CN108315364A - 生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺 - Google Patents

生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺 Download PDF

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CN108315364A CN201810094608.3A CN201810094608A CN108315364A CN 108315364 A CN108315364 A CN 108315364A CN 201810094608 A CN201810094608 A CN 201810094608A CN 108315364 A CN108315364 A CN 108315364A
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Abstract

本发明公开了一种生物转化制备α‑酮戊二酸的分离纯化工艺，属于微生物技术领域。本发明生物转化制备α‑酮戊二酸的分离纯化工艺包括电渗析、纳滤、活性炭脱色、反渗透浓缩、浓缩结晶和干燥。本发明采用陶瓷膜分离、电渗析脱盐、膜浓缩和精制等先进处理工艺的组合，有效实现了a‑酮戊二酸生物技术的洁净化生产。该工艺的关键点为用电渗析取代了传统离子交换，提高了产品提取率，提高了产品纯度，同时减少了原有工艺的酸碱用量和水耗，降低了后续工艺的活性炭用量，减少了环境污染。

Description

生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺。
背景技术
L-谷氨酸氧化酶（EC 1.4.3.11，L-glutamate oxidase，GLOD）是以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的一种L-氨基酸氧化酶，是80年代初开始发现的一种新酶，最早从蛇的毒液、鼠的肾脏、无脊椎动物和微生物等生物体中分离纯化得到。L-谷氨酸氧化酶能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化L-谷氨酸脱氨，生成α-酮戊二酸和过氧化氢。GLOD 对催化反应底物有高度的立体异构选择性，催化效率高，反应条件温和，已被广泛用于食品、轻工、化工、医药、环保、能源和科研等各个领域。该酶自 20 世纪 80 年代被发现以来，一直是工具酶研究的热点之一。现阶段酶的主要研究集中在，一是借由现代的观察及测定手段研究酶的结构以及作用机制，二是利用酶的特性以及工程学的方法研究如何利用酶来服务于人类的生产、生活。
近年来，国内外科学家先后分别从土壤中分离到能产生 GLOD 的链霉菌、放线菌，并建立了较完善的液体发酵产酶体系，制备了 GLOD 粗品，通过对其酶学性质进行研究，纯化得到的该酶都具有以下特性： 能专一性地催化L-谷氨酸生成过氧化氢、氨和a-酮戊二酸。目前，GLOD 发酵生产距工业化生产还有很大距离，这在很大程度上限制了其应用。因此需要进一步研究其发酵工艺，通过工艺优化，改进发酵培养基成分和发酵条件，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，显著提高发酵产量。
L-谷氨酸氧化酶一方面可以应用到测定 L-谷氨酸及其偶联反应；另一方面则可以用于a-酮戊二酸的制备，进而制备L-谷氨酸-a-酮戊二酸。国内目前为止还没有厂家对其进行生产，国外也只有一家生产重组于大肠杆菌的 L-谷氨酸氧化酶。价格的昂贵、来源的单一，严重制约着 L-谷氨酸氧化酶的应用和发展。
本公司于2016年8月27日申请了申请公告号为“CN 106318888 A”、发明名称为“一株产谷氨酸氧化酶的菌株MQO-160及其应用”的发明专利公开了一株产L-谷氨酸氧化酶的菌株MQO-160、该菌株再制备L-谷氨酸氧化酶方面的应用、该菌株再生产α-酮戊二酸方面的应用、利用该菌株制备L-谷氨酸氧化酶的方法、利用该菌株生产纯化α-酮戊二酸的方法。该发明专利中，利用该菌株生产纯化α-酮戊二酸的方法中，分离纯化生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺包括步骤：
离子交换：将含有α-酮戊二酸转化液经D301大孔弱碱性阴树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用0.25N盐酸溶液洗脱；
纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤α-酮戊二酸洗脱液纯化液得到α-酮戊二酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清晰浓缩液后，弃去浓缩液，收集含α-酮戊二酸产品的纳滤透析液，该步骤收率达到97%；
活性炭脱色：pH 3.0，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为α-酮戊二酸纳滤清液的1%质量分数，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液；
反渗透浓缩：将α-酮戊二酸脱色液经反渗膜浓缩至原体积一半得到α-酮戊二酸预浓缩液；
浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至含量≥80%的浓缩液，将浓缩液搅拌冷却至20℃结晶5h；
干燥：结晶结束后，抽滤获得晶体，将结晶晶体50℃真空干燥，得到a-酮戊二酸成品。
该纯化方式相对于现有技术虽然已经获得较高收率较高纯度的α-酮戊二酸，但是，但是，实际生产过程存在诸多不足，例如用水量大，污水产生量过高，酸碱用量和活性炭用量较大，造成人工和物料消耗的提取成本较高，此外提取收率偏低，产品质量控制波动性大。。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺。
本发明的技术方案为：
一种生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，包括步骤：
1）陶瓷膜过滤：将含有α-酮戊二酸的转化液经陶瓷膜过滤，去除转化液菌体细胞，得到含有α-酮戊二酸的陶滤清液；
2）电渗析：将所述α-酮戊二酸的陶滤清液经电渗析脱盐处理，获得渗透清液；
3）纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤所述渗透清液，分别得到纳滤清液和纳滤浓液；所述纳滤浓液采用去离子水稀释后，进行二次纳滤，得到二次纳滤清液和二次纳滤浓液，弃去二次纳滤浓液，将所述纳滤清液和二次纳滤清液混合得含有α-酮戊二酸的清液混合液；
4）活性炭脱色：调节所述清液混合液的pH至3.0-3.5，用活性炭脱色，脱色温度为45-50℃，脱色时间为0.5-1 h；采用0.22μm滤膜过滤得含有α-酮戊二酸的脱色液；
5）反渗透浓缩：将所述脱色液经反渗透膜浓缩至所述脱色液体积的一半得含有α-酮戊二酸的预浓缩液；
6）浓缩结晶：将所述预浓缩液进行浓缩，浓缩至α-酮戊二酸的含量为25%-55%（w/w）的浓缩液；将所述浓缩液冷却至室温结晶4-6h；抽滤得α-酮戊二酸的晶体；
7）干燥：α-酮戊二酸的晶体干燥，得纯化的α-酮戊二酸产品。
作为优选方案，步骤1）中，陶瓷膜过滤的条件为：陶瓷膜的孔径为50nm（100KD分子量），物料温度保持在37-45℃，发酵液菌体干重小于5%。该工艺条件下，菌体蛋白去除率可达到97%，a-酮戊二酸产品回收率大于98%（未包含菌体部分）。
作为优选方案，采用中试异相合金膜或均相膜设备对陶滤清液进行电渗析脱盐处理，具体条件为：电渗析设备运行电压20v，电流变化范围1-20A，电极液为1.5%-2.5%（质量百分数）硫酸铵水溶液（初始料液电导率小于10ms/cm），pH维持在6.0-7.0。该工艺条件下，脱盐后料液电导率在300-2000μs/cm，a-酮戊二酸收率达到98%（以浓水计）。
作为优选方案，步骤3）中，所述纳滤浓液采用纳滤液三倍质量的去离子水分三次清洗稀释。
作为优选方案，步骤4）中，活性炭的用量为所述清液混合液质量的0.2%-0.5%。
作为优选方案，步骤6）中，将所述预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下进行浓缩。
作为优选方案，步骤7）中，α-酮戊二酸的晶体在50℃下真空干燥。
作为优选方案，所述含有α-酮戊二酸的转化液的制备方法如下:
A. 利用菌株 MQO-160获得L-谷氨酸氧化酶的发酵液；
B. 粗酶液的制备：将L-谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍即为酶转化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液；
C.转化培养：在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L-谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a-酮戊二酸的转化液；磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L-谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol，L-谷氨酸钠的终浓度为10%。
作为优选方案，利用菌株 MQO-160获得L-谷氨酸氧化酶的发酵液的步骤如下：
a.斜面培养：将菌株 MQO-160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养，培养温度为28℃，培养时间为48h；
b.种子扩大培养：从步骤a的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为 10%（v/v），扩大培养的温度为 28℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h；
c.发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10%（v/v），扩大培养温度30℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h；
d.30L 发酵罐培养：将步骤c中发酵培养后的发酵液接种到 30L
发酵罐的发酵培养基中，接种量为10%（v/v），控制罐压强为0.05MPa，在28℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，风量为10 L/min，发酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液。
菌株MQO-160的保藏编号为：CGMCC No.12892 ；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2016 年8 月22 日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号。
本发明的有益效果为：
1、通过新提取工艺的组合提高了产品收率和产品质量。a-酮戊二酸的一次性提取收率达到65%，纯度高达99%；
2、本发明用电渗析取代了传统离子交换工艺，大大降低了污水产生量。现有工艺采用离子交换进行产品分离，污水产生量较大，环保压力较高。每吨产品消耗新鲜水量约100吨，产生污水约80吨。而采用电渗析工艺后，污水产生量下降50%以上，每吨产品消耗新鲜水量约40吨，产生污水约30吨。
3、本发明用电渗析取代了传统离子交换工艺，节约了人工成本和物料消耗，降低了生产成本。目前离子交换工艺为人工操作控制，该岗位需要配置人员为10人左右，提取成本约为8000元/吨，而采用升级工艺后，电渗析工序可以采用自动化控制，人工可降低到3人，而且有效降低了酸、碱、活性炭用量，提取成本约为5000元/吨，降低1/3左右。
具体实施方式
实施例1：
本实施例所用菌株为MQO-160，MQO-160的保藏编号为：CGMCC No.12892 ；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2016 年8 月22 日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号。
菌株 MQO-160 的生物特性为：该菌株基内和气生菌丝均为乳白色，菌丝有较多的隔膜，气生菌丝有较多的枝状分支，部分菌丝处于旺盛的生长期，有芽状结构，该菌株产生金黄色或紫红色可溶性色素。该菌株孢子卵圆形、球形或柱形，表面光滑，孢子丝呈螺旋状。
利用菌株 MQO-160获得L-谷氨酸氧化酶的发酵液的步骤如下：
a.斜面培养：将菌株 MQO-160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养，培养温度为28℃，培养时间为48h；
b.种子扩大培养：从步骤a的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为 10%（v/v），扩大培养的温度为 28℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h；
c.发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10%（v/v），扩大培养温度30℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h；
d.30L 发酵罐培养：将步骤c中发酵培养后的发酵液接种到 30L
发酵罐的发酵培养基中，接种量为10%（v/v），控制罐压强为0.05MPa，在28℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，风量为10 L/min，发酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液。
斜面培养基的配制：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g ，琼脂20g，加纯净水至 1L。斜面培养基灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。
种子培养基的配制：蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO46g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g，加纯净水至 1L。种子培养基的灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。
发酵培养基的配制：葡萄糖30g，玉米浆干粉20g，蔗糖30g，酵母膏 1g， (NH4)2SO410g，谷氨酸钠 10g，MgCl2 0.5g，KCl 0.5g，NaH2PO40.5g，用自来水配成 1L 溶液。发酵培养基的灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
含有α-酮戊二酸的转化液的制备方法如下:
A. 利用菌株 MQO-160获得L-谷氨酸氧化酶的发酵液；
B. 粗酶液的制备：将L-谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍即为酶转化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液；
C.转化培养：在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L-谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a-酮戊二酸的转化液；磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L-谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol，L-谷氨酸钠的终浓度为10%。
上述生物转化制备的α-酮戊二酸的分离纯化工艺，包括步骤：
1）陶瓷膜过滤：将上述含有α-酮戊二酸的转化液经陶瓷膜过滤，去除转化液菌体细胞，得到含有α-酮戊二酸的陶滤清液；
本步骤中，陶瓷膜过滤的条件为：陶瓷膜的孔径为50nm（100KD分子量），物料温度保持在37-42℃，发酵液菌体干重小于5%。该工艺条件下，菌体蛋白去除率可达到97%，a-酮戊二酸产品回收率大于98%（未包含菌体部分）。
2）电渗析：将α-酮戊二酸的陶滤清液经电渗析脱盐处理，获得渗透清液；
本步骤中，采用中试异相合金膜或均相膜设备对陶滤清液进行电渗析脱盐处理，具体条件为：电渗析设备运行电压20v，电流变化范围1-20A，电极液为2.0%（质量百分数）硫酸铵水溶液（初始料液电导率小于10ms/cm），pH维持在6.2-6.5。该工艺条件下，脱盐后料液电导率在300-2000μs/cm，a-酮戊二酸收率达到98%（以浓水计）。本步骤中采用硫酸铵水溶液作为电极液，是由于本工艺主要脱除的盐为硫酸铵，为了不引入其他离子，选择硫酸铵为电极液。
3）纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤渗透清液，分别得到纳滤清液和纳滤浓液；纳滤浓液采用去离子水清洗稀释（纳滤浓液采用纳滤液三倍质量的去离子水分三次清洗稀释）后，进行二次纳滤，得到二次纳滤清液和二次纳滤浓液，弃去二次纳滤浓液，将纳滤清液和二次纳滤清液混合得含有α-酮戊二酸的清液混合液；
4）活性炭脱色：调节清液混合液的pH至3.0，用活性炭脱色，活性炭的用量为清液混合液质量的0.5%，脱色温度为50℃，脱色时间为0.5 h；采用0.22μm滤膜过滤得含有α-酮戊二酸的脱色液；
5）反渗透浓缩：将脱色液经反渗透膜浓缩至脱色液体积的一半得含有α-酮戊二酸的预浓缩液；
6）浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下进行浓缩，浓缩至α-酮戊二酸的含量为40%的浓缩液；将浓缩液冷却至室温结晶4-6h；抽滤得α-酮戊二酸的晶体；
7）干燥：α-酮戊二酸的晶体在50℃下真空干燥，得纯化的α-酮戊二酸产品。
本实施例a-酮戊二酸的一次性提取收率为65%，所得a-酮戊二酸的纯度高达99%，本实施例分离纯化过程中所产生的废水为30吨/吨 a-酮戊二酸。
对比例1：
对比例1与实施例1含有α-酮戊二酸的转化液的制备方法完全相同。
本对比例中上述生物转化制备的α-酮戊二酸的分离纯化工艺，包括步骤：
1）离子交换：将含有α-酮戊二酸转化液经D301大孔弱碱性阴树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用0.25N盐酸溶液洗脱；
2）纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤α-酮戊二酸洗脱液纯化液得到α-酮戊二酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清晰浓缩液后，弃去浓缩液，收集含α-酮戊二酸产品的纳滤透析液，该步骤收率达到97%；
3）活性炭脱色：pH 3.0，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为α-酮戊二酸纳滤清液的1%质量分数，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液；
4）反渗透浓缩：将α-酮戊二酸脱色液经反渗膜浓缩至原体积一半得到α-酮戊二酸预浓缩液；
5）浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至含量≥80%的浓缩液，将浓缩液搅拌冷却至20℃结晶5h；
6）干燥：结晶结束后，抽滤获得晶体，将结晶晶体50℃真空干燥，得到a-酮戊二酸成品
本对比例a-酮戊二酸的一次性提取收率为50%，所得a-酮戊二酸的纯度为96%，本实施例分离纯化过程中所产生的废水为80吨/吨a-酮戊二酸。
可见，本发明与对比例相比，a-酮戊二酸的一次性提取收率提高了30%，纯度也大大提升，另外，所产生的废水显著降低，极大降低了环境压力，减少了污水处理所耗能源。
实施例2：
实施例2与实施例1含有α-酮戊二酸的转化液的制备方法完全相同。
本实施例中上述生物转化制备的α-酮戊二酸的分离纯化工艺，包括步骤：
1）陶瓷膜过滤：将上述含有α-酮戊二酸的转化液经陶瓷膜过滤，去除转化液菌体细胞，得到含有α-酮戊二酸的陶滤清液；
本步骤中，陶瓷膜过滤的条件为：陶瓷膜的孔径为50nm（100KD分子量），物料温度保持在42-45℃，发酵液菌体干重小于5%。该工艺条件下，菌体蛋白去除率可达到97%，a-酮戊二酸产品回收率大于98%（未包含菌体部分）。
2）电渗析：将α-酮戊二酸的陶滤清液经电渗析脱盐处理，获得渗透清液；
本步骤中，采用中试异相合金膜或均相膜设备对陶滤清液进行电渗析脱盐处理，具体条件为：电渗析设备运行电压20v，电流变化范围5-15A，电极液为2.3%（质量百分数）硫酸铵水溶液（初始料液电导率小于10ms/cm），pH维持在6.6-6.9。该工艺条件下，脱盐后料液电导率在300-2000μs/cm，a-酮戊二酸收率达到98%（以浓水计）
3）纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤渗透清液，分别得到纳滤清液和纳滤浓液；纳滤浓液采用去离子水清洗稀释（纳滤浓液采用纳滤液三倍质量的去离子水分三次清洗稀释）后，进行二次纳滤，得到二次纳滤清液和二次纳滤浓液，弃去二次纳滤浓液，将纳滤清液和二次纳滤清液混合得含有α-酮戊二酸的清液混合液；
4）活性炭脱色：调节清液混合液的pH至3.1-3.3，用活性炭脱色，活性炭的用量为清液混合液质量的0.3%，脱色温度为45-47℃，脱色时间为0.6 h；采用0.22μm滤膜过滤得含有α-酮戊二酸的脱色液；
5）反渗透浓缩：将脱色液经反渗透膜浓缩至脱色液体积的一半得含有α-酮戊二酸的预浓缩液；
6）浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下进行浓缩，浓缩至α-酮戊二酸的含量为40%的浓缩液；将浓缩液冷却至室温结晶5h；抽滤得α-酮戊二酸的晶体；
7）干燥：α-酮戊二酸的晶体在50℃下真空干燥，得纯化的α-酮戊二酸产品。
本实施例a-酮戊二酸的一次性提取收率为64%，所得a-酮戊二酸的纯度高达99%，本实施例分离纯化过程中所产生的废水为30吨/吨 a-酮戊二酸。

Claims (9)

1.一种生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于，包括步骤：
1）陶瓷膜过滤：将含有α-酮戊二酸的转化液经陶瓷膜过滤，去除转化液菌体细胞，得到含有α-酮戊二酸的陶滤清液；
2）电渗析：将所述α-酮戊二酸的陶滤清液经电渗析脱盐处理，获得渗透清液；
3）纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤所述渗透清液，分别得到纳滤清液和纳滤浓液；所述纳滤浓液采用去离子水稀释后，进行二次纳滤，得到二次纳滤清液和二次纳滤浓液，弃去二次纳滤浓液，将所述纳滤清液和二次纳滤清液混合得含有α-酮戊二酸的清液混合液；
4）活性炭脱色：调节所述清液混合液的pH至3.0-3.5，用活性炭脱色，脱色温度为45-50℃，脱色时间为0.5-1 h；采用0.22μm滤膜过滤得含有α-酮戊二酸的脱色液；
5）反渗透浓缩：将所述脱色液经反渗透膜浓缩至所述脱色液体积的一半得含有α-酮戊二酸的预浓缩液；
6）浓缩结晶：将所述预浓缩液进行浓缩，浓缩至α-酮戊二酸的含量为25%-55%的浓缩液；将所述浓缩液冷却至室温结晶4-6h；抽滤得α-酮戊二酸的晶体；
7）干燥：α-酮戊二酸的晶体干燥，得纯化的α-酮戊二酸产品。
2.如权利要求1所述生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于：步骤1）中，陶瓷膜过滤的条件为：陶瓷膜的孔径为50nm，物料温度保持在37-45℃，发酵液菌体干重小于5%。
3.如权利要求1或2所述生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于：步骤2）中，采用中试异相合金膜或均相膜设备对陶滤清液进行电渗析脱盐处理，具体条件为：电渗析设备运行电压20v，电流变化范围1-20A，电极液为1.5%-2.5%的硫酸铵水溶液pH维持在6.0-7.0。
4.如权利要求1或2所述生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于：步骤3）中，所述纳滤浓液采用纳滤液三倍质量的去离子水分三次清洗稀释。
5.如权利要求1或2所述生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于：步骤4）中，活性炭的用量为所述清液混合液质量的0.2%-0.5%。
6.如权利要求1或2所述生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于：步骤6）中，将所述预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下进行浓缩。
7.如权利要求1或2所述生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于：步骤7）中，α-酮戊二酸的晶体在50℃下真空干燥。
8.如权利要求1或2所述生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于，所述含有α-酮戊二酸的转化液的制备方法如下:
A. 利用菌株 MQO-160获得L-谷氨酸氧化酶的发酵液；
B. 粗酶液的制备：将L-谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍即为酶转化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液；
C.转化培养：在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L-谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a-酮戊二酸的转化液；磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L-谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol，L-谷氨酸钠的终浓度为10%。
9.如权利要求1或2所述生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺，其特征在于：利用菌株 MQO-160获得L-谷氨酸氧化酶的发酵液的步骤如下：
a.斜面培养：将菌株 MQO-160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养，培养温度为28℃，培养时间为48h；
b.种子扩大培养：从步骤a的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为 10%，扩大培养的温度为 28℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h；
c.发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10%，扩大培养温度30℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h；
d.30L 发酵罐培养：将步骤c中发酵培养后的发酵液接种到 30L发酵罐的发酵培养基中，接种量为10%，控制罐压强为0.05MPa，在28℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，风量为10 L/min，发酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液。
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