CN101712944A

CN101712944A - 一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产烟酰胺中的应用

Info

Publication number: CN101712944A
Application number: CN200910264302A
Authority: CN
Inventors: 杨寿海; 孔国平; 陈金福; 韦琛鸿; 赵广福
Original assignee: Nanjing No1 Pesticide Group Co ltd
Current assignee: Rui Bang bio tech ltd, Anhui
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: CN101712944B

Abstract

本发明属于生物化工领域，公开了一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产烟酰胺中的应用。枯草芽孢杆菌CGMCC NO.3242，其产生的腈水合酶能催化3-氰基吡啶进行水合反应生成烟酰胺。利用枯草芽孢杆菌CGMCC NO.3242生物催化生产烟酰胺的工艺为以3-氰基吡啶为底物，以枯草芽孢杆菌CGMCCNO.3242为生物催化剂，采用底物和生物催化剂耦合补加的方式进行催化水合反应得到烟酰胺。本发明有效的降低了高浓度底物和产物对细胞的毒害作用，有利于得到高浓度的烟酰胺水合液，其中烟酰胺的浓度不低于25％，有利于产物分离。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产烟酰胺中的应用

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产烟酰胺中的应用。

背景技术

烟酰胺俗名VB₃，又名尼克酰胺(Nicotinamide、Niacinamide)，化学名为3-吡啶甲酰胺，吡啶-3-甲酰胺等，分子式C₆H₆N₂O，分子量122.13，为白色针状结晶或粉末，熔点129～131℃，比重1.400。易溶于水、能溶于乙醇和甘油，不溶于醚，无臭、略带苦味，微毒。

烟酸、烟酰胺属B族维生素，统称维生素PP，在实际应用中可等量替代，自然界的烟酸存在于肝、肾、酵母和米糠中，是生物体内脱氢辅酶I或II的组分，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。它们在医药中可用于治疗糙皮病等，还可以添加到食品和面粉中用以补充人体所需的维生素，其最大的应用领域是用作饲料添加剂。

工业上，烟酰胺、烟酸主要是以吡啶类化合物为原料生产的，世界烟酰胺、烟酸的生产主要集中在西欧和美国，日本也有少量生产。全球烟酰胺、烟酸年产能4.2万t/a，年产量达3.0万吨，主要生产国有瑞士、比利时、美国、日本及中国等。主要生产厂家有瑞士龙沙(1.5万t/a)、比利时德固赛(能力为8500t/a)、美国Reilly、日本Yuyigosei公司以及美国内贝塔公司等。国内生产厂家受原料进口限制，生产规模普遍较小，主要有广州龙沙(属于瑞士龙沙)、江苏南通醋酸化工、浙江新昌制药厂等。

在生产中主要的工艺就是将3-甲基吡啶(PIC)氨氧化生成3-氰基吡啶(NSN)，再经化学水解得到烟酰胺或烟酸。瑞士龙沙公司以2-甲基-1，5-戊二胺(MPDA)为原料合成3-甲基吡啶，再经生化水解得烟酰胺，该技术的应用使龙沙公司的烟酰胺生产技术在世界上处于领先地位。其中的生化法主要工艺如下：使用第三代丙烯酰胺菌种Rhodococcus rhodochrous J1的固定化细胞将3-氰基吡啶水解为烟酰胺，采用连续搅拌釜，沿工艺流程方向将浓度为10～20％的3-氰基吡啶连续进料，并逆流投入生物催化剂。酶水解生产所需要的酰胺的选择性＞99％，转化率为100％。

近年来，国内不少单位在丙烯腈生物催化合成丙烯酰胺的研究中，对腈水合酶/腈水解酶菌种的筛选和工业化应用也进行了较深入的研究，研究单位有上海农药所，浙江工业大学，清华大学和中科院生命有机化学国家重点实验室等。其中上海农药所先后承担了国家“七五”，“八五”，“九五”期间丙烯酰胺的工业化生产相关的重大课题，并成功开发出了烟腈微生物催化为烟酰胺技术，且申请有专利。在此基础上，并于2003年7月份在与浙江医药股份有限公司合作，在浙江来益生物技术有限公司建立了0.2wt/a规模的烟酰胺生产装置。

如上海市农药研究所的专利CN1424402中报道了采用丙酸棒杆菌产生的腈水合酶将3-氰基吡啶转化成烟酰胺。在转化过程中，当产物浓度≥5％时用ultra flow膜过滤系统出产物，同时开始补加3-氰基吡啶和水，等产物的累积浓度≥10％以后一次性出罐。

瑞士龙沙股份有限公司的专利CN1154364A中报道了采用固定化的红球菌属rhodochrous微生物，再多段连续槽形反应器中进行3-氰基吡啶的催化水合反应。其反应液中3-氰基吡啶的含量在10～20％重量之间，因此，反应结束后产物烟酰胺的浓度也基本不超过20％。

浙江爱迪亚营养科技开发有限公司的专利CN1952114A中报道了一种产腈水合酶的谷氨酸棒杆菌，经过固定化处理后在水溶液中转化3-氰基吡啶，最终在反应物总重量中所加入的3-氰基吡啶的重量为10～25％。

以上专利都是采用生物催化的方法，以3-氰基吡啶为底物，产腈水合酶的微生物作生物催化剂进行水合反应。期间向反应釜中一次性添加生物催化剂，连续或间隙的补加底物3-氰基吡啶进行水合反应，反应结束后得到浓度较低的烟酰胺反应液。以上传统生物催化工艺的不足之处在于生物催化剂一次性加入，随着反应时间的延长，细胞受底物和产物的抑制效果逐渐增加，反应速度下降，酶活降低，只能被动的在较低产物浓度时选择放料，最终难以得到高浓度的产物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242。本发明的另一目的是提供该细菌在生物催化生产烟酰胺中的应用。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242，其发酵产物是产腈水合酶的细胞，腈水合酶能催化3-氰基吡啶进行水合反应生成烟酰胺。

枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)具有以下微生物学特征：

1.形态学特征

在固体平板培养基上培养48小时后出现圆形光滑的单菌落，灰白色，不透明，表面湿润，边缘光滑，整个菌落凸起，易挑取；镜检成杆状，大小长为(0.5～0.8um)×(1.5～2.5um)，芽孢中生。

2.培养学特征

本菌株在以下3种培养基中30℃下培养48～96小时后的培养特征见表1。

表1枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)在3种培养基上的培养特征

3.生理生化特征

表2枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)生理生化性质

(注：表中+表示阳性，-表示阴性。)

枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的培养方法如下：(1)种子液制备：先进行枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)斜面种子制备，将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)接种到灭过菌的斜面培养基上后在20～35℃下培养3～7天，刮取3～5环菌种接种到装有已灭菌的液体培养基的三角瓶中，在温度为20～35℃，转速为100～300rpm下振荡培养30～120小时，即可作为枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)的一级种子。同样培养条件下，将一级种子按3～10％(％：v/v)的接种量转接第二批装有同样培养基的三角瓶中，同样条件下培养30～72小时后作为枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的二级种子。

(2)扩大培养：将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)二级种子以3～10％(％：v/v)的接种量接种到7～300L发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：装液量：60～80％(％：v/v)，通气量：0.1～1(v/v.min)，罐压：0.02～0.05MPa，温度：20～35℃，转速：100～400rpm，发酵时间：30～120小时。

所涉及的培养基成分如下：

斜面培养基(g/L)：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，琼脂：10～30，pH：5～9，121℃灭菌20min。

一级、二级液体种子培养基(g/L)：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，尿素：2～20，己内酰胺：0.5～10，氯化钴：5～50ppm，pH：5～9，121℃灭菌20min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖：10～50，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，尿素：2～20，己内酰胺：0.5～10，氯化钴：5～50ppm，pH：5～9，121℃灭菌20min。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242在生物催化生产烟酰胺中的应用。

一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242生物催化生产烟酰胺的工艺如下：以3-氰基吡啶为底物，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242为生物催化剂，采用底物和生物催化剂耦合补加的方式，在温度为5～35℃，搅拌转速为100～300rpm下进行催化水合反应得到烟酰胺。

所述的催化水合反应一般在反应釜中进行，反应釜的装液体积为50～70％(％：v/v)。3-氰基吡啶的起始添加量为1～10％(％：g/100mL)，生物催化剂的累积添加总量为1～30％(％：g/100mL)，当底物浓度低于0.5g/L时，开始耦合补加底物3-氰基吡啶和生物催化剂，每批的添加量和两者的起始添加量一致，顺序可以互为先后或同时补加，一般连续补加次数为5～20次，最终底物累加浓度可达25％(％：g/100mL)以上。

所述的催化水合反应一般进行15～96小时，当底物浓度逐渐降低，趋向于零时即可终止。

所述的反应结束后，在2500～3500rpm下离心10～20分钟后取上清，或者用0.2～0.5um膜超滤后置于0～4℃下冷冻1～1.5小时左右即可直接析出大量烟酰胺晶体，将其混合液2500～3500rpm转速下冷冻离心10～20分钟得晶体，30～80℃下真空干燥即得纯度在98％以上的烟酰胺。

本发明的有益效果：

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242，该菌株产腈水合酶的总酶活力高，为生物催化法生产烟酰胺提供了优良的菌种。

其他生物催化反应只补加底物，而本发明首次采用底物和催化剂耦合多次补加。底物分批补加，创造出持续低浓度底物的催化反应系统，有效的降低了高浓度底物和产物对细胞的毒害作用；同时，虽然每次底物浓度较低，但通过多次补加，底物的累积浓度较之一次性加入并未降低；另外，催化剂分批补加，使生物催化剂受抑制的累积时间相对减少，有利于维持生物催化剂的活性。底物和催化剂耦合多次补加，将二者分批补加的优势结合在一起，产生了1+1＞2的效果，有利于得到高浓度的烟酰胺水合液，其中烟酰胺的浓度不低于25％(％：g/100mL)，有利于反应结束后的产物分离。

本发明反应结束后的产物分离部分，含高浓度烟酰胺的水合液勿需经过浓缩处理，可直接经过冷冻结晶、干燥处理后得到纯度在98％以上的烟酰胺晶体，减少了工艺流程，提高了分离效率。

涉及的生物材料样品的保藏

本发明所要求保护的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.3242，保藏日期为2009年8月19日。

具体实施方式

实施例1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242的筛选

从南京第一农药厂污水池不同角度取污泥样100余批，分批富集培养后进行筛选和鉴定：

称取10克污泥，加无菌水50mL，用玻璃珠摇碎后取5mL悬浊液接种到45mL富集培养基中，放置30℃摇床上，120rpm振荡培养3天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀释液涂布到含初筛固体培养基的平板上，置30℃恒温培养箱培养3～6天。挑取生长出的单菌落接种到新的初筛固体培养基上扩大培养，培养条件同上。待菌长出后刮取3～5环接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上120rpm下振荡培养3天，取15mL培养液3000rpm下离心10min，倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体，继续离心得菌体。将所得菌体添加到含1％(％：g/100mL)亚氨基二乙腈的PBS缓冲液中转化2小时，反应体系中菌体浓度为0.5g/L。取5mL转化液3000rpm下离心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果转化液含有亚氨基二乙酸则说明该菌对亚氨基二乙腈具有转化能力，选择其中亚氨基二乙酸转化率最高的一株，按《简明伯杰细菌鉴定手册》第八版进行鉴定为枯草芽孢杆菌。将该株枯草芽孢杆菌命名为KR2，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC NO.3242，保藏日期为2009年8月19日。

筛选方法中的所述的液体富集培养基、固体初筛培养基、液体复筛培养基如下：

富集培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，pH：7，121℃灭菌20min。

固体初筛培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，亚氨基二乙腈(或丙烯腈、或烟腈、或乳腈、或羟基乙腈)：1，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，琼脂：2，pH：7，121℃灭菌20min。

液体发酵培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，尿素：0.5，pH：7，121℃灭菌20min。

实施例2生物催化剂的制备

将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)斜面菌种接种到液体种子培养基中(葡萄糖：15，酵母膏：5，蛋白胨：5，氯化钠：2，磷酸二氢钾：1，磷酸氢二钾：1，硫酸镁：0.5，尿素：10，己内酰胺：5，氯化钴：10ppm，pH 7.0，单位：g/L)。在温度为25℃，转速为150rpm下振荡培养48小时即可得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)一级种子液，将该一级种子液按照10％的接种量转接到装有同样成分已灭菌的培养基中继续进行培养，48小时后可得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)二级种子液。

将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)二级种子液按照10％的接种量接种到35L已灭菌的液体发酵培养基中，(葡萄糖：30，酵母膏：10，蛋白胨：10，氯化钠：2，磷酸二氢钾：1，磷酸氢二钾：1，硫酸镁：0.5，尿素：10，己内酰胺：5，氯化钴：10ppm，pH：7，单位：g/L)，发酵罐体积为50L，采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于10％，通气量：0.2v/v.min，罐压：0.03MPa，温度：25℃，起始转速100rpm，发酵过程中根据发酵液的溶氧水平有步骤的调节，最大转速不超过400rpm，发酵72小时后即可制得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)细胞发酵液。

将上述所得的发酵液3000rpm离心15min所得沉淀即为本发明所需的生物催化剂。

实施例3酶活测定

本实施例采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242的发酵液进行酶活的测定。酶活的定义：在25℃下，1mL发酵液与1微克3-氰基吡啶催化反应1小时后生成的烟酰胺的微克数，该微克数即为总酶活力单位数。烟酰胺采用液相色谱法进行检测，检测参数为：色谱柱：CLC-ODS柱，150mm×6.0mm I.D；流动相：乙腈/水/庚烷磺酸钠/三乙胺(50/450/0.8g/2mL)(pH3)；流速：1.2mL/min；柱温：室温；检测波长：UV268nm。在本发明条件下，每毫升发酵液中生物量最高可达47mg湿菌体，总酶活最高可达1255U。

实施例4烟酰胺的制备

在50L搅拌釜中，先添加30L去离子水，调pH到7.0，温度为30℃。向反应釜中添加0.6kg 3-氰基吡啶，生物催化剂的起始添加量为0.1kg。每隔2小时检测一次反应液中的3-氰基吡啶浓度，当底物浓度低于0.5g/L后同时开始补加底物和生物催化剂，补加的量与起始量一致，连续补加14次。反应50小时后检测反应液中的3-氰基吡啶的浓度，当底物浓度趋向于零时即可终止反应。将反应液于3000rpm离心10min，取上清液同样条件下再离心1次，得澄清的上清液。将该上清液4℃下冷冻结晶，等析出大量晶体后将混合液于3000rpm下冷冻离心10min得晶体，60℃下真空干燥，最后得纯度为98.5％的烟酰胺9.68kg，收率达90.3％。

实施例5

本实施例仅改变催化反应的温度，其余反应条件与参数均与实施例4保持一致。本实施例将搅拌釜中催化反应的温度调整为10℃，其余条件不变。最终得到纯度为98.5％的烟酰胺9.76千克，收率达91.1％。

实施例6

本实施例除对底物和生物催化剂的补加顺序进行了调整外，其他的反应条件和操作方法均与实施例4中的方法保持一致。本实施例的反应参数、底物和生物催化剂起始添加量、补加次数也均与实施例4保持一致。本实施例所述的底物和生物催化剂的补加顺序指先添加底物，半小时后再补加生物催化剂，以此类推。最终得到纯度为98.6％的烟酰胺9.66千克，收率达90.2％。

实施例7

本实施例中3-氰基吡啶的起始添加浓度量为2kg，生物催化剂的起始添加量为0.4kg，每隔5小时检测一次反应液中的底物浓度，当底物浓度低于0.5g/L后开始补加底物与生物催化剂，补加量与起始添加量一致，连续补加4次。其余反应条件和操作均与实施例4保持一致。最终得纯度为99.1％的烟酰胺10.93千克，收率达92.3％。

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.3242。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242在生物催化生产烟酰胺中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242生物催化生产烟酰胺的工艺如下：以3-氰基吡啶为底物，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242为生物催化剂，采用底物和生物催化剂耦合补加的方式于5～35℃，100～300rpm下进行催化水合反应得到烟酰胺。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的3-氰基吡啶的起始添加量为1～10％，生物催化剂的起始添加量为1～5％，当底物浓度低于0.5g/L时，开始耦合补加底物3-氰基吡啶和生物催化剂，每批的添加量和两者的起始添加量一致，顺序可以互为先后或同时补加，使得最终底物累加浓度在25％以上，最终生物催化剂累积浓度在1～30％。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的底物浓度趋向于零时结束反应。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的反应结束后，将反应液在2500～3500rpm下离心或者用0.2～0.5um膜超滤后于0～4℃下冷冻结晶、之后于30～80℃下真空干燥得到纯度达98％以上的烟酰胺。