CN101768561B

CN101768561B - 一株枯草芽孢杆菌及其在合成亚氨基二乙酸中的应用

Info

Publication number: CN101768561B
Application number: CN2009102643067A
Authority: CN
Inventors: 杨寿海; 孔国平; 王红明; 刘善和; 葛九敢
Original assignee: Nanjing Huazhou Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Huazhou Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: CN101768561A

Abstract

本发明属于生物化工领域，公布了一株枯草芽孢杆菌及其在合成亚氨基二乙酸中的应用。应用的具体方法为在水-水溶性溶剂组成的均相溶剂体系中，以亚氨基二乙腈为底物，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2(CGMCC NO.3242)的絮凝细胞液为生物催化剂，于温度为5～35℃，搅拌转速为100～300rpm下反应15～50小时得到亚氨基二乙酸。本发明工艺最终产物纯度超过96％，收率达90.0％以上。本发明方法操作简单，反应条件温和，废水量少，工艺适合规模化工业生产应用。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在合成亚氨基二乙酸中的应用

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一株新菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2，以及该菌株在生物催化法合成亚氨基二乙酸中的应用。

背景技术

亚氨基二乙腈：NH(CH₂CN)₂，易溶于丙酮等有机溶剂，主要用于合成除草剂草甘膦。另外，作为一种重要的精细化工中间体，在染料、电镀、水处理、合成树脂等领域也有一定的应用。

亚氨基二乙酸：NH(CH₂COOH)₂，比重1.56，溶于水，难溶于醇、丙酮和乙醚，熔点247.5℃(分解)，与酸碱生成盐，还和多种金属形成蛰合物。亚氨基二乙酸又名氨乙二酸，简称IDA，是一种重要的精细化工产品，主要用于草甘膦等农药的制造，离子交换树脂的原料及橡胶、电镀等方面。

目前亚氨基二乙酸主要采用化学法进行生产，主要方法有亚氨基二乙腈水解法、氯乙酸法、二乙醇胺脱氢氧化法、氢氰酸法等。在其众多的合成方法中，综合考虑各方法的工艺收率、原料成本和经济效益，亚氨基二乙腈水解法最具有竞争力，将逐渐成为国内合成亚氨基二乙酸的主导工艺。

目前亚氨基二乙腈水解法主要采用化学水解法，其工艺大致是在催化剂作用下，用强碱将亚氨基二乙腈水解后再经过酸化处理制得亚氨基二乙酸，其工艺反应原理如下：

化学水解法虽然是目前的主流工艺，但是本路线中需要消耗大量的强酸和强碱，同时需要高温、高压等反应条件，副产物多，产量低，废水量大，环境污染严重。

近期也有利用生物催化法合成亚氨基二乙酸的报道，但均为在水相中反应，虽然克服了化学法的众多不足，但也存在底物溶解度低导致的传质效果差，产物浓度低，底物和产物分离难，装置利用率不高，难于工业化等不利因素。

发明内容

本发明的目的是为克服以上技术的局限，提供一株新的芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2，本发明的另一目的是提供该细菌在生物催化法合成亚氨基二乙酸中的应用。

本发明的技术方案是：

本发明所涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2(CGMCC No.3242)是本公司生物化工研究组成员从受腈类化合物污染达15年以上的的农药厂土壤中筛选得到。

枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)具有以下微生物学特征：

1.形态学特征

在固体平板培养基上培养48小时后出现圆形光滑的单菌落，灰白色，不透明，表面湿润，边缘光滑，整个菌落凸起，易挑取；镜检成杆状，大小长为(0.5～0.8um)×(1.5～2.5um)，芽孢中生。

2.培养学特征

本菌在以下3种培养基中30℃下培养48～96小时后的培养特征见表1。

表1枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)在3种培养基上的培养特征

3.生理生化特征

表2枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)生理生化性质

(注：表中+表示阳性，-表示阴性。)

枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的培养方法如下：

(1)种子液制备：先进行枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)斜面种子制备，将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)接种到灭过菌的斜面培养基上后在20～35℃下培养3～7天，刮取3～5环菌种接种到装有已灭菌的液体培养基的三角瓶中，在温度为20～35℃，转速为100～300rpm下振荡培养30～120小时，即可作为枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)的一级种子。同样培养条件下，将一级种子按3～10％(％：v/v)的接种量转接第二批装有同样培养基的三角瓶中，同样条件下培养30～72小时后作为枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的二级种子。

(2)扩大培养：将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)二级种子以3～10％(％：v/v)的接种量接种到7～300L发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：装液量：60～80％(％：v/v)，通气量：0.1～1(v/v.min)，罐压：0.02～0.05MPa，温度：20～35℃，转速：100～400rpm，发酵时间：30～120小时。

所涉及的培养基成分如下：

斜面培养基(g/L)：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，琼脂：15～20，pH：5～9，121℃灭菌20min。

一级、二级液体种子培养基(g/L)：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，己内酰胺：0.5～10，异戊腈：0.1～5，氯化钴：5～50ppm，pH：5～9，121℃灭菌20min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖：10～50，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，己内酰胺：0.5～10，异戊腈：0.1～5，氯化钴：5～50ppm，pH：5～9。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2(CGMCC NO.3242)在生物催化法合成亚氨基二乙酸中的应用。

所述的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)在生物催化法合成亚氨基二乙酸中应用的具体方法是在水-水溶性有机溶剂组成的均相溶剂体系中，以亚氨基二乙腈为底物，以枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)为生物催化剂，于温度为5～35℃，100～300rpm搅拌转速下反应15～50小时得到亚氨基二乙酸。

所述的生物催化反应一般在搅拌釜中进行，装液量为搅拌釜体积的50～70％(％：v/v)。反应体系的溶剂系统为水-水溶性有机溶剂组成的均相系统，水与水溶性有机溶剂的体积比例为5∶1～30∶1，该水溶性溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、二氧六环、甘油，优选水-丙酮作为该均相体系。

所述的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)制备成絮凝细胞作为生物催化剂进行所述的生物催化反应，反应体系中絮凝细胞液的加入量为总反应液体积的5～15％(％：v/v)。

所述的亚氨基二乙腈的起始添加量为装液量的0.5～5％(％：g/100mL)，采用分批补加的方式添加亚氨基二乙腈，亚氨基二乙腈的最终累积浓度不超过30％(％：g/100mL)。在温度为5～35℃，搅拌转速为100～300rpm下催化水解15～50小时。

其中，絮凝细胞液的制备方法为：将发酵罐内的发酵液2500～3500rpm离心10分钟，弃上清，所得沉淀用去离子水冲洗一遍后同样转速下继续离心10分钟，得沉淀湿菌体。或直接将发酵液用0.2～0.5um膜超滤后得湿菌体。将所得的湿菌体用去离子水冲洗下来后搅匀制得湿菌体浓度为1～200g/L的菌悬液。向菌悬液中0.1～15‰(‰：g/1000mL)的絮凝剂，优选添加量为0.5～1.5‰(‰：g/1000mL)，在温度为5～35℃，pH为4～8下，200～500rpm搅拌10min即制得分散均匀的絮凝细胞液。该絮凝剂选自：壳聚糖，甲壳素，聚谷氨酸，聚丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚乙烯亚胺等高分子絮凝剂中的一种或几种的组合，优选壳聚糖。

反应结束后向转化液中重新添加0.1～0.5‰(‰：g/1000mL)的絮凝剂，搅匀，静置10～30min后过滤出絮凝菌团，滤液经2500～3500rpm离心或用0.2～0.5um膜超滤后，在50～80℃以下先蒸馏、浓缩，后于4℃下冷冻结晶，可得到纯度在96％以上的亚氨基二乙酸，亚氨基二乙腈的转化率超过98％。蒸馏出的水溶性有机相和过滤出的絮凝菌团均可套用到下批反应中去。

本发明中所涉及的过滤、蒸馏、浓缩、冷冻结晶均为本领域技术人员所公知的普通技术。

本发明的有益效果：

1、本发明所提供的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)对有机溶剂的耐受性强，适用于含有机溶剂的生物转化系统；该菌用作亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的生物催化剂，亚氨基二乙酸的收率达90％以上。

2、通常情况下细胞酶活的半衰期随温度的升高呈现递减趋势，为维持酶活的稳定性，工业上一般采用低温生物催化。亚氨基二乙腈在水中的溶解度小，25℃时在水中的溶解度仅为6～7克，现有技术采用单独水相中低温生物催化时，添加高浓度的底物亚氨基二乙腈易析出，不利于转化的进行。由于亚氨基二乙腈易溶于丙酮等有机溶剂，且低温环境可有效防止系统中丙酮的挥发，本发明采用水-水溶性有机溶剂组成的均相系统作为生物催化合成亚氨基二乙酸的溶剂，能显著提高底物在低温反应系统中的溶解度，有利于获得较高的产物浓度，亚氨基二乙酸的收率达90％以上，产物纯度大于96％，较现有技术更具工业价值。

3、采用安全性高的絮凝剂对细胞絮凝化处理后进行催化，分离过程简单易于操作，产品纯度高，絮凝剂的使用有效的保护了细胞免受高浓度底物和溶剂的毒害作用，有利于工业化放大生产。

4、产品分离纯化阶段回收的有机溶剂和絮凝细胞可套用到下一批反应，节约成本的同时避免了有机溶剂对环境的污染。

5、生物催化法生产亚氨基二乙酸较之化学法具有反应过程废水产量少，污染少，反应条件温和、能耗低；产品成本低，收率高，易于工业化生产的优点。

涉及的生物材料样品的保藏

本发明所要求保护的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.3242，保藏日期为2009年8月19日。

具体实施方式

实施例1菌种筛选

本发明中菌种的筛选方法如下：

从南京第一农药厂污水池不同角度取污泥样100余批，分批富集培养后进行筛选和鉴定：

称取10克污泥，加无菌水50mL，用玻璃珠摇碎后取5mL悬浊液接种到45mL富集培养基中，放置30℃摇床上，120rpm振荡培养3天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀释液涂布到含初筛固体培养基的平板上，置30℃恒温培养箱培养3～6天。挑取生长出的单菌落接种到新的初筛固体培养基上扩大培养，培养条件同上。待菌长出后刮取3～5环接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上120rpm下振荡培养3天，取15mL培养液3000rpm下离心10min，倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体，继续离心得菌体。将所得菌体添加到含1％(％：g/100mL)亚氨基二乙腈的PBS缓冲液中转化2小时，反应体系中菌体浓度为0.5g/L。取5mL转化液3000rpm下离心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果转化液含有亚氨基二乙酸则说明该菌对亚氨基二乙腈具有转化能力，选择其中亚氨基二乙酸转化率最高的一株，按《简明伯杰细菌鉴定手册》第八版进行鉴定为枯草芽孢杆菌。将该株枯草芽孢杆菌命名为KR2，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC NO.3242，保藏日期为2009年8月19日。

本发明中的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)能同时在分别以丙烯腈、烟腈、乳腈、羟基乙腈，亚氨基二乙腈为唯一氮源的固体初筛培养基上生长，底物范围广，降解腈类化合物能力强，适合用作本发明中亚氨基二乙酸的生物催化合成。

筛选方法中的所述的液体富集培养基、固体初筛培养基、液体复筛培养基分别如下：

富集培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，pH：7，121℃灭菌20min。

固体初筛培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，亚氨基二乙腈(或丙烯腈、或烟腈、或乳腈、或羟基乙腈)：1，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，琼脂：2，pH：7，121℃灭菌20min。

液体发酵培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，尿素：0.5，pH：7，121℃灭菌20min。

实施例2游离细胞的制备

在无菌超净工作台内用接种环刮取枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)斜面菌种3环，接种到一级液体种子培养基中(葡萄糖：15，酵母膏：5，蛋白胨：5，氯化钠：2，磷酸二氢钾：1，磷酸氢二钾：1，硫酸镁：0.5，异戊腈：0.1～5，己内酰胺：5，氯化钴：10ppm，pH：7.0，单位：g/L)。在温度为25℃，转速为150rpm下振荡培养48小时即可得一级枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)种子液，将该一级种子液按照10％的接种量转接到装有同样成分已灭菌的培养基中继续进行培养，48小时后可得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)二级种子液。

将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)二级种子液按照10％的接种量接种到35L已灭菌的液体发酵培养基中，(葡萄糖：30，酵母膏：10，蛋白胨：10，氯化钠：2，磷酸二氢钾：1，磷酸氢二钾：1，硫酸镁：0.5，异戊腈：0.1～5，己内酰胺：5，氯化钴：10ppm，pH：7，单位：g/L)，发酵罐体积为50L，采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于10％，通气量：0.2v/v.min，罐压：0.03MPa，温度：25℃，起始转速100rpm，发酵过程中根据发酵液的溶氧水平有步骤的调节，最大转速不超过400rpm，发酵72小时后即可制得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)细胞发酵液。

实施例3 酶活测定

本实施例采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242的发酵液进行酶活的测定。酶活的定义：在25℃下，1mL发酵液与1微克亚氨基二乙腈催化反应1小时后生成的亚氨基二乙酸的微克数，该微克数即为总酶活力单位数。亚氨基二乙酸采用液相色谱法进行检测，检测参数为：Spherisorb SAX强阴离子交换柱，150mm×4.6mm I.D；流动相：0.005mol/L的磷酸二氢钾缓冲液(pH2.5)；流速：1.0mL/min；柱温：室温；检测波长：UV 210nm。在本发明条件下，每毫升发酵液中生物量最高可达47mg湿菌体，总酶活最高可达560U。

实施例4絮凝细胞液的制备

取3L枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)发酵液3000rpm离心10min得沉淀细胞，用3L去离子水冲洗一遍后3000rpm下继续离心10min，弃上清得沉淀湿菌体。枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)沉淀湿菌体称重后用去离子水将其冲洗下来制得浓度为35g/L的菌悬液。30℃下调菌悬液pH为6，向菌悬液中添加0.6‰(‰：g/1000mL)的壳聚糖，200rpm下搅拌10min即可制得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)絮凝化细胞液。

实施例5均相体系下的催化反应与产物分离

在50L搅拌釜中，先添加27L去离子水和3L制备好的絮凝细胞液，调pH到7.0，反应温度为10℃，搅拌均匀后向其中添加5L丙酮。将3千克纯度为97％的亚氨基二乙腈采用多次间隙补加的方式进行添加，每次1千克，每隔10小时一次，分3批添加进反应釜中，反应40小时后检测转化液中底物亚氨基二乙腈的浓度为0.08％(％：g/100mL)。向上述催化反应结束后的釜中重新添加0.2‰(‰：g/1000mL)的壳聚糖，搅拌10min后静置半小时后下料。将反应液放出后压滤，所得菌团可继续套用到下批反应中。滤液先经0.45um超滤膜过滤后再70℃蒸馏出丙酮，浓缩后于4℃冷冻结晶得纯度为98.6％的亚氨基二乙酸3.856kg，产物收率达93.4％。

实施例6

本实施例将反应釜中的反应温度控制在25℃，其余反应条件和操作方式均与实施例5保持一致。结果是在35小时后检测到转化液中底物亚氨基二乙腈的浓度为0.091％(％：g/100mL)。放料后以同样方式精制亚氨基二乙酸，最终得纯度为98.3％的亚氨基二乙酸3.796kg，收率达91.7％。

实施例7

本实施例操作方法、设备及其他工艺参数都与实施例5保持一致，不同之处在于添加亚氨基二乙腈的起始浓度不同，即将3千克纯度为97％以上的亚氨基二乙腈每隔3小时补加一次，分10次完成，每次300克。反应结束后按同样的方法进行产物分离，得到纯度为99.2％的亚氨基二乙酸3.742千克，收率达91.2％。

实施例8

本实施例操作方法、设备及其他工艺参数都与实施例3保持一致，不同之处在于最终反应系统中水与水溶性有机溶剂的比例不同。实施例5中水-水溶性有机溶剂的最终比例关系为(27+3)∶5，相当于6∶1。本实施例最终反应系统中水-水溶性溶剂比例关系为(27+3)∶2，即反应系统中添加丙酮的量由5L改为2L。反应结束后按同样的方法进行产物分离，得到纯度为98.8％的亚氨基二乙酸3.717千克，收率达90.2％。

实施例9

本实施例主要考查枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的遗传稳定性。将4℃冰箱中保藏的该枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)放置30℃恒温培养箱中活化20分钟后取出接种到新鲜的斜面培养基中，之后放置30℃恒温培养箱培养3天，待斜面上长出新的划线菌落后即为该枯草芽孢杆菌的子一代，命名为KR2-1；之后以KR2-1为出发菌种，以同样的方式进行接种传代，培养出新划线菌落后命名为子二代KR2-2；再以KR2-2为出发菌种，以同样的方式转接新斜面培养基，得子三代KR2-3。以此方式连续传代30次，分别得到KR2-4、KR2-5......KR2-30。斜面培养基(g/L)：葡萄糖：15，酵母膏：5，蛋白胨：2，氯化钠：1，磷酸二氢钾：0.5，磷酸氢二钾：0.5，硫酸镁：0.5，琼脂：20，pH：7。

挑选以上传代培养中所得到KR2-10、KR2-20、KR2-30三株子代，以原始KR2(CGMCC NO.3242)为对照，同时进行一级液体种子、二级液体种子的制备，操作方法和培养基均与实施例1中相同。之后进行游离细胞的制备，将所得的二级液体种子以10％的接种量接种到装有已灭菌发酵培养基的摇瓶中，每500mL容量的摇瓶最终装液量为100mL，接完种之后放置温度为25℃的恒温摇床上振荡培养3天，转速为150rpm。所述的发酵培养基与实施例1中相同。

将以上所得的液体发酵液于3000rpm下冷冻离心10分钟，弃上清液后用等体积的去离子水冲洗沉淀菌体一遍后继续离心10分钟等菌体，转速不变。将所得的沉淀菌体用pH为7的去离子水制成35g/L的菌悬液后进行转化试验。转化试验在恒温摇床上进行，转化液置于摇瓶内，每500mL摇瓶最终装转化液的体积为100mL。底物亚氨基二乙腈的浓度为2％(％：g/100mL)，菌悬液的添加量为5％，转化温度为25℃，摇床转速200rpm，转化时间为10分钟。转化结束后添加5mol/L的盐酸中止酶活，之后将转化液3000rpm离心10分钟后取上清液检测。KR2、KR2-10、KR2-20、KR2-30四株菌所对应的转化液中亚氨基二乙酸的浓度分别为2.38％、2.37％、2.32％、2.25％(％：g/100mL)。以上结果可见，该枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)在传代30次后仍然保持与亲代KR2菌几乎相当的转化率，具有很好的遗传稳定性。

实施例10

本实施例主要进行絮凝细胞套用的考察，其游离细胞的制备、絮凝细胞的制备、均相体系下的催化反应方法都分别与实施例2、实施例4和实施例5保持一致。不同之处在于：将第一批转化反应结束后的絮凝细胞菌团过滤出来，用等量的去离子水冲洗两遍，过滤后向絮凝细胞团中添加去离子水，使絮凝细胞混合液的体积达到3L，将此3L絮凝细胞液套用到下一批转化试验中继续反应。反应结束后以同样的方式继续制备相同体积的絮凝细胞液，再连续套用6次。其中转化液中底物亚氨基二乙腈的添加量与添加方式均与实施例3中相同，最终数据如表3所示。结果显示，该絮凝细胞在循环套用到第4次时亚氨基二乙酸的收率和纯度都出现明显下降。套用3次时亚氨基二乙酸的收率达到90.0％，纯度仍然保持在98％以上。因此，本专利中所述的絮凝细胞菌团以套用3次为佳。

表3 絮凝细胞循环套用后的转化数据

套用次数	亚氨基二乙酸的量(kg)	收率	纯度
				0(起始)	3.861	94.0％	99.1％
1	3.845	93.0％	98.4％
				2	3.834	93.6％	99.4％
3	3.717	90.0％	98.6％
				4	3.487	82.9％	96.8％
5	2.850	64.1％	91.5％
				6	2.417	52.4％	88.2％

7

2.203

46.2％

85.3％

本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。

Claims

1.保藏号为CGMCC No.3242的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2在生物催化法合成亚氨基二乙酸中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的具体方法为在水-水溶性有机溶剂组成的均相溶剂体系中，以亚氨基二乙腈为底物，以保藏号为CGMCCNo.3242的枯草芽孢杆菌KR2为生物催化剂，于温度为5～35℃，搅拌转速为100～300rpm下催化反应得到亚氨基二乙酸。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的保藏号为CGMCC No.3242的枯草芽孢杆菌KR2制备成絮凝细胞液参与反应，反应体系中絮凝细胞液的加入量为总反应液体积的5～15％。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于制备所述的絮凝细胞液所用的絮凝剂是壳聚糖、甲壳素、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺中的一种或几种的组合，絮凝剂添加量为0.1～15g/1000mL。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的絮凝剂为壳聚糖。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的水-水溶性有机溶剂组成的均相溶剂体系中水相与水溶性有机溶剂的体积比为5∶1～30∶1。

7.根据权利要求2或6所述的应用，其特征在于所述的水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、二氧六环或甘油。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的水溶性有机溶剂为丙酮。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的反应体系中底物亚氨基二乙腈的起始添加量为装液量的0.5～5％，采用间隙多次补加的方式使亚氨基二乙腈的累积浓度不超过30％。

10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述生物催化反应结束后向转化液中重新添加0.1～0.5g/1000mL的絮凝剂，搅拌均匀后静置，过滤出菌团，滤液经2500～3500rpm离心或用0.2～0.5um膜超滤后，再经蒸馏、浓缩、冷冻结晶即得纯度在96％以上的亚氨基二乙酸。