KR101265508B1

KR101265508B1 - 개량형 니트릴 하이드라타제

Info

Publication number: KR101265508B1
Application number: KR1020067027118A
Authority: KR
Inventors: 후미야키 와타나베; 다이 우지하라; 미키 사카이; 후지오 유; 데쓰지 나카무라
Original assignee: 다이야니트릭스 가부시키가이샤
Priority date: 2004-05-26
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2013-05-21
Also published as: EP1767624A1; EP1767624A8; EP1767624B1; AU2005248259B2; KR20070056006A; WO2005116206A1; CN103146670B; JPWO2005116206A1; AU2005248259A1; CN102604921B; US20070231868A1; US20090162894A1; CN1961072B; US7645605B2; US7803578B2; CN1961072A; JP4922757B2; CN103146670A; CN102604921A; EP1767624A4

Abstract

본 발명은 니트릴 하이드라타제의 아미노산 서열을 변형시켜 야생형 니트릴 하이드라타제 활성과 비교하여 내열성이 향상된 개량형 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질, 당해 단백질을 암호화하는 유전자 DNA, 당해 유전자 DAN를 갖는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 갖는 형질전환체 또는 형질도입체, 당해 형질전환체 또는 형질도입체의 배양물로부터 채취된 니트릴 하이드라타제 및 이의 제조방법 및 아미드 화합물의 제조방법을 제공한다.

니트릴 하이드라타제

Description

개량형 니트릴 하이드라타제{Improved nitrile hydratase}

본 발명은 내열성이 향상되거나 또는 기질 특이성이 변화된 개량형 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질, 당해 단백질을 암호화하는 유전자 DNA, 당해 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 갖는 형질전환체 또는 형질도입체, 당해 형질전환체 또는 형질도입체의 배양물로부터 채취된 니트릴 하이드라타제 및 이의 제조방법 및 당해 배양물 또는 당해 처리물을 사용한 아미드 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

최근, 니트릴 그룹을 수화하여 아미드 그룹으로 변환하는 니트릴 수화 활성을 갖는 효소인 니트릴 하이드라타제가 발견되었고, 당해 효소 또는 당해 효소를 함유하는 미생물 균체 등을 사용하여 니트릴 화합물로부터 상응하는 아미드 화합물을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 제조방법은, 종래의 화학 합성법과 비교하여, 니트릴 화합물로부터 상응하는 아미드 화합물로의 전화율 및 선택율이 높은 것으로 공지되어 있다.

니트릴 하이드라타제를 생산하는 미생물로서는, 예를 들면, 코리네박테리 움(Corynebacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 크렙시엘라(Klebsiella)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속 등에 속하는 미생물을 들 수 있다. 이 중에서도 로도코커스·로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주는 아크릴아미드의 공업적 생산에 사용되고 있어 유용성이 입증되어 있다. 또한, 이러한 균주가 생산하는 니트릴 하이드라타제를 암호화하는 유전자도 밝혀져 있다[참조: 일본 특허공보 제3162091호]. 또한 내열성이 향상된 효소의 취득은, 반응시의 효소량의 삭감 및 비용 삭감 등의 관점에서 개발이 요망되고 있다.

한편, 자연계에 존재하는 미생물로부터 분리된 니트릴 하이드라타제 또는 이의 유전자를 이용할 뿐만 아니라, 니트릴 하이드라타제에 대하여, 활성, 기질 특이성, Vmax, Km, 열안정성, 기질에 대한 안정성, 생성물에 대한 안정성 등을 변화시킬 목적으로 니트릴 하이드라타제에 변이를 도입하는 것이 시도되고 있다[참조: 국제공개 제2004/056990호 팜플렛 및 일본 공개특허공보 제2004-222538호].

니트릴 하이드라타제는 이미 아크릴아미드의 공업적 생산에 사용되고 있는 효소이지만, 현재 사용되고 있는 효소와 비교하여, 내열성 등의 성질이 더욱 향상된 효소를 취득하는 것이, 효소 반응시의 비용을 삭감할 수 있다는 점에서 유용하다.

그래서, 본 발명의 목적은, 니트릴 하이드라타제를 더욱 개량하여, 내열성이 보다 향상된 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질, 당해 단백질을 암호화하는 유전자 DNA, 당해 유전자 DNA를 갖는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 갖는 형질전환체 또는 형질도입체, 당해 형질전환체 또는 형질도입체의 배양물로부터 채취된 니트릴 하이드라타제 및 이의 제조방법 및 당해 배양물 또는 당해 처리물을 사용한 아미드 화합물의 제조방법을 제공하는 것에 있다.

또한, 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주의 니트릴 하이드라타제는 아크릴로니트릴을 원료로 하는 아크릴아미드의 공업적 생산에 사용되고 있지만, 방향족 니트릴에 대해서는 반응성이 낮으며, 방향족 니트릴에 대한 반응성이 높은 효소가 요망되고 있는 동시에, 촉매의 비용 삭감의 관점에서, 열에 대하여 안정적이고 실활되기 어려운 효소가 요망되고 있었다. 따라서, 본 발명은 니트릴 하이드라타제를 개량하여, 내열성이 향상된 효소를 취득하고/하거나 방향족 니트릴에 대한 반응성이 향상된 효소를 취득하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구 한 결과, 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주 유래의 니트릴 하이드라타제의 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 천연 아미노산의 그룹에서 선택된 잔기로 치환함으로써, 당해 효소의 내열성이 향상되고/되거나 방향족 니트릴에 대한 반응성이 향상됨을 밝혀내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 하기와 같다.

(1) 이하의 (a), (b) 또는 (c)의 단백질.

(a) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열에 있어서, 제24번째의 페닐알라닌 잔기, 제88번째의 이소류신 잔기, 제92번째의 글루탐산 잔기, 제93번째의 글루탐산 잔기, 제96번째의 히스티딘 잔기, 제103번째의 글루탐산 잔기, 제167번째의 아스파라긴 잔기 및 제225번째의 서열번호 4의 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질,

(b) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열중 제167번째의 아스파라긴 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질 또는

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 단백질의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질.

(2) 하기 (a) 또는 (b)의 단백질.

(a) 야생형 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트의 아미노산 서열에 있어서, 제42번째의 아스파라긴 잔기, 제80번째의 알라닌 잔기, 제118번째의 알라닌 잔기 및 제132번째의 아스파라긴산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질 또는

(b) 상기 (a)의 단백질의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질.

(3) 하기 (a), (b) 또는 (c)의 단백질.

(a) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열중 제167번째의 아스파라긴 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열에 있어서, 제144번째의 류신 잔기 또는 제219번째의 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질,

(b) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열중 제167번째의 아스파라긴 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열, 및 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열에 있어서 제129번째의 발린 잔기 또는 제196번째의 류신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질 또는

(4) 하기 (a) 또는 (b)의 단백질.

(a) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열에 있어서 제26번째의 히스티딘 잔기 및 제48번째의 트립토판 잔기중 적어도 한쪽의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질 또는

(5) 상기 항목 (4)에 있어서, 제26번째의 히스티딘 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 단백질.

(6) 상기 항목 (4)에 있어서, 제48번째의 트립토판 잔기가, 아르기닌, 발린 및 류신으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기로 치환된 단백질.

(7) 상기 항목 (1) 내지 (6) 중의 어느 한 항에 따르는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.

(8) 하기 (a), (b) 또는 (c)의 유전자 DNA.

(a) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열에 있어서, 제70 내지 72번째, 제262 내지 264번째, 제274 내지 276번째, 제277 내지 279번째, 제286 내지 288번째, 제307 내지 309번째, 제499 내지 501번째 및 제673 내지 675번째의 염기중 하나 이상의 염기가 기타 다른 염기로 치환된 염기 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA,

(b) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열중 제499 내지 501번째의 하나 이상의 염기가 기타 다른 염기로 치환된 염기 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA 또는

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 유전자 DNA의 염기 서열에 상보적인 염기 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.

(9) 하기 (a) 또는 (b)의 유전자 DNA.

(a) 야생형 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열에 있어서, 제124 내지 126번째, 제238 내지 240번째, 제352 내지 354번째 및 제394 내지 396번째의 염기중 하나 이상의 염기가 기타 다른 염기로 치환된 염기 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA 또는

(b) 상기 (a)가 유전자 DNA의 염기 서열에 상보적인 염기 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.

(10) 하기 (a), (b) 또는 (c)의 유전자 DNA.

(a) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열중 제499 내지 501의 염기중 하나 이상의 염기가 기타 다른 염기로 치환된 염기 서열에 있어서, 제430 내지 432번째 및 제655 내지 657번째의 염기중 하나 이상의 염기가 기타 다른 염기로 치환된 염기 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA,

(b) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열중 제499 내지 501번째의 염기 및 야생형 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열중 제385 내지 387번째 및 제586 내지 588번째의 염기중 하나 이상의 염기가 기타 다른 염기로 치환된 염기 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA 또는

(c) 상기 (a) 또는 (b)가 유전자 DNA의 염기 서열에 상보적인 염기 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.

(11) 하기 (a) 또는 (b)의 유전자 DNA.

(a) 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열에 있어서 제76 내지 78번째 및 제142 내지 144번째의 염기중 하나 이상의 염기가 기타 다른 염기로 치환된 염기 서열을 포함하며, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA 또는

(b) 상기 (a)의 유전자 DNA의 염기 서열에 상보적인 염기 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.

(12) 상기 항목 (11)에 있어서, 제77번째의 염기 A가 G로 치환된 유전자 DNA.

(13) 상기 항목 (11)에 있어서, 제142번째의 염기 T가 C로 치환된 유전자 DNA.

(14) 상기 항목 (7) 내지 (13) 중의 어느 한 항에 따르는 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터.

(15) 상기 항목 (14)에 따르는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 또는 형질도입체.

(16) 상기 항목 (15)에 따르는 형질전환체 또는 형질도입체를 배양하여 수득되는 배양물로부터 채취된 니트릴 하이드라타제.

(17) 상기 항목 (15)에 따르는 형질전환체 또는 형질도입체를 배양하여 수득되는 배양물로부터 니트릴 하이드라타제를 채취함을 특징으로 하는 니트릴 하이드라타제의 제조방법.

(18) 상기 항목 (15)에 따르는 형질전환체를 배양하여 수득되는 배양물 또는 당해 처리물을 니트릴 화합물에 접촉시키고, 당해 접촉에 의해 생성되는 아미드 화합물을 채취함을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조방법.

본 발명에 의해 야생형 니트릴 하이드라타제보다 내열성이 향상되고/되거나 방향족 니트릴에 대한 반응성이 향상된 변이형 니트릴 하이드라타제 및 당해 효소를 암호화하는 유전자가 제공된다. 또한, 상기 변이형 니트릴 하이드라타제 유전자를 포함하는 재조합 DNA, 당해 재조합 DNA를 포함하는 형질전환(도입)체, 당해 형질전환(도입)체를 사용한 아미드 화합물의 제조법이 제공된다.

본 발명에 의해, 효율적으로 아크릴아미드를 제조하는 것이 가능해진다.

도 1은 플라스미드 pJH601의 구성도이다.

도 2는 플라스미드 p3R의 구성도이다.

도 3은 플라스미드 pMH301의 구성도이다.

도 4는 플라스미드 p52의 구성도이다.

도 5A는 플라스미드 pCF002의 구축도이다.

도 5B는 플라스미드 pFY529의 구축도이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하에, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 명세서에 있어서 인용된 문헌, 공개공보, 국제공개공보 그 밖의 특허 공보는 본 명세서에 참조로서 도입하였다.

<니트릴 하이드라타제>

본 발명은 야생형 니트릴 하이드라타제의 아미노산 서열의 일부를 변이시킴으로써, 야생형 니트릴 하이드라타제보다도 내열성 및/또는 기질 특이성이 향상된 개량형 니트릴 하이드라타제를 제공하는 것이다.

「니트릴 하이드라타제」란, 니트릴 화합물을 상응하는 아미드 화합물로 변환하는 수화 반응(RCN+H₂O→RCONH₂)을 촉매하는 효소이다. 또한, 「니트릴 하이드라타제」의 구조는, α서브유니트 및 β서브유니트로 이루어진 고차 구조를 갖는다. 「야생형 니트릴 하이드라타제」란, 이의 효소원이 되는 미생물의 야생주(친주) 유래의 아미노산 서열을 갖는 니트릴 하이드라타제 및 야생주(친주) 유래의 유전자 서열에 의해 암호화된 니트릴 하이드라타제를 말한다. 「야생형 β서브유니트」또는「야생형 α서브유니트」이란, 야생주(친주) 유래의 아미노산 서열을 갖는 β서브유니트 또는 α서브유니트 및 야생주(친주) 유래의 유전자 서열에 의해 암호화된 β서브유니트 또는 α서브유니트를 말한다.

「야생형 니트릴 하이드라타제」는, 각종 미생물의 야생형 유래의 니트릴 하이드라타제를 들 수 있다. 미생물은 니트릴 하이드라타제를 암호화하는 유전자를 갖는 미생물인 한 특별히 한정되는 것이 아니다. 바람직하게는, 로도코커스속에 속하는 미생물, 예를 들면 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1(FERM BP-1478), 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M8(SU1731814), 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M33(VKM Ac-1515D), 또는 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2001-292772호] 등으로부터 유래하는 아미노산 서열을 갖는 니트릴 하이드라타제, 및 이의 유전자 서열에 의해 암호화된 니트릴 하이드라타제를 들 수 있다. 또는, 바실러스 스미시(Bacillus smithii)[참조: 일본 공개특허공보 제(평)09-248188호] 유래의 니트릴 하이드라타제라도 양호하다. 특히 바람직하게는, 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1 또는 로크코커스·로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M8에 유래하는 아미노산 서열을 갖는 니트릴 하이드라타제 및 이의 유전자 서열에 의해 암호화된 니트릴 하이드라타제를 들 수 있다. 또한, 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M33(VKM Ac-1515D)균은, M8(SU1731814)균으로부터 천연돌연변이에 의해서 항상성 니트릴 하이드라타제를 발현하는 주로서 선별된 균주이다. 이러한 니트릴 하이드라타제 자체의 아미노산 서열 및 유전자 서열에 변이는 없다[참조: 미국특허 제 5,827,699호].

여기에서 내열성의 향상이란, 가열 처리한 변이주 유래 효소의 잔존 활성이, 동일한 처리를 실시한 친주 유래 효소의 잔존 활성보다 10% 이상 높은 것을 의미한다. 「잔존 활성」이란, 가열 처리한 균체를 사용하여 활성 측정한 아미드 화합물의 생성량과, 동량의 무처리 균체를 사용하여 활성 측정한 아미드 화합물의 생성량의 비를 나타낸다. 가열 처리 방법으로서는, 배양액, 또는 집균 세정한 배양 균체를 용기에 넣고, 이를 수욕조(water bath) 또는 배양기 등의 가열 장치에 넣고 일정 시간 보온하면 양호하다. 이 때, 효소의 안정성을 높이기 위한 니트릴 화합물이나 아미드 화합물을 첨가하여 가열 처리를 실시하더라도 양호하다. 가열 처리의 조건으로서는 처리 온도와 처리 시간을 적절하게 검토하여, 친주의 활성이 50% 이하로 저하되는 조건을 설정하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 50 내지 70℃의 범위에서 5 내지 30분 동안 가열 처리를 실시한다. 무처리의 균체는 배양액, 또는 집균 세정한 배양 균체를 4℃에서 냉장 보관한 것을 사용한다. 활성 측정은 가열 처리 또는 무처리의 균체를 사용하여, 기질인 니트릴 화합물을 당해 균체와 접촉시켜 상응하는 아미드 화합물로 변환시킴으로써 당해 아미드 화합물을 정량하는 것이다. 기질로서는 니트릴 하이드라타제가 반응하면 어떠한 니트릴 화합물이라도 사용할 수 있지만, 아크릴로니트릴이 바람직하다. 반응 조건으로서는, 예를 들면 기질 농도는 2.5%, 반응 온도는 10 내지 30℃, 반응 시간은 10 내지 30분의 범위에서 실시한다. 효소 반응은 인산을 첨가하여 정지시키고, HPLC, 또는 가스 크로마토그래피에 의해서 생성된 아크릴아미드를 분석한다.

본 발명의 개량형 니트릴 하이드라타제는, 예를 들면, 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주 유래의 니트릴 하이드라타제의 아미노산 서열을 변형시켜, 친주의 니트릴 하이드라타제 활성과 비교하여 내열성이 향상된 개량형 니트릴 하이드라타제를 선택함으로써 수득된다. 이의 변형 방법으로서는, J1균에 하이드록실아민이나 아질산 등의 변이원이 되는 약제를 접촉 작용시키는 방법, 자외선 조사에 의해 변이를 유발하는 방법, J1균 유래의 니트릴 하이드라타제를 암호화하는 유전자(이하, 니트릴 하이드라타제 유전자)에 PCR를 사용하여 무작위로 변이를 도입하는 방법 등을 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열(예를 들면 서열번호 2)중, 제167번째의 아스파라긴이 세린으로 치환된 개량형 니트릴 하이드라타제를 밝혀냈다. 본 발명에서는 이러한 개량형 니트릴 하이드라타제 외에, 더욱 내열성이 향상된 개량형 니트릴 하이드라타제를 선택하였다. 이의 선택 방법은, 상기「내열성」의 정의에 해당하는 변이체(변이 유전자)를 선별함으로써 실시하였다.

이와 같이 하여 수득된 효소로서는, 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열(예를 들면 서열번호 2)에 있어서, 제24번째의 페닐알라닌 잔기, 제88번째의 이소류신 잔기, 제92번째의 글루탐산 잔기, 제93번째의 글루탐산 잔기, 제96번째의 히스티딘 잔기, 제103번째의 글루탐산 잔기, 제167번째의 아스파라긴 잔기, 및 제225번째의 서열번호 4의 잔기중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

또한, 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트의 아미노산 서열(예를 들면 서열번호 4)에 있어서, 제42번째의 아스파라긴 잔기, 제80번째의 알라닌 잔기, 제118번째의 알라닌 잔기 및 제132번째의 아스파라긴산 잔기중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

또한, 본 발명은 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트(서열번호 2)중 제167번째의 아스파라긴 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열에 있어서, β서브유니트의 아미노산 서열의 제144번째의 류신 잔기, 제219번째의 발린 잔기, 및 α서브유니트의 아미노산 서열(서열번호 4)의 제129번째의 발린 잔기 및 제196번째의 류신 잔기중 하나 이상의 아미노산 잔기가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 가지며, 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질이다.

상술한 복합 변이체를 제조하는 수단은 어떠한 방법이라도 양호하며, 예를 들면, 합성 일본쇄 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위 특이적인 치환을 발생시키는 방법, 복수의 상이한 단일 변이 개소를 포함하는 DNA 단편을 제한 효소로 절단하여 연결시키는 방법에 의해 제조할 수 있다.

내열성을 손상시키지 않는 한, 상기의 변이 외에, 1 또는 복수개(예를 들면 1개 또는 수개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가되어 있어도 상관없다. 예를 들면, 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열(예를 들면 서열번호 2) 또는 야생형 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트의 아미노산 서열(예를 들면 서열번호 4)의 1 내지 2개 또는 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자(예를 들면 서열번호 3) 또는 야생형 니트릴 하이드라타제 의 α서브유니트를 암호화하는 유전자(예를 들면 서열번호 3)에 나타낸 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 1 내지 2개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환하더라도 양호하다.

다음에, 바람직한 아미노산 변이의 형태를 나타낸다. 본 발명에 있어서는, 편의상, 아미노산의 1문자 표기와 α또는 β서브유니트의 아미노산 서열의 아미노산번호를 사용하여 변이의 형태를 설명할 수 있다. 예를 들면, Fβ24L이라는 표기는, 「β서브유니트(예를 들면 서열번호 2)의 아미노산 서열중 제24번째의 아미노산이 페닐알라닌으로부터 류신으로 치환된 변이」를 의미한다. 또한, Nβ167S라는 표기는, 「β서브유니트(예를 들면 서열번호 2)의 아미노산 서열중 제167번째의 아미노산이 아스파라긴으로부터 세린으로 치환된 변이」를 의미한다.

<변이와 치환의 형태(1)>

이 형태는, 니트릴 하이드라타제의 α또는 β서브유니트의 아미노산 잔기를 1개 이상 변이시키는 것이다.

단일 변이

복합 변이

상기의 아미노산 치환을 발생시킬 때의 염기 치환은 이하와 같다. 또한, β서브유니트, α서브유니트를 암호화하는 유전자 DNA는, 각각 서열번호 1, 서열번호 3에 나타낸 것을 예로서 설명한다.

단일 변이 1: 서열번호 1에 있어서, 70 내지 72번째의 염기 서열「TTC」을 CTT, CTC, CTA 또는 CTG이 되도록 염기를 치환시킨다. 특히, 70번째의 T를 C로 치환하는 것(TTC→CTC)이 바람직하다.

단일 변이 2: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 262 내지 264번째의 염기 서열「ATC」을, TTT 또는 TTC로 치환시킨다. 특히, 262번째의 A를 T로 치환시키는 것(ATC→TTC)이 바람직하다.

단일 변이 3: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 274 내지 276번째의 염기 서열「GAA」을, AAA 또는 AAG로 치환시킨다. 특히, 274번째의 G를 A로 치환시키는 것(GAA→AAA)이 바람직하다.

단일 변이 4: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 277 내지 279번째의 염기 서열「GAG」을, GGG, GGC, GGA 또는 GGT로 치환시킨다. 특히, 278번째의 A를 G로 치환시키는 것(GAG→GGG)이 바람직하다.

단일 변이 5: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 286 내지 288번째의 염기 서열 「CAC」을, CGC, CGG, CGA 또는 CGT로 치환시킨다. 특히, 287번째의 A를 G로 치환시키는 것(CAC→CGC)이 바람직하다.

단일 변이 6: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 307 내지 309번째의 염기 서열「GAG」을 GAC 또는 GAT로 치환시킨다. 특히, 309번째의 G를 T로 치환시키는 것(GAG→GAT)이 바람직하다.

단일 변이 7: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 499 내지 501번째의 염기 서열「AAC」을, AGC 또는 AGT로 치환시킨다. 특히, 500번째의 A를 G로 치환시키는 것(AAC→AGC)이 바람직하다.

단일 변이 8: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 673 내지 675번째의 염기 서열「TAC」을, CAC 또는 CAT로 치환시킨다. 특히, 673번째의 T를 C로 치환시키는 것(TAC→CAC)이 바람직하다.

단일 변이 9: 서열번호 3에 나타낸 염기 서열에 있어서 124 내지 126번째의 염기 서열 「AAC」를, GAC 또는 GAT로 치환시킨다. 특히, 124번째의 A를 G로 치환시키는 것(AAC→GAC)이 바람직하다.

단일 변이 10: 서열번호 3에 나타낸 염기 서열에 있어서 238 내지 240번째의 염기 서열「GCC」을, ACC, ACG, ACA 또는 ACT로 치환시킨다. 특히, 238번째의 G를 A로 치환시키는 것(GCC→ACC)이 바람직하다.

단일 변이 11: 서열번호 3에 나타낸 염기 서열에 있어서 352 내지 354번째의 염기 서열「GCC」을, GTC, GTG, GTA 또는 GTT로 치환시킨다. 특히, 353번째의 C를 T로 치환시키는 것(GCC→GTC)이 바람직하다.

단일 변이 12: 서열번호 3에 나타낸 염기 서열에 있어서 394 내지 396번째의 염기 서열「GAC」을, AAC 또는 AAT로 치환시킨다. 특히, 394번째의 G를 A로 치환시키는 것(GAC→AAC)이 바람직하다.

복합 변이 1 내지 4의 염기 서열의 치환은 단일 변이의 치환과 동일하다.

<변이와 치환의 형태(2)>

이러한 형태는, 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산을 적어도 2개 변이시키거나 또는 β서브유니트의 아미노산을 1개 이상, 또한, α서브유니트의 아미노산을 1개 이상 변이시키는 형태이다.

상기의 아미노산 치환을 발생시킬 때의 염기 치환은 이하와 같다.

Nβ167S: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 499 내지 501번째의 염기 서열하여「AAC」를, AGC 또는 AGT로 치환시킨다. 특히, 500번째의 A를 G로 치환시키는 것(AAC→AGC)이 바람직하다.

Lβ144H: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 430 내지 432번째의 염기 서열「CTC」을, CAC 또는 CAT로 치환시킨다. 특히, 431번째의 T를 A로 치환시키는 것(CTC→CAC)이 바람직하다.

Vβ219A: 서열번호 1에 나타낸 염기 서열에 있어서 655 내지 657번째의 염기 서열「GTC」을, GCT, GCC, GCA 또는 GCG로 치환시킨다. 특히, 656번째의 T를 C로 치환시키는 것(GTC→GCC)이 바람직하다.

Vα129A: 서열번호 3에 나타낸 염기 서열에 있어서 385 내지 387번째의 염기 서열「GTG」을, GCT, GCC, GCA 또는 GCG로 치환시킨다. 특히, 386번째의 T를 C로 치환시키는 것(GTG→GCG)이 바람직하다.

Lα196P: 서열번호 3에 나타낸 염기 서열에 있어서 586 내지 588번째의 염기 서열「CTC」을, CCT, CCC, CCA 또는 CCG로 치환시킨다. 특히, 587번째의 T를 C로 치환시키는 것(CTC→CCC)이 바람직하다.

<변이와 치환의 형태(3)>

이러한 형태는, 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열중 적어도 제26번째 또는 제48번째의 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환하는 형태이다.

즉, 본 발명은, 방향족 니트릴에 대한 반응성이 향상되고/되거나 내열성이 향상된 니트릴 하이드라타제를 제공하는 것이다. 「니트릴 하이드라타제」란, 니트릴 화합물을 상응하는 아미드 화합물로 변환하는 수화 반응(RCN+2H₂O→RCONH₂)을 촉매하는 효소이다.

여기에서,「방향족 니트릴에 대한 반응성이 향상된 니트릴 하이드라타제」란, 3-시아노피리딘에 대한 비활성이 1.5배 이상 향상된 것을 의미한다.

이러한 선택 방법은, 상기「변이」의 정의에 해당하는 변이체(변이 유전자)를 선별한다.

상기의 수법에 의해 수득된 방향족 니트릴에 대한 반응성이 향상된 효소로서는, 서열번호 2(β서브유니트)의 아미노산 서열에 있어서, 제48번째의 트립토판 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

또한, 내열성이 향상된 효소로서는, 서열번호 2(β서브유니트)의 아미노산 서열에 있어서, 제26번째의 히스티딘 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열(야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유 니트의 아미노산 서열)의 제48번째의 트립토판이 아르기닌으로 치환된 경우, 니트릴 하이드라타제의 내열성이 향상된 효과 외에, 아크릴로니트릴(단쇄 지방족 니트릴)에 대한 기질 특이성에 있어서, 3-시아노피리딘(방향족 니트릴)에 대한 반응성이 향상된다.

다음에, 바람직한 아미노산 변이의 형태를 나타낸다. 예를 들면, Wβ48R라는 표기는, 「β서브유니트(서열번호 1)의 48번째의 아미노산 잔기가 트립토판으로부터 아르기닌으로 치환된 변이」를 의미한다.

(1) 방향족 니트릴에 대한 반응성 향상 변이

Wβ48R

(2) 내열성의 향상 변이

Hβ26R

(3) 복합 변이

Wβ48R, Hβ26R

Wβ48R: 서열번호 1에 있어서, 142 내지 144번째의 염기 서열「TGG」을 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 또는 AGG이 되도록 염기를 치환시킨다. 특히, 142번째의 T를 C로 치환하는 것(TGG→CGG)이 바람직하다.

Hβ26R: 서열번호 1에 있어서, 76 내지 78번째의 염기 서열「CAC」을 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 또는 AGG이 되도록 염기를 치환시킨다. 특히, 77번째의 A를 G로 치환하는 것(CAC→CGC)이 바람직하다.

<복합 변이>

또한, 상기「변이와 치환의 형태」의 (1) 내지 (3)항에 기재한 변이의 복수를 조합하여 복합 변이체로 함으로써, 양 성질을 구비한 변이 효소를 제조할 수도 있다.

복합 변이체를 제조하는 수단은 어떠한 방법이라도 양호하며, 예를 들면, 합성 일본쇄 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위 특이적인 치환을 발생시키는 방법, 복수의 상이한 단일 변이 개소를 포함하는 DNA 단편을 제한 효소로 절단하여 연결시키는 방법에 의해 제조할 수 있다.

변이의 성질을 손상시키지 않는 한, 상기의 변이 외에, 아미노산 서열의 결실, 치환, 부가 등이 일어나도 상관없다. 예를 들면, 상기 변이가 실시된 형태의 아미노산 서열의 1개 또는 수개, 예를 들면 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기가 결실되어도 양호하며, 상기 변이가 이루어진 형태의 아미노산 서열에 1개 또는 수개, 예를 들면 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기가 부가되어도 양호하며, 또는 상기 변이가 이루어진 형태의 아미노산 서열의 1개 또는 수개, 예를 들면 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이 다른 아미노산 잔기로 치환하더라도 양호하다.

<변이 도입법>

상기의 단일 변이 또는 복합 변이가 도입된 니트릴 하이드라타제 유전자의 제조는, Kunkel법이나 Gapped duplex법 등의 공지 수법에 의해, 예를 들면 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들면 퀵 체인지(Quik Change) XL 부위 특이적 돌연변이유발 키트[참조: Stratagene사 제조], GeneTailor^T부위 특이적 돌연변이유발 시스템[참조: 인비트로젠사 제조], TaKaRa 부위 특이적 돌연변이유발 시스템(Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등: 타카라바이오사 제조)를 사용하여 실시할 수 있다〔Nucleic. Acid. Res. 10, 6487(1982), Molecular Cloning 2nd Edt, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)〕.

J1균 이외의 니트릴 하이드라타제에 있어서도 상술한 변이의 위치, 변이하는 아미노산종, DNA 서열에 의해서 내열성이 향상된다고 생각된다. 이와 같은 균으로서는, 전술의 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M8(SU1731814), 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M33(VKM Ac-1515D), 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2001-292772호], 바실러스 스미시(Bacillus smithii)[참조: 일본 공개특허공보 제(평)09-248188호] 등이 예시된다.

또한, 상기 서열번호 1 또는 3에 나타낸 염기 서열에 변이를 도입한 형태의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 DNA와, 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 DNA도 본 발명의 유전자 DNA에 포함된다. 엄격한 조건이란, 예를 들면, 염(나트륨) 농도가 150 내지 900mM이고, 온도가 55 내지 75℃, 바람직하게는 염(나트륨) 농도가 250 내지 450mM이고, 온도가 68℃에서의 조건을 말한다.

<아미드 화합물 내성>

본 발명의 개량형 니트릴 하이드라타제는, 또한 아미드 화합물 내성으로서의 성질을 갖는다. 여기에서, 「아미드 화합물 내성」이란, 다른 야생주 유래의 니트릴 하이드라타제와 비교하여, 아미드 화합물 존재하에서 니트릴 하이드라타제 활성을 유지할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 변이형 니트릴 하이드라타제가 내성인 아미드 화합물로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 이하의 화학식의 아미드 화합물을 들 수 있다:

R-CONH₂

(상기 화학식에서,

R는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 알케닐 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 아릴기 또는 치환되거나 치환되지 않은 포화 또는 불포화 헤테로사이클릭 그룹이다. 특히, R이 CH₂=CH인 아크릴아미드가 바람직하다)

아미드 화합물 내성은, 예를 들면, 본 발명의 개량형 니트릴 하이드라타제를 갖는 형질전환체의 배양물 또는 형질전환체로부터 분리한 니트릴 하이드라타제를, 아크릴아미드 등의 아미드 화합물(예를 들면, 30 내지 50% 등의 고농도) 존재하에서, 기질인 아크릴로니트릴 등의 니트릴 화합물의 소비량 또는 소비 속도를 분석함으로써 평가할 수 있다. 그리고, 친주 유래의 니트릴 하이드라타제와 비교하여, 예를 들면, 소비량 또는 소비 속도가 1.1배를 초과한 경우에, 아미드 화합물 내성이라고 평가할 수 있다.

<재조합 벡터 및 형질전환(도입)체의 제조>

상술한 니트릴 하이드라타제 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환(도입)체의 제조방법에 관해서 설명한다.

니트릴 하이드라타제 유전자는, 형질전환 또는 형질 도입되는 숙주 생물에 있어서, 발현 가능하도록 벡터에 도입하는 것이 필요하다.

예를 들면, 벡터로서는 플라스미드 DNA, 박테리오퍼지 DNA, 레트로트랜스포존 DNA, 인공 염색체 DNA 등을 들 수 있다.

숙주로서는, 예를 들면, 대장균, 고초균 등의 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 사용할 수 있다.

대장균을 숙주로 하는 경우, 발현 효율이 높은 발현 벡터, 예를 들면 trc 프로모터를 갖는 발현 벡터 pKK233-2[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조], 또는 pTrc99A[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조] 등을 사용하는 것이 바람직하다.

벡터에는, 니트릴 하이드라타제 유전자 이외에, 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선별 마커, 리보솜 결합 서열(SD 서열) 등을 연결할 수 있다. 또한, 선별 마커로서는, 예를 들면 카나마이신 내성 유전자, 디하이드로엽산 환원 효소 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.

이하, 숙주의 종류 및 숙주로의 재조합 벡터 도입 방법에 관해서 설명한다.

세균을 숙주로 하는 경우, 대장균으로서는, 예를 들면 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 등을 들 수 있고, 로도코커스(Rhodococcus)균으로서는, 예를 들면 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC12674, 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC17895, 로도코커스. 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC19140 등을 들 수 있다. 이러한 ATCC주는 아메리칸타입컬쳐 콜렉션으로부터 입수할 수 있다.

세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 세균에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 칼슘 이온을 사용하는 방법, 전기천공법 등을 들 수 있다.

효모를 숙주로 하는 경우는, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 등이 사용된다. 효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 전기천공법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로 하는 경우는, 원숭이 세포 COS-7, Vero, CHO 세포, 마우스 L세포, 래트 GH3, 사람 FL 세포 등이 사용된다. 동물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면 전기천공법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등을 들 수 있다.

곤충 세포를 숙주로 하는 경우는, Sf9 세포, Sf21 세포 등이 사용된다. 곤충 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면 인산칼슘법, 리포펙션법, 전기천공법 등이 사용된다.

식물 세포를 숙주로 하는 경우는, 담배 BY-2 세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다. 식물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면 아그로박테리움법, 입자충격법, PEG법, 전기천공법 등이 사용된다.

<니트릴 하이드라타제의 제조>

다음에 니트릴 하이드라타제 및 이의 제조방법에 관해서 설명한다.

본 발명의 니트릴 하이드라타제는, 상기 방법으로 제조된 니트릴 하이드라타제 유전자를 포함하는 형질전환(도입)체를 배양하고, 이의 배양물로부터 채취함으로써 수득할 수 있다.

여기에서, 「배양물」이란, 배양 상청, 배양 세포 또는 배양 균체, 또는 세포 또는 균체의 파쇄물 중 어느 하나를 의미하는 것이다.

본 발명의 형질전환(도입)체를 배양하는 방법은, 이하에 예시한 숙주의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라서 이루어진다.

대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지는, 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하며, 형질전환체의 배양을 효율적으로 할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 사용해도 양호하다. 탄소원으로서는, 글루코스, 프락토스, 수크로스, 전 분 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류를 들 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염 또는 그 밖의 질소 함유 화합물 이외에, 펩톤, 고기 추출액, 옥수수 전분 등을 들 수 있다. 무기물로서는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 배양은, 통상적으로 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하, 30 내지 40℃에서 실시한다. pH의 조정은, 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 사용하여 실시한다. 배양 중에는 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 양호하다.

또한, 배지에는 니트릴 하이드라타제의 보결 금속인 코발트 이온이나 철 이온을 첨가하여, 효소의 유도제가 되는 니트릴류나 아미드류를 첨가해도 양호하다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 필요에 따라 유도인자를 배지에 첨가해도 양호하다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)로 유도 가능한 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 IPTG 등을 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 인돌아세트산(IAA)으로 유도 가능한 trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 IAA 등을 배지에 첨가할 수 있다.

동물 세포를 숙주로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지, DMEM 배지 또는 이러한 배지에 소태아 혈청 등 을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은, 통상적으로 5% CO₂ 존재하, 37℃에서 1 내지 30일 동안 실시한다. 배양중에는 필요에 따라 카나마이신 , 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가하더라도 양호하다.

배양물로부터의 니트릴 하이드라타제의 채취 방법은, 초음파 처리, 동결 해동의 반복, 파쇄 처리 등을 실시하여 균체 또는 세포를 파괴함으로써 목적의 단백질을 채취한다.

형질전환체가 식물 세포 또는 식물 조직인 경우는, 배양은, 통상의 식물 배양용 배지, 예를 들면 MS 기본 배지, LS 기본 배지 등을 사용함으로써 실시할 수 있다. 배양 방법은 통상의 고체 배양법, 액체 배양법 중 어느 것도 채용할 수 있다.

배양물로부터의 니트릴 하이드라타제의 채취 방법은, 우선, 셀룰라제, 펙티나제 등의 효소를 사용한 세포 용해 처리, 초음파 파쇄 처리, 마쇄 처리 등에 의해 세포를 파괴한다. 이어서, 여과 또는 원심분리 등을 사용하여 불용물을 제거하고, 조(粗)단백질 용액을 수득한다. 상기 조용액으로부터 본 발명의 단백질을 정제하기 위해서는, 염석, 각종 크로마토그래피(예를 들면 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등), SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동 등을 단독으로 적절하게 조합하여 실시한다.

또한, 본 발명의 단백질이 균체외 또는 세포외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 단백질의 분리 정제에 사용되는 일반적인 생화학적 방법, 예를 들면 황산암모늄 침 전, 겔 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 사용함으로써, 상기 배양물 중에서 본 발명의 단백질을 분리 정제할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 본 발명의 변이형 니트릴 하이드라타제를 암호화하는 유전자 DNA 또는 상기 벡터로부터, 생세포를 전혀 사용하지 않는 무세포 단백질 합성계를 채용하여, 목적의 단백질을 채취하는 것도 가능하다.

무세포 단백질 합성계란, 세포 추출액을 사용하여 시험관 등의 인공 용기내에서 단백질을 합성하는 시스템이고, 예를 들면 mRNA의 정보를 해독하여 리보솜상에서 단백질을 합성하는 것이다. 또한, 본 발명에 있어서 사용되는 무세포 단백질 합성계에는, DNA를 주형으로 하여 RNA를 합성하는 무세포 전사계도 포함된다.

상기 세포 추출액은, 진핵 세포 유래 또는 원핵 세포 유래의 추출액, 예를 들면, 소맥 배아, 토끼 망상 적혈구, 마우스 L-세포, HeLa 세포, CHO 세포, 출아 효모, 대장균 등의 추출액을 사용할 수 있다. 또한, 이러한 세포 추출액은 농축되거나 농축되지 않은 것이라도 양호하다.

여기에서, DNA상에 암호화된 유전자 정보는, 전사에 의해 mRNA가 되고, 다시 해독되어 단백질로 변환된다. 인공 용기 내에서 이러한 해독 과정을 재현하여 단백질을 합성하기 위해서는, 리보솜, tRNA, 각종 단백질 인자 등, 해독 인자군을 안정화하여, 목적에 따라 mRNA를 생산하는 시스템을 구축하는 것이 필요하다. 세포 추출액은, 예를 들면 한외여과, 투석, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전 등에 의해서 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 무세포 단백질 합성은, 시판 중인 키트를 사용하여 실시할 수도 있다. 이와 같은 키트로서는, 예를 들면 시약 키트 PROTEIOS^TM[참조: 토요보사 제조], TNT^TM System[참조: 프로메가 제조], 합성 장치의 PG-Mate^TM[참조: 토요보사 제조], RTS[참조: 로슈 다이아그노스틱스 제조] 등을 들 수 있다.

무세포 단백질 합성에 의해서 수득되는 변이형 니트릴 하이드라타제는, 적절한 크로마토그래피를 선택하여 정제할 수 있다. 또한, 변이형 니트릴 하이드라타제가 분리 정제된 것의 확인은, SDS PAGE 등에 의해, 활성의 측정은 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물로의 변환율을 측정하는 것 등에 의해 실시할 수 있다.

<아미드 화합물의 제조>

다음에, 형질전환(도입)체를 이용한 아미드 화합물의 제조방법에 관해서 설명한다.

상기의 배양법으로 수득된 배양물, 효소 등은, 니트릴 화합물을 상응하는 아미드 화합물로 변환할 때의 생체 촉매로서 사용된다. 변환 반응의 기질로서 사용하는 니트릴 화합물로서는, 생체 촉매의 기질 특이성에 의해 적절하게 선택된다. 예를 들면, 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주 유래의 니트릴 하이드라타제인 경우, 적합한 기질은 아크릴로니트릴이다.

생체 촉매의 사용 형태, 반응 양식은, 생체 촉매의 종류 등에 따라 적절하게 선택된다. 예를 들면, 생체 촉매의 사용 형태로서는, 상기의 배양물, 정제 효소를 그대로 사용해도 양호하며, 이들을 적당한 담체에 유지하여 고정화 효소로서 사용할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주는, FERM BP-1478로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오 다이 6)에 기탁되어 있다(원기탁일: 1987년 9월 18일).

[실시예 1] 개량형 니트릴 하이드라타제 유전자의 취득(I)

(1) 염색체 DNA의 제조

로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주를 100ml의 MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 박토이스트 추출액, 0.3% 박토몰 추출액, 1% 글루코스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄, pH 7.0)중, 30℃에서 72시간 동안 진탕 배양하였다.

배양후 집균하고, 집균된 균체를 식염수-EDTA 용액(0.1M EDTA, 0.15M NaCl(pH 8.0)) 4ml에 현탁하였다. 현탁액에 리소자임 8mg를 가하고 37℃에서 1 내지 2시간 동안 진탕한 후, -20℃에서 동결하였다.

다음에, 10ml의 Tris-SDS액(1% SDS, 0.1M NaCl, 0.1M Tris-HCl(pH 9.0))를 완만하게 진탕하면서 가하고, 또한 프로테아제 K[참조: 멜크사 제조](종농도 0.1mg)를 가하여 37℃에서 1시간 동안 진탕하였다.

다음에, 등량의 TE 포화페놀을 가하고 교반후(TE: 1OmM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH 8.0)) 원심하여, 상층을 취하여 2배량의 에탄올을 가한 후 유리 막대로 DNA를 권취하여 90%, 80%, 70%의 에탄올로 순차적으로 페놀을 제거하였다.

다음에, DNA를 3ml의 TE 완충액에 용해시키고, 리보뉴클레아제 A 용액(100℃, 15분간의 가열 처리 완료)를 10㎍/ml이 되도록 가하여 37℃에서 30분간 진탕하였다. 또한, 프로테아제 K를 가하고 37℃에서 30분간 진탕한 후, 등량의 TE 포화페놀을 가하여 원심하고, 상층과 하층으로 분리시켰다.

상층에 관해서 이러한 조작을 2회 반복한 후, 동량의 클로로포름(4% 이소아밀알콜 함유)을 가하고 동일한 추출 조작을 반복하였다(이후 이러한 조작을 페놀 처리라고 부른다). 그 후, 상층에 2배량의 에탄올을 가하고 유리 막대로 DNA를 권취하여 회수함으로써 염색체 DNA 표본을 수득하였다.

(2) 플라스미드의 구축

우선, 내열성 평가의 대조군으로서 사용하기 위해서, 통상의 PCR로 야생형 니트릴 하이드라타제 유전자를 증폭시켰다.

하기 반응액 조성, 반응 조건으로 PCR를 실시하였다.

또한, 프라이머 JH1-02(서열번호 5) 및 프라이머 NH-17(서열번호 6)의 각각에는, 제한 효소 NcoI 절단 인식 부위 및 제한 효소 HindⅢ 절단 인식 부위가 도입되어 있으며, 증폭 DNA 산물을 양 제한 효소로 절단함으로써, 후술하는 발현 벡터 pTrc99A의 NcoI 부위-HindⅢ 부위 사이에 용이하게 삽입할 수 있다.

<반응 용액 조성>

<프라이머>

PCR은 열순환기 퍼스널(Thermalcycler personal)[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여(94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분)을 30회 실시하였다.

PCR 종료후, 반응액 5㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 3kb의 증폭 단편을 검출하였다. 반응 종료액을 GFX 칼럼[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]으로 정제하여, 제한 효소 NcoI와 HindⅢ로 절단하였다. 제한 효소 처리를 실시한 PCR 산물은 0.7% 아가로스 겔로 전기영동을 실시하여, 3kb 부근의 밴드를 회수하였다. 회수한 PCR 산물은 연결 키트[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여 벡터(pTrc99A의 NcoI-HindⅢ 부위)에 결합하여, JM109를 형질전환시켰다. 수득된 형질전환체 콜로니로부터 수개의 클론을 LB-Amp 배지 1.5ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 진탕 배양하였다. 배양후, 이 배양물을 원심분리에 의해 집균한 후, Flex Prep[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]를 사용함으로써, 플라스미드 DNA를 추출하였다. 수득된 플라스미드 DNA를 제한 효소 NcoI-HindⅢ로 절단한 후, 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 확인한 후, 니트릴 하이드라타제 유전자 단편(3kb)이 바르게 연결되어 있는 클론을 선택하여 pJH601(도 1)로 명명하였다. 당해 pJH601를 사용하여 JM109를 형질전환시켰다(JM109/pJH601).

또한, 플라스미드 pJH601는 야생형 니트릴 하이드라타제의 발현 플라스미드이고, 수탁번호 FERM ABP-10314로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오 다이 6)에 기탁되어 있다(원기탁일: 2002년 12월 26일).

(3) 변이 유전자 라이브러리의 구축

상기 공정(2)에서 수득된 플라스미드 pJH601를 기초로, 야생형 니트릴 하이드라타제 유전자에 무작위 변이 도입을 실시하였다. 변이 도입은, PCR에서의 뉴클레오티드의 오류 도입에 의한 염기 치환을 이용하였다. 하기 반응액 조성, 반응 조건으로 PCR를 실시하였다.

<반응액 조성>

<프라이머>

PCR는 열순환기 퍼스널[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여(94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분)을 30회 실시하였다.

PCR 종료후, 반응액 5㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 3kb의 증폭 단편을 검출하였다. 반응 종료액을 GFX 칼럼[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]으로 정제하여, 제한 효소 NcoI-HindⅢ로 절단하였다. 제한 효소 처리를 실시한 PCR 산물은 0.7% 아가로스 겔로 전기영동하여, 3kb 부근의 밴드를 회수하였다. 회수한 PCR 산물은 연결 키트[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여 벡터(pTrc99A의 NcoI-HindⅢ 부위)에 결합하여, 이러한 결합 생성물을 사용하여 JM109를 형질전환시켰다.

(4) 내열성 니트릴 하이드라타제의 스크리닝 및 변이 개소의 동정

상기 공정(3)에서 수득된 변이 니트릴 하이드라타제 유전자를 포함하는 JM109형질전환체 및 JM109/pJH601를, LB-Amp 배지(1mM IPTG, 5㎍/ml CoCl₂ 함유)를 1ml씩 넣은 96구멍 딥 웰 플레이트에 각각 접종하여, 37℃에서 12시간 동안 액체 배양하였다. 수득된 배양물을, 55℃의 온도하, 30분간의 열처리에 제공한 후, 잔존 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다.

활성 측정은 5% 아크릴로니트릴을 포함하는 50mM 인산 완충액 pH 7.7을 균체 현탁액과 등량 가하여, 30℃에서 30분 동안 반응시켰다. 0.1M 인산을 등량 가하여 반응을 정지시키고, 원심분리에 의해서 균체를 제거하고, 상청을 HPLC에 제공하여, 생성된 아크릴아미드 농도를 분석하였다[WAKOSIL 5C8(참조: 와코쥰야쿠사 제조), 5mL 인산을 포함하는 10% 아세토니트릴, 이동상의 유속 1ml/분 및 자외 흡수 검출기 파장 260nn)]. 비교 대조군으로서 열처리를 하지 않고 4℃에서 냉장 보관한 것을 각각의 무처리균으로서 잔존 활성을 구하였다.

수천주의 형질전환체에 관해서 스크리닝을 실시한 결과, 야생형 효소와 비교하여 높은 잔존활성을 나타내는 주가 16주 수득되었다. 또한, 이러한 균주를 배양하여 플라스미드를 회수하고, 염기 서열을 결정하였다. 염기 서열의 결정은 Beckman CEQ-2000XL을 사용하였다. 결과를 표 1에 기재하였다.

[실시예 2] 개량형 니트릴 하이드라타제의 성질

실시예 1에서 수득된 플라스미드 p3를 사용하여 JM109를 재형질전환시켜 (JM109/p3), 수득된 콜로니를 LB 배지(암피실린, IPTG, 코발트 함유)에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 균체를 원심분리에 의해서 회수하여, 50mM 인산 완충액으로 2회 세정하여, 균체 현탁액으로 하였다.

수득된 균체 현탁액 0.5ml을 시험관에 넣고, 50 내지 60℃의 각 온도의 욕조중에서 5 내지 20분 동안 보온하고, 그 후 빙욕중에서 냉각시켰다.

균체의 활성 측정은 실시예 1 (4)의 방법으로 실시하였다.

비교 대조군으로서 JM109/pJH601를 사용하여, 열처리를 실시하지 않고 4℃에서 냉장 보관한 것을 각각의 무처리균으로서 잔존 활성을 구하였다. 결과를 표 2에 기재한다.

야생형 효소에서는 60℃에서 5분 동안의 열처리로 잔존 활성이 6%인데 반해서, 개량형 효소에서는 거의 100%의 잔존 활성을 유지하고 있다는 점에서, 개량형 효소로서 내열성이 향상된 것이 확인되었다.

[실시예 3] 로도코커스 재조합체의 제조

실시예 1에서 취득한 개량형 효소의 성질을 로도코커스균 재조합체로 확인하였다.

(1) 로도코커스균 도입용 플라스미드의 구축

이하의 방법으로 p3의 변이(Eβ93G)를 갖는 로도코커스균 도입용 플라스미드를 제조하였다. 변이의 도입은 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여, 시판 키트: 퀵 체인지 XL 부위 특이적 돌연변이유발 키트[참조: Stratagene사 제조]를 사용하였다. 실험은 조작 매뉴얼에 따랐다. 변이를 도입하는 주형 플라스미드로서 pSJO34를 사용하였다. pSJ034는 로도코커스균에 있어서 니트릴 하이드라타제를 발현하는 플라스미드이고, pSJ034는 pSJO23로부터 일본 공개특허공보 제(평)10-337185호에 나타낸 방법으로 제조하였다. 또한, pSJ023는 형질전환체「알. 로도크로우스 ATCC12674/pSJ023」으로 하여 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오 다이 6)에 기탁되어 있다(FERM BP-6232)(원기탁일: 1997년 3월 4일).

변이를 도입하기 위한 2종의 프라이머를 합성하였다. 밑줄부는 변이 도입 부위를 나타낸다.

변이를 도입하기 위한 PCR는 이하의 조건으로, GeneAmp9700[참조: PE 바이오사이언스사 제조]를 사용하여 95℃에서 1분, (95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 68℃에서 20분)×18회, 68℃에서 20분 동안의 반응을 실시하였다.

<반응액 조성>

PCR 종료후, 반응액 10㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 약 11kb의 증폭 단편을 검출하였다. 증폭 단편을 확인한 후, 1㎕의 DpnI(키트에 부속)을 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 주형 DNA를 제거하였다.

다음에, XL10-GOLD 울트라 컴피턴트 세포(키트에 부속)을 사용하여 형질전환을 실시하였다. 2㎕의 DpnI 처리 완료된 PCR 반응액과 45㎕의 컴피턴트 세포를 혼합하여, 4℃에서 30분 동안 보온하고, 42℃에서 30초 동안 열 쇼크를 실시한 후, 0.5ml의 NZY+배지(1% NZ 아민, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 12.5mM MgCl₂, 12.5mM MgSO₄, 0.4% 글루코스, pH 7.5)를 첨가하고, 또한 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 당해 배양액 250㎕를 LB 플레이트(1% NaCl, 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 2% 한천, 50mg/L 암피실린)에 플레이팅하여, 37℃에서 1일 동안 배양하였다.

수득된 콜로니 수개를 LB 배지(50mg/L 암피실린) 1.5ml에서 배양하여, FlexiPrep Kit[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]를 사용하여 플라스미드를 제조하였다. 마지막에, 수득된 플라스미드의 염기 서열을 결정하고, 목적의 변이가 도입되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 하여 Eβ93G의 변이 도입 플라스미드: p3R를 수득하였다(도 2).

(2) 변이 효소 유전자를 도입한 로도코커스균 재조합체(형질전환체)의 취득

로도코커스 로도크로우스 ATCC 12674주의 대수 증식기의 세포를 원심분리기에 의해 집균하고, 빙냉시킨 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. (1)에서 제조한 플라스미드 p3R 1㎕와 균체 현탁액 10㎕을 혼합하고 빙냉하였다. 큐벳에 DNA와 균체의 현탁액을 넣고, 유전자 도입 장치 Gene Pulser(BIO RAD)에 의해 2.0KV, 200 OHMS에서 전기 펄스 처리를 실시하였다. 전기 펄스 처리액을 빙냉하 10분 동안 정치하고, 37℃에서 10분간 열 쇼크를 실시하고, MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 박토이스트 추출액, 0.3% 박토몰트 추출액, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500㎕를 가하고, 30℃에서 5시간 동안 정치하였다. 그 후, 50㎍/ml 카나마이신 함유 MYK 한천 배지에 도말하여, 30℃에서 3일 동안 배양하였다. 이렇게 하여 수득된 로도코커스속 세균 재조합체(ATCC 12674/p3R)를 MYK 배지(50㎍/ml 카나마이신 함유) 10ml에 접종하여, 30℃에서 72시간의 전배양을 실시하였다. 본 배양은 MYK 배지(50㎍/ml 카나마이신, 5㎍/ml CoCl₂, 0.1% 요소 함유) 100ml에서 실시하고, 전배양으로부터 1% 접종하고, 30℃에서 96시간 동안 배양하였다. 원심분리에 의해 집균하여, 100mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 균체를 세정하고, 마지막에 소량의 완충액에 현탁하였다.

(3) 로도코커스균 재조합체의 내열성 확인

수득된 로도코커스균 재조합체를 사용하여 내열성을 조사하였다. 비교 대조군으로서 야생형 니트릴 하이드라타제를 갖는 ATCC12674/pSJ034를 준비하였다.

수득된 균체 현탁액 0.5ml을 시험관에 넣고, 65℃, 70℃의 각 온도의 욕조 중에서 10분간 보온하고, 그 후 얼음 중에서 냉각시켰다. 비교 대조군으로서 열처리를 실시하지 않고 4℃에서 냉장 보관한 것을 무처리균으로서 잔존 활성을 구하였다. 결과를 표 3에 기재한다.

활성 측정은 10℃에서 10분간 반응시킨 것 이외에는 실시예 1 (4)와 동일한 방법으로 실시하였다. 결과를 표 3에 기재한다.

이와 같이 ATCC12674/pSJ034에서는 70℃에서 10분의 열처리로 잔존 활성이 4%밖에 유지되지 않았던데 반해, ATCC 12674/p3R에서는 46%의 잔존 활성을 유지하고 있다는 점에서, 개량형 효소에서 내열성이 향상된 것이 확인되었다.

[실시예 4〕부위 특이적인 무작위 변이

특정한 변이 장소에 관해서, 무작위 변이를 실시하였다.

(1) 부위 특이적인 무작위 변이 도입

실시예 3의 부위 특이적 변이 도입 키트를 사용하여, pJH601에 무작위 변이를 도입하였다.

변이를 도입하는 장소로서 β서브유니트의 아미노산 서열중 제93번째를 선택하고, 변이를 도입하기 위한 2종의 프라이머를 합성하였다. 밑줄부는 변이 도입 부위를 나타낸다.

PCR는 이하의 조건으로, GeneAmp9700[참조: PE 바이오사이언스사 제조]를 사용하여 95℃에서 1분, (95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 68℃에서 14분)×18회, 68℃에서 7분 동안 반응을 실시하였다.

<반응 조성액>

PCR 종료후, 반응액 10㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 약 6kb의 증폭 단편의 검출을 실시하였다. 증폭 단편을 확인한 후, 1㎕의 DpnI(키트에 부속)을 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응하여, 주형 DNA를 제거하였다. 다음에, XL10-GOLD 울트라 컴피턴트 세포(키트에 부속)을 사용하여 형질전환을 실시하였다. 2㎕의 DpnI 처리 완료된 PCR 반응액과 45㎕의 컴피턴트 세포를 혼합하여 4℃에서 30분 동안 보온하고, 42℃에서 30초 동안 열 쇼크를 실시한 후, 0.5ml의 NZY+배지(1% NZ 아민, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 12.5mM MgCl₂, 12.5mM MgSO₄, 0.4% 글루코스, pH 7.5)를 첨가하고, 다시 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이러한 배양액 250㎕을 LB 플레이트(1% NaCl, 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 2% 한천, 50mg/L 암피실린)에 플레이팅하여, 37℃에서 1일 동안 배양하였다.

(2) 부위 특이적 무작위 변이 도입주의 평가

상기 공정(1)에서 수득된 콜로니 및 XL10/pJH601를, LB-Amp 배지(1mM IPTG, 5㎍/ml CoCl₂ 함유)를 1ml씩 넣은 96구멍 딥 웰 플레이트에 각각 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 액체 배양하였다. 수득된 배양물을, 55℃의 온도하, 30분간의 열처리에 제공한 후, 잔존 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다.

활성 측정은 실시예 1 (4)와 동일한 방법으로 실시하였다. 비교 대조군으로서 열처리를 실시하지 않고 4℃에서 냉장 보관한 것을 각각의 무처리균으로서 잔존 활성을 구하였다.

대조군에 대하여 잔존 활성이 높았던 것에 관해서는, 다시 염기 서열을 결정을 실시하였다.

결과를 표 4에 기재한다.

표 4로부터 명백한 바와 같이, β서브유니트 93번째의 아미노산은 다른 아미노산으로 치환하더라도 내열성은 향상되었다.

[실시예 5]

β서브유니트 167번째의 아미노산에 무작위 변이를 도입하였다.

변이를 도입하기 위한 2종의 프라이머만을 변경하고, 그 외에는 실시예 4와 동일한 조작을 실시하였다. 밑줄부는 변이 도입 부위를 나타낸다. 결과를 표 5에 기재한다.

표 5로부터 명백한 바와 같이, β서브유니트 167번째의 아미노산은 다른 아미노산으로 치환하더라도 내열성은 향상되었다.

[실시예 6] 로도코커스 로도크로우스 M8주 유래 니트릴 하이드라타제로의 변이 도입

(1) 니트릴 하이드라타제 유전자의 클로닝

로도코커스 로도크로우스 M8주를 실시예 1에 나타낸 방법과 동일한 방법으로 배양하여, 배양 균체로부터 염색체 DNA를 제조하였다. 다음에, 이하의 조건으로 PCR를 실시하고, 니트릴 하이드라타제 유전자를 증폭하였다. 또한, 로도코커스 로도크로우스 M8주는 러시아 균주 센터 IBFM(VKPM S-926)로부터 용이하게 입수할 수 있다.

<반응 용액 조성>

<프라이머>

PCR는, 열순환기 퍼스널[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여(94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분)을 30회 실시하였다.

PCR 종료후, 반응액 5㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 1.5kb의 증폭 단편(서열번호 17)의 검출을 실시하였다. 반응 종료액을 GFX 칼럼[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]으로 정제하여, 제한 효소 NcoI와 HindⅢ로 절단을 실시하였다. 제한 효소 처리를 실시한 PCR 산물은 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 1.5kb 부근의 밴드를 회수하였다. 회수한 PCR 산물은 연결 키트[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여 벡터(pTrc99A의 NcoI-HindⅢ 부위)에 결합하고, JM109로 형질전환을 실시하였다. 수득된 형질전환체 콜로니로부터 수개의 클론을 LB-Amp 배지 1.5ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 진탕 배양하였다. 배양후, 이러한 배양물을 원심분리에 의해 집균하였다. Flexi Prep[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]를 사용함으로써, 집균한 균체로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 수득된 플라스미드 DNA를 제한 효소 NcoI와 HindⅢ로 절단한 후, 0.7% 아가로스 겔에 의해 전기영동을 실시하고, 니트릴 하이드라타제 유전자 단편(1.5kb)이 바르게 연결되어 있는 클론을 선택하여 pMH301(도 3)로 명명하였다. pMH301를 사용하여 JM109의 형질전환을 실시하였다(JM109/pMH301).

(2) 부위 특이적 변이의 도입

부위 특이적 변이의 도입은 실시예 3에 나타낸 방법에 따라서, β서브유니트의 93번째에 변이를 도입하였다. 프라이머의 염기 서열중 밑줄부는 변이 도입 부위를 나타낸다.

<반응 조성액>

PCR 종료후, 반응액 10㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 약 5kb의 증폭 단편의 검출을 실시하였다. 증폭 단편을 확인한 후, 1㎕의 DpnI(키트에 부속)을 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 주형 DNA를 제거하였다. 다음에, XL10-GOLD 울트라 컴피턴트 세포(키트에 부속)을 사용하여 형질전환을 실시하였다. 2㎕의 DpnI 처리 완료된 PCR 반응액과 45㎕의 컴피턴트 세포를 혼합하여 4℃에서 30분 동안 보온하며, 42℃에서 30초 동안 열 쇼크를 실시하였다. 그 후, 0.5ml의 NZY+배지(1% NZ아민, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 12.5mM MgCl₂, 12.5mM MgSO₄, 0.4% 글루코스, pH 7.5)를 첨가하고, 다시 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 당해 배양액 250㎕을 LB 플레이트(1% NaCl, 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 2% 한천, 50mg/L 암피실린)에 플레이팅하고, 37℃에서 1일 동안 배양하였다.

수득된 콜로니 수개를 LB 배지(50mg/L 암피실린)에서 배양하였다. FlexiPrep 키트[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]를 사용하여, 플라스미드를 제조하였다. 마지막에, 수득된 플라스미드의 염기 서열을 결정하여, 목적의 변이가 도입되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 하여 Eβ93G의 변이 도입 플라스미드: pMH404를 수득하였다.

동일하게, 이하의 프라이머를 사용하여 β서브유니트의 167번째에 변이를 도입하였다. 밑줄부는 변이 도입 부위를 나타낸다.

수득된 콜로니 수개를 LB 배지(50mg/L 암피실린)에서 배양하고, 플라스미드를 추출하였다. 수득된 플라스미드의 염기 서열을 결정하고, 목적의 변이가 도입되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 하여 Nβ167S의 변이 도입 플라스미드: pMH508을 수득하였다.

(3) 활성 측정

공정(2)에서 수득된 XL10/pMH404XL10-Gold/pMH508 및 XL10/pMH301을, LB-Amp 배지(1mM IPTG, 5㎍/ml CoCl₂ 함유) 10ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 액체 배양하였다. 수득된 배양물을, 55℃의 온도하, 30분간의 열처리에 제공한 후, 잔존 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다.

활성 측정은 실시예 1 (4)와 동일한 방법으로 실시하였다. 비교 대조군으로서 열 처리를 하지 않고 4℃에서 냉장 보관한 것을 각각의 무처리균으로서 잔존 활성을 구하였다. 결과를 표 6에 기재한다.

표 6으로부터 명백한 바와 같이, 로도코커스 로도크로우스 M8주 유래의 니트릴 하이드라타제에 있어서도, Eβ93G, Nβ167S의 도입에 의해서 내열성이 향상된 것이 확인되었다.

[실시예 7] 개량형 니트릴 하이드라타제 유전자의 취득(II)

(1) 변이 유전자 라이브러리의 구축

본 실시예에서는, 로도코커스 로도크로우스 J-1주 유래의 니트릴 하이드라타제 유전자로의 무작위 변이 도입을 실시하였다. 변이 도입은 PCR에서의 뉴클레오티드의 오류 도입에 의한 염기 치환을 이용하였다. 주형이 되는 플라스미드는 야생형 β서브유니트의 167번째의 아미노산이 아스파라긴으로부터 세린으로 변이된 플라스미드 p52(도 4)를 사용하였다.

니트릴 하이드라타제 유전자로 무작위 변이를 도입시키는 PCR은 하기 반응액 조성, 반응 조건으로 실시하였다.

<반응액 조성>

<프라이머>

PCR는 GeneAmp9700[참조: PE 바이오사이언스사 제조]를 사용하여(94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분)을 30회 실시하였다.

PCR 종료후, 반응액 5㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 3kb의 증폭 단편을 검출하였다. 반응 종료액을 GFX 칼럼[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]으로 정제하고, 제한 효소 NcoI과 HindⅢ로 절단을 실시하였다. 제한 효소 처리를 실시한 PCR 산물은 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 3kb 부근의 밴드를 회수하였다. 회수한 PCR 산물은 연결 키트[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여 벡터(pTrc99A의 NcoI-HindⅢ 부위)에 결합하였다. 이러한 결합 생성물을 사용하여 JM109를 형질전환시켰다.

(2) 내열성 니트릴 하이드라타제의 스크리닝 및 변이 개소의 동정

상기 공정(1)에서 수득된 변이 니트릴 하이드라타제 유전자를 포함하는 JM109형질전환체 및 야생형 니트릴 하이드라타제 생산주로서 JM 109/pJH 601를 사용하여, 잔존 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다.

내열성의 평가는 처리 온도만 60℃, 20분으로 변경하고, 그 외에는 실시예 1 (4)와 동일한 방법으로 실시하였다.

무작위로 변이 도입된 니트릴 하이드라타제 유전자를 갖는 수천개의 재조합체에 관해서 스크리닝을 실시한 결과, 야생형 니트릴 하이드라타제와 비교하여 높은 잔존 활성을 나타내는 재조합체가 선별되었다. 잔존 활성의 결과를 표 7에 기재하였다.

당해 재조합체를 배양하여 플라스미드를 회수하고, 플라스미드 pA077로 명명하였다. 플라스미드 pA077의 염기 서열을 결정하였다. 염기 서열의 결정은 Beckman CEQ-2000XL을 사용하였다. 플라스미드 pA077의 변이 유전자 서열에 의해서 암호화되는 아미노산 서열은, Nβ167S, Lβ144H, Vβ219A, Vα129A 및 Lα196P의 5개소에 변이를 갖고 있었다.

[실시예 8] 대장균 재조합체의 제조와 평가

(1) 플라스미드의 구축

주형 플라스미드 p52(도 4)에, 실시예 7의 (2)에서 수득된 변이 개소의 정보를 바탕으로 변이를 도입하였다. 변이 도입에는 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여, 시판 키트: 퀵 체인지 XL 부위 특이적 돌연변이유발 키트[참조: Stratagene사 제조]를 사용하였다. 실험은 조작 매뉴얼에 따랐다.

변이를 도입하기 위한 PCR는 이하의 조건으로, GeneAmp9700[참조: PE 바이오사이언스사 제조]를 사용하여 95℃에서 1분, (95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 68℃에서 14분)×18회, 68℃에서 7분 동안 반응을 실시하였다.

<반응액 조성>

PCR 종료후, 반응액 10㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 약 11kb의 증폭 단편을 검출하였다. 증폭 단편을 확인한 후, 1㎕의 DpnI(키트에 부속)을 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응하여, 주형 플라스미드를 제거하였다.

다음에, XL10-GOLD 울트라 컴피턴트 세포(키트에 부속)을 사용하여 형질전환을 실시하였다. 2㎕의 DpnI 처리 완료된 PCR 반응액과 45㎕의 컴피턴트 세포를 혼합하여 4℃에서 30분 동안 보온하고, 42℃에서 30초 동안 열 쇼크를 실시하였다. 그 후, 0.5ml의 NZY+배지(1% NZ아민, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 12.5mM MgCl₂, 12.5mM MgSO₄, 0.4% 글루코스, pH 7.5)를 첨가하고, 다시 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 당해 배양액 250㎕을 LB 플레이트(1% NaCl, 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 2% 한천, 50mg/L 암피실린)에 플레이팅하여, 37℃에서 1일 동안 배양하였다.

수득된 콜로니 수개를 LB 배지(50mg/L 암피실린) 1.5ml에서 배양하고, FlexiPrep Kir[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]를 사용하여 플라스미드를 제조하였다. 마지막에, 수득된 플라스미드의 염기 서열을 결정하여, 목적의 변이가 도입되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 하여 Lβ144H의 변이 도입 플라스미드: pAB001를 수득하였다.

다음에, 상기와 동일한 수법을 사용하여 p52 또는 pAB001을 주형 플라스미드로 하여 Vβ219A 또는 Vα129A의 변이를 도입하였다. 사용한 프라이머를 이하에 나타낸다.

수득된 플라스미드는 각각 pAB002(Nβ167S, Vβ219A), pAB003(Nβ167S, Vα129A), pAB004(Nβ167S, Lβ144H, Vβ219A)로 명명하였다.

(2) 내열성 평가

(1)에서 수득된 변이 니트릴 하이드라타제 유전자를 포함하는 플라스미드를 각각 대장균 JM109로 형질전환시켜, 재조합균을 수득하였다. 이러한 재조합균을 LB-Amp 배지(1mM IPTG, 5㎍/ml CoCl₂ 함유) 1.5ml에 각각 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 액체 배양하였다. 수득된 배양균액을, 60℃의 온도하, 20분 동안의 열처리에 제공한 후, 잔존 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다. 활성 측정은 실시예 1의 (4)와 동일한 방법으로 실시하였다. 잔존 활성의 결과를 표 8에 기재하였다.

표 8로부터 분명한 바와 같이 Lβ144H, Vβ219A, Vβ219A의 도입에 의해서 내열성이 향상된 것이 명백해졌다.

[실시예 9] 로도코커스(Rbodococcus)균 재조합체의 제조와 평가

(1) 플라스미드의 구축

이하의 방법으로 β서브유니트의 167번째에 변이(Nβ167S)를 갖는 로도코커스(Rhodococcus)균용 플라스미드를 제조하였다. 변이의 도입은 부위 특이적 변이 도입법을 사용하고, 시판 키트: 퀵 체인지 XL 부위 특이적 돌연변이유발 키트[참조: Stratagene사 제조]를 사용하였다. 실험은 조작 매뉴얼에 따랐다. 변이를 도입하는 주형 플라스미드로서 pSJ034를 사용하였다.

변이를 도입하기 위한 PCR는 실시예 3 (1)과 동일한 조건으로 실시하였다.

<반응액 조성>

PCR 종료후, 실시예 3 (1)과 동일한 수법에 의해 Nβ167S의 로도코커스(Rhodococcus)균용 변이 도입 플라스미드: p52R를 수득하였다.

다음에, 상기와 동일한 수법을 사용하여 p52R를 주형 플라스미드로서 Lβ144 H, Vβ219A 또는 Vα129A의 변이를 도입하였다. 사용한 프라이머를 이하에 나타낸다.

수득된 플라스미드는 각각 pAR001(Nβ167S, Lβ144H), pAR002(Nβ167S, Vβ219A), pAR003(Nβ167S, Vα129A)로 명명하였다. 또한 수득된 플라스미드 pAR001를 주형 플라스미드로서 상기와 동일한 수법을 사용하여 Vβ219A의 변이를 도입하였다. 수득된 플라스미드는 pAR004(Nβ167S, Lβ144H, Vβ219A)로 명명하였다.

(2) 로도코커스(Rhodococcus)균 재조합체의 제조

로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC12674주의 대수증식기의 세포를 원심분리기에 의해 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. (1)에서 제조한 플라스미드 1㎕과 균체 현탁액 10㎕을 혼합하여, 빙냉하였다.

그 후 실시예 3 (2)와 동일한 조작을 실시하였다.

(3) 로도코커스(Rhodococcus) 균 재조합체의 내열성 평가

수득된 로도코커스(Rhodococcus)균 재조합체를 사용하여 실시예 3 (3)의 방법과 동일하게 열처리후의 잔존 니트릴 하이드라타제 활성을 조사하였다.

로도코커스(Rhodococcus)속 세균 재조합체는 MYK 배지(50㎍/ml 카나마이신, 5㎍/ml CoCl₂, 0.1% 요소 함유)에 각각 접종하여, 30℃에서 3일 동안 진탕 배양하였다. 원심 분리에 의해 집균하고, 100mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 균체를 세정하고, 마지막에 소량의 완충액에 현탁하였다.

가열 처리는, 적절하게 희석시킨 균체 현탁액 0.5ml을 시험관에 넣고, 65℃ 온도하의 욕조 중에서 30분 동안 보온하고, 그 후 얼음 중에서 냉각시켰다.

활성 측정은 실시예 3 (3)과 동일한 방법으로 실시하였다. 잔존 활성 결과를 표 9에 기재하였다.

ATCC12674/pSJ034에서는 65℃에서 30분 동안의 열처리로 잔존 활성이 31%인데 대해, ATCC12674/pAR001 내지 pAR004에서는 60% 이상의 잔존 활성을 유지하고 있다는 점에서, 개량형 니트릴 하이드라타제에서 내열성이 향상된 것이 확인되었다.

(3) 아크릴아미드 내성의 평가

실시예 9 (2)에서 사용한 형질전환체를 사용하여 아크릴아미드 내성을 평가하였다. 이하의 조성의 반응액을 제조하여, 30℃에서 교반하면서 반응시켰다. 또한, 반응에 사용하는 각 균체 현탁액의 균량은, 실시예 3 (3)의 방법으로 측정한 활성의 측정 결과에 따라서, 동일한 효소 활성 단위(U)량이 되도록 제조하였다. 비교 대조군으로서 야생형 니트릴 하이드라타제를 갖는 ATCC12674/pSJ034를 사용하였다.

<반응액 조성>

반응 개시전(0시간), 0.5시간후 및 20시간후에 각각 반응액 1ml을 샘플링하고, 0.22㎛의 필터를 사용하여 여과하였다. 수득된 여과액을 가스 크로마토그래피에 제공하여 분석하였다(분석 기기: 가스 크로마토그래프 GC-14B[참조: 시마즈세사쿠쇼 제조], 검출기; FID, 검출온도: 200℃, 칼럼: 폴라팩PS(워터즈사 제조의 칼럼 충전제)를 충전한 1.1m 충전된 유리 칼럼, 칼럼 온도: 190℃, 캐리어가스: N2)

분석의 결과, 여과액 중에 잔존하는 아크릴로니트릴의 비율(%)을 표 10에 기재한다.

이상과 같이, 개량형 니트릴 하이드라타제는, 비교 대조군의 pSJ034보다 소비한 아크릴로니트릴이 많다는 점에서, 개량형 니트릴 하이드라타제는, 고농도의 아크릴아미드 존재하에서도 활성이 유지되고, 아크릴아미드에 대한 내성이 높은 것을 알 수 있었다.

[실시예 10] 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous)

M8주 유래 니트릴 하이드라타제로의 변이 도입, 재조합체 제조와 평가

(1) 변이 도입 재조합체의 제조

로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M8주 유래 니트릴 하이드라타제로 변이 도입을 실시하였다. 부위 특이적 변이 도입은, 사용한 플라스미드가 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M8주 유래 니트릴 하이드라타제를 암호화하는 유전자(서열번호 17)를 포함하는 발현 플라스미드의 pMH301(도 3)인 것 이외에는, 실시예 6 (2)와 동일한 방법으로 실시하였다. 수득된 플라스미드는, 각각 pMH508(Nβ167S), pMH601(Nβ167S, Lβ144H), pMH602(Nβ167S, Vβ219A), pMH603(Nβ167S, Vα129A)로 명명하였다. 당해 플라스미드는 JM109로 형질전환시켜, 변이 도입 재조합균을 제조하였다. 수득된 재조합균은, LB-Amp 배지(1mM IPTG, 5㎍/ml CoCl₂ 함유) 10ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 액체 배양하였다.

(2) 내열성 평가

수득된 배양물은, 60℃의 온도하, 20분 동안의 열처리에 제공한 후, 잔존 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다. 활성 측정은 실시예 7의 (2)와 동일한 방법으로 실시하였다. 비교 대조군으로서 열처리를 하지 않고 4℃에서 냉장 보관한 것을 각각의 무처리균으로서 잔존 활성을 구하였다. 잔존 활성 결과를 표 11에 기재하였다.

로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) M8주에 있어서도 개량형 니트릴 하이드라타제에서 내열성이 향상된 것으로 나타났다.

[실시예 11] 변이형 니트릴 하이드라타제 유전자의 취득

(1) 플라스미드의 구축

실시예 1에서 제조한 pJH601로부터 실시예 1 (3)과 동일한 방법으로 무작위 변이가 도입된 니트릴 하이드라타제 유전자를 증폭시키고, 3Kb의 PCR 산물을 회수하였다.

회수한 PCR 산물은 연결 키트[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여 플라스미드 pFY529의 NcoI-HindⅢ 부위에 삽입하여, JM109의 형질전환을 실시하여, 형질전환체를 수득하였다. 또한, pFY529의 제조는, 참고예 1에 기재하였다.

(2) 기질 특이성 변이 니트릴 하이드라타제의 취득 및 변이 개소의 동정

상기 공정 (1)에서 수득된 변이 니트릴 하이드라타제 유전자를 포함하는 JM109형질전환체 및 JM109/pJH601을, 실시예 1 (4)와 동일하게 하여 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다.

수백주의 형질전환체에 관해서 스크리닝을 실시한 결과, 야생주와 비교하여 명백하게 3-시아노피리딘에 높은 활성을 나타내는 1개의 주(JM109/pNHM101)가 수득되었다. 또한, 이러한 균주를 배양하여 플라스미드를 회수하고, 염기 서열을 결정하였다. 염기 서열의 결정은 Beckman CEQ-2000XL을 사용하였다. 본 플라스미드의 니트릴 하이드라타제 유전자에 있어서는, β서브유니트의 48번째의 트립토판 잔기(TGG)가 아르기닌 잔기(CGG)로 변화되었다.

[실시예 12] 로도코커스 재조합체의 제조

실시예 11에서 취득한 변이 효소의 성질을 로도코커스균 재조합체로 확인하였다

(1) 로도코커스균 도입용 플라스미드의 구축

이하의 방법으로 pNHM101의 변이(Wβ48R)를 갖는 로도코커스균 도입용 플라스미드를 제조하였다. 변이의 도입은 Kurosawa 등의 방법[참조: Gene. 1991 15; 102: 67-70]에 의해 실시하였다. 변이를 도입하는 플라스미드로서 pSJ034를 사용하였다. pSJ034은 로도코커스균에 있어서 니트릴 하이드라타제를 발현하는 플라스미드이고, pSJO34는 pSJ023로부터 일본 공개특허공보 제(평)10-337185호에 나타낸 방법으로 제조하였다. pSJ023는 형질전환체「알. 로도크로우스 ATCC12674/pSJ023」으로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오 다이 6)에 기탁되어 있다(FERM BP-6232).

1차 PCR

이하의 조건으로 2종의 1차 PCR 반응을 실시하였다. GeneAmp9700[참조: PE 바이오사이언스사 제조]를 사용하여 95℃에서 1분, (95℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 10분)×30회, 72℃에서 7분 동안 반응을 실시하였다.

<반응 조성물>

2종의 PCR은 프라이머 1(NR-01)와 프라이머 2(NH18)의 조합 및 프라이머1(NOXbaI-1)와 프라이머 2(RE1-02)의 조합으로 실시하였다.

PCR 종료후, 반응액 1㎕을 0.7% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 증폭 단편을 확인한 후, 나머지 반응액을 동조건에 의한 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 증폭 단편을 정제하였다.

2차 PCR

1차 PCR에서 수득된 2종의 PCR 단편을 사용하여, 하기의 조건으로 2차 PCR를 실시하였다.

<반응액 조성>

효소를 넣지 않는 조건으로, 93℃에서 10분 동안 처리한 후, 1시간에 걸쳐 37℃로 냉각시키고, 37℃에서 15분 동안 방치하고, 효소를 가하여 1분, (95℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 10분)×30회, 72℃에서 7분 동안 반응을 실시하였다.

수득된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인한 후 XbaI 및 Sse8387I에 의해 처리하여, 아가로스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 정제하였다.

정제한 PCR 단편은 연결 키트[참조: 타카라슈조사 제조]를 사용하여 벡터pSJ034(XbaI-Sse8387I 부위)에 결합하여, JM109의 형질전환을 실시하였다. 수득된 형질전환체 콜로니로부터 수개의 클론을 LB-Amp 배지 1.5ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 진탕 배양하였다. 배양후, 당해 배양물을 원심분리에 의해 집균한 후, FlexiPrep[참조: 아마샴바이오사이언스사 제조]를 사용함으로써, 플라스미드 DNA를 추출하였다. 수득된 플라스미드 DNA를 제한 효소 XbaI와 Sse8387I로 절단한 후, 0.7% 아가로스 겔에 의해 전기영동을 실시하여, 니트릴 하이드라타제 유전자를 포함하는 단편(약 2kb)이 바르게 연결되어 있는 클론을 선택하였다. 마지막에, 수득된 플라스미드의 염기 서열을 결정하여, 목적의 변이가 도입되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 하여 Wβ48R의 변이 도입 플라스미드: pAJ001를 수득하였다.

(2) 변이 효소 유전자를 도입한 로도코커스균 재조합체의 취득

로도코커스 로도크로우스 ATCC12674주의 대수증식기의 세포를 원심분리기에 의해 집균하여, 빙냉시킨 멸균수로 3회 세정하고, 멸균수에 현탁하였다.

(1)에서 제조한 플라스미드 pAJ001 1㎕와 균체 현탁액 10㎕을 혼합하고, 빙냉시켰다.

그 후에는 실시예 3 (2)와 동일한 처리를 실시하여, 로도코커스균 재조합체를 수득하였다.

(3) 로도코커스균 재조합체의 활성

수득된 로도코커스균 재조합체를 사용하여, 아크릴아미드 및 3-시아노피리딘에 대한 활성을 조사하였다. LB-Amp 배지(1mM IPTG, 5㎍/ml CoCl₂ 함유)를 1ml씩 넣은 96구멍 딥 웰 플레이트에 각각 접종하여, 37℃에서 12시간 동안 액체 배양하였다. 수득된 배양물의 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다.

활성 측정은 5% 아크릴로니트릴/50mM 인산 완충액 pH 7.7 또는 0.5% 3-시아노피리딘/50mM 인산 완충액 pH 7.7을 균액에 대하여 등량 가하고, 30℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 종료후, 0.1M 인산을 반응액과 등량 가하여 원심분리하고, 이의 상청을 적절하게 희석시켜 HPLC에 제공하여, 생성된 아미드 농도를 분석하였다(아크릴아미드: WAKOSIL 5C8(참조: 와코쥰야쿠사 제조), 5mM 인산을 포함한 10%아세토니트릴, 니코틴아미드: WAKOSIL 5C8(참조: 와코쥰야쿠사 제조), 5mM 인산을 포함한 35% 아세토니트릴).

비교 대조군으로서 야생형 니트릴 하이드라타제를 갖는 ATCC12674/pSJ034를 준비하였다.

결과를 표 12에 기재한다.

[실시예 13]

pNHM101를 주형으로 하여 상기와 동일하게 하여 변이 니트릴 하이드라타제 유전자 라이브러리를 제조하여, 내열성을 지표로 스크리닝을 실시하였다.

스크리닝은 실시예 1 (4)와 동일한 처리 조건과 방법으로 실시하였다.

수백주의 형질전환체에 관해서 스크리닝을 실시한 결과, 야생주와 비교하여 높은 잔존 활성을 나타내는 1개의 주가 수득되었다(JM109/pNHM111). 이를 배양하여 플라스미드를 회수하여, 염기 서열을 결정하였다. 염기 서열의 결정은 BeckmanCEQ-2000XL을 사용하였다. 본 플라스미드의 니트릴 하이드라타제 유전자에 있어서는, pNHM101의 변이에 가하여, β서브유니트의 26번째의 히스티딘 잔기(CAC)가 아르기닌 잔기(CGC)로 변화되었다.

[실시예 14]

실시예 13에서 취득한 내열 효소의 변이(Hβ26R)의 성질을 로도코커스균 재조합체로 확인하였다.

변이 프라이머로서 NH-18 대신에 NH-25를 사용하여, 실시예 12와 동일하게 하여 플라스미드를 제조하였다. 이를 pAJ006이라고 명명하고, 실시예 12와 동일하게 하여 로도코커스 로도크로우스 ATCC12674주에 도입하였다.

(변이 도입용 프라이머, 변이 개소를 밑줄로 나타낸다)

수득된 로도코커스균 재조합체를 사용하여 실시예 3 (3)와 동일하게 내열성을 조사하였다. 비교 대조군으로서 야생형 니트릴 하이드라타제를 갖는 ATCC12674/pSJ034를 준비하였다.

수득된 균체 현탁액 0.5ml을 시험관에 넣고, 65℃, 70℃의 각 온도의 욕조 중에서 10분 동안 보온하고, 그 후 얼음 중에서 냉각시켰다. 잔존 활성은, 열처리를 하지 않고 4℃에서 냉장 보관한 것(무처리구)의 초기 활성을 100%로 한 상대 활성으로 평가하였다.

ATCC12674/pSJ034에서는 70℃에서 10분 동안의 열처리로 잔존 활성이 4%인 데 대하여, ATCC12674/pAJ006에서는 40%의 잔존 활성을 유지하고 있었기 때문에, 변이 효소(Hβ26R)에서 내열성이 향상된 것이 확인되었다.

[참고예 1]

에스테라제 발현 플라스미드 pFY529의 제조

플라스미드 pFY529에는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 에스테라제 유전자가 포함되어 있지만, 본 플라스미드는 일본 공개특허공보 제(평)1-67190호에 기재되어 있는 플라스미드 pFY520로부터 제조하였다(도 5A, 도 5B). 플라스미드 pFY520는 형질전환체「JM109/pFY520」로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오 다이 6)에 기탁되었다(FERM BP-1469)(원기탁일: 1987년 9월 3일).

pFY520을 제한 효소 NaeI로 절단한 후, HindⅢ 링커와 함께 연결을 실시하여, pFY520의 NaeI 부위가 HindⅢ 부위로 치환된 플라스미드를 수득하였다. 이를 pCFOO1라고 명명하였다. pCFOO1를 제한 효소 HindⅢ로 절단하여, 에스테라제 유전자를 포함하는 약 0.8kb의 DNA 단편을 제조하였다. 본 단편을 발현 벡터 pKK233-2의 HindⅢ 부위에 trc 프로모터와 동일 방향이 되도록 삽입하여, 플라스미드 pCF002를 수득하였다. pCF002를 제한 효소 NaeI 및 ScaI로 절단하여 수득된 약 1.96kb의 단편과, 플라스미드 pUC18를 제한 효소 PvuII 및 ScaI로 절단하여 수득된 약 1.55kb의 단편을 결합시켜, 플라스미드 pFY529를 수득하였다. pFY529는 trc 프로모터를 갖는다는 점에서 pCF002(pKK233-2 벡터)와 동등하지만, 복제수가 보다 높다는 특징을 갖는다.

본 발명에 의해 개량형 니트릴 하이드라타제가 제공된다. 본 발명의 니트릴 하이드라타제는, 내열성이 높고, 또한 기질 특이성도 높다는 점에서, 아미드 화합물을 효율적으로 제조하기 위해서 유용하다.

서열목록 예비설명

서열번호 5: 합성 DNA

서열번호 6: 합성 DNA

서열번호 7: 합성 DNA

서열번호 8: 합성 DNA

서열번호 9: 합성 DNA

서열번호 10: 합성 DNA

서열번호 11: 합성 DNA

서열번호 11: n은 a, c, g 또는 t이다(존재 위치 20-21).

서열번호 12: 합성 DNA

서열번호 12: n은 a, c, g 또는 t이다(존재 위치 21-22).

서열번호 13: 합성 DNA

서열번호 14: 합성 DNA

서열번호 14: n은 a, c, g 또는 t이다(존재 위치 21-22).

서열번호 15: 합성 DNA

서열번호 16: 합성 DNA

서열번호 18: 합성 DNA

서열번호 19: 합성 DNA

서열번호 20: 합성 DNA

서열번호 21: 합성 DNA

서열번호 22: 합성 DNA

서열번호 23: 합성 DNA

서열번호 24: 합성 DNA

서열번호 25: 합성 DNA

서열번호 26: 합성 DNA

서열번호 27: 합성 DNA

서열번호 28: 합성 DNA

서열번호 29:합성 DNA

서열번호 30: 합성 DNA

<110> Mitsubishi Rayon Co., Ltd. <120> Improved Nitrile Hydratase <130> PCT05-0035 <150> JP 2004-156593 <151> 2004-05-26 <150> JP 2004-237888 <151> 2004-08-18 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <220> <221> CDS <222> (1)..(687) <400> 1 atg gat ggt atc cac gac aca ggc ggc atg acc gga tac gga ccg gtc 48 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 ccc tat cag aag gac gag ccc ttc ttc cac tac gag tgg gag ggt cgg 96 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 acc ctg tca att ctg act tgg atg cat ctc aag ggc ata tcg tgg tgg 144 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 gac aag tcg cgg ttc ttc cgg gag tcg atg ggg aac gaa aac tac gtc 192 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 aac gag att cgc aac tcg tac tac acc cac tgg ctg agt gcg gca gaa 240 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 cgt atc ctc gtc gcc gac aag atc atc acc gaa gaa gag cga aag cac 288 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 cgt gtg caa gag atc ctt gag ggt cgg tac acg gac agg aag ccg tcg 336 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 cgg aag ttc gat ccg gcc cag atc gag aag gcg atc gaa cgg ctt cac 384 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 gag ccc cac tcc cta gcg ctt cca gga gcg gag ccg agt ttc tct ctc 432 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 ggt gac aag atc aaa gtg aag agt atg aac ccg ctg gga cac aca cgg 480 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 tgc ccg aaa tat gtg cgg aac aag atc ggg gaa atc gtc gcc tac cac 528 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His 165 170 175 ggc tgc cag atc tat ccc gag agc agc tcc gcc ggc ctc ggc gac gat 576 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 cct cgc ccg ctc tac acg gtc gcg ttt tcc gcc cag gaa ctg tgg ggc 624 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 gac gac gga aac ggg aaa gac gta gtg tgc gtc gat ctc tgg gaa ccg 672 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 tac ctg atc tct gcg tga 690 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 2 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 3 <211> 612 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <220> <221> CDS <222> (1)..(609) <400> 3 gtg agc gag cac gtc aat aag tac acg gag tac gag gca cgt acc aag 48 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 gcg atc gaa acc ttg ctg tac gag cga ggg ctc atc acg ccc gcc gcg 96 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 gtc gac cga gtc gtt tcg tac tac gag aac gag atc ggc ccg atg ggc 144 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 ggt gcc aag gtc gtg gcc aag tcc tgg gtg gac cct gag tac cgc aag 192 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 tgg ctc gaa gag gac gcg acg gcc gcg atg gcg tca ttg ggc tat gcc 240 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 ggt gag cag gca cac caa att tcg gcg gtc ttc aac gac tcc caa acg 288 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 cat cac gtg gtg gtg tgc act ctg tgt tcg tgc tat ccg tgg ccg gtg 336 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 ctt ggt ctc ccg ccc gcc tgg tac aag agc atg gag tac cgg tcc cga 384 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 gtg gta gcg gac cct cgt gga gtg ctc aag cgc gat ttc ggt ttc gac 432 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 atc ccc gat gag gtg gag gtc agg gtt tgg gac agc agc tcc gaa atc 480 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 cgc tac atc gtc atc ccg gaa cgg ccg gcc ggc acc gac ggt tgg tcc 528 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 gag gag gag ctg acg aag ctg gtg agc cgg gac tcg atg atc ggt gtc 576 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 agt aat gcg ctc aca ccg cag gaa gtg atc gta tga 612 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 4 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 ggaatgaggc catggatggt atcc 24 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 gcgtaagctt ccgcgagatc agtatccacc g 31 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 ggaattcgta taatgtgtgg aattgtgagc 30 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 ggctgaaaat cttctctcat ccgcc 25 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 gatcatcacc gaagaagggc gaaagcaccg tgtgc 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 gcacacggtg ctttcgccct tcttcggtga tgatc 35 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 caagatcatc accgaagaan nscgaaagca ccgtgtgcaa g 41 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 cttgcacacg gtgctttcgs nnttcttcgg tgatgatctt g 41 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 gtgcccgaaa tatgtgcggn nsaagatcgg ggaaatcgtc g 41 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 cgacgatttc cccgatctts nnccgcacat atttcgggca c 41 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 15 ccatggatgg tatccacgac acaggcggca tgacc 35 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 16 aagcttcacg ctggcctcga gcgcctttgt ccag 34 <210> 17 <211> 1565 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 17 ccatggatgg tatccacgac acaggcggca tgaccggata cggaccggtc ccctatcaga 60 aggacgagcc cttcttccac tacgagtggg agggtcggac cctgtcgatt ctgacctgga 120 tgcatctcaa gggcatgtcg tggtgggaca agtcgcggtt cttccgggag tcgatgggga 180 acgaaaacta cgtcaacgag attcgcaact cgtactacac ccactggctg agtgcggcag 240 aacgtatcct cgtcgccgac aagatcatca ccgaagaaga gcgaaagcac cgtgtgcagg 300 agatcctcga gggtcggtac acggacagga acccgtcgcg gaagttcgat ccggccgaga 360 tcgagaaggc gatcgaacgg cttcacgagc cccactccct agcacttcca ggagcggagc 420 cgagtttctc cctcggtgac aaggtcaaag tgaagaatat gaacccgctg ggacacacac 480 ggtgcccgaa atatgtgcgg aacaagatcg gggaaatcgt cacctcccac ggctgccaga 540 tctatcccga gagcagctcc gccggcctcg gcgacgatcc ccgcccgctc tacacggtcg 600 cgttttccgc ccaggaactg tggggcgacg acggaaacgg gaaagacgta gtgtgcgtcg 660 atctctggga accgtacctg atctctgcgt gaaaggaata cgatagtgag cgagcacgtc 720 aataagtaca cggagtacga ggcacgtacc aaggcaatcg aaactttgct gtacgagcga 780 gggctcatca cgcccgccgc ggtcgaccga gtcgtttcgt actacgagaa cgagatcggc 840 ccgatgggcg gtgccaaggt cgtggcgaag tcctgggtgg accctgagta ccgcaagtgg 900 ctcgaagagg acgcgacggc cgcgatggcg tcattgggct atgccggtga gcaggcacac 960 caaatttcgg cggtcttcaa cgactcccaa acgcatcacg tggtggtgtg cactctgtgt 1020 tcgtgctatc cgtggccggt gcttggtctc ccgcccgcct ggtacaagag catggagtac 1080 cggtcccgag tggtagcgga ccctcgtgga gtgctcaagc gcgatttcgg tttcgacatc 1140 cccgatgagg tggaggtcag ggtttgggac agcagctccg aaatccgcta catcgtcatc 1200 ccggaacggc cggccggcac cgacggttgg tccgaggacg agctggcgaa gctggtgagt 1260 cgggactcga tgatcggtgt cagtaatgcg ctcacacccc aggaagtgat cgtatgagtg 1320 aagacacact cactgatcgg ctcccggcga ctgggaccgc cgcaccgccc cgcgacaatg 1380 gcgagcttgt attcaccgag ccttgggaag caacggcatt cggggtcgcc atcgcgcttt 1440 cggatcagaa gtcgtacgaa tgggagttct tccgacagcg tctcattcac tccatcgctg 1500 aggccaacgg ttgcgaggca tactacgaga gctggacaaa ggcgctcgag gccagcgtga 1560 agctt 1565 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 18 cccgaaatat gtgcggagca agatcgggga aatcg 35 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 19 cgatttcccc gatcttgctc cgcacatatt tcggg 35 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 20 ggagccgagt ttctctcacg gtgacaagat c 31 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 21 gatcttgtca ccgtgagaga aactcggctc c 31 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 22 gaaagacgta gtgtgcgccg atctctggga acc 33 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 23 ggttcccaga gatcggcgca cactacgtct ttc 33 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 24 gagtaccggt cccgagcggt agcggaccct cg 32 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 25 cgagggtccg ctaccgctcg ggaccggtac tc 32 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 26 aacgtcgaca ccggtggtgg 20 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 27 ccgcgacttg tcccgccacg atatgccc 28 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 28 gtacccgggg atccactaga 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 29 ccttagtcag cttctgtccg 20 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 30 ccctcccact cgtagcggaa gaagggctcg 30

Claims

이하의 (a) 또는 (b)의 단백질.

(a) 서열번호 2의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열에 있어서,

제24번째의 페닐알라닌 잔기의 류신 잔기로의 치환,

제88번째의 이소류신 잔기의 페닐알라닌 잔기로의 치환,

제92번째의 글루탐산 잔기의 리신 잔기로의 치환,

제93번째의 글루탐산 잔기의 글리신, 아르기닌, 글루타민, 히스티딘, 류신, 리신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기로의 치환,

제96번째의 히스티딘 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환,

제103번째의 글루탐산 잔기의 아스파라긴산 잔기로의 치환,

제167번째의 아스파라긴 잔기의 세린, 글리신, 이소류신, 리신, 트립토판, 티로신, 발린, 프롤린, 알라닌, 시스테인 또는 트레오닌 잔기로의 치환, 및

제225번째의 티로신 잔기의 히스티딘 잔기로의 치환

으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질 또는

(b) 서열번호 2의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열 중 제167번째의 아스파라긴 잔기가 세린, 글리신, 이소류신, 리신, 트립토판, 티로신, 발린, 프롤린, 알라닌, 시스테인 또는 트레오닌 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질.
서열번호 4의 야생형 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트의 아미노산 서열에 있어서,

제42번째의 아스파라긴 잔기의 아스파라긴산 잔기로의 치환,

제80번째의 알라닌 잔기의 트레오닌 잔기로의 치환,

제118번째의 알라닌 잔기의 발린 잔기로의 치환, 및

제132번째의 아스파라긴산 잔기의 아스파라긴 잔기로의 치환

으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질.
이하의 (a) 또는 (b)의 단백질.

(a) 서열번호 2의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열 중 제167번째의 아스파라긴 잔기가 세린, 글리신, 이소류신, 리신, 트립토판, 티로신, 발린, 프롤린, 알라닌, 시스테인 또는 트레오닌 잔기로 치환된 아미노산 서열에 있어서, 제144번째의 류신 잔기가 히스티딘 잔기로 치환되거나 제219번째의 발린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질 또는

(b) 서열번호 2의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열 중 제167번째의 아스파라긴 잔기가 세린, 글리신, 이소류신, 리신, 트립토판, 티로신, 발린, 프롤린, 알라닌, 시스테인 또는 트레오닌 잔기로 치환된 아미노산 서열, 및 서열번호 4의 야생형 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트의 아미노산 서열에 있어서 제129번째의 발린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 또한 α서브유니트의 제196번째의 류신 잔기가 프롤린 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질.
서열번호 2의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트의 아미노산 서열에 있어서 제26번째의 히스티딘 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환; 및

제48번째의 트립토판 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환

중 하나 이상으로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질.
제4항에 있어서, 제26번째의 히스티딘 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된, 단백질.
제4항에 있어서, 제48번째의 트립토판 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된, 단백질.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따르는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.
이하의 (a) 또는 (b)의 유전자 DNA.

(a) 서열번호 1의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열에 있어서,

제70 내지 72번째가 류신을 암호화하는 치환,

제262 내지 264번째가 페닐알라닌을 암호화하는 치환,

제274 내지 276번째가 리신을 암호화하는 치환,

제277 내지 279번째가 글리신, 아르기닌, 글루타민, 히스티딘, 류신, 리신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기로의 치환을 암호화하는 치환,

제286 내지 288번째가 아르기닌을 암호화하는 치환,

제307 내지 309번째가 아스파라긴산을 암호화하는 치환,

제499 내지 501번째가 세린, 글리신, 이소류신, 리신, 트립토판, 티로신, 발린, 프롤린, 알라닌, 시스테인 또는 트레오닌을 암호화하는 치환, 및

제673 내지 675번째가 히스티딘을 암호화하는 치환으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 갖는 염기 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA 또는

(b) 서열번호 1의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열 중 제499 내지 501번째의 하나 이상의 염기가 세린, 글리신, 이소류신, 리신, 트립토판, 티로신, 발린, 프롤린, 알라닌, 시스테인 또는 트레오닌을 암호화하도록 치환된 염기 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.
서열번호 3의 야생형 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열에 있어서,

제124 내지 126번째가 아스파라긴산을 암호화하는 치환,

제238 내지 240번째가 트레오닌을 암호화하는 치환,

제352 내지 354번째가 발린을 암호화하는 치환, 및

제394 내지 396번째가 아스파라긴을 암호화하는 치환

으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 갖는 염기 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.
이하의 (a) 또는 (b)의 유전자 DNA.

(a) 서열번호 1의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열 중 제499 내지 501번째의 염기의 하나 이상의 염기가 세린, 글리신, 이소류신, 리신, 트립토판, 티로신, 발린, 프롤린, 알라닌, 시스테인 또는 트레오닌을 암호화하도록 치환된 염기 서열에 있어서,

제430 내지 432번째가 히스티딘 또는 제655 내지 657번째가 알라닌을 암호화하도록 치환된 염기 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA 또는

(b) 서열번호 1의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열 중 제499 내지 501번째의 하나 이상의 염기가 세린, 글리신, 이소류신, 리신, 트립토판, 티로신, 발린, 프롤린, 알라닌, 시스테인 또는 트레오닌을 암호화하도록 치환된 염기 서열을 포함하고, 서열번호 3의 야생형 니트릴 하이드라타제의 α서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열 중 제385 내지 387번째의 염기가 알라닌을 암호화하도록 치환된 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 있어서 또한 제586 내지 588번째의 염기가 프롤린을 암호화하도록 치환된 염기 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.
서열번호 1의 야생형 니트릴 하이드라타제의 β서브유니트를 암호화하는 유전자의 염기 서열에 있어서 제76 내지 78번째의 염기가 아르기닌을 암호화하도록 치환된 것; 및

제142 내지 144번째의 염기가 아르기닌을 암호화하도록 치환된 것

중에 하나 이상으로 치환된 염기 서열을 포함하고, 또한, 야생형에 비해 향상된 내열성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 DNA.
제11항에 있어서, 제77번째의 염기 A가 G로 치환된 유전자 DNA.
제11항에 있어서, 제142번째의 염기 T가 C로 치환된 유전자 DNA.
제7항에 따르는 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
제14항에 따르는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 또는 형질도입체.
제15항에 따르는 형질전환체 또는 형질도입체를 배양하여 수득되는 배양물로부터 채취된 니트릴 하이드라타제.
제15항에 따르는 형질전환체 또는 형질도입체를 배양하여 수득되는 배양물로 부터 니트릴 하이드라타제를 채취함을 특징으로 하는, 니트릴 하이드라타제의 제조방법.
제15항에 따르는 형질전환체를 배양하여 수득되는 배양물을 니트릴 화합물에 접촉시키고, 상기 접촉에 의해 생성되는 아미드 화합물을 채취함을 특징으로 하는, 아미드 화합물의 제조방법.