JP5532618B2 - 改良型ニトリルヒドラターゼ及びその製造方法 - Google Patents
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Description
しかし、耐熱性及びアミド化合物耐性の向上したニトリルヒドラターゼを開発し、アミド化合物の製造に用いることは、触媒コスト等の生産コストの観点などから非常に有用であり、より耐性の向上した酵素の取得は、反応時の酵素量の削減及びコスト削減等の観点から開発が望まれている。
以下の(A)又は(B)のタンパク質。
(A)野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の下記(a)、(b)及び(c)のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されており、
(a)βサブユニットのアミノ酸配列のうち、C末端のアミノ酸残基から数えて63残基上流のアミノ酸残基
(b)上記C末端のアミノ酸残基から数えて11残基上流のアミノ酸残基
(c)上記C末端のアミノ酸残基から数えて173残基上流のアミノ酸残基
下記(d)〜(o)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置されたアミノ酸配列を含み、
(d)上記C末端のアミノ酸残基から数えて12残基上流のアミノ酸残基
(e)上記C末端のアミノ酸残基から数えて14残基上流のアミノ酸残基
(f)上記C末端のアミノ酸残基から数えて15残基上流のアミノ酸残基
(g)上記C末端のアミノ酸残基から数えて98残基上流のアミノ酸残基
(h)上記C末端のアミノ酸残基から数えて99残基上流のアミノ酸残基
(i)上記C末端のアミノ酸残基から数えて116残基上流のアミノ酸残基
(j)上記C末端のアミノ酸残基から数えて123残基上流のアミノ酸残基
(k)上記C末端のアミノ酸残基から数えて125残基上流のアミノ酸残基
(l)上記C末端のアミノ酸残基から数えて126残基上流のアミノ酸残基
(m)上記C末端のアミノ酸残基から数えて130残基上流のアミノ酸残基
(n)上記C末端のアミノ酸残基から数えて135残基上流のアミノ酸残基
(o)上記C末端のアミノ酸残基から数えて215残基上流のアミノ酸残基
且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
(B)(A)のタンパク質のアミノ酸配列において、前記置換後のアミノ酸残基を除き、1又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
1.野生型ニトリルヒドラターゼ
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、野生型ニトリルヒドラターゼの改良型(変異型)であり、その由来は特に限定されるものではない。ここで、「野生型ニトリルヒドラターゼ」とは、自然界の生物(例えば、土壌細菌等の微生物)より分離され得るニトリルヒドラターゼを指し、当該酵素を構成するアミノ酸配列、及び当該酵素をコードする遺伝子の塩基配列が、人為的に欠失又は挿入せず、あるいは、他のアミノ酸又は塩基で置換されておらず、天然由来の特性を保持したままのニトリルヒドラターゼを意味する。既知の微生物由来のニトリルヒドラターゼのみならず、未知の生物由来のニトリルヒドラターゼも上記「野生型ニトリルヒドラターゼ」に含まれる。
2.改良型ニトリルヒドラターゼ
本発明は、野生型ニトリルヒドラターゼにアミノ酸置換を施した改良型(変異型)ニトリルヒドラターゼである。置換を施す対象となる野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列はGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等のNCBIのデータベースに公表されている。
例えば、ロドコッカス・ロドクロウスJ1(FERM BP−1478)由来のαサブユニットは、アミノ酸配列及び塩基配列が配列番号1で示される。また、βサブユニット(配列番号1)のアクセッション番号は「P21220」である。また、ロドコッカス・ロドクロウスM8(SU1731814) 由来のαサブユニットのアクセッション番号は「ATT79340」であり、βサブユニットのアクセッション番号は「AAT79339」である。さらに、シュードノカルデァ・サーモフィラ(Pseudonocardia thermophila)JCM3095由来のαサブユニットのアクセッション番号は「1IRE A」であり、βサブユニットのアクセッション番号は「1IRE B」である。
上流のアミノ酸残基
(b)上記C末端のアミノ酸残基から数えて11残基上流のアミノ酸残基
(c)上記C末端のアミノ酸残基から数えて173残基上流のアミノ酸残基
(d)上記C末端のアミノ酸残基から数えて12残基上流のアミノ酸残基
(e)上記C末端のアミノ酸残基から数えて14残基上流のアミノ酸残基
(f)上記C末端のアミノ酸残基から数えて15残基上流のアミノ酸残基
(g)上記C末端のアミノ酸残基から数えて98残基上流のアミノ酸残基
(h)上記C末端のアミノ酸残基から数えて99残基上流のアミノ酸残基
(i)上記C末端のアミノ酸残基から数えて116残基上流のアミノ酸残基
(j)上記C末端のアミノ酸残基から数えて123残基上流のアミノ酸残基
(k)上記C末端のアミノ酸残基から数えて125残基上流のアミノ酸残基
(l)上記C末端のアミノ酸残基から数えて126残基上流のアミノ酸残基
(m)上記C末端のアミノ酸残基から数えて130残基上流のアミノ酸残基
(n)上記C末端のアミノ酸残基から数えて135残基上流のアミノ酸残基
(o)上記C末端のアミノ酸残基から数えて215残基上流のアミノ酸残基。
・上記(a)〜(c)のアミノ酸残基と、上記(d)〜(o)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基
・上記(a)〜(c)、及び(i)のアミノ酸残基と、上記(d)〜(h)及び(j)〜(o)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基
・上記(a)〜(c)、及び(j)のアミノ酸残基と、上記(d)〜(i)及び(k)〜(o)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基
・上記(a)〜(c)、及び(l)のアミノ酸残基と、上記(d)〜(k)及び(m)〜(o)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基
・上記(a)〜(c)、(i)、(j)、(l)のアミノ酸残基と、上記(d)〜(h)、(k)及び(m)〜(o)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例としては、J1菌由来の野生型ニトリルヒドラターゼにおいて、本発明のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列におけるC末端のアミノ酸残基から数えて63残基上流のアミノ酸残基(アスパラギン)、上記C末端のアミノ酸残基から数えて11残基上流のアミノ酸残基(バリン)、及び上記C末端のアミノ酸残基から数えて173残基上流のアミノ酸残基(セリン)が他のアミノ酸(例えばリジンなど)に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質が好ましく挙げられる。このようなアミノ酸置換の態様の表記例としては、「Nβ←63S,Vβ←11A,Sβ←173R、Kβ←116Y」等が挙げられる。
3.ニトリルヒドラターゼ活性
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの活性は、天然由来の特性を保持したままの野生型ニトリルヒドラターゼの活性に対して耐熱性及びアミド化合物耐性が向上している。
反応条件としては、基質濃度は2.5%、反応温度は10℃から30℃、反応時間は10分から30分の範囲で行う。酵素反応はリン酸を添加して停止させる。その後、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)により、生成したアクリルアミドを分析することでアミド化合物の定量を行うことができる。
また、ニトリルヒドラターゼ活性の有無は活性染色法によって簡便に調べることができる。例えば、基質にアントラニロニトリル(anthranilonitrile)を使用すれば、ニトリルヒドラターゼによって変換されたアントラニルアミド(anthranilamide)は蛍光を有するので高感度に簡便に検出することができる(Antonie Van Leeuwenhoek 80(2):169−183,2001参照)。
「耐熱性及びアミド化合物耐性の向上」とは、親株(野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において上記(a)、(b)及び(c)の三箇所が置換されたタンパク質)が失活する高濃度のアミド化合物存在下で加熱処理条件において、親株以上のニトリルヒドラターゼ活性を維持することができることを意味する。改良型ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の培養物又は当該形質転換体から単離した改良型ニトリルヒドラターゼを、アクリルアミド等のアミド化合物の存在下で、加熱処理を行う。
加熱処理の方法としては、当該容器をウォーターバスやインキュベーター等の加熱装置に入れ一定時間保温すればよい。この時、酵素の安定性を高める為のニトリル化合物やアミド化合物を添加して加熱処理を実施してもよい。
加熱処理の条件としては処理温度と処理時間を適宜検討し、親株の活性が検出できない条件を設定するのが好ましい。加熱処理後のニトリルヒドラターゼ活性は、活性染色法や活性測定で確認することができる。
具体的には、30〜50%のアクリルアミド溶液に培養した形質転換体を懸濁し、50℃から70℃の範囲で、5分から60分加熱処理を行う。加熱処理後、基質となるニトリルを含む基質溶液を添加し、活性染色法にてニトリルヒドラターゼ活性が保持されているか調べればよい。
親株が完全に失活する処理条件において、ニトリルヒドラターゼ活性が確認できた変異型酵素を耐熱性及びアミド化合物耐性が向上したと評価した。ここで、本発明における親株とは、変異導入する鋳型プラスミドが導入された形質転換体を意味する。
R−CONH2 (1)
(ここで、Rは、置換されていてもよい炭素数1〜10の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基又はアルケニル基、置換されていてもよい炭素数3〜18のシクロアルキル基又はアリール基、あるいは、置換されていてもよい飽和又は不飽和複素環基である。)
で表されるアミド化合物が挙げられる。特に、式中、Rが「CH2=CH−」であるアクリルアミドが好ましい。
なお、ロドコッカス・ロドクロウスJ1株は、FERM BP−1478として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に昭和62(1987)年9月18日付けで国際寄託されている。
なお、ロドコッカス・ロドクロウスM33(VKM Ac−1515D)は、上記M8菌(SU1731814)から自然突然変異によって構成的にニトリルヒドラターゼを発現する株として選抜された菌株である。そのニトリルヒドラターゼ自体のアミノ酸配列及び遺伝子配列に変異はない(米国特許第5,827,699号)。
4.アミノ酸残基置換方法
野生型ニトリルヒドラターゼをアミノ酸置換する方法としては、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物にハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子にPCRを用いてランダムに変異を導入するError prone PCR方法等を採用することができる。
変異体を用いたタンパク質の機能、性質を研究する方法の一つに、ランダム変異導入法がある。ランダム変異導入法とは、特定のタンパク質をコードする遺伝子に対してランダムな変異を導入し、変異体を作製する方法である。PCRによるランダム変異導入法では、DNA増幅時に厳密度(ストリンジェンシー)の低い条件を設定して、塩基の変異を導入する(Error prone PCR)ことができる。
このError prone PCRでは、増幅されるDNAの全域に対して任意の部位に変異が導入される。そうすると、得られた任意の部位に変異が導入された変異体の機能を検討することによって、タンパク質固有の機能に重要なアミノ酸やドメインの情報を得ることができる。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼには、表1に示す変異を導入したタンパク質をコードした遺伝子が含まれる。
5.組換えベクター、形質転換体
ニトリルヒドラターゼ遺伝子は、形質転換される宿主生物において発現可能なように、ベクターに組み込むことが必要である。例えば、ベクターとしてはプラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられる。
6.培養物及び改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法
本発明において、改良型ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、特に大腸菌形質転換体を培養する場合には、振盪培養又は通気攪拌培養(ジャーファーメンター)により好気的条件下で培養することが好ましい。
破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣(細胞抽出液不溶性画分を含む)を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した改良型ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
7.アミド化合物の製造方法
上述のように製造された改良型ニトリルヒドラターゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、上記改良型ニトリルヒドラターゼを接触させることにより、アミド化合物を生成する。そして、接触により生成されるアミド化合物を採取する。これにより、アミド化合物を製造することができる。
〔実施例1〕
改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子の取得
(1)変異遺伝子ライブラリーの構築
鋳型となるプラスミドとしては、βサブユニットのアミノ酸配列(配列番号1)のC末端のアミノ酸残基から数えて63残基上流のアミノ酸残基をアスパラギン(N)からセリン(S)に変異し、且つ、上記C末端のアミノ酸残基から数えて11残基上流のアミノ酸残基をバリン(V)からアラニン(A)に変異し、且つ、上記C末端のアミノ酸残基から数えて173残基上流のアミノ酸残基をセリン(S)からリジン(R)に変異した特開2007−143409号記載のプラスミドpER205(図1)を用いた。
鋳型プラスミド(pER205)(10ng) 1μl
10× PCR Buffer(GIBCO社製) 10μl
50mM MgCl2(GIBCO社製) 3μl
プライマーNH−19(50μM) 1μl
プライマーNH−20(50μM) 1μl
2.5mM dNTPmix 8μl
10mM dITP 2μl
10mM dBraUTP 2μl
滅菌水 71μl
Taq DNAポリメラーゼ(GIBCO社製) 1μl
<プライマー>
NH−19 GCCTCTAGATATCGCCATTCCGTTGCCGG (配列番号3)
NH−20 ACCCTGCAGGCTCGGCGCACCGGATGCCCAC (配列番号4)
<反応条件>
(94℃で30秒、65℃で30秒、72℃で3分)×30サイクル
PCR終了後、反応液5μlを0.7%アガロースゲル電気泳動に供し、2.5kbのPCR増幅産物の検出を行った。PCR産物を含む反応終了液をWizard SV Gel and PCR Clean−up System(プロメガ社)で精製し、制限酵素XbaIとSse8387Iで切断を行った。制限酵素処理済みのPCR産物を0.7%アガロースゲル電気泳動に供し、2.5 Kb付近のバンドを回収した。回収したPCR産物は、Ligation Kit(宝酒造)を用いてベクターpSJ034(XbaI−Sse8387I部位)と結合した。
この結合生成物を用いて大腸菌JM109を形質転換した。結合生成物と100μlの大腸菌JM109コンピテントセルを混ぜ4℃で30分保温し、42℃で40秒ヒートショックを行った。その後、これに0.5mlのSOC培地(2% トリプトン、0.5% 酵母エキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、20mM MgCl2、20mM MgSO4、0.2% グルコース、pH7.0)を添加し、37℃で1時間培養した。この培養液250μlをLBプレート(1% NaCl、1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、2% 寒天、50mg/L アンピシリン)にプレーティングし、37℃で1日培養した。ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む大腸菌JM109形質転換体が得られた。
(2)ロドコッカス菌形質転換体の作製
ロドコッカス・ロドクロウス ATCC 12674 株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記(1)で調製したプラスミド 1μlと菌体懸濁液10μlを混合して氷冷し、キュベットにプラスミドDNAと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置 Gene Pulser II(BIO RAD)により2.0KV、200 OHMSで電気パルス処理を行った。
電気パルス処理液の入ったキュベットを氷冷下10分間静置し、37℃で10分間ヒートショクを行った。その後、キュベットにMYK培地(0.5%ポリペプトン、0.3%バクトイーストエキス、0.3%バクトモルトエキス、0.2% K2HPO4 、0.2% KH2PO4 )500μl を加え、30℃、5時間静置した後、50μg/mlカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布した。30℃、3日間培養後のコロニーを形質転換体とした。
(3)ロドコッカス菌形質転換体のアミド処理
スクリーニングには、上記(2)で得られたニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むロドコッカス菌形質転換体、及び野生型ニトリルヒドラターゼを産生するロドコッカス菌形質転換体ATCC12674/ pER205を使用した。GGPK培地(1.5% グルコース、1% グルタミン酸ナトリウム、0.1% 酵母エキス、0.05% K2HPO4 、0.05% KH2PO4、0.05% MgSO4・7H2O、1% CoCl2、0.1% 尿素、50μg/mlカナマイシン、pH7.2)を1mlずつ入れた96穴ディープウェルプレートに上記菌株を各々接種し、30℃で3日間液体培養した。
高濃度アクリルアミド溶液に懸濁した組換え菌をインキュベーター中に置き、60℃の温度下、30分間の加熱処理で比較となる親株を完全に失活させた。残存ニトリルヒドラターゼ活性の有無は下記の活性染色法で確認した。
次に、0.1%(w/v) anthranilonitrile/50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)溶液200μlを各ウェルに添加し、室温で1時間放置した。1時間後、UVトランスイルミネーターの上にき、蛍光の発色を観察し、発色するウェルを選んだ。
上記の条件において比較例であるpER205は1時間放置後にも発色しなかった。
上記の方法でランダムに変異導入したニトリルヒドラターゼ遺伝子を有する数万個の形質転換体についてスクリーニングを行い、高濃度アクリルアミドに耐性を有する変異酵素21株を選抜した。
(4)塩基配列の確認
塩基配列の確認をするため、得られた選抜株からプラスミドを回収した。
ロドコッカス株を、10mlのMYK培地(ポリペプトン0.5%、バクトイーストエキス0.3%、マルツエキス0.3%、グルコース1%、カナマイシン 50μg/ml)に植菌した。24時間培養した後に終濃度2%となるように滅菌した20%グリシン溶液を添加し、さらに24時間培養した。
その後、遠心分離により菌体を回収し、菌体をTES(10mMTris−HCl(pH8)−10mMNaCl−1mMEDTA)緩衝液で洗浄後、2mlの50mMTris−HCl(pH8)−12.5%シュークロース−100mM NaCl−1mg/mlリゾチームに懸濁し、37℃にて3時間振盪した。これに0.4mlの10%SDSを加え室温で穏やかに1時間振盪し、さらに2.1mlの5M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)を添加し氷中で1時間静置した。その後、4℃にて10,000xg、1時間遠心し上清を得た。これに2.5倍量のエタノールを加え、−20℃で30分静置した後、10,000xg、20分間遠心した。沈澱物を10mlの70%エタノールで洗浄した後、100μlのTE緩衝液に溶解しDNA溶液を得た。
次に、ニトリルヒドラターゼを含む配列をPCR法で増幅した。
鋳型プラスミド 1μl
10× PCR Buffer(NEB社製) 10μl
プライマーNH−19(50μM) 1μl
プライマーNH−20(50μM) 1μl
2.5mM dNTPmix 8μl
滅菌水 79μl
Taq DNAポリメラーゼ(NEB社製) 1μl
<反応条件>
(94℃で30秒、65℃で30秒、72℃で3分)×30サイクル。
PCR終了後、反応液5μlを0.7%アガロースゲル電気泳動に供し、2.5kbのPCR増幅産物の検出を行った。PCR反応液はExo−SAP処理(アマシャムファルマシア)後、サイクルシークエンシング法により配列解析用サンプルを調整し、Beckman CEQ−2000XLで解析を行った。結果を表5にまとめた。
配列番号1:ロドコッカス・ロドクロウスJ1由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットの塩基配列及びアミノ酸配列
配列番号2:ロドコッカス・ロドクロウスJ1由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットの塩基配列及びアミノ酸配列
配列番号3: プライマー:NH−19
配列番号4:プライマー:NH−20
配列番号5:Rhodococcus erythropolis 871−AN042由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号6:Rhodococcus erythropolis 871−AN053由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号7:Rhodococcus erythropolis ARG−AN024由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号8:Rhodococcus erythropolis ARG−AN025由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号9:Rhodococcus rhodochrous IFO15564由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号10:Rhodococcus erythropolis 67−BEN001由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号11:Rhodococcus erythropolis ANT−AN007由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号12:Rhodococcus erythropolis 870−AN019由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号13:Rhodococcus erythropolis ENG−AN033由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号14:Rhodococcus erythropolis 122−AN065由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号15:Achromobacter xerosis IFO12668由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号16:Bacillus sp. BR499由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号17:Bacillus smithii由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号18:Pseudonocardia thermophila JCM3095由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号19:Rhodococcus sp. Cr4由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号20:Comamonas testosteroni 5−MGAM−4D由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号21:Geobacillus thermoglucosidasius Q6由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号22:Rhodococcus rhodochrous M8由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号23:ロドコッカス属N711株由来鉄型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのシステインクラスター
配列番号24:ロドコッカス・ロドクロウスJ1菌由来由来コバルト型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのシステインクラスター
Claims (7)
- 以下の(A)又は(B)のタンパク質。
(A)ロドコッカス・ロドクロウス由来の野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の下記(a)、(b)及び(c)のアミノ酸置換を含み、
(a)βサブユニットのアミノ酸配列のうち、C末端のアミノ酸残基から数えて63残基上流のアミノ酸残基のセリンへの置換
(b)上記C末端のアミノ酸残基から数えて11残基上流のアミノ酸残基のアラニンへの置換
(c)上記C末端のアミノ酸残基から数えて173残基上流のアミノ酸残基のリジンへの置換
下記(i)〜(k)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、
(i)上記C末端のアミノ酸残基から数えて116残基上流のアミノ酸残基のチロシン、グルタミン、又はフェニルアラニンへの置換
(j)上記C末端のアミノ酸残基から数えて123残基上流のアミノ酸残基のリジンへの置換
(k)上記C末端のアミノ酸残基から数えて125残基上流のアミノ酸残基のフェニルアラニン又はロイシンへの置換
且つ、野生型ニトリルヒドラターゼよりも耐熱性およびアミド化合物耐性が向上したニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
(B)(A)のタンパク質のアミノ酸配列において、前記置換後のアミノ酸残基を除き、1〜10個のアミノ酸残基が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、野生型ニトリルヒドラターゼよりも耐熱性およびアミド化合物耐性が向上したニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。 - 以下の(A)又は(B)のタンパク質。
(A)ロドコッカス・ロドクロウス由来の野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の下記(a)〜(e)のアミノ酸置換を含み、
(a)βサブユニットのアミノ酸配列のうちC末端のアミノ酸残基から数えて63残基上流のアミノ酸残基のセリンへの置換
(b)上記C末端のアミノ酸残基から数えて11残基上流のアミノ酸残基のアラニンへの置換
(c)上記C末端のアミノ酸残基から数えて173残基上流のアミノ酸残基のリジンへの置換
(d)上記C末端のアミノ酸残基から数えて116残基上流のアミノ酸残基のチロシン、グルタミン、又はフェニルアラニンへの置換
(e)上記C末端のアミノ酸残基から数えて123残基上流のアミノ酸残基のリジンへの置換
下記(f)〜(i)及び(l)〜(o)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸置換
を含み、
(f)上記C末端のアミノ酸残基から数えて12残基上流のアミノ酸残基のトレオニンへの置換
(g)上記C末端のアミノ酸残基から数えて14残基上流のアミノ酸残基のヒスチジンへの置換
(h)上記C末端のアミノ酸残基から数えて15残基上流のアミノ酸残基のグルタミンへの置換
(i)上記C末端のアミノ酸残基から数えて98残基上流のアミノ酸残基のアルギニンへの置換
(l)上記C末端のアミノ酸残基から数えて126残基上流のアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換
(m)上記C末端のアミノ酸残基から数えて130残基上流のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
(n)上記C末端のアミノ酸残基から数えて135残基上流のアミノ酸残基のヒスチジンへの置換
(o)上記C末端のアミノ酸残基から数えて215残基上流のアミノ酸残基のトリプトファンへの置換
且つ、野生型ニトリルヒドラターゼよりも耐熱性およびアミド化合物耐性が向上したニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
(B)(A)のタンパク質のアミノ酸配列において、前記置換後のアミノ酸残基を除き、1〜10個のアミノ酸残基が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、野生型ニトリルヒドラターゼよりも耐熱性およびアミド化合物耐性が向上したニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。 - 請求項1又は2記載のタンパク質をコードするDNA。
- 請求項3記載の遺伝子DNAを含む組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項5記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを含むニトリルヒドラターゼの製造方法。
- 請求項1又は2記載のタンパク質をニトリル化合物に接触させることを含むアミド化合物の製造方法。
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