CN103649312A - 改良型腈水合酶 - Google Patents

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Abstract

通过野生型腈水合酶的改良，提供耐热性、酰胺化合物耐性以及高温累积性进一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白质。使用一种蛋白质，其为以下的(A)或(B)的蛋白质；(A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中特定的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；(B)蛋白质，其特征在于，包含在上述(A)的蛋白质的氨基酸序列中除了上述特定的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。

Description

改良型腈水合酶
技术领域
本发明涉及改良型(变异型)的腈水合酶及其制造方法。进而涉及编码该酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、和具有该重组载体的转化体以及酰胺化合物的制造方法。
背景技术
近年发现了酶腈水合酶、即具有将腈基水合并转换为酰胺基的腈水合活性的酶，公开了使用该酶或含有该酶的微生物菌体等通过腈化合物而制造对应的酰胺化合物的方法。已知该制造方法与现有的化学合成法相比较，由腈化合物向对应的酰胺化合物的转化率和选择率高。
作为生产腈水合酶的微生物，可列举出例如：属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1株用于丙烯酰胺的工业生产中，其有用性已被证实。另外，编码该菌株所产生的腈水合酶的基因也已明确(参照专利文献1)。
另一方面，不仅利用由自然界中存在的微生物分离的腈水合酶、其基因，还出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、对底物的稳定性、对生成物的稳定性等目的，尝试了向腈水合酶中导入变异(参照专利文献2)，本发明人等取得了使耐热性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(参照专利文献3和4)。
但是，从催化剂成本等生产成本的观点出发，开发耐热性和酰胺化合物耐性更进一步提高、或在高温下能够反应的腈水合酶并用于酰胺化合物的制造是非常有用的；从反应时的酶量的削减和成本削减等观点出发，期望开发而获得具有这样的性能的酶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3162091号公报
专利文献2：国际公开第2004/056990号小册子
专利文献3：国际公开第2005/116206号小册子
专利文献4：日本特开2007-143409号公报
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于通过腈水合酶的改良，提供耐热性、酰胺化合物耐性以及高温累积性进一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白质。另外，本发明的目的在于提供编码该蛋白质的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。进而，本发明的目的在于提供使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题进行了深入的研究。结果发现，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中将特定的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基而成的蛋白质不仅具有腈水合酶活性，耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性也提高了，至此完成本发明。
即，本发明如下。
(1)以下(A)或(B)的蛋白质；
(A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基、进而选自由下述(f)～(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；
(a)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基、
(b)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基、
(c)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基、
(d)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基、
(e)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基、
(f)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基、
(g)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基、
(h)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基、
(i)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数144残基下游的氨基酸残基、
(j)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数133残基下游的氨基酸残基、
(k)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数112残基下游的氨基酸残基、
(l)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数105残基下游的氨基酸残基、
(m)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数95残基下游的氨基酸残基、
(n)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数17残基下游的氨基酸残基、
(o)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数15残基下游的氨基酸残基、
(p)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起67残基下游的氨基酸残基、
(q)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起17残基下游的氨基酸残基、
(B)蛋白质，其特征在于，包含在(A)蛋白质的氨基酸序列中除了前述置换后的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。
(2)一种DNA，其编码(1)所述的蛋白质。
(3)一种重组载体，其包含(2)所述的基因DNA。
(4)一种转化体，其包含(3)所述的重组载体。
(5)一种腈水合酶，是从培养(4)所述的转化体而得到的培养物中提取的。
(6)一种腈水合酶的制造方法，其特征在于，培养(4)所述的转化体，从得到的培养物中提取腈水合酶。
(7)一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使(1)所述的蛋白质或培养(4)所述的转化体而得到的培养物或该培养物的处理物与腈化合物接触。
发明的效果
本发明能够提供耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性提高了的新型的改良型(变异型)腈水合酶。耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性均进一步提高了的该改良型腈水合酶由于酰胺化合物的制造效率变高而非常有用。
附图说明
图1为质粒pER855A的结构图。
图2-1为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列的图。
图2-2为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列的图(接着图2-1)。
图3-1为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列的图。
图3-2为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列的图(接着图3-1)。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
需要说明的是，本说明书中，除了特别表明的情况，“上游”和“上游侧”在涉及氨基酸序列时意味着“N末端侧”，在涉及碱基序列时意味着“5’末端侧”。
另外，“下游”和“下游侧”涉及氨基酸序列时意味着“C末端侧”，涉及碱基序列时意味着“3”。
1.改良型腈水合酶
(a)野生型腈水合酶
本发明的改良型腈水合酶为野生型腈水合酶的改良型，对于其来源没有特别地限定。此处，“野生型腈水合酶”是指由自然界的生物(例如：土壤细菌等微生物)分离而得到的腈水合酶；意味着构成该酶的氨基酸序列、以及编码该酶的基因的碱基序列没有人为地缺失或插入，或者没有被其他的氨基酸或碱基置换而保持天然来源特性的状态的腈水合酶。
另外，不仅是已知的微生物来源的腈水合酶，只由未限定生物来源的DNA序列限定的腈水合酶也包含于上述“野生型腈水合酶”中。
“野生型腈水合酶”采取由α亚基和β亚基的结构域缔合而成的高级结构，具有非血红素铁原子或非咕啉核钴原子作为辅基。这些腈水合酶分别以铁型腈水合酶和钴型腈水合酶的称呼加以区分。
作为铁型腈水合酶，可列举出来源于红球菌属N-771株的腈水合酶作为其代表例。通过进行X射线结晶结构解析，该铁型腈水合酶的立体结构变得明确。结果，该酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(：序列号61)中的4个氨基酸残基而与非血红素铁结合。
作为钴型腈水合酶，可列举出来源于玫瑰色红球菌J1株(以下有时称为“J1菌”)的钴型腈水合酶，或来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的钴型腈水合酶作为代表例。来源于J1菌的钴型腈水合酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(：序列号62)所示的区域而与钴原子结合。需要说明的是，来源于嗜热假诺卡氏菌的钴型腈水合酶的半胱氨酸簇中，上述来源于J1菌的半胱氨酸簇中的上游侧(N末端侧)起第4位的半胱氨酸(Cys)为半胱亚磺酸(Csi)，最下游侧(C末端侧)的第6位的半胱氨酸(Cys)为半胱次磺酸(Cse)。
如上所述，辅基与α亚基中的半胱氨酸簇“C(S/T)LCSC”(序列号61和62)所示的区域结合。作为包含这样的辅基结合区域的腈水合酶，可列举出例如：具有来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)、玫瑰色红球菌M8(SU1731814)、玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)、玫瑰色红球菌ATCC39484(日本特开2001-292772)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)(日本特开平9-248188)、嗜热假诺卡氏菌(日本特开平9-275978)或热葡糖苷地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于上述菌的基因序列所编码的腈水合酶。
将来源于各种微生物的野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图3-1和图3-2中。需要说明的是，在图3-1、3-2中，从上方的氨基酸序列起依次表示序列号4、和49～60。
另一方面，认为β亚基的功能涉及结构的稳定性。将来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图2-1和图2-2中。需要说明的是，在图2-1、2-2中，从上方的氨基酸序列起依次表示序列号2、和35～48。
(b)改良型腈水合酶
本发明为对野生型腈水合酶实施了氨基酸置换的改良型(变异型)腈水合酶。成为实施置换的对象的野生型腈水合酶的氨基酸序列由GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等NCBI的数据库公布。
例如：来源于玫瑰色红球菌J1(FERMBP-1478)的α亚基的氨基酸序列如序列号4所示，碱基序列如序列号3所示。另外，β亚基的氨基酸序列如序列号2所示，碱基序列如序列号1所示，登录号为“P21220”。另外，来源于玫瑰色红球菌M8(SU1731814)的α亚基的登录号为“ATT79340”，β亚基的登录号为“AAT79339”。进而，来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)JCM3095的α亚基的登录号为“1IRE A”，β亚基的登录号为“1IREB”。
另外，由在特定的氨基酸残基被置换的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加有1个或数个(例如1个～10个左右、优选为1个～5个左右)氨基酸残基(其中，除了上述置换后的基酸残基之外)的氨基酸序列构成且具有腈水合酶活性的改良型腈水合酶也在本发明的范围内。
作为本发明中的“改良型腈水合酶”可列举出一种蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基，进而选自由下述(f)～(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。需要说明的是，下述(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)和(q)的氨基酸残基在各种野生型腈水合酶中也分别优选为来源于属于玫瑰色红球菌种的细菌的野生型腈水合酶的氨基酸序列中的氨基酸残基。
(a)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基。
(b)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基。
(c)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基。
(d)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基。
(e)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基。
(f)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基。
(g)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基。
(h)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基。
(i)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数144残基下游的氨基酸残基。
(j)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数133残基下游的氨基酸残基。
(k)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数112残基下游的氨基酸残基。
(l)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数105残基下游的氨基酸残基。
(m)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数95残基下游的氨基酸残基。
(n)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数17残基下游的氨基酸残基。
(o)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数15残基下游的氨基酸残基。
(p)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起67残基下游的氨基酸残基。
(q)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起17残基下游的氨基酸残基。
另外，作为本发明的改良型腈水合酶，优选列举上述蛋白质中被置换的氨基酸残基为以下所列举的氨基酸残基的腈水合酶。
(1)上述(a)～(e)、和(n)的氨基酸残基。
(2)选自上述(a)～(e)、和(n)的氨基酸残基、以及选自上述(g)～(j)、(l)、(m)、(o)和(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基。
(3)上述(a)～(e)、(n)、(i)、和(p)的氨基酸残基。
(4)上述(a)～(e)、(n)、(p)、和(f)的氨基酸残基。
(5)上述(a)～(e)、(n)、(i)、(p)的氨基酸残基、以及选自由上述(f)、(k)和(m)所组成的组的至少一个氨基酸残基。
作为本发明的改良型腈水合酶的一例，优选可列举出一种酶蛋白，其包含：来源于J1菌的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第167位的氨基酸残基(天冬酰胺)、β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第219位的氨基酸(缬氨酸)、β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第57位的氨基酸(丝氨酸)、β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第114位的氨基酸(赖氨酸)、β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第107位的氨基酸(苏氨酸)、和β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第17位的氨基酸(脯氨酸)，并且具有腈水合酶活性。作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出“Nβ167S，Vβ219A，Sβ57R、Kβ114Y、Tβ107K、Pβ17D”等。
需要说明的是，氨基酸的字母标记可以用通常的单字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“26”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
具体而言，关于序列号2所表示的β亚基的氨基酸序列，标记为“Nβ167S”的情况下，意味着β亚基的氨基酸序列(序列号2)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第167位的天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
此处，“α↓”的标记意味着置换位置位于比CTLCSC区域的最下游侧的C残基还要下游(不包含该C残基数起，位于C末端侧)。
进而，作为本发明的改良型腈水合酶，更优选列举上述蛋白质中被置换的氨基酸残基为表1中所列举的氨基酸残基的腈水合酶。
[表1]
Figure BDA0000422780280000101
Figure BDA0000422780280000111
其中，进而优选以上述的置换序号13～29的形式实施了氨基酸置换的改良型腈水合酶，特别优选以上述的置换序号26～29的形式实施了氨基酸置换的改良型腈水合酶。
作为用于产生上述氨基酸置换的碱基置换，优选可列举出以下的表2的形式。
[表2]
Figure BDA0000422780280000112
Figure BDA0000422780280000121
Figure BDA0000422780280000131
Figure BDA0000422780280000141
需要说明的是，本发明的氨基酸置换的位置也包含：从与序列号2的来源于J1菌的腈水合酶β亚基的比对来看与第167位、第219位、第57位、第114位、第107位、第218位、第190位、第168位、第144位、第133位、第112位、第105位、第95位、第17位、和第15位的氨基酸残基相应的位置。作为一例，作为嗜热假诺卡氏菌中相应的氨基酸序列，分别与第164位、第216位、第57位、第114位、第107位、第215位、第187位、第165位、第141位、第129位、第108位、第102位、第92位、第17位、和第15位相应。进而，本发明的氨基酸置换的位置也包含：从与序列号4的J1菌腈水合酶α亚基的比对来看与第124位、和第174位相应的位置，嗜热假诺卡氏菌中分别与130位和第180位相应。
对于氨基酸序列的比对所应用的手段，没有特别的限定，可列举出：GENETXY(日本GENETYX CORPORATION)、DNASIS(Hitachi SoftwareEngineering Co.,Ltd.)或免费软件CLUSTALW、BLAST等基因序列解析软件。作为比对的一例的图2-1、图2-2、图3-1、图3-2为使用了GENETXY Ver.7(日本GENETYX CORPORATION、默认设定)的结果。
相对于保持着天然来源的特性的野生型腈水合酶的活性，本发明的改良型腈水合酶的活性中的耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性提高。
此处，“腈水合酶活性”是指催化将腈化合物转换为对应的酰胺化合物的水合反应(RCN＋H2O→RCONH2)的酶。关于活性测定，可以通过使作为底物的腈化合物与腈水合酶接触，转换为对应的酰胺化合物之后，将该酰胺化合物定量而算出。作为底物，只要腈水合酶反应，不论怎样的腈化合物都可以使用，优选丙烯腈。
作为反应条件，在底物浓度为2.5%、反应温度为10℃～30℃、反应时间为10分钟～30分钟的范围下进行。酶反应通过添加磷酸而停止。之后，可以通过HPLC(高效液相色谱)分析生成的丙烯酰胺而进行酰胺化合物的定量。
另外，腈水合酶活性的有无可以通过活性染色法简便地检测。例如：如果使用2-氨基苯甲腈(anthranilonitrile)作为底物，由于通过腈水合酶转换而得的2-氨基苯甲酰胺(anthranilamide)具有荧光，因而能够高灵敏度、简便地进行检测(参照Antonie Van Leeuwenhoek80(2)：169-183，2001)。
“耐热性提高”是指经过加热处理的改良株的残余活性与进行了相同处理的比较例的残余活性相比高10%以上。作为加热处理的方法，将培养液或经过集菌·洗涤的培养菌体加入至容器后，将该容器加入至水浴或恒温箱等加热装置保温一定时间即可。此时，为了提高酶的稳定性，也可以添加腈化合物、酰胺化合物而实施加热处理。作为加热处理的条件，对于处理温度和处理时间进行适当研究，优选设定为比较株的活性相对于加热处理前降低至50%以下的条件。具体而言，在50℃～70℃的范围进行5分钟～60分钟加热处理。残余活性表示使用经过加热处理的菌体进行了活性测定的酰胺化合物的生成量与使用了等量的无处理的菌体进行了活性测定的酰胺化合物的生成量的比。无处理的菌体使用将培养液或经过集菌·洗涤的培养菌体在4℃下预先进行保存冷却而成的菌体。此处，作为本发明中的比较例，意味着导入有pER855A的转化体，可以将残余活性与比较株相比高10%以上的腈水合酶评价为耐热性提高。
“酰胺化合物耐性”是指即便在酰胺化合物存在下，也能够维持腈水合酶活性。将具有改良型腈水合酶的转化体的培养物或由该转化体分离的改良型腈水合酶在丙烯酰胺等酰胺化合物(例如、30～50%的高浓度)的存在下，分析作为底物的丙烯腈等腈化合物的消耗量或消耗速度。可以将消耗量或消耗速度相对于比较例超过1.01倍的腈水合酶评价为酰胺化合物耐性。
“高温累积性”是指在高于20℃的反应温度下，能够产生超过35%的高浓度的丙烯酰胺。对于具有改良型腈水合酶的转化体的培养物或由该转化体分离的改良型腈水合酶，边添加丙烯腈边继续酶反应，分析生成的丙烯酰胺浓度。丙烯腈的添加方法既可以边控制反应溶液内的丙烯腈浓度边添加，也可以边逐次添加边使之反应。本发明的高温表示20℃以上的反应温度。可以将生成的丙烯酰胺浓度超过比较例的腈水合酶评价为高温累积性提高。
作为酰胺化合物，可列举出例如下述通式(1)所示的酰胺化合物：
R-CONH2     (1)
(此处，R为可以被取代的碳原子数1～10的直链状或支链状的烷基或者烯基、可以被取代的碳原子数3～18的环烷基或芳基、或者可以被取代的饱和或不饱和杂环基。)。
特别优选式中的R为“CH2＝CH-”的丙烯酰胺。
上述的改良型腈水合酶为将野生型腈水合酶通过氨基酸置换而得到的，例如，通过改变来源于玫瑰色红球菌J1株的腈水合酶的氨基酸序列(序列号2和/或4)并选择耐热性和/或酰胺化合物耐性提高的腈水合酶而得到。
需要说明的是，玫瑰色红球菌J1株以FERM BP-1478于昭和62(1987)年9月18日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏。
可以认为：J1菌以外的腈水合酶中，氨基酸同源性高的酶通过上述的变异也会提高耐热性和/或酰胺化合物耐性。
作为这样的菌，可列举出史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)(日本特开平09-248188)、嗜热假诺卡氏菌(日本特开平09-275978)、热葡糖苷地芽孢杆菌(专利号)等，进而优选氨基酸同源性超过90%的(将高同源性酶进行罗列)玫瑰色红球菌M8(SU1731814)、玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)。需要说明的是，玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)是筛选出的上述M8菌(SU1731814)由于自发突变从而结构上表达腈水合酶的菌株。该腈水合酶自身的氨基酸序列和基因序列中没有变异(美国专利第5,827,699号)。
作为对野生型腈水合酶进行氨基酸置换的方法，可以采用：使具有腈水合酶活性的微生物与羟基胺、亚硝酸等成为变异源的药剂接触、发生作用的方法；通过紫外射线照射诱导变异的方法；对于编码腈水合酶的基因中使用PCR随机地导入变异的易错聚合酶链反应（Error prone PCR）、基因定点诱变（Site-directed Mutagenesis）等方法。
(b-1)随机变异导入法
作为使用变异体研究蛋白质的功能、性质的方法之一，有随机变异导入法。随机变异导入法是指对于编码特定的蛋白质的基因，导入随机的变异，制作变异体的方法。利用PCR进行的随机变异导入法中，可以在DNA扩增时设定严格度(Stringency)低的条件而导入碱基的变异(Error prone PCR)。
该易错聚合酶链反应中，对于被扩增的DNA的全部区域，在任意的位点导入变异。这样，通过对于得到的在任意位点导入有变异的变异体的功能进行研究，能够得到对蛋白质固有功能重要的氨基酸、结构域的信息。
成为易错聚合酶链反应的模板的腈水合酶可以使用来源于野生株的腈水合酶基因、利用易错聚合酶链反应获得的扩增产物DNA。
作为易错聚合酶链反应的反应条件，可列举出例如：将反应液中的dNTP(dGTP、dCTP、dATP或dTTP)的任1种、2种或3种的配合比例设为与其他的dNTP相比减少的组成的条件。由此，DNA合成时，在需要配合比例已经减少的dNTP的位置，错误地使用其他的dNTP的可能性变高，从而导入变异。另外，作为其他的反应条件，也优选列举出设为增加了反应液中的MgCl2和/或MnCl2量的组成的条件。
(b-2)来源于玫瑰色红球菌J1株的改良型腈水合酶及其基因
本发明的改良型腈水合酶中包含编码导入了表1所示的变异的蛋白质的基因。
这样的编码改良型腈水合酶的DNA可以以野生型腈水合酶基因为基础根据Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nded.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley＆Sons(1987-1997)等所述的位点特异性变异诱导法而进行制备。为了向DNA中导入变异，可以通过Kunkel法、缺口双链体（Gapped duplex）法等公知手法，使用利用了位点特异性突变诱导法的变异导入用试剂盒，例如Quick ChangeTM XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司造)、Gene Tailor TMSite-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制造)、TaKaRa Site-DirectedMutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TAKARA BIO INC.制造)等而进行。
另外，本发明的基因也包含与如下DNA在严格条件下杂交且编码具有腈水合酶活性的蛋白质的DNA：由与本发明的基因的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA。
这样的改良型腈水合酶基因可以如上所述通过向野性型基因中导入变异而得到；也可以将该基因序列或其互补序列、或者它们的片段作为探针，通过菌落杂交、噬菌斑杂交(plaque hybridization)、DNA印迹杂交(Southernblotting)等公知的杂交法，由cDNA文库和基因组文库而得到。文库能够利用采用公知的方法制作的文库，也可以利用市售的cDNA文库和基因组文库。
“严格条件(Stringent conditions)”意味着杂交后洗涤时的条件为盐浓度300～2000mM、温度40～75℃；优选为盐浓度600～900mM、温度65℃的条件。可列举出例如：2×SSC下50℃等的条件。本领域技术人员可以在这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件的基础上，加上其他的如探针浓度、探针的长度、反应时间等各种条件，适宜地设定用于得到编码本发明的腈水合酶的DNA的条件。
对于杂交法的详细的步骤，可以参照Molecular Cloning，A LaboratoryManual2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等。作为杂交的DNA，可列举出：包含与本发明的基因DNA具有至少40%以上、优选为60%、进而优选为90%以上的同源性的碱基序列的DNA或其部分片段。
对于置换野性型腈水合酶的氨基酸序列中的特定的氨基酸残基的氨基酸(置换后的氨基酸)的种类，均可以在包含置换后的氨基酸的多肽(蛋白质)具有腈水合酶活性的范围适宜选择，没有限定。
(c)重组载体、转化体
腈水合酶基因需要按照在被转化的宿主生物中能够表达的方式重组入载体中。作为载体可列举出例如：质粒DNA、噬菌体DNA、反转录转座子DNA、人工染色体DNA等。
另外，本发明中能够使用的宿主，只要是导入了上述重组载体后能够表达目标腈水合酶，就没有特别的限定。可以使用例如：大肠杆菌和枯草杆菌等细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。将大肠杆菌作为宿主的情况下，优选使用表达效率高的表达载体，例如：具有trc启动子的表达载体pkk233-2(Amersham Biosciences公司制造)或pTrc99A(Amersham Biosciences公司制造)等。
除了腈水合酶基因之外，载体中还可以连接有启动子、终止子、增强子、剪接信号(Splicing signal)、poly-A附加信号(poly-A additional signal)、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等。需要说明的是，作为选择标记，可列举出例如：卡那霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因等。
将细菌作为宿主的情况下，可列举出例如：大肠杆菌(Escherichia coli)，作为红球菌，可列举出例如：玫瑰色红球菌ATCC12674、玫瑰色红球菌ATCC17895、玫瑰色红球菌ATCC19140等。这些ATCC株能够从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection.)购得。
制作表达腈水合酶的转化体时，使用大肠杆菌作为宿主的情况下，表达的大部分腈水合酶成为包涵体(inclusion body)而不溶化，因此得到的是菌体活性低的转化体。另一方面，将红球菌作为宿主使用的情况下，腈水合酶存在于可溶性级分中，因此能够得到高活性的转化体。这些转化体根据目的进行选择即可，严格条件下选拔改良型酶的情况优选使用高活性的红球菌的转化体。
作为向细菌导入重组载体的方法，只要是向细菌中导入DNA的方法，就没有特别的限定。可列举出例如：使用钙离子的方法、电穿孔法等。
将酵母作为宿主的情况下，可以使用例如：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichiapastoris)等。作为向酵母导入重组载体的方法，只要是向酵母中导入DNA的方法，就没有特别的限定，可列举出例如：电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法等。
将动物细胞作为宿主的情况下，可以使用猴细胞COS-7、Vero、CHO细胞、小鼠L细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。作为向动物细胞中导入重组载体的方法，可列举出例如：电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法等。
将昆虫细胞作为宿主的情况下，可以使用Sf9细胞、Sf21细胞等。作为向昆虫细胞导入重组载体的方法，可以使用例如磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法等。
将植物细胞作为宿主的情况下，可列举出烟草BY-2细胞等，对其没有限定。作为向植物细胞导入重组载体的方法，可以使用例如：土壤杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等。
(d)培养物和改良型腈水合酶的制造方法
本发明中，改良型腈水合酶可以通过培养上述转化体，从得到的培养物中提取而进行制造。
本发明还包含特征在于从该培养物中提取改良型腈水合酶的、改良型腈水合酶的制造方法。
本发明中，“培养物”是指培养上清、培养细胞、培养菌体、或者细胞或菌体的破碎物的任意者。培养本发明的转化体的方法根据宿主的培养中所使用的通常的方法而进行。目标的改良型腈水合酶累积于上述培养物中。
培养本发明的转化体的培养基只要是含有宿主菌所能够同化(assimilation)的碳源、氮源、无机盐类等，能够有效地进行转化体的培养的培养基，就可以使用天然培养基、合成培养基的任意者。作为碳源，可列举出：葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖和淀粉等碳水化合物、醋酸和丙酸等有机酸、乙醇和丙醇等醇类。作为氮源，可列举出：氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、或者其他的含氮化合物。
其他的，也可以使用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、玉米浆、各种氨基酸等。作为无机物，可列举出：磷酸二氢钾、磷酸氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸銅、碳酸钙等。另外，也可以根据需要，为了防止培养中的发泡而添加消泡剂。进而，也可以向培养基中添加作为腈水合酶的辅基的钴离子、铁离子，成为酶的诱导剂的腈类、酰胺类。
培养中，为了防止载体和目标基因的脱落，也可以在施加了选择压力(selection pressure)的状态下进行培养。即，选择标记为药剂抗性基因的情况下，可以向培养基中添加相应的药剂；或者选择标记为营养缺陷型(auxotrophic)互补基因的情况下，也可以将相应的营养因子从培养基中去除。
另外，选择标记为赋予同化性的基因的情况下，可以根据需要添加相应的同化因子作为唯一因子。例如，培养用包含氨苄青霉素抗性基因的载体进行了转化的大肠杆菌的情况下，培养中也可以根据需要添加氨苄青霉素。
用将诱导型的启动子用作启动子的表达载体进行了转化而制成转化体，将该转化体进行培养的情况下，也可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如：用具有能够用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体进行了转化而制成转化体，将该转化体进行培养时，可以向培养基中添加IPTG等。另外，使用了能够用吲哚乙酸(IAA)诱导的trp启动子的表达载体进行了转化而制成转化体，将该转化体进行培养时，可以向培养基中添加IAA等。
对于转化体的培养条件，只要在不妨碍目标改良型腈水合酶的生产率和宿主的生育的条件下，就没有特别的限定，通常为10℃～40℃、优选为20℃～37℃下进行5～100小时。pH的调节使用无机或有机酸、碱溶液等进行，例如为大肠杆菌时调节为6～9。
作为培养方法，可列举出：固体培养、静置培养、振荡培养、通气搅拌培养等；特别是培养大肠杆菌转化体的情况下，优选通过振荡培养或通气搅拌培养(小型发酵罐)在需氧条件下进行培养。
如果在上述培养条件下进行培养，则能够以高收率将本发明的改良型腈水合酶累积于上述培养物中，即培养上清、培养细胞、培养菌体或者细胞或菌体的破碎物的至少一者中。
培养后，在菌体内或细胞内生产改良型腈水合酶的情况下，通过将菌体或细胞进行破碎，能够提取目标的改良型腈水合酶。作为菌体或细胞的破碎方法，可以利用通过弗氏压碎器或均化器的高压处理、超声波处理、通过玻璃珠等的磨碎处理、使用溶菌酶、纤维素酶或果胶酶等的酶处理、冻融处理、低渗液处理、通过噬菌体的溶菌诱导处理等。
破碎后，可以根据需要去除菌体或细胞的破碎残渣(包含细胞提取液不溶性级分)。作为将残渣去除的方法，可以列举出例如：离心分离、过滤等，也可以根据需要使用絮凝剂、过滤助剂等提高残渣除去效率。去除残渣后得到的上清为细胞提取液可溶性级分，可以作为经粗纯化的改良型腈水合酶溶液。
另外，在菌体内或细胞内生产改良型腈水合酶的情况下，也可以将菌体、细胞自身用离心分离、膜分离等进行回收，以未破碎的状态使用。
在菌体内或细胞内生产改良型腈水合酶的情况下，将培养液直接使用、或者通过离心分离、过滤等将菌体或细胞去除。之后，也可以根据需要通过利用硫酸铵沉淀的提取等，从前述培养物中提取出改良型腈水合酶，进而，根据需要使用透析、各种色谱(凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱等)进行分离纯化。
培养转化体而得到的腈水合酶的产率可以以例如单位培养液、单位菌体湿重量或干燥重量、单位粗酶液蛋白质等单位，通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或腈水合酶活性测定等进行确认，没有特别的限定。SDS-PAGE可以使用本领域技术人员公知的方法进行。另外，腈水合酶活性可以适用上述的活性值。
另外，本发明中，不必全部使用活细胞(living cell)，采用无细胞蛋白质合成系而能够生产改良型腈水合酶。
无细胞蛋白质合成体系是指使用细胞提取液在试管等人工容器内合成蛋白质的体系。需要说明的是，本发明中使用的无细胞蛋白质合成体系中也包含将DNA作为模板合成RNA的无细胞转录体系。
此时，对应于上述的宿主的生物与下述的细胞提取液的来源生物相对应。此处，上述细胞提取液可以使用来源于真核细胞的提取液或来源于原核细胞的提取液，例如：小麦胚芽、大肠杆菌等的提取液。需要说明的是，这些细胞提取液既可以被浓缩，也可以不被浓缩。
细胞提取液可以通过例如超滤、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等而得到。进而，本发明中，无细胞蛋白质合成也可以使用市售的试剂盒而进行。作为这样的试剂盒，可列举出例如:试剂盒PROTEIOSTM(TOYOBO CO.,LTD.)、TNTTM System(Promega KK.)、合成装置的PG-MateTM(TOYOBO CO.,LTD.)、RTS(Roche Diagnostics K.K.)等。
如上所述，通过无细胞蛋白质合成得到的改良型腈水合酶可以如前所述选择适宜色谱而进行纯化。
2.酰胺化合物的制造方法
如上所述制造的改良型腈水合酶可以作为酶催化剂利用于物质生产。例如，通过使腈化合物与上述改良型腈水合酶接触而生成酰胺化合物。接着，提取通过接触而生成的酰胺化合物。由此，能够制造酰胺化合物。
作为酶催化剂，可以使用如前述那样分离纯化的腈水合酶。另外，如前所述，按照在适当的宿主内改良型腈水合酶基因能够表达的方式进行基因导入，利用培养宿主后的培养物或者该培养物的处理物。作为处理物，可列举出例如：将培养后的细胞用丙烯酰胺等凝胶包埋而成的处理物、用戊二醛进行了处理的处理物、负载于氧化铝、二氧化硅、沸石和珪藻土等无机载体而成的处理物等。
此处，“接触”是指使改良型腈水合酶和腈化合物存在于相同的反应体系或培养体系中，包含例如：将经分离纯化的改良型腈水合酶与腈化合物进行混合；向表达改良型腈水合酶基因的细胞的培养容器中添加腈化合物；在腈化合物的存在下培养该细胞；将该细胞的提取液与腈化合物混合等。
作为底物而使用的腈化合物，考虑酶的底物特异性、酶相对于底物的稳定性等而进行选择。作为腈化合物优选丙烯腈。反应方法、和反应结束后的酰胺化合物的提取方法根据底物和酶催化剂的特性而进行适宜选择。
酶催化剂只要其活性不失活，就优选循环使用。鉴于防止失活、容易地进行循环的观点，酶催化剂优选以处理物的形式而使用。
实施例
以下，列举实施例进而具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例1
改良型腈水合酶基因的取得和评价(1)
(1)变异基因文库的构建
作为模板的质粒，使用由β亚基的氨基酸序列(序列号2)的N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基由天冬酰胺(N)变异为丝氨酸(S)；并且，由上述N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基由缬氨酸(V)变异为丙氨酸(A)；并且，由上述N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基由丝氨酸(S)变异为甲硫氨酸(M)；并且，由上述N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基由赖氨酸(K)变异为酪氨酸(Y)；并且，由上述N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基由苏氨酸(T)变异为赖氨酸(K)而成的质粒pER855(参照日本特开2010-172295)的改变物pER855A(图1)。
作为载体使用的pSJ034为在红球菌中表达腈水合酶的质粒，由pSJ023使用日本特开平10-337185号公报所示的方法制作。需要说明的是，pSJ023为转化体“R.rhodochrous ATCC12674/pSJ023”，以保藏号FERM BP-6232于平成9(1997)年3月4日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行国际保藏。
首先，按照以下的方法向腈水合酶基因导入变异。
＜PCR反应液组成＞
Figure BDA0000422780280000251
＜PCR反应条件＞
(98℃10秒、55℃5秒、72℃下90秒)×30循环
＜引物＞β17的饱和变异引物
β17RM-F ggatacggaccggtcNNStatcagaaggacgag(序列号5)
β17RM-R ctcgtccttctgataSNNgaccggtccgtatcc(序列号6)
＜反应条件＞
(94℃下30秒、65℃下30秒、72℃下3分钟)×30循环
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7%琼脂糖凝胶电泳，确认11kb的扩增片段，将1μl的DpnI(试剂盒附带的)添加至PCR反应液中使之在37℃下反应1小时，进行模板质粒的去除。将反应结束液用Wizard SV Gel and PCR Clean-UpSystem(Promega KK.)进行纯化，使用经纯化的PCR反应物对JM109进行转化。将得到的数千个菌落由平板进行回收，使用QIAprep Spin MiniprepKit(QIAGEN公司)提取质粒DNA，作为变异基因文库。
(2)红球菌转化体的制作
将玫瑰色红球菌ATCC12674株的对数增殖期的细胞通过离心分离器进行集菌，在冰冷却过的无菌水中洗涤3次，悬浮于无菌水中。将上述(1)制备的质粒1μl和菌体悬浮液10μl混合，用冰冷却，向比色皿中加入质粒DNA和菌体的悬浮液，通过基因导入装置Gene Pulser II(BIO RAD)在2.0KV、200OHMS下进行电脉冲处理。
将加入了电脉冲处理液的比色皿在冰冷却下静置10分钟，37℃下进行10分钟热休克。之后，向比色皿中加入MYK培养基(0.5%聚蛋白胨、0.3%Bacto酵母提取物、0.3%Bacto麦芽浸膏提取物、0.2%K2HPO4、0.2%KH2PO4)500μl，30℃下静置5小时后，涂布至加入了50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基。将30℃下培养3天后的菌落作为转化体。同样地制作pER855A的转化体作为比较株。
(3)红球菌转化体的酰胺处理
为了进行筛选，使用上述(2)中得到的包含腈水合酶基因的红球菌转化体、和作为比较株的ATCC12674/pER855A。在各加入了GGPK培养基(1.5%葡萄糖、1%谷氨酸钠、0.1%酵母提取物、0.05%K2HPO4、0.05%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、1%CoCl2、0.1%尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)1ml的96孔深孔平板中分别接种上述菌株，30℃下进行3天液体培养。
接着，将得到的培养液30μl分注至96孔平板，通过离心分离去除培养基，最后，添加50%丙烯酰胺溶液40μl，将菌悬浮。将悬浮于高浓度丙烯酰胺溶液的转化体置于恒温箱中，50℃的温度下、进行30分钟加热处理，使作为比较的比较株完全地失活。残余腈水合酶活性按照下述的方法进行测定。
首先，将经过丙烯酰胺处理的转化体用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗涤，按照以下的方法进行了活性测定。向试管中添加经洗涤的转化体和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，30℃下进行10分钟预孵育，添加等量的5%丙烯腈溶液(pH7.0)使之反应10分钟，添加1/10量的1M磷酸，从而使反应停止。接着，由停止的反应液通过离心分离去除转化体，稀释至适当的浓度，通过HPLC进行分析(WAKOSIL5C8(和光纯药公司)250mm、包含5mM磷酸的10%乙腈、流动相的流速1ml/min和紫外吸收检测器波长260nm)。需要说明的是，使用没有进行丙烯酰胺处理的各种无处理菌进行活性测定作为比较对照，将得到的活性值作为基准，求出丙烯酰胺处理后的残余活性。
从具有按照上述的方法导入了变异的腈水合酶基因的数百个转化体中，选拔出表3所示的具有高浓度丙烯酰胺耐性的变异酶4株。
[表3]
变异株NO. 质粒名
1 pFR003
2 pFR004
3 pFR005
4 pFR006
(4)碱基序列的确认
为了进行腈水合酶基因的碱基序列的确认，从得到的选拔株回收质粒。将红球菌转化体接种至10ml的MYK培养基(聚蛋白胨0.5%、Bacto酵母提取物0.3%、麦芽浸膏提取物0.3%、葡萄糖1%、卡那霉素50μg/ml)中。24小时培养后添加20%灭菌的甘氨酸溶液使其终浓度为2%，进一步进行24小时培养。之后，通过离心分离回收菌体，将菌体用TES(10mM Tris-HCl(pH8)-10mMNaCl-1mM EDTA)缓冲液进行洗涤后，悬浮于2ml的50mMTris-HCl(pH8)-12.5%蔗糖-100mM NaCl-1mg/ml溶菌酶，37℃下进行3小时振荡。向其中加入0.4ml的10%SDS，在室温下平稳地进行1小时振荡，进而，添加2.1ml的5M醋酸钠缓冲液(pH5.2)，在冰中静置1小时。之后，4℃下进行10,000×g、1小时离心，得到上清。向其中加入5倍量的乙醇，-20℃下静置30分钟后，进行10,000×g、20分钟离心。将沉淀物用10ml的70%乙醇进行洗涤后，溶解于100μl的TE缓冲液中，得到DNA溶液。
接着，将包含腈水合酶的序列用PCR法进行扩增。
＜PCR反应液组成＞
Figure BDA0000422780280000281
＜引物＞
NH-19GCCTCTAGATATCGCCATTCCGTTGCCGG(序列号7)
NH-20ACCCTGCAGGCTCGGCGCACCGGATGCCCAC(序列号8)
＜反应条件＞
(94℃下30秒、65℃下30秒、72℃下3分钟)×30循环
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7%琼脂糖凝胶电泳，进行2.5kb的PCR扩增产物的检测。PCR反应液经过Exo-SAP处理(Amersham Pharmacia)后，通过循环测序法制备序列解析用样品，用Beckman CEQ-2000XL进行解析。结果示于表4中。
[表4]
Figure BDA0000422780280000291
(5)酰胺化合物耐性的评价
按照以下的手法对(4)中取得的改良型腈水合酶的酰胺化合物的耐性实施评价。
将ATCC12674/pER855A和、上述(2)的工序中得到的各转化体分别接种于10ml的MYK培养基(50μg/ml卡那霉素)中，在30℃下进行2天振荡培养，在100ml的GGPK培养基(1.5%葡萄糖、1%谷氨酸钠、0.1%酵母提取物、0.05%K2HPO4、0.05%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、1%CoCl2、0.1%尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)中接种1%而进行。30℃下进行3天振荡培养，通过离心分离进行集菌。
得到的培养菌体的酶活性按照下述的方法进行。将菌体液0.2ml和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)4.8ml进行混合，进而，将包含5.0%(w/v)丙烯腈的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)5ml加入至混合液，10℃下边进行振荡边使之反应10分钟。接着，将菌体过滤，使用气相色谱将生成的丙烯酰胺的量进行定量。
＜分析条件＞
分析仪器：气相色谱仪GC-14B(岛津制作所制作)
检测器：FID(检测200℃)
柱：填充有Porapak PS(Nihon Waters K.K.制造柱填充剂)而成的1m玻璃柱
柱温度：190℃
由丙烯酰胺的量换算腈水合酶活性。此处，腈水合酶活性将1分钟内生成1μmol的丙烯酰胺的酶量定义为1U。
接着，在下述反应液组成和反应条件下进行实验。需要说明的是，反应中使用的各菌体悬浮液，基于事先测定的酶活性用100mM磷酸缓冲液(pH7.0)适宜稀释至相同的活性量。使用作为比较株的ATCC12674/pER855A作为比较对照。
＜反应液组成＞
50%丙烯酰胺溶液                            94g
丙烯腈                                     4g
1M磷酸缓冲液                               1g
菌液(相同的酶活性单位(U)量)
＜反应条件＞
边搅拌边进行5小时反应(30℃)
反应开始前(0小时)、5小时后分别将反应液采样1ml，使用0.45μm的滤器进行过滤，将得到的滤液供于气相色谱。将残余的丙烯腈的比例(%)的分析结果示于表5中。
[表5]
Figure BDA0000422780280000301
由上述结果，相比于作为比较例的pER855A，全部的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率超过103%。因此，改良型腈水合酶即便在高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，因此可以说对于丙烯酰胺的耐性提高。
实施例2
改良型腈水合酶基因的取得和评价(2)
(1)向腈水合酶导入变异和选拔
将实施例1中取得的pFR005作为模板，进而，尝试取得丙烯酰胺耐性提高的改良型腈水合酶。只将使用的引物进行变更，实施与实施例1同样的手法(变异导入、红球菌转化体的制作、红球菌转化体的酰胺处理方法、碱基序列的确认)，取得表6中选拔出的变异酶。
＜引物＞
β15的饱和变异引物
β15RM-F：atgaccggatacggaNNSgtcccctatcagaag(序列9)
β15RM-R：cttctgataggggacSNNtccgtatccggtcat(序列10)
β95的饱和变异引物
β95RM-F：accgaagaagagcgaNNScaccgtgtgcaagag(序列11)
β95RM-R：ctcttgcacacggtgSNNtcgctcttcttcggt(序列12)
β105的饱和变异引物
β105RM-F：GAGATCCTTGAGGGTNNSTACACGGACAGG(序列13)
β105RM-R：CCTGTCCGTGTASNNACCCTCAAGGATCTC(序列14)
β133的饱和变异引物
β133RM-F：cacgagccccactccNNSgcgcttccaggagcg(序列15)
β133RM-R：cgctcctggaagcgcSNNggagtggggctcgtg(序列16)
β144的饱和变异引物
β144RM‐F：ggagccgagtttctctNNSggtgacaagatc(序列17)
β144RM‐R：gatcttgtcaccSNNagagaaactcggctcc(序列18)
β168的饱和变异引物
β168RM-F：cgaaatatgtgcggagcNNSatcggggaaatcg(序列19)
β168RM-R：cgatttccccgatSNNgctccgcacatatttcg(序列20)
β190的饱和变异引物
β190RM-F：gagcagctccgccggcctcNNSgacgatcctcg(序列21)
β190RM-R：cgaggatcgtcSNNgaggccggcggagctgctc(序列22)
α124的饱和变异引物
α124RM-F：gtacaagagcatgNNStaccggtcccgagtgg(序列23)
α124RM-R：ccactcgggaccggtaSNNcatgctcttgtac(序列24)
[表6]
Figure BDA0000422780280000321
(2)性能评价
采用与实施例1(5)相同的手法对取得的改良型腈水合酶的性能实施评价。
[表7]
Figure BDA0000422780280000331
由上述结果，相比于作为比较例的pER855A，全部的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率超过117%。因此，改良型腈水合酶即便在高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，所以可以说对于丙烯酰胺的耐性提高。
实施例3
改良型腈水合酶基因的取得和评价(3)
(1)向腈水合酶导入变异和选拔
将实施例2中取得的pFR108A作为模板，进而，尝试取得丙烯酰胺耐性提高的改良型腈水合酶。只将使用的引物进行变更，实施与实施例1同样的手法(变异导入、红球菌转化体的制作、红球菌转化体的酰胺处理方法、碱基序列的确认)，取得表8中选拔出的变异酶。需要说明的是，具有改良型腈水合酶的转化体的选拔在55℃的温度下、进行60分钟的热处理，除此以外，采用与实施例1相同的方法进行。
＜引物＞
α174的饱和变异引物
α174RM-F：gccggcaccgacNNStggtccgaggag(序列25)
α174RM-R：ctcctcggaccaSNNgtcggtgccggc(序列26)
[表8]
Figure BDA0000422780280000341
(2)性能评价
采用与实施例1(5)相同的手法对取得的改良型腈水合酶的性能实施评价。
[表9]
Figure BDA0000422780280000342
由上述结果，相比于作为比较例的pER855A，全部的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率超过124%。因此，改良型腈水合酶即便在高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，所以可以说对于丙烯酰胺的耐性提高。
实施例4
(1)向腈水合酶导入变异和选拔
将实施例2中取得的pFR211作为模板，进而，尝试取得丙烯酰胺耐性提高的改良型腈水合酶。只将使用的引物进行变更，实施与实施例3同样的手法(变异导入、红球菌转化体的制作、红球菌转化体的酰胺处理方法、碱基序列的确认)，取得表10中选拔出的变异酶。
＜引物＞
β95的饱和变异引物
β95RM-F：accgaagaagagcgaNNScaccgtgtgcaagag(序列27)
β95RM-R：ctcttgcacacggtgSNNtcgctcttcttcggt(序列28)
β112的饱和变异引物
β112RM-F：GACAGGAAGCCGNNSCGGAAGTTCGATCCG(序列29)
β112RM-R：CGGATCGAACTTCCGSNNCGGCTTCCTGTC(序列30)
β218的饱和变异引物
β218RM-F：gggaaagacgtagtgNNSgccgatctctgggaa(序列31)
β218RM-R：ttcccagagatcggcSNNcactacgtctttccc(序列32)
[表10]
Figure BDA0000422780280000351
(2)性能评价
采用与实施例1(5)相同的手法对取得的改良型腈水合酶的性能实施评价。结果示于表11中。
[表11]
Figure BDA0000422780280000352
由上述结果，相比于作为比较例的pER855A，全部的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率超过125%。因此，改良型腈水合酶即便在高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，所以对于丙烯酰胺的耐性提高。
实施例5
(1)pFR306A的制作
将实施例4中取得的pFR306作为模板，制作将Lβ144S置换为野生型氨基酸的改良型腈水合酶。作为方法，使用下述的引物，采用与实施例1相同的方法制作红球菌转化体。
＜引物＞
将β144的变异恢复至野生型
F＿Sβ144L-F：TTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG(序列33)
F＿Sβ144L-R：GTCACCGAGAGAGAAACTCGGCTCCGC(序列34)
[表12]
Figure BDA0000422780280000361
(2)耐热性的评价
按照下述的手法对本发明中取得的改良型腈水合酶的性能实施评价。
将包含表13所示的变异腈水合酶基因的转化体采用实施例1(5)的方法进行培养，用于耐热性的评价中。将得到的培养物用50mM磷酸缓冲液进行适宜稀释，在70℃的水浴下供于10分钟热处理之后，进行残余腈水合酶活性的测定。活性测定按照实施例1(5)记载的方法进行。将作为比较对照的不进行热处理而在4℃下保冷的菌作为各个无处理菌而求出残余活性。
[表13]
Figure BDA0000422780280000371
将比较例的pER855A的残余活性设为1(11%)时，改良型腈水合酶的残余活性均超过3倍(30%)。因此，改良型腈水合酶的耐热性提高。
实施例6
使用实施例5中得到的下述的转化体，评价高温反应时的丙烯酰胺累积性。
向带盖的塑料试管中添加10ml的50mM磷酸缓冲液、和与所加入的活性量相应的转化体，在40℃的水浴中边振动边进行10分钟预孵育。接着，向各反应液中添加丙烯腈1ml，起始反应，以后在规定的时间(20分钟、40分钟、小时、1小时30分钟、2小时)边逐次添加丙烯腈各1ml边继续反应，将反应3小时后的反应液用滤器过滤，用气相色谱测定滤液的丙烯酰胺浓度。
实验的结果是，比较例的pER855A累积有32%的丙烯酰胺，与此相对，改良型腈水合酶均累积有超过40%的丙烯酰胺。因此，改良型腈水合酶的高温累积性提高。
产业上的可利用性
本发明提供改良型腈水合酶。本发明的改良型腈水合酶的耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性提高。因此，通过使用本发明的改良型腈水合酶，能够效率良好地由腈化合物制造酰胺化合物。
[序列表的说明]
序列号1：来源于J1菌的腈水合酶β亚基的碱基序列
序列号2：来源于J1菌的腈水合酶β亚基的氨基酸序列
序列号3：来源于J1菌的腈水合酶α亚基的碱基序列
序列号4：来源于J1菌的腈水合酶α亚基的氨基酸序列
序列号5：β17的饱和变异引物
序列号6：β17的饱和变异引物
序列号7：NH-19引物
序列号8：NH-20引物
序列号9：β15的饱和变异引物
序列号10：β15的饱和变异引物
序列号11：β95的饱和变异引物
序列号12：β95的饱和变异引物
序列号13：β105的饱和变异引物
序列号14：β105的饱和变异引物
序列号15：β133的饱和变异引物
序列号16：β133的饱和变异引物
序列号17：β144的饱和变异引物
序列号18：β144的饱和变异引物
序列号19：β168的饱和变异引物
序列号20：β168的饱和变异引物
序列号21：β190的饱和变异引物
序列号22：β190的饱和变异引物
序列号23：α124的饱和变异引物
序列号24：α124的饱和变异引物
序列号25：α174的饱和变异引物
序列号26：α174的饱和变异引物
序列号27：β95的饱和变异引物
序列号28：β95的饱和变异引物
序列号29：β112的饱和变异引物
序列号30：β112的饱和变异引物
序列号31：β218的饱和变异引物
序列号32：β218的饱和变异引物
序列号33：使β144的变异恢复至野生型的引物
序列号34：使β144的变异恢复至野生型的引物
序列号35：红球菌属M8的β亚基
序列号36：赤红球菌TH的β亚基
序列号37：嗜吡啶红球菌MW3的β亚基
序列号38：嗜吡啶红球菌S85-2的β亚基
序列号39：嗜吡啶红球菌MS-38的β亚基
序列号40：诺卡氏菌JBRs的β亚基
序列号41：诺卡氏菌属YS-2002的β亚基
序列号42：玫瑰色红球菌ATCC39384的β亚基
序列号43：不可培养细菌SP1的β亚基
序列号44：不可培养细菌BD2的β亚基
序列号45：睾丸酮丛毛单胞菌的β亚基
序列号46：热葡糖苷酶芽胞杆菌Q6的β亚基
序列号47：嗜热假诺卡氏菌JCM3095的β亚基
序列号48：玫瑰色红球菌Cr4的β亚基
序列号49：红球菌属M8的α亚基
序列号50：赤红球菌THα亚基
序列号51：嗜吡啶红球菌MW3的α亚基
序列号52：嗜吡啶红球菌S85-2的α亚基
序列号53：诺卡氏菌JBRs的α亚基
序列号54：诺卡氏菌属YS-2002的α亚基
序列号55：不可培养细菌BD2的α亚基
序列号56：不可培养细菌SP1的α亚基
序列号57：玫瑰色红球菌ATCC39484的α亚基
序列号58：中华根瘤菌WSM419的α亚基
序列号59：嗜热假诺卡氏菌JCM3095的α亚基
序列号60：玫瑰色红球菌Cr4的α亚基
序列号61：来源于红球菌属N-771株的铁型腈水合酶α亚基的半胱氨酸簇
序列号62：来源于J1菌的钴型腈水合酶α亚基的半胱氨酸簇
Figure IDA0000422780410000011
Figure IDA0000422780410000021
Figure IDA0000422780410000031
Figure IDA0000422780410000041
Figure IDA0000422780410000051
Figure IDA0000422780410000061
Figure IDA0000422780410000071
Figure IDA0000422780410000081
Figure IDA0000422780410000091
Figure IDA0000422780410000101
Figure IDA0000422780410000111
Figure IDA0000422780410000141
Figure IDA0000422780410000151
Figure IDA0000422780410000161
Figure IDA0000422780410000171
Figure IDA0000422780410000181
Figure IDA0000422780410000191
Figure IDA0000422780410000201
Figure IDA0000422780410000211
Figure IDA0000422780410000221
Figure IDA0000422780410000231
Figure IDA0000422780410000241
Figure IDA0000422780410000251
Figure IDA0000422780410000261
Figure IDA0000422780410000271
Figure IDA0000422780410000281
Figure IDA0000422780410000301
Figure IDA0000422780410000311
Figure IDA0000422780410000321
Figure IDA0000422780410000331
Figure IDA0000422780410000341
Figure IDA0000422780410000351
Figure IDA0000422780410000361
Figure IDA0000422780410000371
Figure IDA0000422780410000381
Figure IDA0000422780410000401
Figure IDA0000422780410000411
Figure IDA0000422780410000421
Figure IDA0000422780410000441
Figure IDA0000422780410000451
Figure IDA0000422780410000461
Figure IDA0000422780410000471
Figure IDA0000422780410000481
Figure IDA0000422780410000491
Figure IDA0000422780410000501
Figure IDA0000422780410000511
Figure IDA0000422780410000521
Figure IDA0000422780410000531
Figure IDA0000422780410000541
PCT/RO/134表
Figure 201280028405515001600011
Figure 201280028405515001600021

Claims (8)

1.一种蛋白质，
其为以下(A)或(B)的蛋白质；
(A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基、进而选自由下述(f)～(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；
(a)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基、
(b)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基、
(c)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基、
(d)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基、
(e)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基、
(f)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基、
(g)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基、
(h)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基、
(i)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数144残基下游的氨基酸残基、
(j)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数133残基下游的氨基酸残基、
(k)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数112残基下游的氨基酸残基、
(l)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数105残基下游的氨基酸残基、
(m)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数95残基下游的氨基酸残基、
(n)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数17残基下游的氨基酸残基、
(o)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数15残基下游的氨基酸残基、
(p)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起67残基下游的氨基酸残基、
(q)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起17残基下游的氨基酸残基、
(B)蛋白质，其特征在于，包含在(A)蛋白质的氨基酸序列中除了所述置换后的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。
2.一种DNA，其编码权利要求1所述的蛋白质。
3.一种DNA，其与权利要求2所述的DNA在严格条件下杂交并且编码具有腈水合酶活性的蛋白质。
4.一种重组载体，其包含权利要求2或3所述的基因DNA。
5.一种转化体，其包含权利要求4所述的重组载体。
6.一种腈水合酶，是从培养权利要求5所述的转化体而得到的培养物中提取的。
7.一种腈水合酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求5所述的转化体，从得到的培养物中提取腈水合酶。
8.一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使权利要求1所述的蛋白质或培养权利要求5所述的转化体而得到的培养物或该培养物的处理物与腈化合物接触。
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