L意指从α亚基起始N端处第174位的氨基酸残基被亮氨酸(L)置换。

对于特定位置处的不同氨基酸通过/符号分隔的本文段落中，“/”符号意指“和”或者“或”。举例来说β17S/β110R/β152S /βS141K/β143K/β144E/β215C/α133C可以表示上述突变均存在于腈水合酶中。

对于特定位置处的不同氨基酸通过/符号分隔的本文段落中，并用括号包括，其中/符号意指“或”，()符号表明同一位置处的氨基酸。举例来说，(Y/F)(A/S/T)意指两个氨基酸残基可以为YA、YS、YT、FA、FS或FT。

在不同位置处通过/符号分隔的本文段落中，“/”符号意指“和”以使得Y51/N55是Y51和N55。

术语“野生型”是指与天然存在的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是群体中最常观察到的基因，并且因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“经修饰的”，“突变体”或“变体”是指与野生型基因或基因产物相比显示序列的修饰(例如，取代、截短或插入)，翻译后修饰和/或功能特性(例如，改变的特性)的基因或基因产物。注意，天然存在的突变体可以被分离；通过与野生型基因或基因产物相比其具有改变的特性这一事实来鉴定这些突变体。用于引入或取代天然存在的氨基酸的方法在本领域是众所周知的。举例来说，可通过在编码突变单体的多核苷酸中的相关位置处用精氨酸的密码子(CGT)置换甲硫氨酸的密码子(ATG)，而用精氨酸(R)来取代甲硫氨酸(M)。用于引入或取代非天然存在的氨基酸的方法在本领域也是众所周知的。

野生型腈水合酶

腈水合酶(nitrile hydratase，NHase)是一种金属依赖性酶，活性中心含有非血红素铁原子或钴原子，可分为Fe-型和Co-型两种。目前已知的腈水合酶均有α和β两个亚基(或被称之a和b亚基)以异源多聚体形式存在，活性中心的氨基酸残基较为保守(-C(S/T)LCSC (T/Y)-)。本研究选择Co-型腈水合酶为研究对象。

具体地，发明人选取了来源于玫瑰色红球菌、嗜吡啶红球菌、红色红球菌或诺卡氏菌的多种野生型腈水合酶。

腈水合酶突变体

本申请的技术构思如下：发明人从野生型腈水合酶出发，解析了该酶的晶体结构信息，通过结构分析、分子动力学模拟和酶分子序列比对，锁定了调控关键氨基酸残基，通过定向设计，构建了腈水合酶突变体库，获得了一系列催化性能提升的突变株，相比母本稳定性和产物耐受性得到显著提升；在此基础上，发明人将有益突变位点引入到不同来源的腈水合酶中，意外地获得了本申请腈水合酶突变位点在不同来源的腈水合酶中同样发挥调控效应，可进一步提升腈水合酶的热稳定性和产物耐受性。

以腈水合酶分子为研究对象，通过结构-功能关系研究，分析底物与酶分子间相互作用，并对酶分子进行重构，从分子水平上提升其稳定性和产物耐受性。

本申请的目的是通过以下技术方案实现的：

根据本申请实施例，二级结构域S1和S2，二级结构域H6和H7，起始柔性环L1中的位置可以如图1所示。

在现有的野生型腈水合酶的基础上，通过结构分析和理性设计，申请人获得了多个有益突变体。并进一步发现这些有益的突变都集中于野生型腈水合酶的特定的一级结构（氨基酸种类的突变）和/或二级结构域中。

进一步发现这些有益的突变位点在空间结构中的分布。发明人在结构基础上利用分子对接模拟底物与酶分子的结合状态，并通过分子动力学模拟，研究了底物与酶分子的结合过程，分析底物与酶分子间的相互作用力，确定了影响可能影响酶催化性能的氨基酸位点，并结合多序列比对分析锁定候选氨基酸残基，并依据结构位置和进化保守性分析进行定向设计，构建突变体库，并通过催化性能评价，筛选出多个稳定性和产物耐受性提升的突变体。

以来源于红色红球菌TH、玫瑰色红球菌J1、玫瑰色红球菌M8、嗜吡啶红球菌、诺卡氏菌的腈水合酶为模板，通过同源建模获得不同来源的腈水合酶的结构模型，通过结构比对发现这些腈水合酶中一级结构和特定二级结构域具有很高的保守性，因此本申请考察了所获的有益突变位点在其他来源的腈水合酶的调控作用。

作为示例，基于，红色红球菌(Rhodococcus ruber TH)的腈水合酶，其β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；本申请的腈水合酶突变体在上述的野生型腈水合酶的氨基酸序列的基础上，包含上述任意一项或其任意组合的突变。

在一些可选的实施方式中，野生型腈水合酶来源于玫瑰色红球菌、嗜吡啶红球菌、红色红球菌、诺卡氏菌中的任意一种。

根据本申请实施例，野生型腈水合酶可以来自野生型腈水合酶来源于玫瑰色红球菌、嗜吡啶红球菌、红色红球菌或诺卡氏菌中的任意一项。

具体地，野生型腈水合酶具有选自以下的序列：

1）野生型红色红球菌（Rhodococcus ruber TH）的腈水合酶，其β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，表达相关氨基酸序列的结构基因和调控基因序列详见专利号ZL200910076710.1的中国发明专利，将其全部内容通过引用并入本文。红色红球菌Rhodococcus ruber有时也译作赤红球菌。

SEQ ID NO: 1

MDGIHDTGGMTGYGPVPYQKDEPFFHYEWEGRTLSILTWMHLKGMSWWDKSRFFRESMGNENYVNEIRNSYYTHWLSAAERILVADKIITEEERKHRVQEILEGRYTDRNPSRKFDPAEIEKAIERLHEPHSLALPGAEPSFSLGDKVKVKNMNPLGHTRCPKYVRNKIGEIVTSHGCQIYPESSSAGLGDDPRPLYTVAFSAQELWGDDGNGKDVVCVDLWEPYLISA

SEQ ID NO: 2

MSEHVNKYTEYEARTKAIETLLYERGLITPAAVDRVVSYYENEIGPMGGAKVVAKSWVDPEYRKWLEEDATAAMASLGYAGEQAHQISAVFNDSQTHHVVVCTLCSCYPWPVLGLPPAWYKSMEYRSRVVADCRGVLKRDFGFDIPDEVEVRVWDSSSEIRYIVIPERPAGTDGWSEDELAKLVSRDSMIGVSNALTPQEVIV；

2）来源于玫瑰色红球菌J1（Rhodococcus rhodochrous J1）的腈水合酶，其β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为P21220，α亚基为P21219，其全部内容通过引用并入本文。

3）来源于玫瑰色红球菌M8（Rhodococcus rhodochrousM8）的腈水合酶，其β亚基的GenBank登录号为AAT79339.1，α亚基为AAT79340.1，其全部内容通过引用并入本文。

4）来源于嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinivorans）的腈水合酶，其β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为Q2UZQ6，α亚基为Q2UZQ5，其全部内容通过引用并入本文。

5）来源于红球菌属（Rhodococcussp.）的腈水合酶，其β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为Q59785，α亚基为Q59786，其全部内容通过引用并入本文。

6）来源于诺卡氏菌（Nocardiasp. JBRs）的腈水合酶，其β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为Q8GE66，α亚基为Q8GE67，其全部内容通过引用并入本文。

在一些可选的实施方式中，腈水合酶突变体满足下列条件中的至少一项：

1）突变1中，β亚基的152位氨基酸位点发生突变；

2）突变2中，β亚基的110位氨基酸位点发生突变；

3）突变3中，β亚基的17位氨基酸位点发生突变。

根据本申请实施例，β亚基的152位氨基酸位点发生突变可以理解为：β亚基的自起始N端处第152位氨基酸位点发生突变。β亚基的110位氨基酸位点发生突变可以理解为：β亚基的自起始N端处第110位氨基酸位点发生突变。β亚基的17位氨基酸位点发生突变可以理解为：β亚基自起始N端处第17位氨基酸位点发生突变。上述突变可以任意地单独存在，或者任意的组合。

在一些可选的实施方式中，152位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸、苏氨酸，谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺中的任意一种。

根据本申请实施例，可以理解为β亚基的152位氨基酸位点的氨基酸残基突变为152C、152T、152E、152D、152V、152S、152Q、152G中任意一种。

在一些可选的实施方式中， 110位氨基酸位点的氨基酸残基突变为丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种。

根据本申请实施例，可以理解为110位氨基酸位点的氨基酸残基突变为110A、110R、110S、110T、 110V、110F、110L、110I、110K中任意一种。

在一些可选的实施方式中， 17位氨基酸位点的氨基酸残基突变为丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种。

根据本申请实施例，可以理解为β亚基自起始N端处第17位氨基酸位点的氨基酸残基突变为17A、17R、17E、17D、17S、17C、17K、17H中任意一种。

在一些可选的实施方式中，腈水合酶突变体包括突变1和突变2的任意组合。示例性地，突变体M26-M30。

在一些可选的实施方式中，腈水合酶突变体包括突变1和突变3的任意组合。示例性地，突变体M48-M54。

在一些可选的实施方式中，腈水合酶突变体包括突变2和突变3的任意组合。示例性地，突变体M39-M47。

在一些可选的实施方式中，腈水合酶突变体包括突变1、突变2和突变3的组合。示例性地，突变体M56-M69。

可以理解为：β亚基自起始N端处第167位氨基酸为β167S；α亚基自起始N端处第174位氨基酸为α174L；α亚基的自起始N端处第178位氨基酸为α178E。上述的突变可以单独存在后，与突变1-突变3中任意组合的突变进行组合。上述的突变可以任意地组合存在后，与突变1-突变3中任意组合的突变进行组合。

在上述突变体的基础上，腈水合酶突变体进一步包含β亚基167位天冬酰胺突变为丝氨酸，α亚基174位的甘氨酸突变为亮氨酸，α亚基178位的天冬氨酸突变为谷氨酸中的任意一种或其组合。本实施例的上述的突变可以任意的组合存在后，与上述的任意实施例且包含突变1-突变3中任意组合的突变进行组合。

在一些可选的实施方式中，腈水合酶突变体包含：结构域突变，其包括：β亚基141位氨基酸位点的氨基酸残基突变为赖氨酸，143位氨基酸位点的氨基酸残基突变为赖氨酸，144位氨基酸位点的氨基酸残基突变为谷氨酸，215位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸， α亚基133位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸。

可以理解为：β亚基自起始N端处第141位氨基酸为β141K；β亚基自起始N端处第143位氨基酸为β143K；β亚基自起始N端处第144位氨基酸为β144E；β亚基自起始N端处第215位氨基酸为β215C；α亚基自起始N端处第133位氨基酸为α133C。上述突变同时存在于该结构域突变中。可以与其他实施例的突变任意的组合。

在上述突变体或野生型的基础上，进一步引入盐桥改造、二硫键，所述腈水合酶突变体包含：β亚基141丝氨酸突变为赖氨酸、143位丝氨酸突变为赖氨酸和144位亮氨酸突变为谷氨酸的组合，215位天冬氨酸突变为半胱氨酸、 α亚基133位脯氨酸突变为半胱氨酸的组合，并与上述实施例的任意突变体任意的组合且共同存在。

在一些可选的实施方式中，腈水合酶突变体包括17A/17R/17E/17D/17S/17C/17K/17H、110A/110R/110S/110T/110V/110F/110L/110I/110K、152C/152A/152T/152E/152D/152V/152S/152Q/152G中的至少一项。

可以理解为：β亚基自起始N端处第17位氨基酸可以为17A、17R、17E、17D、17S、17C、17K、17H中任意一种，β亚基自起始N端处第110位氨基酸为110A、110R、110S、110T、 110V、110F、110L、110I、110K中任意一种。β亚基自起始N端处第152位氨基酸为152C、152T、152E、152D、152V、152S、152Q、152G中任意一种，本申请实施例的腈水合酶突变体包含上述三种突变中的任意一种，或任意一种的随机组合。

在一些可选的实施方式中，β17S/β110R/β152C、 β17R/β110R/β152D、β17S/β110K/152C、β17S/β110R/β152C、β17S/β110R/β152C、β110K/β152T、β110K/β152D、β110R/β152T、β110K/β17E、β110K/β17C、β110K/β17D、β152S/β17H、β152S/β17E、β110K/β152S/β17E、β17A/β110K/β152G /α174L/α178E、β17E/β110R/β152S /α174L/α178E、β17S/β110V/β152S/βS141K/β143K/β144E、

β17D/β110K/β152V /α174L/α178E、β110R/β152S/β17D、

可以理解为：与野生型腈水合酶相比，或与相关技术中的突变型的腈水合酶相比，腈水合酶的位点包括其中三个位点的突变，突变的具体形式包括：17S/110R/152C、 17R/110R/152D、17S/110K/152C、17S/110R/152C、17S/110R/152C等。例如，17S/110R/152C可以理解为：β亚基自起始N端处17位氨基酸为丝氨酸，β亚基自起始N端处第110位氨基酸为精氨酸； β亚基自起始N端处第152位氨基酸为半胱氨酸。

腈水合酶的催化活性

腈水合酶活性是指催化腈化合物水合产生酰胺类化合物的活性。将底物(腈类化合物)与腈水合酶在一定条件下进行反应，在单位时间内测定底物的消耗量和产物的增加量计算腈水合酶的活性。作为底物，只要腈水合酶发生反应，则不论怎样的腈化合物都可以使用，可选为丙烯腈和烟腈。反应条件是水合反应的通用条件，只要能够保证腈水合酶具有催化活性即可，底物的消耗量和产物的增加量可通过HPLC和GC进行检测和定量分析。

腈类化合物的通式如(1)所示：

R-CN (1)

此处，R基团为任选被取代的碳原子数1～10的直链状或者支链状的烷基或烯基、任选被取代的碳原子数3～18的环烷基或芳基、或者任选被取代的饱和或不饱和杂环基。

酰胺类化合物的通式如(2)所示：

R-CONH₂ (2)

经研究，本申请记载的野生型腈水合酶和突变型腈水合酶分别具有催化活性。

第二方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，核酸分子包含编码如第一方面的腈水合酶突变体的核苷酸序列。

根据本申请实施例，核酸分子包含编码所述腈水合酶突变体的核苷酸序列。核苷酸序列可以为在野生型腈水合酶的序列基础上，通过碱基突变获得。

腈水合酶突变体的重组载体、转化体

第三方面，本申请提供了一种表达载体，其包含第二方面的核酸分子。

根据本申请实施例，选择的表达载体可以在原核或真核细胞的各种宿主中稳定存在并可自主复制，如本领域中的常规质粒(pET系列)、穿梭载体pNV18.1、噬菌体或病毒载体等。

在一些可选的实施方式中，表达载体为质粒载体。

在一些可选的实施方式中，表达载体为pET系列、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；可选地，所述表达载体为pET-28a或pNV18.1。

根据本申请实施例，通过酶切、连接等分子生物学操作，将野生型腈水合酶的核苷酸序列插入到pET-28a或pNV18.1等表达载体中，构建得到重组表达质粒，分别命名为pET28a-Nh，pNV18.1-Nh。根据本申请实施例，可以将本申请实施例的腈水合酶突变体的编码基因，构建到重组表达质粒。

第三方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的表达载体。

根据本申请实施例，可以将本申请第二方面所述的分离的核酸分子直接插入宿主菌的染色体，或采用氯化钙法或电穿孔转化法将第三方面的表达载体导入宿主菌。

在一些可选的实施方式中，宿主细胞包括大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌中的任意一种。

在一些可选的实施方式中，宿主细胞为红色红球菌或/和大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

根据宿主细胞的不同，编码腈水合酶突变体的核苷酸序列可以构建到不同类型的重组载体，也可以直接整合到宿主菌的染色体中。作为使用的载体，可列举出质粒DNA、噬菌体DNA、反转录转座子DNA、人工染色体DNA等。以大肠杆菌和红色红球菌为例，可选为PET系列载体和PNV系列载体。

本申请的转化体能使用的宿主只要能够在导入上述重组载体或编码腈水合酶突变体的核苷酸序列后表达目标腈水合酶，就没有特别限定，例如可以使用红球菌、大肠杆菌等细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。

作为向细菌导入重组载体的方法，只要是向细菌中导入DNA的方法，就没有特别的限定。例如可列举出使用钙离子的方法、电穿孔法等。

作为向细菌中整合编码腈水合酶突变体的核苷酸序列的方法，只要是向细菌中导入DNA的方法，就没有特别的限定。例如可列举出使用同源重组、基因编辑法等。

催化剂以及酰胺类化合物的制备方法

在一些可选的实施方式中，催化剂为全细胞催化剂、游离蛋白催化剂或固定化酶催化剂。

根据本申请实施例，全细胞催化剂是指经本申请第四方面构建的宿主细胞经富集培养和目标蛋白的诱导表达后获得的全细胞。游离蛋白催化剂是将全细胞经超声破碎或高压匀浆破碎并通过离心后获得的粗酶液，亦包括通过蛋白纯化手段获得的纯酶。固定化酶催化剂即为选择不同的固定化载体，将游离蛋白催化剂进行固定化操作，从而获得不同形式的固定化腈水合酶突变体。

第五方面，本申请提供了一种酰胺类化合物的制备方法，方法包括使用第一方面或第四方面的催化剂催化腈类化合物发生水合反应，得到酰胺类化合物；

在一些可选的实施方式中，腈类化合物选自丙烯腈、烟腈、肉桂腈、苯乙腈或对羟基苯乙腈。

在一些可选的实施方式中，酰胺类物质选自丙烯酰胺、烟酰胺、肉桂酰胺、苯乙酰胺或对羟基苯乙酰胺。

下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。

实施例

实施例1 腈水合酶突变体的序列

在红色红球菌来源的野生型腈水合酶（WT）的基础上，设计了如下突变体，其中，所述红色红球菌来源的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述突变体详见表1：

表1

续表1

实施例2 腈水合酶重组表达载体的构建

在大肠杆菌细胞内，以质粒pET-28a为表达载体，发明人将编码腈水合酶的核苷酸序列两端设计Nco I和Xho I的酶切位点，使用限制性内切酶Nco I和Xho I对质粒载体和本实施例中腈水合酶的核苷酸序列进行双酶切，利用核酸电泳(1.0%琼脂糖)和试剂盒回收酶切后的基因片段，然后将酶切后的目的基因片段酶切后的质粒载体进行连接。

10 μL连接体系包括：

1 μL 10 × T4 DNA 连接酶Buffer(Takara公司)；

2.5 μL目的基因片段；

2.5 μL质粒片段；

1 μL T4 DNA连接酶；

3 μL ddH₂O；

在16^oC下连接过夜，转化至BL21(DE3)感受态细胞内，挑取单克隆子测序验证，提取测序正确的重组质粒，获得包含腈水合酶编码基因的重组表达载体。

实施例3 腈水合酶突变体的构建

本申请采用全质粒扩增法构建含有腈水合酶突变基因的重组质粒。将所需突变体位点设计上下游引物，以质粒pET28a-NH为模板，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司)进行全质粒扩增。通过PCR扩增出含有编码腈水合酶基因序列发生突变的重组质粒。

20 μL的PCR反应体系包括：

1 μL pET28a-NH质粒模板(约220 ng/μL)；

10 μL 2×PrimeSTAR HS DNA 聚合酶；

1.0 μL 正向引物(10 μM)；

1.0 μL 反向引物(10 μM)；

7 μL ddH₂O。

所述正向引物为针对不同突变体构建过程中所使用的特定引物。所述反向引物为针对不同突变体构建过程中所使用的特定引物。该处限于篇幅不一一赘述，但是本领域技术人员应该知晓，在已知序列的基础上设计引物并获得目的产物是本领域技术人员的常规技术手段。

PCR原液经DpnI酶消化去除模板序列后，利用热激法转化到BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板中，置于37℃培养箱中倒置培养约12 h。挑取单克隆子进行测序验证，测序正确后用20%（V/V）的甘油进行保菌，置于-70进冰箱内保存。

实施例4 腈水合酶组合突变体的构建

腈水合酶组合突变体是通过多轮定点突变的方式获得的，在获取单个点突变体后，以含有该突变位点的重组质粒为模板，设计突变位点的上下游引物，进行全质粒PCR扩增，通过PCR扩增出含有编码腈水合酶组合突变体基因序列的重组质粒。

所述正向引物可以使用针对不同突变体构建过的特定引物，该处限于篇幅不一一赘述，但是本领域技术人员应该知晓，在已知序列的基础上设计引物并获得目的产物是本领域技术人员的常规技术手段。

PCR原液经DpnI酶消化去除模板序列后，利用热激法转化到BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板中，置于37℃培养箱中倒置培养约12 h。挑取单克隆子进行测序验证。

实施例5 腈水合酶及其突变体的大肠杆菌基因工程菌构建及催化剂的制备

将实施例3和4中制备的大肠杆菌基因工程菌，涂布含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板，37℃，培养过夜后，挑取单菌落转接含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养中，37℃培养12h，送样进行测序，将正确的克隆子保存到-70℃冰箱，以此获得大肠杆菌为宿主的基因工程菌。

将包含腈水合酶及其突变体的编码序列的基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH=7.0)中，在含有LB培养基的试管(4 mL，含终浓度50 μg/mL卡那霉素)中，置于37℃摇床内，200 rpm转速下培养10~12 h，得到种子液。

在超净工作台中将试管内的种子液转接到含有LB培养基的摇瓶(100 mL，含终浓度50 μg/mL卡那霉素)中。将含有种子液的LB培养基置于37℃摇床内，200 rpm转速下培养2~3 h。待培养液的OD₆₀₀值达到0.6~0.8时，添加终浓度为0.1~0.8 mM的IPTG和0.1-0.8 mMCo²⁺离子进行诱导表达，诱导温度为16~37 ℃。可选的IPTG浓度为0.2 mM，可选钴离子浓度为0.2 mM，可选的诱导温度为16 ℃。在可选条件下诱导24 h后，离心收集细胞，获得腈水合酶的大肠杆菌细胞催化剂，置于-70 ℃冰箱内保存。

称取10 g 冻存湿细胞，加入到100 mL的缓冲液A (25 mM Tris-HCl，pH 8.0；300mM NaCl，10 mM咪唑，375 μL/L巯基乙醇)中，终浓度为10 g/L，放置在室温融解，过滤去除未完全溶解的块状菌体。然后使用高压匀浆机进行破碎，压力控制在700-800 bar，破碎过程中利用低温循环设备进行降温，循环破碎2-3次即可。将收集到的破碎液离心，收集上清液，获得游离的腈水合酶催化剂。

称取适量固定化氨基树脂材料，用磷酸钾缓冲液(100 mM, pH 7.0)平衡，将处理好的树载体加入到缓冲液中，载体与溶液的比例为1/5 (w/v)，然后加入戊二醛溶液(50%V/V)至终浓度为2%。在振荡器中(16 ℃, 200 rpm)活化2-3 h后，使用去离子水清洗活化后的载体，去除残余的戊二醛。称取适量活化后的固定化载体置于缓冲液中，加入酶溶液，载体和酶溶液的比例仍为1/5 (w/v)。将其置于恒温摇床或振荡器中(16 ℃, 200 rpm)进行固定化，时间为8 h。然后用缓冲液清洗固定化酶以除去残余的酶液，然后将其置于4 ℃冰箱内保存备用。

实施例6 腈水合酶突变体的红球菌体系构建及催化剂的制备

分别以实施例3和4中制备的重组表达载体为模板，设计腈水合酶的通用引物，该通用引物序列中包含优化版的自杀质粒pYsacB的同源片段和腈水合酶基因片段，通过PCR扩增出含有突变位点的腈水合酶基因序列。该优化版的自杀质粒pYsacB1是在自杀质粒pYsacB的基础上添加了腈水合酶基因上下游两端的各1000 bp左右的同源臂序列。

通过Gibson Assembly无缝克隆试剂盒，将获得的腈水合酶突变基因与酶切后的自杀质粒pYsacB进行连接，

20 μL的连接体系包括：

4 μL 目标基因；

6 μL 自杀质粒载体；

10 μL 连接试剂；

55 ℃下连接50 min，将连接液转换至Top 10 感受态细胞内，挑起单克隆测序验证后，提取重组自杀质粒，将构建成功的重组自杀质粒利用电转化法，转化至红球菌的感受态细胞内，复苏培养后涂布于含抗生素的平板培养基上，20-37℃下培养；然后挑取单菌落，菌落PCR验证，验证自杀质粒整合到红球菌基因组中的正确位置；将单交换成功的菌落，接种到不含抗生素的种子培养基中，20-37℃下培养12 h，稀释100倍，取200 μL涂布于含100g/L蔗糖的平板上，28℃培养，待长出单菌落后，进行菌落PCR，验证腈水合酶基因序列整合到基因组上，并送测序公司，将测序正确的菌株置于-70℃冰箱保存备用。

将上述构建的包含腈水合酶突变体的编码序列的红球菌接种到种子培养基中，培养至菌体OD₆₀₀达到30左右。此时按初始OD₆₀₀=3.0的接种量将种子培养基接入50 mL发酵培养基中，对于腈水合酶的诱导表达，需向发酵培养基中加入终浓度为0.08 mM Co²⁺，诱导表达48 h后，离心收集细胞，获得腈水合酶红球菌细胞催化剂。

称取10 g冻存湿细胞，加入到100 mL的缓冲液A (25 mM Tris-HCl，pH 8.0；300mM NaCl，10 mM咪唑，375 μL/L巯基乙醇)中，终浓度为10 g/L，放置在室温融解，过滤去除未完全溶解的块状菌体。然后使用高压匀浆机进行破碎，压力控制在1200-1500 bar，破碎过程中利用低温循环设备进行降温，循环破碎2-3次即可。将收集到的破碎液离心，收集上清液，获得游离的腈水合酶催化剂。

称取适量固定化载体，用磷酸钾缓冲液(100 mM, pH 7.0)平衡，将处理好的树载体加入到缓冲液中，载体与溶液的比例为1/5 (w/v)，然后加入戊二醛溶液(50%)至终浓度为2% V/V。在振荡器中(16℃,200 rpm)活化2-3 h后，使用去离子水清洗活化后的载体，去除残余的戊二醛。称取适量活化后的固定化载体置于缓冲液中，加入酶溶液，载体和酶溶液的比例仍为1/5 (w/v)。将其置于恒温摇床或振荡器中(16℃, 200 rpm)进行固定化，时间为8 h。然后用缓冲液清洗固定化酶以除去残余的酶液，然后将其置于4 ℃冰箱内保存备用。

实施例7 腈水合酶活力测定方法

腈水合酶对底物丙烯腈活性测定方法如下：取50~100 μL催化剂（细胞、游离酶、固定化酶）加入离心管中，加入纯水补足至4.5 mL，在28℃水浴锅中放置10分钟使温度稳定。加入100 μL丙烯腈，混匀后反应5分钟，加入200 μL的3 mol/L盐酸终止反应。取1 mL反应液13000×g离心2分钟后，取500 μL上清液与500 μL的内标溶液(40 g/L乙酰胺)混匀后，进行气相色谱分析。测定丙烯酰胺与乙酰胺的面积比，利用内标法测定产物丙烯酰胺的浓度，计算活力。

通过气相检测产物的生成量，检测条件为：气相色谱分析条件如下：美国赛默飞Trace 1300气相色谱仪；Abel Bonded AB-I NOWAX色谱柱(内径0.25 mm，长度30 m，膜厚0.25 μm)；FID检测器。柱温、进样口温度、检测器温度分别19℃、26℃、26℃；载气为氮气，恒压模式，分压10⁸kPa；进样体积为1 μL，分流进样，分流比为30:1。

所述腈水合酶的活力计算方式如下：

K为内标常数，其数值为0.6001；C_ac为乙酰胺浓度40 g/L；V总为总体积，其数值为5mL；V为实际加入的催化剂体积；t为反应时间；MW为丙烯酰胺，分子量71；U为总酶活，单位为μmol丙烯酰胺/(min·mL菌液)。

所述酶活力(U)定义为：在上述反应条件下，每分钟催化1 μmol底物所需要的酶量为一个酶活单位，用U表示。

经检测，突变体M133的底物消耗率如图2所示，相比野生型的腈水合酶，仍具有良好的催化能力，能催化底物进行反应。

实施例8 腈水合酶热稳定性和产物耐受性评价

将实施例5和6中获得的腈水合酶催化剂，用去离子水进行重悬(10 g/L)，在55 ℃恒温水浴中静止放置，间隔2 h取出样品，按照实施例7中的方法测定残余活力，并绘制催化剂的失活曲线，通过线性拟合的酶失活半衰期，半衰期越高，表明稳定性越好，以此衡量腈水合酶的热稳定性。

同样，将实施例5和6中获得的腈水合酶催化剂，用去离子水进行重悬(10 g/L)，各取适量催化剂放置于10-mL的离心管中，添加丙烯酰胺至终浓度为50% (v/v)，在28℃恒温水浴中静止放置2 h后测定催化剂的残余活力，绘制催化剂的失活曲线，通过线性拟合的酶失活半衰期，半衰期越高，表明稳定性越好，以此衡量腈水合酶的产物耐受性。

经检测，突变体M133的残余活力如图3所示，相比野生型的腈水合酶，仍具有较佳的活力。

实施例9 腈水合酶及其突变体稳定性和耐受性测定结果

如实施例3和4中所构建的突变体，按照实施例8的方法进行稳定性和耐受性测定，结果表明获得腈水合酶突变体其热稳定性和耐受性的均有不同提升。突变体M1-M35的产物耐受性提高倍数在5.1-6.0倍，突变体M1-M35的热稳定性的提高倍数在5.1-6.0倍；突变体M36-M119、M121-M125、M127-M130、M133和M134的产物耐受性提高倍数在6.1-8.0倍；突变体M36-M119、M121-M125、M127-M130、M133和M134的热稳定性的提高倍数在6.1-8.0倍；突变体M120、M126、M131、M132、M135-M139的产物耐受性提高倍数在8.1-12.0倍。

表2

表2中，+: 提高5.1-6.0倍，++：提高6.1-8.0倍； +++：提高8.1-12.0倍。

实施例10 关键氨基酸位点对于不同来源的腈水合酶的调控作用

本申请研究了实施例1所述的有益突变位点在其他来源的腈水合酶的调控作用(表1)。首先通过多序列比对确定了其他腈水合酶中的位于相似位置的氨基酸残基，并参照实施例1-9中设计的突变体进行突变和性能测定。来源于玫瑰色红球菌J1（Rhodococcus rhodochrous J1）的腈水合酶，其β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为P21220，α亚基为P21219。来源于玫瑰色红球菌M8（Rhodococcus rhodochrousM8）的腈水合酶，其β亚基的GenBank登录号为AAT79339.1，α亚基为AAT79340.1。

来源于嗜吡啶红球菌RP（Rhodococcus pyridinivorans）的腈水合酶，其β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为Q2UZQ6，α亚基为Q2UZQ5。

来源于红球菌属R. sp（Rhodococcussp.）的腈水合酶，其β亚基在UniProtArchive数据库中的UPI编号为Q59785，α亚基为Q59786。

来源于诺卡氏菌JBR（Nocardiasp. JBRs）的腈水合酶，其β亚基在UniProtArchive数据库中的UPI编号为Q8GE66，α亚基为Q8GE67。

获得的突变腈水合酶的具有酶活性，且热稳定性和产物耐受性均得到了提高，说明这些突变位点对于不同来源的腈水合酶的热稳定性和产物耐受性均具有有益调控效应。结果如表3所示。

如β110R/β152D/β17D表示β亚基中110氨基酸位点、152氨基酸位点、17氨基酸位点同时存在的情况，其他以此的描述方式也表示同时存在的情况。

表3中，++：提高6.1-8.0倍； +++：提高8.1-12.0倍。

表3

续表3

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Claims

1.一种腈水合酶突变体，其中，基于野生型腈水合酶，所述腈水合酶突变体为所述野生型腈水合酶的柔性环结构域上的氨基酸残基发生突变，包含突变1：位于野生型腈水合酶β亚基的二级结构域S1和S2之间的柔性环上的极性氨基酸突变，β亚基的152位氨基酸位点发生突变；所述152位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸、苏氨酸，谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺中的任意一种；

所述野生型腈水合酶来源于玫瑰色红球菌J1（Rhodococcus rhodochrous J1）、玫瑰色红球菌M8（Rhodococcus rhodochrous M8）、嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinivorans）、红色红球菌（Rhodococcus ruber）、红球菌属（Rhodococcus sp.）、诺卡氏菌（Nocardia sp. JBRs）中的任意一种，其中，

所述玫瑰色红球菌J1（Rhodococcus rhodochrous J1）的野生型腈水合酶中β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为P21220；

所述玫瑰色红球菌M8（Rhodococcus rhodochrous M8）的野生型腈水合酶中β亚基的GenBank登录号为AAT79339.1；

所述嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinivorans）的野生型腈水合酶中β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为Q2UZQ6；

所述红色红球菌（Rhodococcus ruber）的β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1；

所述红球菌属（Rhodococcus sp.）的野生型腈水合酶中β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为Q59785；

所述诺卡氏菌（Nocardia sp. JBRs）的腈水合酶，其β亚基在UniProt Archive数据库中的UPI编号为Q8GE66。

2.根据权利要求1所述的腈水合酶突变体，其中，所述腈水合酶突变体包含下列突变中的至少一项：

突变2：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域H6和H7之间的柔性环上的极性氨基酸突变，β亚基的110位氨基酸位点发生突变；

突变3：位于野生型腈水合酶β亚基的起始柔性环L1上的疏水性氨基酸突变，β亚基的17位氨基酸位点发生突变。

3.根据权利要求2所述的腈水合酶突变体，其中，所述腈水合酶突变体满足下列条件中的至少一项：

1）突变2中，所述110位氨基酸位点的氨基酸残基突变为丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种；

2）突变3中，所述17位氨基酸位点的氨基酸残基突变为丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的腈水合酶突变体，其中，所述腈水合酶突变体满足下列条件中的至少一项：

所述腈水合酶突变体包括突变1和突变3的任意组合；

所述腈水合酶突变体包括突变1和突变2的任意组合；

所述腈水合酶突变体包括突变1、突变2和突变3的组合。

5.根据权利要求2-4中任意一项所述的腈水合酶突变体，其中，所述腈水合酶突变体包含β亚基167位氨基酸位点的氨基酸残基突变为丝氨酸，α亚基174位的氨基酸位点的氨基酸残基突变为亮氨酸，α亚基178位的氨基酸位点的氨基酸残基突变为谷氨酸中的至少一种。

6.根据权利要求2-4中任意一项所述的腈水合酶突变体，其中，所述腈水合酶突变体包含：结构域突变，其包括：β亚基141位氨基酸位点的氨基酸残基突变为赖氨酸，143位氨基酸位点的氨基酸残基突变为赖氨酸，144位氨基酸位点的氨基酸残基突变为谷氨酸，215位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸， α亚基133位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸。

7.根据权利要求5所述的腈水合酶突变体，其中，所述腈水合酶突变体包含：结构域突变，其包括：β亚基141位氨基酸位点的氨基酸残基突变为赖氨酸，143位氨基酸位点的氨基酸残基突变为赖氨酸，144位氨基酸位点的氨基酸残基突变为谷氨酸，215位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸， α亚基133位氨基酸位点的氨基酸残基突变为半胱氨酸。

8.根据权利要求1所述的腈水合酶突变体，其中，所述腈水合酶突变体包括

β17S/β110R/β152C、β17R/β110R/β152D、β17S/β110K/152C、β110K/β152T、

β110K/β152D、β110R/β152T、β110K/β17E、β110K/β17C、β110K/β17D、

β152S/β17H、β152S/β17E、β110K/β152S/β17E、β17A/β110K/β152G /α174L/α178E、

β17E/β110R/β152S /α174L/α178E、β17S/β110V/β152S/βS141K/β143K/β144E、

β17D/β110K/β152V /α174L/α178E、β110R/β152S/β17D、

β17E/β110K/β152S /β167S/α174L/α178E、

β17E/β110K/β152S/β167S/α174L/α178E/β215C/α133C/βS141K/β143K/β144E、

β17R/β110S/β152Q/β167S/α174L/α178E/β215C/α133C//βS141K/β143K/β144E、

β17D//β110F/β152C/β167S/α174L/α178E/β215C/α133C/βS141K/β143K/β144E中的任意一项。

9.一种分离的核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码权利要求1至8中任一项所述的腈水合酶突变体的核苷酸序列。

10.一种表达载体，其中，包含权利要求9所述的核酸分子。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其中，所述表达载体为质粒载体，所述质粒载体包括pET系列、穿梭载体、噬菌体和病毒载体中的任意一种。

12.一种宿主细胞，其中，包含权利要求9所述的核酸分子或权利要求10或11所述的表达载体。

13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包括大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌中的任意一种。

14.一种催化剂，其中，包含权利要求1至8中任一项所述的腈水合酶突变体。

15.一种酰胺类化合物的制备方法，其中，所述方法包括使用权利要求1至8中任一项所述的腈水合酶突变体或权利要求14所述的催化剂催化腈类化合物发生水合反应，得到酰胺类化合物。