CN110257450A - 一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法 Download PDF

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CN110257450A CN201910636726.7A CN201910636726A CN110257450A CN 110257450 A CN110257450 A CN 110257450A CN 201910636726 A CN201910636726 A CN 201910636726A CN 110257450 A CN110257450 A CN 110257450A
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Abstract

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，包括以下步骤：(1)紫外诱变筛选高表达腈水合酶菌株；(2)生产高纯度烟酰胺：a、一级种子液的制备；b、二级种子液的制备；c、发酵培养，待OD600达到50‑70时，补加诱导剂，待酶活降低后停止反应；d、水合反应：所得反应液和水加入反应釜，反应温度20‑25℃，缓慢滴加3‑氰基吡啶，滴加完后继续反应。本发明通过对特定的枯草芽孢杆菌进行紫外诱变，进而筛选出高表达腈水合酶菌株，并通过特定的发酵及优化的催化反应，得到副产物烟酸含量低于10ppm的烟酰胺水溶液，产品纯度高、收率高，原料溶剂低廉，经济性好，反应温和，污染小，适合工业化生产。

Description

一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法。
背景技术
烟酰胺又称尼克酰胺，是烟酸的酰胺化合物，为白色的结晶性粉末；无臭或几乎无臭，味苦；略有引湿性。在水或乙醇中易溶，在甘油中溶解。临床上主要用于防治糙皮并口炎、舌炎，病态窦房结综合征，房室传导阻滞等问题。
目前，腈水合酶是生产烟酰胺的重要生物催化媒介，但一般的产腈水合酶菌株在催化反应合成烟酰胺中都易于产生副产物烟酸，而且烟酸含量较高，这样使得得到的烟酰胺纯度不高。尤其对于发酵过程中生物催化剂等一次性投入导致最终腈水合酶活性下降，反应速度变慢。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，通过对特定的枯草芽孢杆菌进行紫外诱变，进而筛选出高表达腈水合酶菌株，并通过特定的发酵及优化的催化反应，得到副产物烟酸含量低于10ppm的烟酰胺水溶液，产品纯度高、收率高，原料溶剂低廉，经济性好，反应温和，污染小，适合工业化生产。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，包括以下步骤：
(1)紫外诱变筛选高表达腈水合酶菌株
a、取对数生长期的枯草芽孢杆菌平铺于90mm的无菌培养皿，置于30w紫外灯下20cm处，分别在避光条件下照射处理30s、40s、50s、60s、90s、120s；
b、照射后的培养皿放置在37℃培养箱中，静置1小时。将培养的菌液均匀涂布在LB固体培养基上，37℃静置培养2天，生长的单菌落用于发酵摇瓶筛选；
c、挑取若干单菌落，接种于诱导培养基；
d、通过SDS-PAGE检测筛选获得高表达腈水合酶菌株；
(2)生产高纯度烟酰胺
a、一级种子液的制备：将经步骤(1)得到的高表达腈水合酶菌株自平板上培养后接种至培养基装液量为40mL的一级种子液摇瓶中，25℃-35℃摇床培养12-48h，摇床转速150-300rpm，得一级种子液；
b、二级种子液的制备：将培养好的一级种子按5-20％接种量接入培养基装液量为250mL的二级种子液摇瓶中，25℃-35℃摇床培养12-48h，摇床转速150-300rpm，得二级种子液；
c、发酵培养：在10L发酵罐中加入1-5L的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：乳糖1-5％(g/mL)、KH2PO4 0.01-0.2％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.01-0.2％(g/mL)、MgSO4·7H2O0.01-0.05％(g/mL)、酵母粉0.1-1％(g/mL)、氯化铵0.1-1％(g/mL)、尿素0.1-1％(g/mL)、诱导剂1-5mL/L，其余为水，pH 6.5-7.5；
121℃实罐消毒10-30min，以5-20％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度25-35℃条件下，发酵周期72-96h，培养过程中，每隔4-6h取样，测定OD值和pH值变化，pH值控制6.5-7.5，待OD600达到50-70时，补加诱导剂，待酶活降低后停止反应；
d、水合反应：将上述反应结束后所得反应液和水加入反应釜，控制反应温度20-25℃，缓慢滴加3-氰基吡啶，滴加完后继续反应，直至反应结束。
优选地，步骤(1)的步骤a中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CICC10071或枯草芽孢杆菌CICC10456，枯草芽孢杆菌CICC10071或枯草芽孢杆菌CICC10456均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
优选地，步骤(1)的步骤c中，诱导培养基配方如下：乳糖3％(g/mL)、KH2PO4 0.1％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.1％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.03％(g/mL)、酵母粉0.5％(g/mL)、氯化铵0.5％(g/mL)。
优选地，步骤(2)的步骤a、b中，培养基组成为：乳糖1-2.5％，酵母粉0.5-1.5％，NaC1 0.1-0.2％，K2HPO4·3H2O 0.05-0.2％，MgSO4·7H2O 0.01-0.02％，尿素0.1-0.5％，其余为水，pH 7.0-7.5。
优选地，步骤(2)的步骤c中，诱导剂组成为：乳糖7-9％(g/mL)，CoCl2·6H2O 1-1.2％(g/mL)，其余为水；步骤(3)中补加诱导剂后，诱导剂的浓度为2-3.5ml/L。
优选地，步骤(2)的步骤d中，反应液、水、3-氰基吡啶的质量比为1：6.5-8：2。
优选地，步骤(2)的步骤d中，反应结束后烟酸含量低于10ppm。
本发明的有益效果是：
本发明解决了现有的枯草芽孢杆菌产腈水合酶活性低以及且副产烟酸含量高的问题，本发明中，先通过紫外诱变筛选高表达腈水合酶菌株，再将得到的高表达腈水合酶菌株通过种子培养、发酵培养、水合反应等步骤，在发酵过程中调控工艺，并通过优化条件后可得到高酶活性的腈水合酶，在之后水合反应能将副产烟酸降低至10ppm，所得烟酰胺的纯度达到99.9％以上。本发明先对特定的枯草芽孢杆菌进行紫外诱变，进而筛选出高表达腈水合酶菌株，并通过特定的发酵及优化的催化反应，使副产物烟酸含量低，产品纯度高、收率高，原料溶剂低廉，经济性好，反应温和，污染小，适合工业化生产。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：紫外诱变筛选高表达腈水合酶菌株
(1)取对数生长期的枯草芽孢杆菌CICC10071，平铺于90mm的无菌培养皿，置于30w紫外灯下20cm处，分别在避光条件下照射处理30s、40s、50s、60s、90s、120s。
(2)照射后的培养皿放置在37℃培养箱中，静置1小时。将培养的菌液均匀涂布在LB固体培养基上，37℃静置培养2天，生长的单菌落用于发酵摇瓶筛选。
(3)挑取若干单菌落，接种于诱导培养基，配方如下：乳糖3％(g/mL)、KH2PO4 0.1％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.1％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.03％(g/mL)、酵母粉0.5％(g/mL)、氯化铵0.5％(g/mL)。
(4)通过SDS-PAGE检测筛选获得高表达腈水合酶菌株。
实施例2：紫外诱变筛选高表达腈水合酶菌株
(1)取对数生长期的枯草芽孢杆菌CICC10456，平铺于90mm的无菌培养皿，置于30w紫外灯下20cm处，分别在避光条件下照射处理30s、40s、50s、60s、90s、120s。
(2)照射后的培养皿放置在37℃培养箱中，静置1小时。将培养的菌液均匀涂布在LB固体培养基上，37℃静置培养2天，生长的单菌落用于发酵摇瓶筛选。
(3)挑取若干单菌落，接种于诱导培养基，配方如下：乳糖3％(g/mL)、KH2PO4 0.1％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.1％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.03％(g/mL)、酵母粉0.5％(g/mL)、氯化铵0.5％(g/mL)。
(4)通过SDS-PAGE检测筛选获得高表达腈水合酶菌株。
实施例3：高纯度烟酰胺的生产
一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，包括以下步骤：
(1)一级种子液的制备：将实施例1中筛选获得的高表达腈水合酶菌株自平板上培养后接种至培养基装液量为40mL的一级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖2％，酵母粉1％，NaC1 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.3％，其余为水，pH 7.2；25℃摇床培养148h，摇床转速300rpm，得一级种子液。
(2)二级种子液的制备：将培养好的一级种子按10％接种量接入培养基装液量为250mL的二级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖2％，酵母粉1％，NaC1 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.3％，其余为水，pH 7.2；25℃摇床培养48h，摇床转速300rpm，得二级种子液。
(3)发酵培养：在10L发酵罐中加入2L的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：乳糖3％(g/mL)、KH2PO4 0.1％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.1％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.03％(g/mL)、酵母粉0.5％(g/mL)、氯化铵0.5％(g/mL)、尿素0.5％(g/mL)、诱导剂3mL/L，其余为水，pH7.2；
121℃实罐消毒30min，以10％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度35℃条件下，发酵周期96h，培养过程中，每隔5h取样，测定OD值和pH值变化，pH值控制7，待OD600达到60时，补加诱导剂，诱导剂的终浓度为3ml/L，待酶活降低后停止反应；
上述诱导剂组成均为：乳糖8.5％(g/mL)，CoCl2·6H2O 1％(g/mL)，其余为水。
(4)水合反应：将上述反应结束后所得反应液和水加入反应釜，控制反应温度20-25℃，缓慢滴加3-氰基吡啶，滴加完后继续反应，直至反应结束，其中反应液、水、3-氰基吡啶的质量比为1：7.5：2；反应结束后烟酸含量为8ppm，反应的转化率在99.9％以上。将反应结束后所得水合液经过常规的过滤、浓缩、干燥等步骤，最终得到粉末状的烟酰胺，经检测该烟酰胺的纯度≥99.93％。
实施例4：高纯度烟酰胺的生产
一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，包括以下步骤：
(1)一级种子液的制备：将实施例1中筛选获得的高表达腈水合酶菌株自平板上培养后接种至培养基装液量为40mL的一级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖2.5％，酵母粉1％，NaC1 0.15％，K2HPO4·3H2O 0.05％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.4％，其余为水，pH 7.0；30℃摇床培养40h，摇床转速200rpm，得一级种子液。
(2)二级种子液的制备：将培养好的一级种子按15％接种量接入培养基装液量为250mL的二级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖2.5％，酵母粉1％，NaC1 0.15％，K2HPO4·3H2O 0.05％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.4％，其余为水，pH7.0；30℃摇床培养24h，摇床转速200rpm，得二级种子液。
(3)发酵培养：在10L发酵罐中加入3L的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：乳糖5％(g/mL)、KH2PO4 0.1％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.12％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.03％(g/mL)、酵母粉0.6％(g/mL)、氯化铵0.3％(g/mL)、尿素0.5％(g/mL)、诱导剂2.5mL/L，其余为水，pH 7.0；
121℃实罐消毒30min，以15％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度35℃条件下，发酵周期96h，培养过程中，每隔5h取样，测定OD值和pH值变化，pH值控制7.0，待OD600达到60时，补加诱导剂，诱导剂的终浓度为3ml/L，待酶活降低后停止反应；
上述诱导剂组成均为：乳糖9％(g/mL)，CoCl2·6H2O 1％(g/mL)，其余为水。
(4)水合反应：将上述反应结束后所得反应液和水加入反应釜，控制反应温度25℃，缓慢滴加3-氰基吡啶，滴加完后继续反应，直至反应结束，其中反应液、水、3-氰基吡啶的质量比为1：8：2；反应结束后烟酸含量为10ppm，反应的转化率在99.9％以上。将反应结束后所得水合液经过常规的过滤、浓缩、干燥等步骤，最终得到粉末状的烟酰胺，经检测该烟酰胺的纯度≥99.99％。
实施例5：高纯度烟酰胺的生产
一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，包括以下步骤：
(1)一级种子液的制备：将实施例1中筛选获得的高表达腈水合酶菌株自平板上培养后接种至培养基装液量为40mL的一级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖2.5％，酵母粉0.5％，NaC1 0.15％，K2HPO4·3H2O 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.3％，其余为水，pH 7.0；35℃摇床培养12h，摇床转速250rpm，得一级种子液。
(2)二级种子液的制备：将培养好的一级种子按20％接种量接入培养基装液量为250mL的二级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖2.5％，酵母粉0.5％，NaC1 0.15％，K2HPO4·3H2O 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.3％，其余为水，pH7.0；35℃摇床培养12h，摇床转速250rpm，得二级种子液。
(3)发酵培养：在10L发酵罐中加入4L的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：乳糖5％(g/mL)、KH2PO4 0.15％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.15％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.03％(g/mL)、酵母粉0.4％(g/mL)、氯化铵0.8％(g/mL)、尿素0.5％(g/mL)、诱导剂3.5mL/L，其余为水，pH 7.0；
121℃实罐消毒30min，以15％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度35℃条件下，发酵周期96h，培养过程中，每隔5h取样，测定OD值和pH值变化，pH值控制7.0，待OD600达到60时，补加诱导剂，诱导剂的终浓度为3ml/L，待酶活降低后停止反应；
上述诱导剂组成均为：乳糖9％(g/mL)，CoCl2·6H2O 1％(g/mL)，其余为水。
(4)水合反应：将上述反应结束后所得反应液和水加入反应釜，控制反应温度25℃，缓慢滴加3-氰基吡啶，滴加完后继续反应，直至反应结束，其中反应液、水、3-氰基吡啶的质量比为1：6.5：2；反应结束后烟酸含量为6ppm，反应的转化率在99.9％以上。将反应结束后所得水合液经过常规的过滤、浓缩、干燥等步骤，最终得到粉末状的烟酰胺，经检测该烟酰胺的纯度≥99.9％。
实施例6：高纯度烟酰胺的生产
一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，包括以下步骤：
(1)一级种子液的制备：将实施例2中筛选获得的高表达腈水合酶菌株自平板上培养后接种至培养基装液量为40mL的一级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖1％，酵母粉1.5％，NaC1 0.2％，K2HPO4·3H2O 0.01％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.5％，其余为水，pH 7.2；25℃摇床培养48h，摇床转速150rpm，得一级种子液。
(2)二级种子液的制备：将培养好的一级种子按10％接种量接入培养基装液量为250mL的二级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖1％，酵母粉1.5％，NaC1 0.2％，K2HPO4·3H2O 0.01％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.5％，其余为水，pH7.2；25℃摇床培养48h，摇床转速150rpm，得二级种子液。
(3)发酵培养：在10L发酵罐中加入5L的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：乳糖3％(g/mL)、KH2PO4 0.01％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.05％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.01％(g/mL)、酵母粉0.5％(g/mL)、氯化铵1％(g/mL)、尿素0.5％(g/mL)、诱导剂2mL/L，其余为水，pH6.5；
121℃实罐消毒20min，以10％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度25℃条件下，发酵周期72h，培养过程中，每隔4h取样，测定OD值和pH值变化，pH值控制6.5，待OD600达到55时，补加诱导剂，诱导剂的终浓度为2.5ml/L，待酶活降低后停止反应；
上述诱导剂组成均为：乳糖7％(g/mL)，CoCl2·6H2O 1.2％(g/mL)，其余为水。
(4)水合反应：将上述反应结束后所得反应液和水加入反应釜，控制反应温度20℃，缓慢滴加3-氰基吡啶，滴加完后继续反应，直至反应结束，其中反应液、水、3-氰基吡啶的质量比为1：8：2；反应结束后烟酸为9ppm，反应的转化率在99.9％以上。将反应结束后所得水合液经过常规的过滤、浓缩、干燥等步骤，最终得到粉末状的烟酰胺，经检测该烟酰胺的纯度≥99.90％。
实施例7：高纯度烟酰胺的生产
一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，包括以下步骤：
(1)一级种子液的制备：将实施例2中筛选获得的高表达腈水合酶菌株自平板上培养后接种至培养基装液量为40mL的一级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖1％，酵母粉1.5％，NaC1 0.2％，K2HPO4·3H2O 0.01％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.5％，其余为水，pH 7.2；30℃摇床培养24h，摇床转速200rpm，得一级种子液。
(2)二级种子液的制备：将培养好的一级种子按15％接种量接入培养基装液量为250mL的二级种子液摇瓶中，其中培养基(经过灭菌后的培养基)组成为：乳糖1％，酵母粉1.5％，NaC1 0.2％，K2HPO4·3H2O 0.01％，MgSO4·7H2O 0.02％，尿素0.5％，其余为水，pH7.2；30℃摇床培养24h，摇床转速200rpm，得二级种子液。
(3)发酵培养：在10L发酵罐中加入1L的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：乳糖1％(g/mL)、KH2PO4 0.2％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.01％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.05％(g/mL)、酵母粉0.4％(g/mL)、氯化铵0.8％(g/mL)、尿素1％(g/mL)、诱导剂1mL/L，其余为水，pH7.5；
121℃实罐消毒20min，以10％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度30℃条件下，发酵周期72h，培养过程中，每隔4h取样，测定OD值和pH值变化，pH值控制6.5，待OD600达到50时，补加诱导剂，诱导剂的终浓度为2ml/L，待酶活降低后停止反应；
上述诱导剂组成均为：乳糖7％(g/mL)，CoCl2·6H2O 1.2％(g/mL)，其余为水。
(4)水合反应：将上述反应结束后所得反应液和水加入反应釜，控制反应温度22℃，缓慢滴加3-氰基吡啶，滴加完后继续反应，直至反应结束，其中反应液、水、3-氰基吡啶的质量比为1：7.5：2；反应结束后烟酸为9.5ppm，反应的转化率在99.9％以上。将反应结束后所得水合液经过常规的过滤、浓缩、干燥等步骤，最终得到粉末状的烟酰胺，经检测该烟酰胺的纯度≥99.99％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)紫外诱变筛选高表达腈水合酶菌株
a、取对数生长期的枯草芽孢杆菌平铺于90mm的无菌培养皿，置于30w紫外灯下20cm处，分别在避光条件下照射处理30s、40s、50s、60s、90s、120s；
b、照射后的培养皿放置在37℃培养箱中，静置1小时，将培养的菌液均匀涂布在LB固体培养基上，37℃静置培养2天，生长的单菌落用于发酵摇瓶筛选；
c、挑取若干单菌落，接种于诱导培养基；
d、通过SDS-PAGE检测筛选获得高表达腈水合酶菌株；
(2)生产高纯度烟酰胺
a、一级种子液的制备：将经步骤(1)得到的高表达腈水合酶菌株自平板上培养后接种至培养基装液量为40mL的一级种子液摇瓶中，25℃-35℃摇床培养12-48h，摇床转速150-300rpm，得一级种子液；
b、二级种子液的制备：将培养好的一级种子按5-20％接种量接入培养基装液量为250mL的二级种子液摇瓶中，25℃-35℃摇床培养12-48h，摇床转速150-300rpm，得二级种子液；
c、发酵培养：在10L发酵罐中加入1-5L的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：乳糖1-5％(g/mL)、KH2PO4 0.01-0.2％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.01-0.2％(g/mL)、MgSO4·7H2O0.01-0.05％(g/mL)、酵母粉0.1-1％(g/mL)、氯化铵0.1-1％(g/mL)、尿素0.1-1％(g/mL)、诱导剂1-5mL/L，其余为水，pH6.5-7.5；
121℃实罐消毒10-30min，以5-20％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度25-35℃条件下，发酵周期72-96h，培养过程中，每隔4-6h取样，测定OD值和pH值变化，pH值控制6.5-7.5，待OD600达到50-70时，补加诱导剂，待酶活降低后停止反应；
d、水合反应：将上述反应结束后所得反应液和水加入反应釜，控制反应温度20-25℃，缓慢滴加3-氰基吡啶，滴加完后继续反应，直至反应结束。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，其特征在于，步骤(1)的步骤a中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CICC10071或枯草芽孢杆菌CICC10456。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，其特征在于，步骤(1)的步骤c中，诱导培养基配方如下：乳糖3％(g/mL)、KH2PO4 0.1％(g/mL)、K2HPO4·3H2O 0.1％(g/mL)、MgSO4·7H2O 0.03％(g/mL)、酵母粉0.5％(g/mL)、氯化铵0.5％(g/mL)。
4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，其特征在于，步骤(2)的步骤a、b中，培养基组成为：乳糖1-2.5％，酵母粉0.5-1.5％，NaC1 0.1-0.2％，K2HPO4·3H2O 0.05-0.2％，MgSO4·7H2O 0.01-0.02％，尿素0.1-0.5％，其余为水，pH7.0-7.5。
5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，其特征在于，步骤(2)的步骤c中，诱导剂组成为：乳糖7-9％(g/mL)，CoCl2·6H2O 1-1.2％(g/mL)，其余为水；步骤(3)中补加诱导剂后，诱导剂的浓度为2-3.5ml/L。
6.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，其特征在于，步骤(2)的步骤d中，反应液、水、3-氰基吡啶的质量比为1：6.5-8：2。
7.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，其特征在于，步骤(2)的步骤d中，反应结束后烟酸含量低于10ppm。
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