KR20030081484A

KR20030081484A - 니트릴 수화효소 및 아미드의 제조방법

Info

Publication number: KR20030081484A
Application number: KR20037011504A
Authority: KR
Inventors: 도루 나가사와; 아키노부 마츠야마
Original assignee: 다이셀 케미칼 인더스트리즈 리미티드
Priority date: 2001-03-02
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2003-10-17
Also published as: US20040209345A1; WO2002070717A3; CN1571843A; US7300784B2; JP2002325587A; WO2002070717A2; EP1368482A2

Abstract

본 발명의 목적은 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드를 제조할 수 있는 니트릴 수화효소를 제공하는 것이다. 본 발명은 α-히드록시니트릴을 기질로서 이용하여 α-히드록시아미드를 제조하는 신규한 니트릴 수화효소를 제공한다. 상기 효소는 로도코커스 종(Rhodococcus sp.)으로부터 얻을 수 있다. 또한, 상기 효소의 효소 활성은 반응 중 안정하게 유지될 수 있다. 본 발명은 아미드 화합물의 제조방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 효소를 니트릴 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, 니트릴 수화효소의 효소활성을 감소시키지 않고 히드록시 니트릴 화합물로부터 상응하는 아미드 화합물을 생화학적으로 제조할 수 있다.

Description

니트릴 수화효소 및 아미드의 제조방법{Nitrile hydratase and a method for producing amides}

니트릴 수화효소의 발현 수준을 개선하기 위하여 유전공학적으로 미생물 세포 내에서 니트릴 수화효소를 과잉발현시키고 상기 세포를 이용하여 니트릴 화합물을 대응하는 아미드 화합물로 전환시키는 방법이 검토되어 왔다. 예를 들면, 공지의 니트릴 수화효소들이 하기 미생물로부터 유도된다. 모든 니트릴 수화효소는 두가지 타입의 이종형(heterogeneous) 서브유니트로 구성되어 있다.

로도코커스(Rhodococcus) 속 (일본 심사특허출원공보(JP-B) 제 평3-54558호)

로도코커스(Rhodococcus) 속 (일본 미심사특허출원공보(JP-A) 제 평2-119778호)

슈도모나스(Pseudomonas) 속(JP-A 평3-251184호)

로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) 속 (유럽 특허출원 제 455646호)

그러나, 모든 경우에 있어서, 니트릴 수화효소의 발현수준은 상기 특허 공보에 기재된 어떠한 니트릴 수화효소 유전자의 삽입 단편을 포함하는 발현형 플라스미드로 형질전환된 대장균(E.coli)으로도 충분히 높지 않고; 상기 형질전환체의 세포 중량당 니트릴-수화 활성은 상기 유전자가 유래된 원천 미생물의 경우보다 낮다(Ikehata, O., Nishiyama, M., Horinouchi, S. and Beppu, T. "Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus speices N-774 and its expression in Escherichia coli" Eur. J. Biochem. 181(1989), 563-570; Nishiyama, M., Horinouchi, S., Kobayashi, M., Nagasawa, T., Yamada, H. and Beppu, T. "Cloning and Characterization of Genes Responsible for Metabolism of Nitrile Compounds from Pseudomonas chlororaphis B23" Journal of bacteriology 173(1991):2465-2472; Kobayashi,M., Nishiyama, M., Nagasawa, T., Horinouchi, S., Beppu, T. and Yamada, H. "Cloning nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of two cobalt-containing nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous J1" Biochimica et Biophysica Acta. 1129(1991):23-33).

상기한 바와 같이, 유전자 재조합 기술에 의해E.coli내에서 니트릴 수화효소 활성 자체를 발현시키는 것은 가능하였다. 그러나, 이제까지 아미드의 공업적 제조에 사용할 만큼 높은 니트릴 수화 활성을 갖는 형질전환체는 없었다.

한편, 매우 높은 니트릴 수화 활성을 나타내는 니트릴 수화효소는 아크로모박터 제로시스(Achromobacter xerosis, IFO 12668)에서 발견되었고, 상기 효소를 코딩하는 유전자가 클로닝되었다. 또한, 발현 플라스미드를 이용하여 상기 유전자를E.coli에 도입하고 얻어진 형질전환체로 니트릴 수화효소를 과량생산하였다(JP-A 평 8-266277). 그러나, 이 문헌은 아크릴아미드 및 α-히드록시이소부틸아미드의 제조예만을 보여주고, 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴을 위한 상기 효소의 활성에 대해선 개시하고 있지 않다.

따라서, 기질로서 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴(이하 HMBN이라 약칭함)을 사용할 수 있는 니트릴 수화효소에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 또한, 삽입 단편으로서 니트릴 수화효소 유전자를 포함하는 발현 플라스미드로 형질전환된E.coli를 이용하여 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴로부터 2-히드록시-4-메틸티오부틸아미드(이하 HMBAm이라 약칭함)를 제조하는 방법은 알려져 있지 않다.

한편, 미생물에 의한 α-히드록시아미드의 제조와 관련하여, 바실러스(Bacillus) 속, 박테리디움(Bacteridium) 속, 마이크로코커스(Micrococcus) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물을 이용하여 락토니트릴, 히드록시아세토니트릴, α-히드록시 메틸티오부티로니트릴로부터 대응하는 아미드를 제조하는 방법이 공지되어 있다(JP-B 소62-21519 참조). 또한, 시아노히드린으로부터 만델아미드를 제조하는 공지의 방법도 있다(JP-A 평 4-222591; JP-A 평 8-89267 참조).

그러나, 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 전환시킬 수 있는 니트릴 수화효소의 활성을 갖는 효소는 출발 물질로서 존재하는 니트릴 화합물이나 생성물질로서 존재하는 아미드 화합물 때문에 자체의 효소활성을 쉽게 상실한다는 문제가 있다. 아미드화율을 높이기 위하여 니트릴 화합물의 농도를 높이면 니트릴 수화효소가 단기간에 쉽게 불활성화되고 따라서 원하는 시간동안 반응 산물로서 아미드 화합물을 얻기 어렵다. 또한, 생성물질로서 아미드 화합물은 니트릴 수화효소를 쉽게 불활성화하므로 아미드 화합물을 고농도로 얻기 어렵다.

또한, 화합물 타입에 따라 α-히드록시니트릴은 극성 용매 내에서 대응하는 알데히드 및 히드로시안산으로 부분적으로 분해되는 것으로 알려져 있다( V. Okano et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 98, 4201 (1976) 참조). 일반적으로, 알데히드는 단백질에 연계되어 효소 활성을 불활성화시킬 수 있다 (Chemical Modification of Proteins, G. E. Means et al., Holden-Day, 125(1971) 참조). 또한, 알데히드와 마찬가지로, 히드로시안산(시아나이드)은 많은 효소에 제한 활성적으로 작용할 수 있다. 따라서, 출발 물질로서 α-히드록시니트릴로부터 제조된 알데히드 및 시아나이드는 효소활성 감소의 원인이 될 수 있다. 효소적 수화나 α-히드록시 니트릴의 가수분해시 상기 효소가 단기간에 불활성화된다는 문제 때문에 고수율로 고농도의 α-히드록시아미드를 얻는 것은 어려웠다.

효소활성의 손실을 방지하기 위하여, 효소활성을 증가시키거나 효소활성의 손실(불활성화)을 억제하는 다양한 방법이 시험되었다. 예컨대, 그러한 시도는 다음과 같다:

상기 반응을 어는 점으로부터 15℃까지의 비교적 낮은 온도에서 수행한다 (JP-B 소 56-38118).

다중 공급구로부터 저농도의 기질을 계속적으로 공급한다(JP-B 소 57-1234).

미생물이나 그의 공정 산물을 유기용매로 처리한다(JP-A 평 5-308980).

높은 불포화 지방산의 존재하에 반응을 수행한다(JP-A 평 7-265090).

미생물 세포를 글루타르알데히드 등으로 가교처리한다(JP-A 평 7-265091; JP-A 평 8-154691).

니트릴 화합물 내에 오염된 히드로시안산의 농도를 화학적 방법으로 낮춘 후, 니트릴 수화효소를 상기 니트릴 화합물과 반응시킨다(JP-A 평 11-123098 참조).

효소활성의 장기적 안정화는 설파이트 이온, 산 설파이트 이온 또는 디티오나이트 이온의 존재에 의해 달성된다(JP-A 평 8-89267 참조).

알데히드를 부가한다(JP-A 평 4-222591 참조).

상기 방법 중 어느 것도 공업적인 적용에는 충분한 효과가 없었다. 상기 방법 중 몇개는 효과적이었으나, 경제적인 또는 실제적인 개선의 여지가 있었다. 예를 들면, 알데히드를 부가하는 상기 방법은 출발 물질로서 시아노히드린보다 1-5배 과잉 몰량의 알데히드를 필요로 하므로, 상기 방법은 경제적인 해결책이 못된다. 마찬가지로, 설파이트 이온, 산 설파이트 이온 또는 디티오나이트 이온을 가하는 방법은 출발 물질량 이상의 이온량을 부가하여야 하므로 이 방법도 실제적이지 못한 것으로 나타났다.

본 발명의 목적은 높은 니트릴-수화 활성을 갖는 니트릴 수화효소를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 장기간에 걸쳐 높은 효소 활성을 유지할 수 있는 안정된 니트릴 수화효소를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 중요한 목적은 기질로서 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴을 또한 이용할 수 있는 니트릴 수화효소를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 높은 니트릴 수화 활성을 갖는 니트릴 수화효소를 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 이 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 목적은 높은 니트릴 수화 활성을 발현하는 형질전환체를 이용하여 니트릴로부터 대응하는 아미드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 신규한 니트릴 수화효소 및 그 니트릴 수화효소를 이용하여 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도1은 SDS-PAGE에 의한 본 발명의 니트릴 수화효소의 분자량 측정결과를 나타낸다. 가로축은 상대이동도, 세로축은 분자량(kDa)을 나타낸다.

도2는 butyl-Toyopearl 650M 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 니트릴 수화효소의 용출 프로필을 나타낸 그래프이다. 하얀 사각형(□)은 OD₂₈₀, 검은 점(●)은 활성, 짧은 막대(-)는 (NH₄)₂SO₄를 나타낸다.

도3은 겔 여과에 의한 본 발명의 니트릴 수화효소의 분자량 측정결과를 나타낸다. 가로축은 머무름시간, 세로축은 분자량(kDa)을 나타낸다.

도4는 본 발명의 니트릴 수화효소의 HMBN에 대한 Km 값을 S-V 플롯으로 구한 결과를 나타낸 그래프이다.

도5는 본 발명의 니트릴 수화효소의 HMBN에 대한 Km 값을 Lineweaver-Burk 플롯으로 구한 결과를 나타낸 그래프이다.

도6은 본 발명의 니트릴 수화효소의 3-시아노피리딘에 대한 Km 값을 S-V 플롯으로 구한 결과를 나타낸 그래프이다.

도7은 본 발명의 니트릴 수화효소의 3-시아노피리딘에 대한 Km 값을 Lineweaver-Burk 플롯으로 구한 결과를 나타낸 그래프이다.

도8은 본 발명의 니트릴 수화효소 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프이다.

도9는 본 발명의 니트릴 수화효소의 열안정성을 나타낸 그래프이다.

도10은 본 발명의 니트릴 수화효소 활성에 미치는 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.

도11은 본 발명의 니트릴 수화효소의 pH 안정성을 나타낸 그래프이다.

도12는 로도코커스 종(Rhodococcussp.) Cr4의 유전자 클러스터의 배치도이다. 대문자로 나타낸 뉴클레오티드 서열이 ORF에 상당하는 영역이다. 각 ORF가 코딩하고 있는 서브유니트를 뉴클레오티드 서열의 우측에 기재하였다.

도13은 로도코커스 종(Rhodococcussp.) Cr4 및 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트 간의 아미노산 서열의 비교결과를 나타낸 도면이다. 로도코커스 종(Rhodococcussp.) Cr4 (위; CrNH-α)및 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1(아래; J1 L-α)에서 동일한 아미노산을 *로, 상이한 아미노산을 빈 칸으로 표시하였다.

도14는 로도코커스 종(Rhodococcussp.) Cr4 및 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1의 니트릴 수화효소의 β-서브유니트 간의 아미노산 서열의 비교결과를 나타낸 도면이다. 로도코커스 종(Rhodococcussp.) Cr4 (위; CrNH-β)및 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1(아래; J1 L-β)에서 동일한 아미노산을 *로, 상이한 아미노산을 빈 칸으로 표시하였다.

본 발명자들은 정력적인 연구 끝에 상기 목적을 달성하고, 로도코커스 속(로도코커스 종)에 속하는 미생물에서 매우 높은 니트릴 수화 활성을 갖는 니트릴 수화효소를 발견하였다. 그리고, 본 발명자들은 상기 니트릴 수화효소가 상기 목적들을 달성하는 데에 유용한 신규한 효소임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이어서, 본 발명자들은 DNA 재조합 기술을 이용하여 상기 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하고 상기 분리된 유전자를 삽입체로서 함유하는 발현 벡터를 포함하는 발현플라스미드로 형질전환된E.coli를 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 취득한 형질전환체로써 니트릴 수화효소의 대량 생산에 성공하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 하기의 니트릴 수화효소, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 효소의 제조방법 및 본 발명의 효소를 이용한 아미드의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 니트릴 수화효소는 다음과 같은 물리화학적 성질 (a) 및 (b)를 갖는다:

(a) 니트릴 화합물의 니트릴기에 작용하여, 니트릴기를 수화시켜서 아미드기로 전환시키는 성질;

(b) 시아나이드에 대한 내성.

본 발명에 있어서, 니트릴 화합물의 니트릴기를 수화시키고 아미드기로 전환시키는 활성은 "니트릴 수화효소 활성"으로 칭한다. 바람직하게는 하기 화학식1의 화합물에 작용하여 화학식3의 아미드 화합물을 제조할 수 있는 효소를 "니트릴 수화효소"로 칭한다.

(식 중, R은 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 알케닐기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 치환 또는 비치환된 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 포화 또는 불포화된 복소환기를 나타낸다).

바람직하게는, 본 발명의 니트릴 수화효소는 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴에 작용하여 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드를 제조할 수 있다.

본 발명의 니트릴 수화효소의 활성은 다음과 같이 확인할 수 있다. 우선, 효소 샘플을 10% v/v 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴(HMBN)을 기질로서 함유하는 0.1 M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 6.5)에 가한다. 효소 샘플 대신에, 미생물 세포 및 조(粗)효소도 사용할 수 있다. 효소를 가한 후, 상기 용액을 15분간 20℃에서 인큐베이션한다. 이어서 상기 용액을 과량의 0.1% (v/v) 포스페이트 용액과 혼합하고, 상기 혼합물을 격렬히 흔들어 반응을 종료시킨다. 상기 반응 산물을 HPLC로 분석할 수 있다.

상기 분석 방법에 따르면, 니트릴 수화효소 1U는 표준조성을 갖는 반응액에서 20℃에서, 1분 동안 1μmol의 니코틴아미드를 제조할 수 있는 효소의 양으로 정의하였고; 1U는 표준조성을 갖는 반응액에서 20℃에서, 1분 동안 1μmol의 HMBAm를 제조할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.

구체적으로, 예를 들면, 상기 효소 활성은 실시예에 기술된 과정에 의해 분석할 수 있다. 또한, 단백질 정량은 바이오라드(Bio-Rad)사제 단백질 어세이 키트를 이용하여 염료 결합 방법(dye-binding method)으로 수행한다.

한편, 본원에서 "시아나이드 내성"은 1 mM 시아나이드 이온 존재하에 20℃에서 30분간 처리시 상기 효소가 40% 이상의 니트릴 수화효소 활성을 보유하는 것을 의미한다. 또는, 5 mM 시아나이드 이온 존재하에 20℃에서 30분간 처리 후 상기 효소가 10% 이상의 니트릴 수화효소 활성을 보유할 경우, 상기 효소는 시아나이드-내성을 가진다고 말할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 물리화학적 성질 (1)-(7)을 갖는 니트릴 수화효소를제공한다:

(1) 분자량:

겔 여과 방법(gel filtration)으로 측정할 경우 분자량은 약 110,000 Da이다;

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 상기 효소는 26.8 kDa 및 29.5 kDa의 두 서브유니트로 분리된다.

(2) 활성:

상기 효소는 니트릴 화합물의 니트릴기에 작용한다.

(3) 최적 pH:

니트릴기를 수화하는 활성은 pH 5.5 - 6.5에서 최대이다.

(4) 최적 온도:

니트릴기를 수화하는 활성은 40 - 45℃에서 최대이다.

(5) pH 안정성:

상기 효소는 pH 4 - 9에서 안정하다.

(6) 열 안정성:

상기 효소는 50℃에서 30분간 열-처리 후 70% 이상의 활성을 보유한다.

(7) 저해제:

상기 효소는 HgCl₂, AgNO₃, 히드록실아민 또는 페닐히드라진에 의해 저해된다.

또한, 본 발명은 상기 물리화학적 성질 (a) 및 (b), 또는 (1)-(7)에 추가하여 하기 물리화학적 성질 (c) 및/또는 (d)를 갖는 니트릴 수화효소를 제공한다.

(c) 기질 특이성:

상기 효소는 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴을 기질로 이용하여 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드를 생산한다.

(d) 안정화:

상기 효소는 2가 금속 이온에 의해 안정화된다.

본 발명에 있어서, 니트릴 수화효소의 기질 특이성은 상기한 바와 같이 니트릴 수화효소의 활성을 시험하는 방법에 의해 결정할 수 있다. 또한, 본원에서 "2가 금속 이온에 의해 안정화된다"는 것은 상기 효소를 2가 금속이온의 존재하에 20분간 1.8 w/w% 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴과 함께 인큐베이션하여도 효소 활성이 실질적으로 감소되지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 니트릴 수화효소는 상기 조건 하에서 110% 이상 활성을 유지할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2가 금속 이온은 니켈 이온 및 코발트 이온을 포함한다. 상기 2가 금속 이온은 0.1 mM-1 M, 일반적으로 0.5-100 mM, 바람직하게는 1-10 mM의 농도에서 본 발명의 니트릴 수화효소의 효소 활성을 증진시킨다.

본 발명의 니트릴 수화효소는 통상적으로 사용하는 단백질 정제 방법에 의해 상기 효소를 제조할 수 있는 미생물로부터 정제될 수 있다. 상기 미생물은 표준 박테리아 배지에서 배양할 수 있다. 니트릴 수화효소의 발현을 유도하는 일정한 화합물을 상기 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들면, 니트릴 화합물 또는 아미드 화합물을 가하면 니트릴 수화효소의 활성을 증진시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 아세토니트릴, 아세트아미드 등을 그러한 효소-유도제(enzyme-inducer)로서 사용할 수 있다.

상기 효소를 제조할 수 있는 미생물을 충분히 배양한 다음, 세포를 수거한다. 이 세포를 적절한 완충액내에서 용해하여 무세포추출물(cell-free extract)을 제조한다. 상기 완충액은 2-머캅토에탄올과 같은 환원제, 페닐메탄술포닐 플루오라이드(PMFS)와 같은 프로테아제 저해제를 함유할 수 있다. 상기 니트릴 수화효소는 단백질 용해도에 기초한 분획법 및 다양한 크로마토그래피 방법의 적절한 조합으로써 무세포추출물로부터 정제될 수 있다.

단백질 용해도에 기초한 분획법으로서는 예를 들면, 아세톤 및 디메틸술폭시드와 같은 유기용매로 침전 또는 암모늄 설페이트로 염석(salting out)을 이용할 수 있다. 한편, 공지의 크로마토그래피 방법은 염료(dye), 항체 등을 이용하는 다수의 친화성 크로마토그래피 방법뿐만 아니라 양이온-교환 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 크로마토그래피를 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 니트릴 수화효소는 예를 들면, 페닐-토요펄(phenyl-TOYOPEARL), DEAE-세파로스(DEAE-Sepharose)를 이용한 음이온-교환 크로마토그래피, 부틸-토요펄(butyl-TOYOPEARL)을 이용한 소수성 크로마토그래피, 블루-세파로스(Blue-Sepharose)를 이용한 친화성 크로마토그래피, 수퍼덱스 200(Superdex 200)을 이용한 겔 여과 등에 의해 전기영동시 동형(homogeneous) 폴리펩티드로서 정제할 수 있다.

이러한 목적에 사용할 수 있는 미생물로는 예를 들면, 로도코커스 속 (로도코커스 종)에 속하는 것들을 포함한다. 보다 구체적으로, 로도코커스 종(Rhodococcus sp.) Cr4는 본 발명의 니트릴 수화효소를 제조하기에 적합한 미생물이다. 로도코커스 종 Cr4는 국제 특허 기탁 기관에 수탁번호 FERM BP-6596로 기탁되어 있다.

로도코커스 종 Cr4의 국제 기탁:

(a) 기탁 기관의 명칭 및 주소

명칭: 국제 특허 기탁 기관(International Patent Organism Depositary), 국립 첨단 공업 과학 및 기술 연구소(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)), 독립 행정법인 산업기술총합연구소(Independent Administrative Institution, 구명칭: 경제산업성 산업기술총합연구소 생명공학 공업기술 연구소, The National Institute of Bioscience and Human-Technology, The Agency of Industrial Science and Technology, The Ministry of International Trade and Industry)

주소: 일본 이바라키 305-8566, 츠쿠바시, 히가시 1-쵸, 츄오 6, 1-1 (Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566 Japan)

(b) 기탁일 (원 기탁일): 1998, 12, 8.

(c) 수탁 번호: FERM BP-6596

로도코커스 종 Cr4로부터 얻을 수 있는 본 발명의 니트릴 수화효소는 상기한물리화학적 성질 (a)-(d) 및 (1)-(7)를 갖는 신규한 효소이다. 구조적 특징은 물리화학적 성질(1)로서 상기하였다; 상기 효소는 SDS-PAGE로 결정시, 26.8 kDa의 α-서브유니트 및 29.5 kDa의 β-서브유니트로 구성되는 이형-이분체(hetero-dimeric) 폴리펩티드이다. α-서브유니트의 아미노산 서열은 서열번호: 2 (226개의 아미노산 잔기)로 나타내었고, β-서브유니트의 아미노산 서열은 서열번호: 4 (207개의 아미노산 잔기)로 나타내었다. 즉, 본 발명은 니트릴 수화효소 활성을 갖는 실질적으로 순수한 하기 단백질 복합체를 제공한다.

본 발명은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 간의 실질적으로 순수한 단백질 복합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 간의 실질적으로 순수한 단백질 복합체의 동족체(homologue)를 포함한다.

주어진 단백질, 폴리펩티드, 또는 단백질 복합체에 대하여 본원에서 "실질적으로 순수"하다는 말은 상기 단백질, 폴리펩티드, 또는 단백질 복합체에 다른 생물학적 거대분자가 실질적으로 없다는 것을 의미한다. 실질적으로 순수한 단백질, 폴리펩티드, 또는 단백질 복합체는 건조 중량으로 75% 이상 (예컨대, 적어도 80, 85, 95, 또는 99%) 순수하다. 순도는 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석과 같이 당업계 공지의 적절한 표준 방법 중 어느 것으로도 측정할 수 있다.

본 발명의 단백질 복합체는 본 발명의 니트릴 수화효소를 코딩하는 분리된폴리뉴클레오티드를 이용하여 유전자 재조합 기술에 의해 발현될 수 있는 니트릴 수화효소이다. 본 발명의 니트릴 수화효소를 코딩하는 폴리펩티드는 예를 들면, 하기 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 니트릴 수화효소는 (A)-(E) 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-서브유니트 및, (a)-(e) 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 β-서브유니트로 구성되며, 하기 물리화학적 성질 (i) 및 (ii)를 갖는 단백질 복합체이다.

(i) 효과:

니트릴 화합물의 니트릴기에 작용하여 니트릴기를 수화시켜 아미드기로 전환시킨다;

(ii) 기질 특이성:

상기 효소는 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴을 기질로 사용하여 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드를 생산한다.

하기 (A)-(E) 중 어느 하나에 나타낸 폴린뉴클레오티드는 본 발명의 단백질 복합체를 구성하는 α-서브유니트를 코딩하는 유전자로서 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, (A)-(E) 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트를 발현하기에 유용하다:

(A) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(B) 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(C) 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 함유하는 것;

(D) 엄격한 조건(stringent conditions)하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화(hybridizing)될 수 있는 폴리뉴클레오티드;

(E) 서열번호: 2 의 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 상동성(identity)을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

또한, 하기 (a)-(e) 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 단백질 복합체를 구성하는 β-서브유니트를 코딩하는 유전자로서 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, (a)-(e) 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 니트릴 수화효소의 β-서브유니트를 발현하기에 유용하다:

(a) 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 함유하는 것;

(d) 엄격한 조건(stringent conditions)하에서 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드;

(e) 서열번호: 4 의 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

본 발명은 니트릴 수화효소의 서브유니트 및 그의 동족체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본원에서 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 그 구조가 여하한 자연 발생 폴리뉴클레오티드나 세개 이상 별개의 유전자를 포함(spanning)하는 자연 발생 게놈 폴리뉴클레오티드의 어떠한 단편과도 동일하지 아니한 폴리뉴클레오티드이다. 따라서, 상기 용어는 예를 들면, (a) 자연 발생의 기원이 되는 생물체 게놈 내 자연 발생 게놈 DNA 분자의 부분적 서열을 갖는 DNA; (b) 벡터나 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA에 편입되어 결과적으로 만들어지는 분자가 어떠한 자연발생 벡터나 게놈 DNA와도 동일하지 않게 되는 폴리뉴클레오티드; (c) cDNA, 게놈 단편, 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction (PCR))에 의해 제조된 단편, 또는 제한 단편(restriction fragment)과 같이 분리된 분자; 및 (d) 혼성화 유전자(hybrid gene), 즉 퓨젼 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 부분인 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상이한 (i) DNA 분자, (ii) 형질감염된 세포(transfected cells), 또는 (iii) 세포 클론의 혼합물 내에 존재하는 DNA 분자의 폴리뉴클레오티드는 상기 정의에서 특별히 제외되는데, 예컨대 이들은 cDNA나 게놈 DNA 라이브러리와 같은 DNA 라이브러리 내에서 발생하기 때문이다.

따라서, 어떤 측면에서는 본 발명은 여기서 기술된 폴리펩티드나 그의 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게는, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 1 또는 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호: 1 또는 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 갖는다. 길이에 있어서 참조서열, 예컨대 서열번호 : 1 또는 3과 길거나 동등한 분리된 폴리뉴클레오티드의 경우, 상기 비교는 참조 서열의 전체 길이로써 행하였다. 분리된 폴리뉴클레오티드가 참조 서열, 예컨대 서열번호: 1 또는 3보다 짧을 경우, 상기 비교는 같은 길이의 참조 서열의 단편(호모롤지 계산에서 필요한 루프는 제외)으로써 행하였다.

본 발명의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트 및 β-서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 각각은 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 마찬가지로 신규하다. 본 발명에서 개시된 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 상기한 바와 마찬가지로 기탁된 미생물로부터 원하는 유전자를 얻을 수 있다. 상기 유전자는 PCR이나 혼성화 기술로 스크리닝하여 얻을 수 있다. 전체 길이 유전자는 화학적 DNA 합성에 의해서도 얻을 수 있다.

또한, 상기 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 다른 생물체로부터 유래된 니트릴 수화효소 유전자를 얻을 수 있다. 예를 들면, 상기 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부의 서열을 프루브로 이용하여 다른 생물로부터 제조한 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에 혼성화함으로써 각종 생물 유래의 니트릴 수화효소를 분리할 수 있다.

"엄격한 조건하에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드"라 함은 서열번호: 1 (α-서브유니트) 및 서열번호: 3 (β-서브유니트)에 기재된 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 프루브로 하는 폴리뉴클레오티드에, 예를 들면 ECL 직접 핵산-표지법 및 검출 시스템(Amersham Pharmacia Biotech사제)을 이용하여 매뉴얼에 기재된 조건(42℃에서 0.5x SSC를 함유하는 1차 세척 완충액으로 세척)에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다. 이하 기술하는 바와 같이 본 발명에는 고도의 엄격한 조건하에서 서열번호: 1의 뉴클레오티드 서열이나 그의 단편에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 포함된다. "고도의 엄격한 조건(High stringency conditions)" 이란 약 45℃에서 6x SSC에서 혼성화하고, 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS내에서 1회 이상 세척하는 것을 말한다. 프루브 폴리뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드 서열은 상기 뉴클레오티드 서열로부터 임의로 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 예를 들면 40, 60 또는 100개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 하나 또는 복수개의 서열로서 제조할 수 있다.

또한, 상기 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 호몰로지(homology)가 높은 영역으로부터 PCR용의 프라이머를 디자인할 수 있다. 이러한 프라이머를 이용하여 염색체DNA 또는 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 행하면, 니트릴 수화효소를 코딩하는 유전자를 각종 생물로부터 분리할 수 있다.

본 발명에 있어서, 자연형 효소 뿐만 아니라, 상기 물리화학적 성질(a) 및 (b) 또는 상기 물리화학적 성질 (1)-(7)을 갖는 단백질 복합체를 형성할 수 있는 한, 자연형 효소의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 효소를 이용할 수도 있다. 당업자라면, 예를 들어, 부위특이적 돌연변이법(site-specific mutagenesis) (Nucleic Acid Res. 10, pp.6487 (1982); Methods in Enzymol.100, pp.448 (1983); Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); PCR, A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)) 등을 이용하여 적절한 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 변이를 도입함으로써 폴리펩티드의 구조를 변화시킬 수 있다. 또한, 아미노산 변이는 자연계에 있어서 발생하는 경우도 있어서, 인공적으로 아미노산을 변이한 효소뿐만아니라, 자연계에 있어서 아미노산이 변이된 효소도 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

효소가 상기 물리화학적 성질(a) 및 (b) 또는 상기 물리화학적 성질 (1)-(7)을 갖는 단백질 복합체를 형성할 수 있는 한, 변이가 되는 아미노산의 수는 특별히 제한되지 않는다. 통상적으로, 그것은 50개의 아미노산, 바람직하게는 30개의 아미노산, 보다 바람직하게는 10개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 3개의 아미노산 내이다. 효소가 상기 물리화학적 성질(a) 및 (b) 또는 상기 물리화학적 성질 (1)-(7)을 갖는 단백질 복합체를 형성할 수 있는 한, 변이의 자리는 어느 곳이라도 될 수 있다.

아미노산 치환의 경우 바람직하게는 상기 아미노산의 측쇄(side-chain)의 특성이 보존되는 상이한 아미노산(들)로 변이되는 것이다. "보존적 아미노산 치환"은 화학적으로 유사한 측쇄를 갖는 하기 군의 하나에 속하는 하나의 아미노산 잔기를 동일 군 내 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군은 당업계에 정의되어 있다. 상기 군은 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향성 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서, 니트릴 수화효소의 각 서브유니트의 아미노산 서열에 대해 호몰로지를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자도 그 생성산물이 상기 물리화학적 성질 (a) 및 (b), 또는 상기 물리화학적 성질 (1)-(7)을 갖는 단백질 복합체를 형성하는 한, 본 발명에 이용할 수 있다. 이들 유전자는 단백질의 호몰로지 검색을 이용하여 얻을 수 있다. 호몰로지 검색에는 예를 들면, 하기 데이터 베이스를 이용할 수 있다:

SWISS-PROT 및 PIR 등의 단백질 아미노산 서열에 관한 데이터 베이스,

DNA Databank of JAPAN (DDBJ), EMBL 및 GenBank 등의 DNA 데이터 베이스,

DNA 서열로부터 추론되는 아미노산 서열의 데이터 베이스, 및

FASTA 프로그램 및 BLAST 프로그램 등의 상동성 검색용 프로그램. 또한, 상기 데이터 베이스 검색용 상기 프로그램을 이용하는 데이터 베이스 검색 서비스도 인터넷 상에서 제공되고 있다. 이러한 종류의 서비스를 이용하여 본 발명에서 이용하는 니트릴 수화효소를 찾을 수 있다.

서열번호: 2(α-서브유니트) 또는 서열번호: 4 (β-서브유니트)에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 단백질은 본 발명에 사용하는 니트릴 수화효소를 구성하는 단백질로서 바람직하다. 본원에서 "상동성 백분율(percent identity)"이라 함은 예를 들어, BLAST 프로그램을 이용한 "양성(positive)"의 상동성 백분율을 의미한다. 구체적으로, 두 핵산이나 두 아미노산 서열의 상동성 백분율은 Karlin 및 Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)에 의해 개선된 Karlin 및 Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990)의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 그러한 알고리즘은 Altschul 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). BLAST 핵산 검색은 NBLAST 프로그램, score = 100, wordlength = 12 으로 수행된다. 단백질의 상동성 검색(Homology search)은 예를 들어, FASTA 프로그램, BLAST 프로그램 등을 이용하여 DNA Databank of JAPAN (DDBJ) 내에서 쉽게 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, score = 50, wordlength = 3으로 수행된다. 두 서열 간 갭이 존재하는 경우, Altsuchl 등 (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)에 기재된 바에 따라 Gapped BLAST가 이용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터(default parameters)가 이용된다.

본 발명에 있어서, 서열번호: 2 에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 α-서브유니트, 및 서열번호: 4 에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 β-서브유니트에 대해 각각 아미노산 서열에 변이를 갖는 폴리펩티드를 이용하여 단백질 복합체를 얻는 경우, 어느 한 쪽, 또는 양 쪽이 변이체 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 유래가상이한 서브유니트를 조합하여 본 발명의 단백질 복합체로 형성할 수 있다. 두 서브유니트 중 어느 한 쪽의 서브유니트를 변이체로 할 경우, 다른 쪽의 서브유니트와 함께 상기 물리화학적 성질 (1) 및 (2)를 갖는 단백질 복합체를 구성할 수 있는 변이체를 선택하여야 한다.

또한, α-서브유니트와 β-서브유니트의 양 쪽에 변이체를 이용한 경우에는 한 변이체에 대해 다른 변이체를 조합하여 상기 물리화학적 성질 (i) 및 (ii)를 갖는 단백질 복합체를 구성할 수 있는 변이체를 마찬가지로 선택한다. 이 경우, 우선 야생형(wild-type)의 아미노산 서열을 갖는 서브유니트와 조합할 경우, 필요한 물리화학적 성질을 나타내는지 변이체 서브유니트를 시험한다. 결과가 양성일 경우,상기 필요한 물리화학적 성질을 나타내는 또 하나의 변이체를 첫번째 변이체와 조합하여 사용하는 짝 서브유니트로서 선택하고; 이에 따라서 변이체를 용이하게 선택할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직한 변이체는 상기 물리화학적 성질 (i) 및 (ii)에 더하여 상기 물리화학적 성질 (a) 및 (b), 또는 상기 물리화학적 성질 (1)-(7)을 갖는다.

본 발명에 있어서, 바람직한 효소 활성 물질로서는 니트릴 수화효소를 코딩하는 유전자를 유전자 재조합 기술을 이용하여 동종(homologous) 또는 이종(heterogonous)의 숙주 내에서 발현시킨 형질전환체, 또는 그 처리물을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 니트릴 수화효소 유전자를 발현시키기 위하여 형질전환의 대상이 되는 생물은, 니트릴 수화효소 활성을 갖는 단백질 복합체를 구성하는 각서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되어 니트릴 수화효소 활성을 발현할 수 있는 생물이면 특별히 제한되지 않는다. 각 서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나의 단일 벡터에 보유시킬 수 있다. 또한, 각 서브유니트에 대한 폴리뉴클레오티드를 두가지 형의 벡터에 삽입시켜 공-형질감염(co-transfect)시킴으로써 본 발명의 단백질 복합체를 발현시킬 수 있다. 또한, 둘 중 단일 서브유니트만을 발현하는 각각의 형질전환체를 조합함으로써 목적으로 하는 단백질 복합체를 체외(in vitro)에서 얻을 수도 있다. 이용가능한 미생물로서는 숙주-벡터계가 이용될 수 있는 것으로서 예를 들면, 하기하는 바와 같은 것을 포함한다:

에스케리치아(Escherichia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 세라티아(Serratia) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속과 같은 박테리아;

로도코커스(Rhodococcus) 속 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속과 같은 방선균(actinomycetes);

사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 속, 야로위아(Yarrowia) 속, 트리코스포론(Trichosporon) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 피키아(Pichia) 속, 및캔디다(Candida) 속과 같은 효모; 및,

뉴로스포라(Neurospora) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 세팔로스포리움(Cephalosporium) 속, 및 트리코더마(Trichoderma) 속과 같은 곰팡이 등.

형질전환체의 제작을 위한 방법 및 숙주에 적합한 재조합 벡터의 구축은 분자생물학, 생물공학, 및 유전공학의 분야에 있어서 관용되어 있는 기술을 채용하여 행할 수 있다(예컨대, Sambrook et al., "Molecular Cloning",　 Cold Spring Harbor Laboratories 참조). 미생물 내에서 본 발명의 니트릴 수화효소를 발현시키기 위해서는 우선 미생물 내에서 안정하게 존재하는 플라스미드 벡터나 파지 벡터 내에 상기 폴리뉴클레오티드를 도입하고 그 유전정보를 전사, 번역시킬 필요가 있다. 이를 위하여 전사, 번역을 제어하는 유니트에 해당하는 프로모터를 본 발명의 폴리뉴클레오티드 5'측 상류에, 바람직하게는 터미네이터를 상기 폴리뉴클레오티드 3'측 하류에 위치시킨다. 상기 프로모터 및 터미네이터로서는 숙주로 이용하는 미생물 내에서 기능하는 것이어야 한다. 상기 각종 미생물에 있어서 이용가능한 벡터, 프로모터 및 터미네이터 등에 관하여는 "Fundamental Course in Microbiology (8): Genetic Engineering",　 Kyoritsu Shuppan, 특히 효모에 관해서는 "Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102(1990)" 및 "Yeast 8, 423-488 (1992)" 에 상세히 기술되어 있다.

예를 들면, 에스케리치아 (Escherichia) 속, 특히 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)에 있어서는 플라스미드 벡터로서 pBR 계 및 pUC 계 플라스미드를 이용할 수 있고, 프로모터로는 lac (β-갈락토시다제 유전자로부터 유래), trp (트립토판 오페론으로부터 유래), tac 및 trc (lac 및 trp의 키메라), λ파지의 PL 및 PR, 등 유래의 프로모터를 이용할 수 있다. 또한, 터미네이터로는 trpA, 파지, rrnB 리보좀 RNA, 등에서 유래된 것을 이용할 수 있다. 이들 중에서, 시판되는 pSE420 (Invitrogen사제)의 다중 클로닝 부위(multicloning site)를 부분적으로 변형시킨 벡터 pSE420D (일본 비심사 특허 공개 (JP-A) 제 2000-189170호에 기재)를 바람직하게 이용할 수 있다.

바실러스 속에 대해서는, pUB110 계 및 pC194 계 플라스미드 등이 이용가능하고, 숙주 염색체 내에 합체될 수 있다. 또한, 프로모터, 터미네이터로서 apr (알칼리 프로테아제), npr (중성 프로테아제), amy (α-아밀라제), 등을 이용할 수 있다.

슈도모나스 속에 대해서는, 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 및 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia)에 대한 숙주-벡터계가 개발되어 있다. 톨루엔 화합물의 분해에 관여하는 TOL 플라스미드에 기초한 광숙주역 벡터(broad-host-range vector), pKT240(자가 복제에 필요한 RSF1010-유래의 유전자를 포함)가 이용가능하고, 리파제 유전자 (JP-A 평 5-284973)에서 유래된 프로모터 및 터미네이터가 이용가능하다.

브레비박테리움 속, 특히 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)에 대해서는, pAJ43 (Gene 39, 281 (1985))등의 플라스미드 벡터가 이용가능하다. 프로모터 및 터미네이터로서는 대장균 (Escherichia coli)에서 사용되고 있는 프로모터, 터미네이터를 브레비박테리움에도 변형없이 그대로 이용가능하다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 대해서는, pCS11 (JP-A 소 57-183799) 및 pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175(1984))과 같은 플라스미드 벡터가 이용가능하다.

스트렙토코커스 속에 대해서는 pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)) 및 pGK1 (Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985))과 같은 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다.

락토바실러스 속에 대해서는 스트렙토코커스 속 용으로 개발된 pAMβ1 (J. Bacteriol. 137, 614 (1979))과 같은 플라스미드 벡터를 이용할 수 있고, 프로모터로서는 에스케리치아 콜리에 이용되는 것을 또한 이용할 수 있다.

로도코커스 속에 대해서는 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous)로부터 분리된 플라스미드 벡터가 이용가능하다(J. Gen. Microbiol. 138, 1003 (1992)).

스트렙토마이세스 속에 대해서는, Hopwood 등에 의한 "Genetic Manipulation of Streptomyces: A laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratories (1985))에 기재된 방법에 따라 플라스미드를 구축할 수 있다. 특히, 스트렙토마이세스 리비단(Streptomyces lividans)에 대해서는 pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986), pKC1064 (Gene 103, 97-99 (1991)), 및 pUWL-KS (Gene 165, 149-150 (1995))를 이용할 수 있다. 스트렙토마이세스 비르기니에(Streptomycesvirginiae)에 대해 동일한 플라스미드를 또한 이용할 수 있다(Actinomycetol. 11, 46-53 (1997)).

사카로마이세스 속, 특히 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 대해서는, YRp 계, YEp 계, YCp 계, 및 YIp 계 플라스미드가 이용가능하고; 다수 카피-리보좀 DNA와 상동 재조합(homologous recombination)을 통하여 염색체 내에 삽입되는 삽입벡터(integration vectors)(EP 537456등 참조)는 다수 카피로 목적으로 하는 유전자를 도입할 수 있고, 삽입된 유전자는 안정하게 미생물 내에서 유지되므로, 이러한 유형의 벡터는 매우 유용하다. 또한, ADH (알코올 탈수소효소), GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소), PHO (산성 포스파타제), GAL (β-갈락토시다제), PGK (포스포글리세레이트 키나제), ENO (에놀라제), 등을 코딩하는 유전자로부터 유래된 프로모터 및 터미네이터가 이용가능하다.

클루이베로마이세스 속, 특히 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에 대해서는 사카로마이세스 세레비지에 유래의 2μm 플라스미드, pKD1 계 플라스미드 (J. Bacteriol. 145, 382-390(1981)), 킬러 활성에 관여하는 pGKl1 유래 플라스미드, KARS (클루이베로마이세스 자가 복제 서열, Kluyveromyces autonomous replication sequence) 플라스미드, 및 리보좀 DNA와 상동 재조합을 통하여 염색체에 삽입될 수 있는 플라스미드 (EP 537456, 등 참조) 등이 이용가능하다. 또한, ADH, PGK 등으로부터 유래하는 프로모터 및 터미네이터가 이용가능하다.

스키조사카로마이세스 속에 대해서는, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)유래의 ARS (자가 복제 서열) 및 사카로마이세스세레비지에 유래의 영양요구성-보충형 선택 마커 (auxotrophy-complementing selectable markers)를 포함하는 플라스미드 벡터가 이용가능하다(Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)). 또한, 스키조사카로마이세스 폼베 유래의 ADH 프로모터 등의 프로모터가 이용가능하다(EMBO J. 6, 729 (1987)). 특히, pAUR224는 TaKaRa Shuzo사로부터 시판되어 용이하게 이용할 수 있다.

자이고사카로마이세스에 대해서는, 자이고사카로마이세스 룩시(Zygosaccharomyces rouxii) 유래의 pSB3 (Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)) 등으로부터 유래하는 플라스미드가 이용가능하고, 사카로마이세스 세레비지에 유래의 PHO5 프로모터 및 자이고사카로마이세스 룩시 유래 GAP-Zr (글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소) 프로모터 등이 이용가능하다(Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)).

피키아 속에 대해서는, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 등에 피키아 유래 자가 복제에 관여하는 유전자 (PARS1 및 PARS2) 등을 이용한 숙주 벡터 계가 개발되어(Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)), 고농도 배양과 메탄올로 유도가능한 AOX등 강한 프로모터를 이용할 수 있다(Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)).

또한, 피키아 속 중에서 피키아 안구스타(Pichia angusta, 구명칭: 한세눌라 폴리모르파,Hansenula polymorpha)에 대하여 숙주벡터계가 개발되어 있다. 벡터로서는 피키아 안구스타 유래의 자가복제에 관여하는 유전자(HARS1 및 HARS2)도 이용가능하지만, 비교적 불안정하기 때문에, 염색체 내로 다수 카피 삽입(multi-copy integration)이 유효하다(Yeast 7, 431-443 (1991)). 또한, 메탄올 등으로 유도되는 AOX (알코올 산화효소) 및 FDH (포름산 탈수소효소)의 프로모터 등이 또한 이용가능하다. 자가 복제에 관련된 피키아-유래 유전자(PARS1 및 PARS2)가 피키아 파스토리스 등 내에서 사용되는 또 다른 숙주 벡터 계가 개발되었고(Mol.Cell.Biol.5, 3376(1985)), 이에 따라 고농도의 배양 및 메탄올로 유도가능한 AOX 등의 강력한 프로모터가 이용하능하다(Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)).

캔디다 속에 대해서는 캔디다 말토사(Candida maltosa), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 등에 대하여 숙주-벡터계가 개발되어 있다. 캔디다 말토사에 대하여는 캔디다 말토사 유래의 자가 복제 서열이 클론되어(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)), 이를 이용한 벡터가 개발되어 있다. 또한, 캔디다 유틸리스에 대하여는 매우 효율적인 프로모터 유니트를 가진 염색체 삽입형의 벡터(chromosome-integration vector)가 개발되어 있다(JP-A 평 08-173170).

아스퍼질러스 속에 대해서는, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)가 곰팡이 가운데에서 가장 잘 연구되어 플라스미드 벡터 및 염색체내 삽입(integration) 벡터가 이용가능하고, 균체외 프로테아제 유전자 및 아밀라제 유전자 유래의 프로모터가 이용가능하다(Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)).

트리코더마 속에 대하여는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)에 대한 숙주-벡터계가 개발되었고, 균체외 셀룰라제 유전자 유래 프로모터 등이 이용가능하다(Biotechnology 7, 596-603(1989)).

미생물이외에서도 식물, 동물에서 다양한 숙주-벡터계가 개발되어 있고, 특히 누에를 이용한 곤충(Nature 315, 592-594(1985)) 및 평지, 옥수수, 감자 등의 식물계가 개발되어 있어서 바람직하게 이용할 수 있다. 형질 전환체의 배양, 및 형질전환체로부터의 니트릴 수화효소의 정제는 당업자에게 공지된 방법으로 행할 수 있다.

본 발명의 벡터에 있어서, 니트릴 수화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는 예를 들면 상기 (A)-(E) 중 어느 것에 기재된 폴리뉴클레오티드, 및 상기 (a)-(e) 중 어느 것에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 벡터에 있어서, 니트릴 수화효소의 α-서브유니트 및 β-서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일렬로(tandem) 연결되는 것이 바람직하다. "바람직하게 일렬로 연결된다"는 말은 공통의 제어 영역의 지배하에 이들 서브유니트가 발현되도록 연결되는 것을 말한다. 이러한 배치를 함으로써 보다 효율적인 서브유니트의 발현과 효소활성을 갖는 단백질 복합체의 보다 효율적인 형성을 기대할 수 있다. 또는 각 서브유니트에 대한 폴리펩티드를 두가지 형태의 벡터에 별개로 삽입시켜서 2개의 벡터를 공형질전환함으로써 단백질 복합체를 형성시킬 수도 있다.

본 발명은 또한 벡터를 발현가능하게 보유한 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 벡터를 기능적으로 보유할 수 있는 숙주라면 임의의 숙주에 형질전환시킬 수 있다. 이러한 목적에 사용하는 숙주로서는 예컨대 대장균(E. coli)을 이용할 수 있다.

본 발명의 니트릴 수화효소, 니트릴 수화효소를 생산하는 미생물, 본 발명의 단백질 복합체, 단백질 복합체를 생산하는 형질전환체, 및 이들의 처리물은 니트릴 화합물을 기질로 사용하는 아미드의 제조에 유용하다. 즉, 본 발명은 본 발명의 니트릴 수화효소, 니트릴 수화효소를 생산하는 미생물, 본 발명의 단백질 복합체, 단백질 복합체를 생산하는 형질전환체, 및 이들의 공정산물로 이루어진 군에서 선택되는 효소학적으로 활성인 물질을 니트릴 화합물과 접촉시켜 아미드를 회수하는 공정을 포함하는, 아미드의 제조방법을 제공한다.

본 원에서, "니트릴 수화효소"라 함은 상기 물리화학적 성질 (a) 및 (b)를 갖는 효소, 또는 상기 물리화학적 성질 (1)-(7)를 갖는 효소를 말한다. 또한, 본 효소를 생산할 수 있는 미생물이라 함은 상기 효소가 유래된 균주 로도코커스 종 (Rhodococcus sp.) Cr4, 본 발명의 효소를 생산하는 로도코커스 속의 미생물, 및 이 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 미생물 숙주를 포함한다. 또한, "형질전환된 미생물 숙주"라 함은 상기 α-서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (A)-(E), 및/또는 β-서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (a)-(e) 를 발현할 수 있는 미생물 숙주를 말한다. 본 발명에 있어서, 상기 미생물 숙주는 본 발명의 α-서브유니트 및 β-서브유니트로 이루어진 본 발명의 단백질 복합체를 생산할 수 있다.

또한, 미생물의 처리물이라 함은 구체적으로는 계면활성제나 톨루엔 등의 유기용매 처리에 의해 세포막의 투과성을 변화시킨 미생물, 또는 유리 비드나 효소 처리에 의해 균체를 용해하여 얻어진 무세포추출물이나 그 추출물로부터 부분정제한 물질 등이 포함된다. 또는, 효소의 처리물이라 함은 효소를 불용성의 담체나 수용성의 담체분자에 결합시킨 것이나 효소분자를 고정함으로써 얻어지는 고정화 효소등이 포함된다.

본 발명에 있어서 효소학적으로 활성인 물질이라 함은 본 발명의 니트릴 수화효소의 효소활성을 보유하고 있는 물질을 전부 포함한다. 따라서, 효소의 순도 및 용해상태와 무관하게 목적으로 하는 효소활성을 보유하고 있는 한, 효소학적으로 활성인 물질에 포함된다.

본 발명에 의한 아미드의 제조방법을 구성하는 효소반응은 상기 효소학적으로 활성인 물질을 기질인 니트릴 화합물을 함유하는 반응용액과 접촉시킴으로써 실시할 수 있다. 구체적으로는 수성 용매 내, 수성 용매와 수용성의 유기용매로 구성되는 혼합용매, 또는 수불용성의 용매의 2상계 내에서, 효소학적으로 활성인 물질과 기질을 접촉시킬 수 있다. 수성 용매로서는 인산완충액(phosphate buffer), 및 트리스-염산 완충액(Tris-HCl buffer) 등의 중성 pH 부근에서 완충능을 갖는 완충액을 포함한다. 또는, 산과 알칼리를 이용하여 반응중의 pH 변화를 바람직한 범위내로 억제할 수 있다면 완충액은 특별히 사용할 필요가 없다. 물에 용해하기 어려운 유기용매로서는 예를 들면, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 톨루엔, 클로로포름, n-헥산 및 이소옥탄 등을 포함한다. 에탄올, 아세톤, 디메틸술폭시드 및 아세토니트릴 등의 유기용매와 수성 매체와의 혼합 용매 내에서 상기 반응을 행할 수 있다.

2상계(two-phase system)로서는 효소학적으로 활성인 물질은 수상에 존재하며, 다른 용매없이 그대로, 또는 물이나 완충액과 조합하여 이용된다. 기질화합물을 물, 완충액 및 에탄올 등의 수용성 용매에 용해시켜서 반응계로 제공할 수도 있다. 이런 경우는 효소학적으로 활성인 물질과 함께 기질은 단일상의 반응계(single-phase reaction system)를 구성한다. 그 밖에 본 발명의 반응은 고정화효소, 막반응기(membrane reactor) 등을 이용하여 행하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 형질전환체는 배양물, 배양배지로부터 여과, 원심분리 등으로 분리된 세포나 원심분리 및 세척으로 분리 후 완충액, 물 등에 재현탁된 세포의 형태로 이용될 수 있다. 상기 분리된 세포는 회수된 상태로, 파쇄된 상태로, 아세톤이나 톨루엔으로 처리된 상태로, 동결건조체(lyophilizate) 상태로 사용될 수 있다. 상기 효소가 균체외 생산된 경우, 형질전환체의 배양배지는 통상의 방법으로 형질전환체로부터 분리된 후에도 사용될 수 있다. 효소학적으로 활성인 물질과 반응용액의 접촉형태는 이들 구체예에 한정되지 않는다. 반응용액이라 함은 효소활성의 발현에 적합한 환경을 부여하는 적절한 용매와 그 용매에 용해된 기질로 구성된 용액을 의미한다.

본 발명의 니트릴 수화효소를 이용하는 아미드의 제조방법에서 사용되는 니트릴 화합물의 형태는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 하기의 니트릴 화합물을 본 발명의 제조방법에 이용할 수 있다.

포화 모노니트릴류;

아세토니트릴, 프로피오니트릴, 부티로니트릴, 이소부티로니트릴, 발레로니트릴, 이소발레로니트릴, 카프로니트릴, 등.

포화 디니트릴류;

말로니트릴, 숙시노니트릴, 글루타르니트릴, 아디포니트릴, 등.

α-아미노니트릴류;

α-아미노프로피오니트릴, α-아미노메틸티오부티로니트릴, α-아미노부티로니트릴, 아미노아세토니트릴, 등.

카르복실기를 갖는 니트릴류;

시아노아세트산, 등.

β-아미노니트릴류;

아미노-3-프로피오니트릴, 등.

불포화 니트릴류;

아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 시아노알릴, 크로토니트릴, 등.

방향족 니트릴류;

벤조니트릴, o-, m- 및 p-클로로벤조니트릴, o-, m- 및 p-플루오로벤조니트릴, o-, m- 및 p-니트로벤조니트릴, p-아미노벤조니트릴, 4-시아노페놀, o-, m- 및 p-톨루니트릴, 2,4-디클로로벤조니트릴, 2,6-디클로로벤조니트릴, 2,6-디플루오로벤조니트릴, 아니소니트릴, α-나프토니트릴, β-나프토니트릴, 프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴, 테레프탈로니트릴, 시아노벤질, 페닐아세토니트릴, 등.

α-히드록시니트릴.

본 발명에 있어서, 특히 바람직한 니트릴 화합물로서는 α-히드록시니트릴 화합물을 들 수 있다. 본 발명에 의한 아미드의 제조방법에 있어서, α-히드록시니트릴 화합물은 특별히 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는 예를 들어 상기 화학식1로 표시되는 화합물을 이용할 수 있다.

식 중, R은 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 알케닐기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 포화 또는 불포화의 복소환기(heterocyclic group)를 나타낸다. α-히드록시니트릴 화합물로부터 α-히드록시아미드를 제조할 수 있다.

복소환기로서는 이종원자로서 질소, 산소, 황의 적어도 1종을 포함한다. 또한, 치환기로서는 예를 들면, 알킬기, 알콕시기, 아실기, 아릴기, 아릴옥시기, 염소, 브롬 등의 할로겐, 히드록시기, 아민기, 니트로기, 티올기 등을 포함한다.

구체적으로, 예를 들면, 다음의 화합물 또는 이들 치환체 등을 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 치환제라 함은 앞서 예시한 바와 같은 치환기를 갖는 화합물을 말한다.

락토니트릴

α-히드록시-n-프로피오니트릴

α-히드록시-n-부티로니트릴

α-히드록시-n-이소부티로니트릴

α-히드록시-n-헥시로니트릴

α-히드록시-n-헵티로니트릴

α-히드록시-n-옥티로니트릴

α,γ-디히드록시-β,β-디메틸부티로니트릴

아크롤레인시아노히드린

메타크릴알데히드 시아노히드린

3-클로로락토니트릴

4-메틸티오-α-히드록시부티로니트릴

α-히드록시-α-페닐프로피오닐

또한, 방향족이나 복소환을 갖는 기질 화합물로서 다음의 예시적 화합물, 및 이들의 치환체 등을 포함한다.

만델로니트릴

2-티오페네카르복시알데히드 시아노히드린

2-피리딘카르복시알데히드 시아노히드린

2-피롤카르복시알데히드 시아노히드린

2-푸르알데히드 시아노히드린

2-나프틸카르복시알데히드 시아노히드린

화학식1로 표시되는 α-히드록시니트릴로 대표되는 니트릴 화합물의 다수는 극성 용매 중에서 알데히드와 히드로시안산으로 분해된다. 예를 들면, 화학식1의 α-히드록시니트릴 화합물은 상기 화학식2에 나타낸 알데히드와 히드로시안산으로 전환된다. 이들 화합물은 평형상태에 있기 때문에 α-히드록시니트릴 화합물이 효소반응에 의해 소비된다면 평형은 α-히드록시니트릴 화합물 쪽으로 기운다.

한편, 히드로시안산에서 유래하는 시안 및 알데히드는 효소단백질에 손상을줄 수 있다. 따라서, 공지의 니트릴 수화효소를 이용한 경우에는 효소활성이 저하되어 α-히드록시니트릴 화합물을 충분량 수화할 수 없기 때문에 충분한 수득량을 기대할 수 없었다. 그러나, 본 발명의 니트릴 수화효소는 시안이나 알데히드의 존재하에서도 효소활성을 유지한다. 따라서, 알데히드와 히드로시안산으로부터 생성되는 니트로 화합물을 기질로서 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 α-히드록시아미드의 제조방법에 있어서는 상기 화학식2로 나타낸 알데히드 화합물과 히드로시안산으로부터 상기 화학식1로 나타낸 화합물을 공급할 수 있다.

본 발명의 아미드 제조방법은 2가의 금속 이온의 존재하에서 행하는 것이 바람직하다. 2가의 금속 이온은 본 발명의 니트릴 수화효소의 활성에 기여한다. 2가의 금속이온으로서는 니켈 이온이나 코발트의 이온이 적합하다. 이들 이온은 적당한 수용성 염의 형태로 반응액에 첨가할 수 있다. 구체적으로는 염화물 (chloride salt)의 형태로 첨가된다.

본 발명에 있어서 니트릴 화합물의 수화 또는 가수분해반응은 물 또는 완충액 등의 수성 용매 중에서 기질 화합물, 또는 기질 화합물로 전환될 수 있는 화학식2로 나타낸 알데히드와 히드로시안산의 혼합물에 본 발명의 효소학적으로 활성인 물질을 접촉시킴으로써 행하여진다. 반응액에는 2가의 금속 이온을 함유시키는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서 "수화"라 함은 니트릴기에 물분자가 부착되는 반응을 말한다. "수화"에 대하여 "가수분해"는 니트릴기에 치환기가 연결되어 있는 화합물로부터 상기 치환기가 가수분해에 따라 절단되는 반응을 말한다. 이들 반응은전부 본 발명의 아미드 제조방법에 포함된다.

반응액 중의 기질 화합물의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 기질 화합물에 의한 효소활성의 저해를 방지하기 위해서는, 예를 들면 α-히드록시니트릴의 경우 통상적으로 0.1 - 10 중량%, 바람직하게는 0.2 - 5.0 중량% 상당량으로 할 수 있다. 기질은 반응개시시에 일괄적으로 첨가하는 것도 가능하지만, 기질농도가 너무 높아지지 않도록 연속적, 또는 비연속적으로 첨가하는 것이 바람직하다.

기질이 되는 니트릴 화합물의 수성 용매에 대한 용해도가 현저하게 작은 경우에는 반응액중에 계면활성제를 가할 수도 있다. 계면활성제로서는 0.1-5.0 중량%의 Triton X-100 또는 Tween 60 등을 이용할 수 있다. 기질의 용해도를 향상시키기 위해서는 유기용매를 포함하는 혼합용매의 이용도 효과적이다. 구체적으로는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 디메틸술폭시드 등을 첨가함으로써 반응 효율을 개선할 수 있다. 또는, 물에 용해하기 어려운 유기용매중이나 물에 용해하기 어려운 유기용매와 수성 용매의 2상계에서 본 발명의 반응을 행할 수 있다. 물에 용해하기 어려운 유기용매로서는 예를 들면, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 톨루엔, 클로로포름, n-헥산, 시클로헥산, 옥탄, 또는 1-옥탄올 등을 이용할 수 있다.

상기 기질 농도에 대하여 본 발명의 니트릴 수화효소는 예를 들면 1 mU/mL-100 U/mL, 바람직하게는 100 mU/mL 이상의 효소량으로 함으로써 효소반응을 효율적으로 진행시킬 수 있다. 또한, 효소학적으로 활성인 물질로서 미생물 균체를 이용할 경우에는 기질에 대한 미생물의 사용량은 건조균체로서 0.01 내지 5.0 중량% 상당량으로 하는 것이 바람직하다. 효소 및 균체 등의 효소학적으로 활성인 물질은반응액에 용해, 또는 분산시킴으로써 기질과 접촉시킬 수 있다. 또는, 화학결합(chemical linking)이나 포획(entrapment) 등의 방법에 의해 고정화시킨 효소학적으로 활성인 물질을 이용할 수도 있다. 또한, 기질은 투과시킬 수 있으나, 효소분자나 균체의 투과를 제한하는 다공질막으로 기질용액과 효소학적으로 활성인 물질을 격리시킨 상태에서 반응시킬 수도 있다.

반응은 통상적으로 어는 점 내지 50℃, 바람직하게는 10-30℃에서 0.1-100 시간 행할 수 있다. 반응액의 pH는 효소활성을 유지할 수 있다면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 니트릴 수화효소는 pH 5.5 내지 6.5에서 최적이므로 반응액의 pH를 이 범위로 설정하는 것이 바람직하다.

따라서, 니트릴 화합물은 미생물의 수화 또는 가수분해 작용에 의해 대응하는 아미드로 변환되어 반응액에 축적된다. 생성된 아미드는 반응액으로부터 적절한 방법으로 회수하고 정제할 수 있다. 구체적으로는 한외여과(ultrafiltration), 농축, 컬럼 크로마토그래피, 추출, 활성탄 처리, 증류 등 통상의 방법을 조합하여 이용함으로써 회수, 정제할 수 있다.

또한 본 발명은 2가 금속 이온을 공존시키는 것을 특징으로 하는, 니트릴 화합물의 존재하에서 니트릴 수화효소의 활성을 안정화시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 2가 금속 이온의 존재하에 니트릴 수화효소를 니트릴 화합물에 작용시켜 생성되는 아미드를 회수하는 공정을 포함하는 아미드의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 2가의 금속이온을 상기 반응계에 존재하게 함으로써 니트릴 수화효소의 활성 저하가 현저하게 억제된다는 것에 기초하고 있다. 본 발명에 있어서니트릴 수화효소의 유래는 제한되지 않는다. 즉, 니트릴 화합물의 니트릴기에 작용하고, 니트릴기를 수화시켜 아미드기로 전환시키는 활성을 갖는 효소라면 임의의 효소를 이용할 수 있다. α-히드록시니트릴을 대응하는 아미드로 수화하는 니트릴 수화효소는 본 발명에 있어서 바람직한 효소이다.

본 발명에 있어서 2가의 금속 이온은 예를 들면 다음과 같은 기작에 의해 니트릴 수화효소의 활성 저하의 억제 효과를 가져온다고 생각할 수 있다: 우선, 기질 화합물인 시아노히드린 구조에 금속이온이 결합되면 효소의 반응을 증진시킨다는 것을 생각할 수 있다. 다음으로 금속이온의 결합에 의해 시아노히드린이 해리되는 것을 방지할 수도 있을 것이다. 그 결과, 반응액 중의 시아나이드 이온의 농도가 저하한다. 시아나이드 이온 농도의 저하에 의해 효소에 대한 저해작용이 작아지므로, 효소활성이 상승한다. 어쨋든, 이들 현상은 특정한 니트릴 수화효소 고유의 현상이 아니라, 시아노히드린 구조를 갖는 기질 화합물을 이용할 때 공통적으로 보이는 현상이라 생각된다. 이러한 이유로, 본 발명의 니트릴 수화효소의 활성 안정화 방법, 또는 아미드의 제조방법에서 사용되는 니트릴 수화효소는 그 유래가 제한되지 않는다.

니트릴 화합물을 대응하는 아미드로 수화하는 능력을 갖는 효소로서는 예를 들면 하기 미생물에서 유래하는 효소가 공지되어 있다(JP-A 평 04-040899 참조).

로도코커스(Rhodococcus) 속

코리네박테리움(Corynebacterium) 속

슈도모나스(Pseudomonas) 속

아르트로박터(Arthrobacter) 속

알칼리게네스(Alcaligenes) 속

바실러스(Bacillus) 속

박테리디움(Bacteridium) 속

마이크로코커스(Micrococcus) 속

브레비박테리움(Brevibacterium) 속

노카르디아(Nocardia) 속.

보다 구체적으로는 예를 들면, 하기 미생물을 포함한다:

로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC 33278

로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IFO 12320

코리네박테리움 니트릴로필루스(Corynebacterium nitrilophilus) ATCC 21419

슈도모나스 종(Pseudomonassp.) SK87 (FERM P-11311)

아르트로박터 종(Arthrobactersp.) HR1 (FERM BP-3323)

알칼리게네스 종(Alcaligenessp.) BC16-2 (FERM BP-3321)

로도코커스 종(Rhodococcussp.) HT40-6 (FERM P-11774)

JP-B 소 62-21519에 기재된 미생물.

그 밖의 미생물은 공지이고 American Type Culture Collection (ATCC); 동경대학응용미생물연구소(Institute of Applied Microbiology (IAM), The University of Tokyo); 공업기술원 미생물공업기술연구소(Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology); 카켄제약주식회사(KAKENPHARMACEUTICAL Co. (KCC)); 재단법인 발효연구소(Institute for Fermentation, Osaka (IFO)); 및 치바대학 진핵미생물연구센터(RESEARCH CENTER FOR PATHOGENIC FUNGI AND MICROBIAL TOXICOSES (IFM), The University of Chiba)로부터 입수할 수 있다. 그 밖에 상기 로도코커스 종 Cr4 (FERM BP-6596)로부터 얻을 수 있는 본 발명의 니트릴 수화효소도 본 발명의 바람직한 효소이다.

본 발명의 아미드 제조방법에서 사용하는 니트릴 화합물은 특별히 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는 예를 들면, 상기 본 발명의 니트릴 수화효소에 의한 α-히드록시아미드의 제조방법에 있어서 예시한 바와 같은 화합물을 바람직한 기질로서 포함한다.

또한, 반응시에 입체특이적인 니트릴 수화효소 또는 가수분해효소, 또는 그러한 효소를 갖는 미생물을 사용하면 α-히드록시아미드 또는 α-히드록시산의 두 광학활성 이성체 중에서 한 쪽의 광학활성체만을 용이하게 생성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 광학분할(optical resolution)이나 라세미화(racemization) 공정을 거쳐 제조하는 종래의 방법에 비하여 매우 유리하게 입체특이적인 α-히드록시아미드 또는 α-히드록시산을 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 니트릴 화합물의 수화 또는 가수분해 반응은 물 또는 완충액 등의 수성 용매 중에서 예를 들면 화학식1로 나타내는 α-히드록시니트릴에 니트릴 수화효소를 접촉시킴으로써 행한다. 이용하는 니트릴 수화효소가 시아나이드나 알데히드에 내성이라면 α-히드록시니트릴로 전환될 수 있는 화학식2로 나타내는 알데히드와 히드로시안산의 존재하에서 반응을 행할 수 있다. 니트릴 수화효소는 정제효소 외에 상기 효소를 생산할 수 있는 미생물의 파쇄물, 조(粗)정제효소, 또는 이들을 고정화한 산물 등일 수 있다. 또한 본 발명에 있어서, 상기 반응액에 0.1 mM-1 M, 일반적으로는 0.5-100 mM, 바람직하게는 1-10 mM의 농도로 2가의 금속 이온을 첨가시킬 수 있다.

본 발명에 사용하는 금속 이온의 형태는 니트릴 수화효소의 활성의 유지에 유효한 것이라면 제한되지 않는다. 예를 들어, 코발트 이온이나 니켈 이온은 니트릴 수화효소의 활성을 높게 유지할 수 있는 바람직한 금속 이온이다. 이들 금속 이온은 염화물 등의 염으로서 반응액에 첨가할 수 있다.

본 발명에 있어서, 2가의 금속 이온을 공존시키는 외에 반응에 이용하는 니트릴 수화효소와 조합되는 기질화합물의 특성에 따라 적절한 조건을 설정할 수 있다. 반응에 사용하는 기질 화합물의 형태 및 반응 조건은 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는 예를 들면, 상기 본 발명의 니트릴 수화효소를 이용하는 α-히드록시아미드의 제조방법에서 예시한 바와 같은 조건에 기초하여 반응계를 설정할 수 있다.

본원에서 인용된 특허, 특허출원, 및 간행물은 어느 것이든 참조로서 통합된다.

본원에서 농도에 대한 %는 다른 것으로 특정되지 않았다면 부피 당 중량 %를 나타낸다.

본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 효소활성의 측정방법

하기 실시예에 있어서, 니트릴 수화효소 활성의 표준적인 측정방법은 다음과 같다. 효소반응의 기본반응액 조성을 표1 및 표2에 나타내었다. 효소반응은 기질화합물로서 3-시아노피리딘 또는 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴(HMBN)의 첨가로 반응을 개시하였다. 3-시아노피리딘을 이용한 반응은 20℃에서 10분간, HMBN을 이용한 반응은 20℃에서 15분간 행하였다. 3-시아노피리딘을 이용한 반응에서는 2 N 염산을 0.1 ml 첨가하고, 격렬하게 진탕시키고, HMBN을 이용한 반응에서는 0.1% (v/v) 인산 0.9 ml에 반응액을 0.1 ml 첨가하고, 격렬하게 진탕시켜서 각각의 반응을 정지시켰다. 그 반응액을 HPLC로 분석하였다.

10% (v/v) HMBN in 0.1 M KPB (pH 6.5)	0.36 ml
0.1 M KPB (pH 6.5)	0.64 ml
효소용액	0.10 ml
0.85% (w/v) NaClaq	0.90 ml
전체 부피	2.00 ml

→ 10% (v/v) HMBN 을 첨가하여 반응 개시.

→ 20℃에서 10분간 진탕하면서 인큐베이션.

→ 0.1% (v/v) H₃PO₄를 첨가하여 반응 정지.

→ 원심 분리.

→ HPLC 분석.

0.3 M 3-시아노피리딘	1.00 ml
0.1 M KPB (pH 7.0)	0.50 ml
효소용액	0.10 ml
0.85% (w/v) NaClaq	0.90 ml
전체 부피	2.00 ml

→ 0.3 M 3-시아노피리딘을 첨가하여 반응 개시.

→ 20℃에서 3분간 진탕하면서 인큐베이션.

→ 2 N HCl를 첨가하여 반응 정지.

→ 원심 분리.

→ HPLC 분석.

반응액의 HPLC 분석 조건:

HMBN의 HPLC 분석 조건은 컬럼: Spherisorb S5ODS2 (4.6 x 150 nm);

이동상(Mobile phase): 0.1%(v/v) 인산/아세토니트릴 = 9/1;

유속: 1.0 ml/min.;

검출: UV 210 nm;

컬럼 온도: 40℃.

HPLC 분석에 의한 효소활성 측정:

생성된 니코틴아미드 또는 HMBAm를 HPLC로 정량하고, 니트릴 수화효소 활성을 산출하였다. HMBAm의 HPLC 분석 조건은 HMBN과 마찬가지였다. 또한, 1 U는 표준반응액 조성에 있어서 20℃에서 1분간 1μmol의 니코틴아미드를 생성하는 효소량, 1 U는 표준반응액 조성에 있어서 20℃에서 1분간 1μmol의 HMBAm를 생성하는 효소량으로 정의하였다.

단백질의 정량:

Bradford법 (Bradford, M., Anal, Biochem., 72, 248(1976))에 따라 Bio-Rad사제의 단백질 어세이 키트를 이용하여 단백질을 정량하였다.

시약: DEAE-Sephacel 및 Butyl-Toyopearl 650 M은 Pharmacia사제; 소혈청 알부민(bovine serum albumin)은 Bio-Rad사제; SDS-PAGE용 분자량 마커는 Pharmacia사제; HPLC용 분자량 마커는 Oriental yeast사제를 사용하였다. 그 밖의 시약은 특별히 명시되어 있지 않는 한 시판되는 특급시약을 사용하였다.

2. 배양조건

하기 조성으로 이루어진 전배양배지를 5 ml 씩 시험관(25 x 200 mm)에 분주하고; 실리콘 마개를 하여 오토클레이브로 멸균하였다. 시험관이 식은 후, 균주를 백금루프로 접종하고 28℃에서 2일간 진탕배양하였다.

전배양배지(pH 7.0):

폴리펩톤 5.0 g

고기 추출물(Meat extract) 5.0 g

NaCl 2.0 g

효모 추출물(Yeast extract) 0.5 g

증류수 1.0 L

다음으로, 500-ml 사카구치 플라스크에 분주하여 오토클레이브하여 멸균한 본 배양배지 20 ml에 전배양후의 배양물을 옮겼다. 본 배양에서는 배양 24시간 후에 0.75%(v/v) 아세토니트릴을 피딩니들로 첨가하고, 33℃에서 2일간 진탕배양하였다.

본 배양배지 (pH 7.0):

아세트아미드 7.5 g

포도당 10.0 g

C.S.L. 10.0 g

효모 추출물 1.0 g

MgSO₄7H₂O 0.5 g

K₂HPO₄1.0 g

CoCl₂6H₂O 20.0 mg

증류수 1.0 L

3. 무세포추출액의 조제

배양액 500 ml분에 대해 5배 농축이 되도록 균체를 50 mM 인산완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)에 현탁하였다. 현탁시킨 균체를 초음파발생장치 201 M (Kubota사제)를 이용하여 4℃ 이하에서 150 W 60분간 파쇄하였다. 그 후, 13,000 rpm에서 20분간 원신분리하고, 상등액과 침전층으로 분획하였다. 상등액을 무세포추출액으로서 하기 정제에 이용하였다.

4. 암모늄 설페이트 분획(Ammonium-sulfate fractionation)

무세포추출액에 암모늄 설페이트를 30% 포화가 되도록 첨가하고, 10%(v/v)암모니아수로 pH를 7.0로 중화한 후, 4℃에서 3시간 교반하였다. 그 후, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리를 행하고, 상등액과 침전층으로 분획하였다. 상등분획에 암모늄 설페이트를 60% 포화가 되도록 첨가하고, 마찬가지로 pH를 7.0로 중화한 후, 4℃에서 3시간 교반하였다. 그 후, 마찬가지로 원심분리를 행하고, 상등액과 침전층으로 분획하였다. 또한, 상등분획에 암모늄 설페이트를 80% 포화가 되도록 첨가, 교반 후, 상등액과 침전층으로 분획하였다. 각각의 침전분획을 10 mM 인산완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)에 현탁하고, 동일한 완충액에 대해 3회 투석한 후 활성을 측정하였다.

5. DEAE-세파셀 컬럼 크로마토그래피(DEAE-Sephacel column chromatography)

10 mM 인산완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)으로 충분히 평형화시킨 DEAE-세파셀 컬럼(Φ13 x 216 mm)에 동일한 완충액으로 충분히 투석을 행한 효소용액을 로딩하고, 동일한 완충액으로 세척하였다. 이어서, 하기의 용출액에 의해 순차용출을 행하고, 용출분획의 효소활성을 평가하였다. 니트릴 수화효소 활성은 10 mM 인산완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/0.3 M KCl을 이용하여 용출시, 분획번호 74 - 80의 분획에서 발견되었다. 각 용출액의 사용량은 담체량의 약 3배로 하였다.

10 mM 인산 완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/0.1 M KCl

10 mM 인산 완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/0.2 M KCl

10 mM 인산 완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/0.3 M KCl

10 mM 인산 완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/0.4 M KCl

6. 부틸-토요펄 (Butyl-Toyopearl) 650 M 컬럼 크로마토그래피

부틸-토요펄 컬럼(Φ11 x 89 mm)를 10 mM 인산 완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)에 20% 포화가 되도록 암모늄 설페이트를 가한 완충액으로 충분히 평형화하였다. 이 컬럼에 20% 포화가 되도록 암모늄 설페이트를 가하고 교반한 효소액을 로딩하고 동일한 완충액으로 세척하였다. 이어서, 하기의 용출액에 의해 순차용출을 행하고, 용출분획의 효소활성을 평가하였다. 니트릴 수화효소 활성은, 10 mM 인산완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/15% 포화 암모늄 설페이트를 이용하여 용출시, 분획번호 58 - 66의 분획에서 발견되었다. 각 용출액의 사용량은 담체량의 약 3배로 하였다.

10 mM 인산 완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/15% 포화 암모늄 설페이트

10 mM 인산 완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/10% 포화 암모늄 설페이트

10 mM 인산 완충액/44 mM n-부티르산 (pH 7.0)/5% 포화 암모늄 설페이트

7. SDS-PAGE

얻어진 정제효소를 이용하여 SDS-PAGE를 행하였다. SDS-PAGE는 Laemmli법 (Laemmli, U.K.: Nature, 227, pp680, 1970)에 따라 행하였다. 즉, Tris/글리신 완충액을 이용하여, 12% 폴리아크릴아미드 슬랩 겔에서 전기영동을 행하였다. 효소용액과 샘플용 완충액을 동량으로 혼합하고, 90℃에서 약 10분간 가열처리를 행하였다. 겔은 Coomassie brilliant blue R-250을 이용하여 염색하고; 탈색에는 에탄올/아세트산/dH₂O (2/3/6, 부피비)를 이용하였다. 결과를 도1에 나타내었다. 정제된 효소는 α-서브유니트(26.8 kDa) 및 β-서브유니트(29.5 kDa)로 이루어진 것이 판명되었다.

8. HPLC에 의한 겔 여과(Gel filtration)

상기한 방법에 따라 니트릴 수화효소를 정제하였다. 우선 파쇄한 균체 현탁액을 원심분리에 의해 상등액과 침전분획으로 분리하였다. 상등액분획에 활성이 포함되어 이를 무세포추출액으로 하였다. 무세포추출액을 암모늄 설페이트 분획을 실시한 결과 30-60% 포화 분획에서 활성이 포함되어 있었다. 활성분획을 DEAE-세파셀 컬럼 크로마토그래피하였다. DEAE-세파셀 컬럼 크로마토그래피에서 용출된 활성분획번호 74-80을 회수하여 부틸-토요펄 (Butyl-Toyopearl) 650 M 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이 부틸-토요펄 (Butyl-Toyopearl) 650 M 컬럼으로부터 용출된 활성분획 번호 58-66을 정제효소로 이용하였다(도2).

최종적으로, 로도코커스 종 Cr4의 니트릴 수화효소는 총 단백질량 5.32 mg; 비활성(specific activity) 477 U/mg; 수율(yield) 44%; 비활성(specific activity)은 13.9 배이었다(표 3). 정제된 효소는 SDS-PAGE의 결과 동종(homogeneous)인 것으로 평가되었다. 최종적으로 정제된 효소의 비활성은 표준조건하에서 HMBN, 3-시아노피리딘을 기질로 한 경우 각각 880 U/mg, 477 U/mg이었다.

단계	총 단백질(mg)	총 활성(U)	비활성(U/mg)	정제(-배)	수율(%)
1. 무세포 추출물	167	5740	34.4	1	100
2. (NH₄)₂SO₄분획	56.6	5220	92.2	2.68	91
3. DEAE-세파셀	18.7	4030	215	6.25	70
4. 부틸-토요펄 650M	5.32	2540	477	13.9	44

효소 1 U는 표준조건 하에서 1분간 3-시아노피리딘으로부터 니코틴아미드 1μmol의 형성을 촉매하는 양으로 정의된다. 약 2.3μg의 정제효소를 표4에 나타낸 조건에 따라 겔 여과분석하고, 분자량을 측정하였다. 그 결과, 효소의 미변성상태에서의 분자량은 112.5 kDa으로 추정되었다(도 3).

HPLC에 의한 겔 여과(Gel filtration):

니트릴 수화효소 분자량의 측정에 이용한 HPLC의 분석조건을 표4에 나타내었다. 분자량 마커로는 Oriental Yeast사 제품을 사용하였다.

컬럼	TSK gel G-3000 SW (0.75 x 60 cm)
용매	0.1 M KPB (pH 7.5) + 0.2 M KCl
유속	0.7 ml/min
주입	5 μl
검출	280 nm

9. 기질 농도의 효과 (Km 값)

HMBN의 Km 값을 S-V 플롯 (도 4) 및 Lineweaver-Burk 플롯 (도 5)로 결정하였다. 0.0585 U의 효소를 이용하여 다양한 농도의 HMBN 용액을 가하고, 20℃에서 15분간 반응시켜 HPLC분석을 행하였다. HMBN에 대한 Km 값은 Lineweaver-Burk 플롯으로부터 1.43 mM으로 산출되어 HMBN에 대해 높은 친화성을 나타내는 것이 판명되었다. 또한, 3-시이노피리딘에 대한 Km 값을 S-V 플롯(도 6)과 Lineweaver-Burk 플롯(도 7)로부터 구하였다. 0.0265 U의 효소를 이용하여 마찬가지로 다양한 농도의 3-시아노피리딘 용액을 가하고, 20℃에서 15분간 반응시켜 HPLC분석을 행하였다. 3-시아노피리딘에 대한 Km 값은 Lineweaver-Burk 플롯으로부터 1.38 mM으로 산출되어 3-시아노피리딘에 대해 높은 친화성을 나타내는 것이 판명되었다.

10. 온도의 효과

정제효소의 최적온도 및 열안정성을 검토하였다. 표1의 기본 반응액조성으로 2.92 U의 효소를 이용하여 각각의 온도 (10, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 65℃)에서 15분간 반응을 행하고, 최적온도를 측정하였다. 효소의 반응속도가 최대가 되는 온도는 45℃이었다. 또한, 2.92 U의 효소를 이용하여 각각의 온도 (10, 20, 30, 40, 50, or 60℃)에서 30분간 열처리하고, 그 후 기본 반응조건에서 열안정성을 조사했다. 50℃에서 77%의 잔존활성을 나타냈다(도 9).

11. pH의 효과

정제효소의 최적pH 및 pH안정성을 검토하였다. 표1의 기본 반응액조성으로 2.92 U의 효소를 이용하여 인산 완충액 대신에 최종농도가 50 mM가 되도록 각 완충액(소듐 사이트레이트 완충액 또는 Tris-HCl 완충액)을 사용하여 20℃에서 15분간 반응시키고 최적 pH를 구하였다. 최적 pH는 6.0이었다(도 10). 또한, 2.92 U의 효소를 최종농도가 50 mM가 되도록 각 완충액(소듐 사이트레이트 완충액, 인산완충액, Tris-HCl 완충액, 글리신/NaOH 완충액 또는 Na₂HPO₄/NaOH 완충액)을 사용하여 20℃에서 30분간 인큐베이션하고, 그 후 기본 반응조건에서 잔존활성을 측정하여 pH안정성을 조사하였다. pH 4.0-9.0에서 30분간 처리에서 거의 100%의 잔존활성을 나타내었다(도 11).

12. 기질 특이성

효소의 기질 특이성을 조사하였다. 표2에 나타낸 기본 반응액 조성으로 2.92 U의 효소를 이용하여 3-시아노피리딘 대신에 다양한 기질을 가하고 반응액 중의 아미드의 생성을 HPLC로 분석하고 상대활성을 구하였다. 가한 기질 화합물의 종류, 최종농도, 반응시간, 및 각 기질에 대응하는 생성물의 HPLC의 분석조건을 표 6에 나타내었다. HPLC의 분석조건 (1)-(9)의 내용은 표 6에 이어서 기재하였다.

정제한 니트릴 수화효소는 휴지기 세포 반응의 경우와 매우 닮은 기질 특이성을 나타내어 말로노니트릴, n-부티로니트릴 및 2-시아노피리딘이 양호한 기질이었다. 3-시이노피리딘에 대한 활성을 100%로 한 경우 HMBN에 대한 상대활성은 154%이었다(표 5).

기질	상대 활성(%)	기질	상대 활성(%)
3-시아노피리딘	100	3-시아노피리딘^*	76.5
2-시아노피리딘	223	n-부티로니트릴^*	379
4-시아노피리딘	127	이소부티로니트릴^*	40.9
아크릴로니트릴	114	n-발레로니트릴^*	118
메타크릴로니트릴	93.7	이소발레로니트릴^*	2.71
크로토니트릴	87.4	n-카프로니트릴^*	18.1
아세토니트릴	14.6	3-인돌릴아세트니트릴^*	2.33
프로피오니트릴	173	벤조니트릴^*	138
HMBN	154	o-클로로벤조니트릴^*	58.6
KCN	0	m-클로로벤조니트릴^*	7.18
말로노니트릴	6736.16	p-클로로벤조니트릴^*	28.4
2-시아노아세트아미드	46.3
시아노피라진	114

반응은 20℃에서 실시하고 2.92 U의 효소를 사용하였다. *는 기질의 용해도를 증진시키기 위하여 메탄올을 첨가한 것을 나타낸다 (최종농도 = 20% v/v).

기질	최종농도(mM)	반응 시간(분)	HPLC 조건
3-시아노피리딘	150	15	(1)
3-시아노피리딘^*	150	15	(1)
2-시아노피리딘	125	10	(1)
4-시아노피리딘	125	10	(1)
아크릴로니트릴	250	3	(5)
메타크릴로니트릴	150	5	(1)
크로토노니트릴	150	5	(1)
아세토니트릴	250	10	(4)
프로피오니트릴	150	5	(4)
n-부티로니트릴^*	150	10	(2)
벤조니트릴^*	50	10	(3)
o-클로로벤조니트릴^*	25	5	(3)
m-클로로벤조니트릴^*	25	5	(3)
p-클로로벤조니트릴^*	25	5	(3)
말로노니트릴	250	3	(6)
이소부티로니트릴^*	150	10	(7)
n-발레로니트릴^*	150	10	(7)
이소발레로니트릴^*	150	10	(7)
n-카프로니트릴^*	150	10	(9)
시아노피라진	150	10	(8)
3-인돌릴아세토니트릴^*	50	5	(9)

HPLC 조건은 다음과 같다:

(1) 컬럼: Waters Spherisorb 5 μODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 10 mM KH₂PO₄(pH 2.8)/아세토니트릴 (v/v) = 9:1;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 230 nm;

주입량: 5 μl.

(2) 컬럼: Waters Spherisorb 5 μODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 10 mM KH₂PO₄(pH 2.8)/아세토니트릴 (v/v) = 9:1;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 230 nm;

주입량: 5 μl.

(3) 컬럼: Waters Spherisorb 5 μODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 5 mM KH₂PO₄(pH 2.8)/아세토니트릴 (v/v) = 12:7;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 230 nm;

주입량: 5 μl.

(4) 컬럼: Waters Spherisorb 5 μODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 10 mM KH₂PO₄(pH 2.5)/아세토니트릴 (v/v) = 99:1;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 210 nm;

주입량: 5 μl.

(5) 컬럼: Waters Spherisorb 5 μODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 10 mM KH₂PO₄(pH 2.5)/아세토니트릴 (v/v) = 99:1;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 230 nm;

주입량: 5 μl.

(6) 컬럼: Spherisorb S5ODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 0.1%(v/v) 인산/아세토니트릴 (v/v) = 99:1;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 210 nm;

주입량: 5 μl.

(7) 컬럼: Spherisorb S5ODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 0.1%(v/v) 인산/아세토니트릴 (v/v) = 9:1;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 210 nm;

주입량: 5 μl;

온도: 40℃.

(8) 컬럼: Spherisorb S5ODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 0.1%(v/v) 인산/아세토니트릴 (v/v) = 9:1;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 230 nm;

주입량: 5 μl;

온도: 40℃.

(9) 컬럼: Spherisorb S5ODS2 (4.6 x 150 mm);

용매: 5 mM KH₂PO₄(pH 2.8)/아세토니트릴 (v/v) = 12:7;

유속: 1.0 ml/min;

검출: 210 nm;

주입량: 5 μl;

온도: 40℃.

13. 효소활성에 대한 저해제의 영향

효소의 저해제를 조사했다. 표1에 나타낸 기본 반응액 조성으로 2.92 U의 효소를 이용하여 최종농도 1.0 mM 또는 0.1 mM이 되도록 각종 저해제를 첨가하고 10분간 20℃에서 10분간 인큐베이션한 후 반응을 15분간 행하였다. 본 효소는 카르보닐 시약인 페닐히드라진이나 히드록실아민에 의해 현저히 저해를 받았다(도 7).

니트릴 수화효소 활성에 미치는 각종 화합물의 영향

화합물(1.0 mM)	상대 활성(%)
없음	100
이오도아세톤	97.0
N-에틸말레이미드	101
p-클로로머큐리벤조에이트	97.7
5-5'-디티오비스(1.0 mM)	99.1
히드록실아민	62.1
페닐히드라진	8.19
시스테아민	106
D-시클로세린	94.8
EDTA	101
티론	132
디에틸디티오카바메이트	97.7
우레아	95.7
NaN₃	98.5
디티오트레이톨	93.4

20℃에서 20분간 효소를 각종 화합물과 인큐베이션하여 효소활성을 측정하였다.

14. 효소활성에 대한 금속 이온의 효과

효소활성에 미치는 금속 이온의 효과를 검토하였다. 표1에 나타낸 기본 반응액 조성으로 2.92 U의 효소를 이용하여 최종농도 1.0 mM이 되도록 각종 금속 이온을 첨가하고 20℃에서 10분간 인큐베이션한 후 반응을 15분간 행하였다. 본 효소는 SH기에 특이적인 Ag⁺및 Hg⁺⁺이온 등의 중금속 이온에 의해 현저하게 저해를 받았다. 또한, Ni⁺⁺또는 Co⁺⁺이온의 첨가에 의해 효소활성이 증가하였다(표 8).

니트릴 수화효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향

금속(1.0 mM)	상대 활성(%)
없음	100
CaCl₂	96.4
MnCl₂	96.7
NiCl₂	196
CoCl₂	154
ZnSO₄	84.1
CuSO₄	109
FeSO₄	78.9
FeCl₃	100
AgNO₃	7.85
HgCl₂	7.48

20℃에서 10분간 효소를 금속 이온과 인큐베이션하여 효소활성을 측정하였다.

15. 효소활성에 대한 Ni⁺⁺및 Co⁺⁺금속 이온의 첨가효과

반응계에 Ni⁺⁺및 Co⁺⁺이온을 첨가하면 효소활성이 증가하는 것으로 판명되었다. 표1에 나타낸 기본 반응액 조성으로 2.92 U의 효소를 이용하여 0-8.0 mM의각 농도의 Ni⁺⁺및 Co⁺⁺이온을 첨가하고, 효소활성에 대한 영향을 조사하였다. Ni⁺⁺및 Co⁺⁺이온을 1.0-2.0 mM 첨가하면 효소활성이 각각 2배 또는 1.5배 증가하였다. 그 이상 첨가하면 활성화현상이 저하되었다(표9, 표10).

니트릴 수화효소 활성에 대한 코발트 이온의 효과

CoCl₂(mM)	상대활성(%)
0	100
0.5	129
1.0	150
2.0	153
4.0	143
6.0	136
8.0	127

20℃에서 5분간 효소를 니켈 이온과 함께 인큐베이션하여 효소활성을 측정하였다.

NiCl₂(mM)	상대활성(%)
0	100
0.5	171
1.0	197
2.0	196
4.0	195
6.0	184
8.0	185

16. Ni⁺⁺이온의 첨가 효과

표10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 니트릴 수화효소의 효소활성은 Ni⁺⁺이온을 반응계에 1.0 mM 첨가함으로써 2배로 활성화되었다. 따라서, 표2에 나타낸 기본 반응액 조성으로 2.92 U의 효소를 이용하여 3-시아노피리딘 대신에 각종의 기질을 가하고, 활성에 대해 영향을 조사하였다. HMBN 또는 만델로니트릴을 기질로서 이용한 경우만이 2배로 활성화되었다. Ni⁺⁺이온의 첨가는 α-히드록시니트릴이 기질로 사용될 때 반응효율을 특이적으로 증진시키는 것으로 추정된다(표11).

기질	없음	NiCl₂(1 mM)
HMBN	100	196
3-시아노피리딘	100	99
2-시아노피리딘	100	97
4-시아노피리딘	100	99
n-부틸로니트릴	100	94
클로토노니트릴	100	103
만데로니트릴	100	201
에틸렌 시아노히드린	100	91
아미노아세토니트릴	0	0
히드록시아세토니트릴	0	0
3-아미노프로피오니트릴	100	97
β-아미노클로토노니트릴	0	0

반응은 20℃에서 10분간 실시하고, 2.92 U의 효소를 이용하였다.

17. N-말단 아미노산 서열의 결정

Applied Biosystem사제의 Procise Sequencer Model 470A을 이용하여 로도코커스 종 Cr4 균주의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트 및 β-서브유니트의 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. N-말단의 15개의 잔기의 서열은 α-서브유니트에서는TAHNPVQGTFPRSNE (서열번호: 5)이고, β-서브유니트에서는 MDGIHDLGGRAGLGP (서열번호: 6)이었다.

상기 서열은 로도코커스 로도크로우스 J1 균주의 저분자형의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트의 N-말단의 15개의 잔기의 서열에서는 93%, β-서브유니트에서는 100%의 상동성을 나타내었다(표12/α-서브유니트; 표13/β-서브유니트).

균주	N-말단 아미노산 서열	상동성(%)
로도코커스 종 Cr4	1 TAHNPVQGTFPRSNE 15	-
로도코커스 로도크로우스 J1(낮음)	1 TAHNPVQGTLPRSNE 15	93
바실러스 서브틸리스	211 VVSNPLAGSRPRSND 225	47

균주	N-말단 아미노산 서열	상동성(%)
로도코커스 종 Cr4	1MDGIHDLGGRAGLGP15	-
로도코커스 로도크로우스 J1(낮음)	1MDGIHDLGGRAGLGP15	100
로도코커스 로도크로우스 J1(높음)	1MDGIHDTGGMTGYGP15	73
슈도모나스 퓨티다	1MNGIHDTGGAHGYGP15	67
슈도모나스 클로로라피스 B23	1MDGFHDLGGFQGFGK15	67

19. 휴지 세포 반응에 있어서 NiCl₂및 CoCl₂의 첨가효과

하기 조성으로 이루어진 전배양 배지 5 ml를 시험관 (25 x 200 mm)에 분주하고; 실리콘 마개를 하여 오토클레이브로 멸균하였다.

전배양배지(pH 7.0):

폴리펩톤 5.0 g

고기 추출물(Meat extract) 5.0 g

NaCl 2.0 g

효모 추출물(Yeast extract) 0.5 g

증류수 1.0 L

시험관이 식은 후, 로도코커스 종 Cr4와 로도코커스 로도크로우스 ATCC 332878의 균주를 백금루프로 접종하고, 28℃에서 2일간 진탕배양하였다. 이어서, 로도코커스 종 Cr4는 본배양배지1에, 로도코커스 로도크로우스 ATCC 332878은 본배양배지2에 옮기고, 33℃에서 2일간 진탕배양하였다. 균체를 수거하여 세척한 후, 표14에 나타낸 반응을 행하여 NiCl₂및 CoCl₂의 첨가효과를 관찰했다.

반응계에 최종농도가 1 mM가 되도록 NiCl₂또는 CoCl₂를 첨가한 결과, 표15에 나타낸 바와 같이 NiCl₂또는 CoCl₂를 첨가함으로써 니트릴 수화효소 활성이 향상되어, 이온의 첨가가 긍정적인 효과를 나타내었다.

본배양배지1 (로도코커스 종 Cr4용)(pH 7.0):

아세트아미드 7.5 g

포도당 10.0 g

C.S.L. 10.0 g

효모 추출물 1.0 g

MgSO₄7H₂O 0.5 g

K₂HPO₄1.0 g

CoCl₂6H₂O 10.0 mg

FeSO₄7H₂O 10.0 mg

증류수 1.0 L

본배양배지2 (로도코커스 로도크로우스 ATCC 332878용)(pH 7.0):

ε-카프롤락탐 5.0 g

포도당 10.0 g

C.S.L. 10.0 g

효모 추출물 1.0 g

MgSO₄7H₂O 0.5 g

K₂HPO₄1.0 g

CoCl₂6H₂O 20.0 mg

증류수 1.0 L

각각의 배지 20 ml을 500-ml 사카구치 플라스크에 분주하고, 오토클레이브로 멸균하여 이용하였다.

10% (v/v) HMBN in 0.1 M KPB (pH 6.5)	0.36 ml
0.1 M KPB (pH 6.5)	0.64 ml
세포현탁액(최종: 0.05배)	0.10 ml
0.85% (w/v) NaClaq	0.90, 0.80 ml
20 mM NiCl₂또는 CoCl₂	0.00, 0.10 ml
전체 부피	2.00 ml

→ HMBN을 첨가 (반응 개시).

→ 20℃에서 10분간 진탕하면서 인큐베이션.

→ 0.1% (v/v) H₃PO₄를 첨가 (반응 정지).

→ 원심 분리.

→ HPLC 분석.

상대활성(%)
	로도코커스 종 Cr4	ATCC 332878
없음	100^*	100^**
NiCl₂	186	193
CoCl₂	137	123

*: 118 μmol/ml/min

**: 30.5 μmol/ml/min

휴지세포 반응에서도 NiCl₂또는 CoCl₂의 첨가에 의해 효소활성이 증가되었다.

20. 시아나이드 이온의 영향

로도코커스 종 Cr4에서 유래하는 본 발명의 니트릴 수화효소 및 로도코커스 로도크로우스 J1 유래의 공지의 니트릴 수화효소(Biochimica et Biophysica Acta. 1129(1991): 23-33)에 대한 시아나이드 이온의 영향을 조사하였다. 다음의 기본 반응액 조성에 대하여 0 mM-20 mM의 시아나이드 이온 (KCN)을 반응계에 첨가하였다. 기질(3-시아노피리딘)을 제거한 상태에서 20℃에서 30분간 인큐베이션한 후에, 기질을 가하여 효소반응을 개시하였다. 20℃에서 10분간의 효소반응 후, 2 N 염산을 0.1 ml 첨가하고, 격렬하게 진탕시켜서 반응을 정지하였다. 반응액은 1.에서 기술한 방법으로 HPLC분석을 하였다.

표준 반응액:

0.5M 3-시아노피리딘 0.5ml

0.1M 인산완충액 (pH 7.5) 0.25ml

효소액 0.1ml

전체 부피 1.0ml

효소량은, 로도코커스 종 Cr4의 니트릴 수화효소는 288 U/ml; 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소는 61 U/ml로 하였다. 표16에 나타낸 바와 같이 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소는 1 mM의 시아나이드 이온으로 완전히 저해된 것에 반하여 로도코커스 종 Cr4의 니트릴 수화효소는 1 mM의 시아나이드 이온에 대하여 47%의 잔존활성, 5 mM의 농도에서는 17%의 잔존활성을 나타냈다.

KCN (mM)	Cr4	J1
0	100%	100%
1	47	0
5	17	0
10	11	0
15	8	0
20	3	0

21. N-말단 아미노산 서열의 결정

로도코커스 종 Cr4로부터 정제한 니트릴 수화효소를 SDS-PAGE한 후, Horiz-Blot Electrophoresis Apparatus Model AE6678-P (ATTO사제)를 이용하여 PVDF 막에 전기전이(electro-transferred)하고, 아미드 블랙 염색을 행하였다. α-서브유니트 및 β-서브유니트에 해당하는 부분을 잘라내어 기상 펩티드 서열분석기 (gas-phase peptide sequencer) model 473A (Applied Biosystem사제)로 자동 에드먼 분해(Edman degradation)를 행하여 PTH 아미노산 유도체를 얻었다. PTH 아미노산 유도체 분석 장치 (PTH amino acid derivative analyzer) model 120A (Applied Biosystem사제)을 이용하여 α-서브유니트 및 β-서브유니트의 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다.

N-말단 아미노산 서열은 α-서브유니트에서는 TAHNPVQGTFPRSNE (서열번호: 5)이고, β-서브유니트에서는 MDGIHDLGGRAGLGPI (서열번호: 7)이었다. 상기 서열은 로도코커스 로도크로우스 J1 균주의 저분자형의 니트릴 수화효소의 N-말단 서열과 α-서브유니트에서는 93% (10번째의 아미노산이 J1에서는 L), β-서브유니트에서는 100%의 상동성을 나타내었다.

이와 같이, 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트 및 β-서브유니트의 N-말단 아미노산 서열은 로도코커스 종 Cr4의 그것과 거의 동일하다. 또한, 이제까지 1차구조가 보고되어 있는 니트릴 수화효소에 대해서는 α-서브유니트에서 상동성이 높다는 것이 알려져 있다. 따라서, 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트 유전자 단편을 프루브 DNA로 이용하여 클로닝을 행하였다. 또한, 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소의 β-서브유니트 유전자 단편을 이용하여 로도코커스 종 Cr4의 니트릴 수화효소 전영역이 클로닝된 것을 확인하였다.

22. 프루브DNA의 제작

로도코커스 로도크로우스 J1에는 저분자형 및 고분자형의 니트릴 수화효소가 존재한다. 따라서, 우선, 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소 유전자 중에서 고분자형의 1차구조와 상이한 저분자형의 1차구조 영역을 선택하였다. 구체적으로는 각각 하기한 아미노산 서열을 선택하였다.

α-서브유니트:

센스 프라이머 영역: QGTLPRSN (서열번호: 8)

안티센스 프라이머 영역: PDPDVEIR (서열번호: 9)

β-서브유니트:

센스 프라이머 영역: PHDYLTSQ (서열번호: 10)

안티센스 프라이머 영역: PNVVNHID (서열번호: 11)

다음으로, 이들 아미노산 서열에 기초하여 저분자형 니트릴 수화효소 유전자의 일부가 특이적으로 증폭되는 PCR 프라이머를 실제로 디자인하였다. 최종적으로, 하기 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머를 디자인하였다.

증폭용 α-서브유니트 유전자 단편:

센스 프라이머: 5'-cagggcacgttgccacgatcg-3' (서열번호: 12)

안티센스 프라이머: 5'-cggatctcgacgtcagggtcg-3' (서열번호: 13)

증폭용 β-서브유니트 유전자 단편:

센스 프라이머: 5'-cgcacgactacctgacctcgc-3' (서열번호: 14)

안티센스 프라이머: 5'-cgatgtgattgactacgttcgg-3' (서열번호: 15)

다음으로, Ausbel 등의 방법 (Ausbel, FM et al: UNIT 2.4, Preparation of Genomic DNA from Bacteria in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York) 1987)에 따라, 로도코커스 로도크로우스 J1의 게놈DNA를 제조하였다. 또한, 동일한 방법을 이용하여 로도코커스 종 Cr4의 배양균체로부터 게놈DNA를 제조하였다.

얻어진 10 ng의 게놈DNA를 주형으로 하여 Taq DNA 중합효소 (Takara Shuzo사제)를 이용하여, 94℃에서 1분간 가닥분리(denaturation), 60℃에서 90초간 어닐링, 72℃에서 90초간 신장(extension)의 조건 하에서 PCR을 30 사이클 행하고, 로도코커스 로도크로우스 J1의 저분자형 니트릴 수화효소 유전자의 일부를 증폭시켰다. 증폭시킨 DNA단편을 아가로스 겔 전기영동한 후, RECOCHIP (Takara Shuzo사제)를 이용하여 겔로부터 회수하였다.

α-서브유니트 유전자 단편 증폭용 프라이머를 이용하여 로도코커스 로도크로우스 J1 및 로도코커스 종 Cr4의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 행한 결과, 양쪽 균주 모두에서 약 450bp의 증폭 단편이 얻어졌다. 그러나, 로도코커스 종 Cr4의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에는 PCR의 증폭효율이 낮았기 때문에 로도코커스 로도크로우스 J1의 게놈 DNA를 주형으로 하여 얻어진 증폭단편을 프루브DNA로 이용하였다. DIG-라벨링 키트 (Boehringer Manheim사제)를 이용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 랜덤 프라임법(random priming method)을 행하고, 로도코커스 로도크로우스 J1유래의 DNA 증폭단편을 디곡시게닌으로 표지하였다. 상기 디곡시게닌 표지 DNA 단편을 서던 블롯 분석과 콜로니 혼성화의 프루브DNA로서 이용하였다.

23. 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)

로도코커스 종 Cr4의 게놈 DNA를 각종 제한효소로 분해시키고, 로도코커스 로도크로우스 J1의 α-서브유니트 유래의 프루브DNA를 이용하여 서던 블롯 분석을 행하였다. 10μg의 로도코커스 종 Cr4의 게놈 DNA를 PstI, SphI 및 BanIII (Toyobo사제)로 완전히 분해시킨 후, 1μg 상당량의 분해물을 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하였다. 버큠 블로터 모델 785 (vacuum blotter model 785) (Bio-Rad사제)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 나일론 막 NY13N (Schleicher & Schuel사제)에 전이한 후, 오토크로스 링커(autocrosslinker) CL-1000 (BM Equipment사제)를 이용하여막에 고정하였다. 얻어진 막을 프루브DNA와 60℃에서 하룻 밤 혼성화(hybridized)시킨 후, 실온에서 5분간, 이어서 60℃에서 15분간 세척하였다. DIG 검출 키트 (DIG detection kit) (Boehringer Manheim사제)를 이용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 CDP-Star에 의한 화학발광을 Fuji RX 필름으로 검출하였다.

서던 블롯 분석으로부터 PstI, SphI 및 BanIII로 분해시킨 로도코커스 종 Cr4의 게놈 DNA에 대하여 각각 3.2 kb, 4.2 kb 및 7.8 kb의 단일 밴드가 하나씩 검출되어 로도코커스 종 Cr4의 니트릴 수화효소 유전자는 1개(a single-copy gene)인 것이 판명되었다. 그 사이에 PstI 분해에 의해 제작된 라이브러리를 이용하여 로도코커스 종 Cr4의 니트릴 수화효소 유전자를 클로닝하였다.

24. 로도코커스 종 Cr4의 게놈 라이브러리 제작 및 콜로니 혼성화(colony hybridization)

pBluescript II SK (+) (Stratagene사제)를 PstI으로 분해시키고, 박테리아 알칼라인 탈인산효소(bacterial alkaline phosphatase) (Takara Shuzo사제)를 이용하여 탈인산화하였다. 로도코커스 종 Cr4의 게놈 DNA를 PstI으로 분해시키고, T4 DNA 리가제 (Takara Shuzo사제)를 이용하여 상기의 pBluescript II SK (+)에 라이게이션시킨 후, E. coli DH5α에 형질전환시켰다.

콜로니 혼성화는 Sambrook 등의 방법 (Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) 1989)에 따라 행하였다. 구체적으로는 50μg/ml의 암피실린을 포함하는 LB한천 평판배지에 니트로셀룰로스 필터를올려서 얻어진 형질전환체를 도말하였다. 37℃에서 하룻밤 배양하여 콜로니를 형성시킨 후, 레플리카 필터를 제작하고 레플리카 필터를 한천 평판배지상에 올려서 마찬가지로 배양하였다. 레플리카 필터상에 콜로니가 형성되면 200μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 한천 평판배지 상으로 옮겨서 37℃에서 24시간 인큐베이션하였다. 필터를 SDS 및 알칼리로 처리하여 용균시킨 후, 서던 블롯 분석과 마찬가지의 조건에서 혼성화를 행하여, 약 2000개의 콜로니로부터 1개의 양성 콜로니를 얻었다.

25. 양성 콜로니의 분석

양성 콜로니를 배양한 후, 알칼리-SDS법에 의해 플라스미드를 제조하고 pNHCr4P로 명하였다. 상기 pNHCr4P는 약 3.2-kb 의 DNA 단편 삽입체를 가지고 있었다. pNHCr4P의 삽입 DNA단편에 β-서브유니트 유전자가 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위하여 β-서브유니트 유전자 단편 증폭용의 프라이머를 이용하여 로도코커스 로도크로우스 J1의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 행하여 프루브DNA를 제조하였다. 이 프루브DNA를 이용하여 pNHCr4P에 대한 서던 블롯 분석을 행하고 약 3.2 kb의 삽입 단편에 β-서브유니트 유전자가 포함되어 있는 것을 확인하였다.

DNA 서열분석기 모델 377A (Applied Biosystem사제) 및 Taq 프라이머 사이클 서열분석 키트 (Taq primer cycle sequencing kit) (Applied Biosystem사제)를 이용하여 디데옥시 체인 종결법(dideoxy chain termination method)을 행하여 약 3.2kb의 pNHCr4P의 삽입 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 16으로 나타내었다. 서열분석의 결과, pNHCr4P의 PstI삽입 DNA 단편은 3205bp이고, ORF가 존재한다는 것이 판명되었다(도 12). 로도코커스 종 Cr4의 유전자 클러스터 구조(organization)는 로도코커스 로도크로우스 J1의 저분자형 니트릴 수화효소 유전자를 포함하는 영역과 매우 유사하였다(Komeda et al: Proc Natl Acad Sci USA 94: 36-41, 1997).

26. 1차 구조의 분석

PstI 단편의 염기번호 245로부터 2100까지의 영역으로부터 추정되는 α-서브유니트의 1차구조를 서열번호: 2로, β-서브유니트의 1차구조를 서열번호: 4로 나타내었다. α-서브유니트 및 β-서브유니트의 N-말단 아미노산 서열은 단백질 서열 분석의 결과와 완전히 일치하였다. 또한, α-서브유니트 및 β-서브유니트는 둘다 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소와 가장 높은 상동성을 나타내었다(표17).

	α	β
알.로도크로우스 (R. rhodochrous) J1 (저분자형)	92%	87%
로도코커스 종 (Rhodococcus sp.)	65%	45%
슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)	59%	37%
바실러스 종 (Bacillus sp.) BR449	60%	38%
메소리조비움 로티 (Mesorhizobium loti)	56%	38%
시노리조비움 멜릴로티(Sinorhizobium meliloti)	55%	39%
로도코커스 종 (Rhodococcus sp.) M8	52%	37%
알.로도크로우스 (R. rhodochrous) J1 (고분자형)	52%	37%
알.에리트로폴리스 (R. erythropolis)	50%	35%
슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis) B23	50%	31%
브레비박테리움 종 (Brevibacterium sp.) R312	50%	?
특허 제 W09504828호	42%	34%

로도코커스 종 Cr4 의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트(서열번호: 2) 및 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소의 α-서브유니트(서열번호: 18)에서 상이한 아미노산 염기수는 207개의 잔기 중에서 17개였다. 또한, 로도코커스 종 Cr4 의 니트릴 수화효소의 β-서브유니트(서열번호: 4) 및 로도코커스 로도크로우스 J1의 니트릴 수화효소의 β-서브유니트(서열번호: 19)에서 상이한 아미노산 염기수는 227 개의 잔기 중에서 29개였다(도13 및 도14).

본 발명은 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴을 기질로 하여 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드를 생성할 수 있는 니트릴 수화효소를 제공한다. 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드는 사료 첨가제(메티오닌 대체물)로서 유용한 화합물이다.

본 발명은 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드를 효소학적으로 생성할 수 있는 니트릴 수화효소를 제공함과 동시에 그 유전자를 클로닝하였다. 본 발명에 의하여 제공되는 니트릴 수화효소를 코딩하는 유전자는 적당한 숙주세포에 형질전환됨으로써 본 발명의 니트릴 수화효소를 높은 수준에서 발현한다. 따라서, 본 발명에 의하여 얻을 수 있는 형질전환체 그 자체, 또는 형질전환체로부터 얻어지는 효소 단백질은 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드의 효소학적인 제조에 유용하다. 유전자 재조합에 의하여 제조되는 공지의 니트릴 수화효소의 다수가 높은 효소활성을 달성할 수 없었음에 반하여 본 발명의 니트릴 수화효소는 유전자 재조합체에 있어서도 높은 활성을 유지한다는 점에서 우수하다.

또한, 본 발명의 니트릴 수화효소는 시아나이드나 알데히드의 존재하에서도높은 효소활성을 유지한다. 극성 용매중에서는 기질 화합물인 α-히드록시니트릴이 히드로시안산 및 알데히드로 해리된다. 히드로시안산은 시아나이드로 전환되어 종종 효소활성 저하의 원인이 된다. 알데히드도 또한 단백질에 장해를 주고, 효소활성 저하의 원인이 된다. 공지의 니트릴 수화효소가 공업적으로 이용될 수 없었던 이유중 하나는 이러한 시아나이드나 알데히드의 영향에 의해 효소활성이 저하되는 것에 있었다. 본 발명의 수화효소는 시아나이드나 알데히드의 존재하에서도 효소활성을 유지한다. 따라서, 알데히드 및 히드로시안산으로부터 생성하는 α-히드록시니트릴을 기질로서 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 니트릴 수화효소는 α-히드록시니트릴을 원료로 하는 아미드의 제조방법에 유용하다.

Claims

물리화학적 성질 (a) 및 (b)를 갖는 니트릴 수화효소:

(a) 니트릴 화합물의 니트릴기에 작용하여, 니트릴기를 수화시켜서 아미드기로 전환시키는 성질; 및

(b) 시아나이드-내성.
하기 물리화학적 성질 (1)-(7)을 갖는 니트릴 수화효소:

(1) 분자량:

겔 여과(gel filtration)로 측정시의 분자량은 약 110,000 Da이고

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 26.8 kDa 및 29.5 kDa의 두 서브유니트로 분리된다;

(2) 활성:

니트릴 화합물의 니트릴기에 작용하여 니트릴기를 수화하고 아미드기로 전환시킨다;

(3) 최적 pH:

니트릴기를 수화하는 활성은 pH 5.5 - 6.5에서 최대이다;

(4) 최적 온도:

니트릴기를 수화하는 활성은 40 - 45℃에서 최대이다;

(5) pH 안정성:

상기 효소의 pH 안정성은 pH 4 - 9 내이다;

(6) 열 안정성:

상기 효소는 50℃에서 30분간 열-처리 후 70% 이상의 활성을 보유한다;

(7) 저해제:

HgCl₂, AgNO₃, 히드록실아민 또는 페닐히드라진에 의해 저해된다.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 물리화학적 특성을 추가적으로 갖는 니트릴 수화효소:

(c) 기질 특이성:

상기 효소는 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴을 기질로서 이용하여 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드를 생산한다.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 물리화학적 특성을 추가적으로 갖는 니트릴 수화효소:

(d) 안정화:

상기 효소는 2가 금속 이온에 의해 안정화된다.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 니트릴 수화효소는 수탁번호 FERM BP-6596로 기탁되어 있는 로도코커스 종(Rhodococcus sp.) Cr4 균주에서 유래된 것을 특징으로 하는 니트릴 수화효소.
수탁번호 FERM BP-6596로 기탁되어 있는 로도코커스 종(Rhodococcus sp.) Cr4 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항의 니트릴 수화효소의 제조방법.
(A) 내지 (E) 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α-서브유니트 및, (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 β-서브유니트로 구성되며, 하기 물리화학적 성질 (i) 및 (ii)를 갖는 단백질 복합체:

(i) 니트릴 화합물의 니트릴기에 작용하여 니트릴기를 수화시켜 아미드기로 전환시키는 성질; 및

(ii) 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴을 기질로 사용하여 2-히드록시-4-메틸티오부티로아미드를 생산하는 기질 특이성;

α-서브유니트:

(A) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(B) 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(C) 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것;

(D) 엄격한 조건(stringent conditions)하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드;

(E) 서열번호: 2 의 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 상동성(identity)을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

β-서브유니트:

(a) 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것;

(d) 엄격한 조건하에서 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드;

(e) 서열번호: 4 의 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서, 상기 α-서브유니트가 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
제7항에 있어서, 상기 β-서브유니트가 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 복합체.
제7항의 단백질 복합체의 α-서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기 (A) 내지 (E)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:

(A) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(B) 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(C) 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것;

(D) 엄격한 조건(stringent conditions)하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드;

(E) 서열번호: 2 의 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 상동성(identity)을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제7항의 단백질 복합체의 β-서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기 (a) 내지 (e)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것;

(d) 엄격한 조건하에서 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드;

(e) 서열번호: 4 의 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제10항 또는 제11항에 의한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질.
제10항의 폴리뉴클레오티드 및 제11항의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 양자가 삽입된 재조합 벡터.
제13항의 재조합 벡터로 숙주를 형질전환하여 얻어지는 형질전환체.
제14항에 있어서, 숙주가 미생물인 형질전환체.
니트릴 수화효소 또는 그의 서브유니트를 제조하는 방법으로서, 제14항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 따른 니트릴 수화효소; 제1항 또는 제2항에 따른 니트릴수화효소를 생산하는 미생물; 제7항에 따른 단백질 복합체; 제14항에 따른 형질전환체; 및 그의 공정 산물

로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소학적으로 활성인 물질을 니트릴 화합물과 접촉시키는 단계; 및 상기 접촉 단계에서 제조된 아미드를 회수하는 단계를 포함하는 아미드의 제조방법.
제17항에 있어서, 상기 니트릴 화합물이 α-히드록시니트릴 화합물이고 상기 아미드가 α-히드록시아미드인 것을 특징으로 하는 아미드의 제조방법.
제18항에 있어서, 상기 α-히드록시니트릴 화합물이 하기 화학식1로 나타내는 화합물이고, 그 산물이 하기 화학식3으로 나타내는 α-히드록시아미드 화합물인 것을 특징으로 하는 아미드의 제조방법:

[화학식1]

[화학식3]

식 중, R은 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 알케닐기, 치환 또는비치환된 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 치환 또는 비치환된 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 포화 또는 불포화된 복소환기를 나타낸다.
제19항에 있어서, 하기 화학식 2로 나타내는 알데히드 및 히드로시안산을 포함하는 복합체내에서 상기 화학식1로 나타내는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미드의 제조방법:

[화학식2]

식 중, R은 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 알케닐기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 치환 또는 비치환된 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 포화 또는 불포화된 복소환기를 나타낸다.
제17항에 있어서, 상기 효소학적으로 활성인 물질이 2가 금속 이온 존재하에 상기 니트릴 화합물과 반응하는 것을 특징으로 하는 아미드의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 2가 금속 이온이 니켈 이온 및/또는 코발트 이온인 것을 특징으로 하는 아미드의 제조방법.
니트릴 수화효소를 2가 금속 이온과 접촉시키는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 존재하에 니트릴 수화효소의 활성을 안정화시키는 방법.
2가 금속 이온의 존재하에서 니트릴 화합물과 니트릴 수화효소를 반응시키는 단계; 및

제조된 아미드를 회수하는 단계를 포함하는 아미드의 제조방법.
제24항에 있어서, 상기 니트릴 화합물이 α-히드록시니트릴이고, 아미드가 α-히드록시아미드인 것을 특징으로 하는 아미드의 제조방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 2가 금속 이온이 니켈 이온 및/또는 코발트 이온인 것을 특징으로 하는 아미드의 제조방법.