JP2002034554A - ビタミンｋ２高生産納豆菌、その育種方法及び納豆 - Google Patents
ビタミンｋ２高生産納豆菌、その育種方法及び納豆Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 バチルス・サチリス（Bacillus subtili
s）に属する納豆菌を、突然変異処理または自然変異処
理によってビタミンＫ2生産性を向上させた後、選択培
地を用いて、特にジヒドロキシナフトエ酸のアナログを
含有する選択培地を用いて、これを分離し、さらに保存
安定性に優れた変異納豆菌を選択し、これを使用して納
豆を製造する。 【効果】 本発明によれば、骨強化作用があると期待で
きるビタミンＫ2を、なかでもＭＫ─７を多く含む納豆
を安定して提供することができる。
s）に属する納豆菌を、突然変異処理または自然変異処
理によってビタミンＫ2生産性を向上させた後、選択培
地を用いて、特にジヒドロキシナフトエ酸のアナログを
含有する選択培地を用いて、これを分離し、さらに保存
安定性に優れた変異納豆菌を選択し、これを使用して納
豆を製造する。 【効果】 本発明によれば、骨強化作用があると期待で
きるビタミンＫ2を、なかでもＭＫ─７を多く含む納豆
を安定して提供することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌の育種及びそ
の利用に係り、更に詳細には、本発明は、ビタミンＫ
（vitamin K）、特にビタミンＫ2の生産性を向上させた
変異納豆菌の育種、その変異納豆菌、それを使用したビ
タミンＫ2を多く含む納豆の製造方法及びその変異納豆
菌を用いて製造されたビタミンＫ2をより高濃度に含有
した納豆に関する。
の利用に係り、更に詳細には、本発明は、ビタミンＫ
（vitamin K）、特にビタミンＫ2の生産性を向上させた
変異納豆菌の育種、その変異納豆菌、それを使用したビ
タミンＫ2を多く含む納豆の製造方法及びその変異納豆
菌を用いて製造されたビタミンＫ2をより高濃度に含有
した納豆に関する。
【０００２】
【従来の技術】天然物中から単離されたビタミンＫとし
ては、主に植物体が生合成するビタミンＫ1（フィロキ
ノン phylloquinone）と、主として微生物から生合成す
るビタミンＫ2（メナキノン menaquinone）などがあ
る。さらにビタミンＫ2としては、メナキノン（ＭＫ）
のキノン骨格に結合するポリプレノイド側鎖の長さによ
ってＭＫ─１〜ＭＫ─１４までの１４種類が知られてお
り、微生物の種類の長さによって主に生産されるメナキ
シンの種類が異なっている（Microbilo. Rev., Vol.45,
p.316─354, 1981）。また、ビタミンＫ3すなわちメナ
ジオン（menadione）（２─メチル─１，４─ナフトキ
ノン）はビタミンＫ1及びビタミンＫ2生合成の中間物質
であって、かつ化学合成もされており、さらにビタミン
K3のハイドロキノン型であるビタミンK4も化学合成され
ている。
ては、主に植物体が生合成するビタミンＫ1（フィロキ
ノン phylloquinone）と、主として微生物から生合成す
るビタミンＫ2（メナキノン menaquinone）などがあ
る。さらにビタミンＫ2としては、メナキノン（ＭＫ）
のキノン骨格に結合するポリプレノイド側鎖の長さによ
ってＭＫ─１〜ＭＫ─１４までの１４種類が知られてお
り、微生物の種類の長さによって主に生産されるメナキ
シンの種類が異なっている（Microbilo. Rev., Vol.45,
p.316─354, 1981）。また、ビタミンＫ3すなわちメナ
ジオン（menadione）（２─メチル─１，４─ナフトキ
ノン）はビタミンＫ1及びビタミンＫ2生合成の中間物質
であって、かつ化学合成もされており、さらにビタミン
K3のハイドロキノン型であるビタミンK4も化学合成され
ている。
【０００３】ビタミンＫはもともと血液凝固因子の１つ
として発見され、その血液凝固作用に対する１日当たり
の必要量は約１μｇ／体重ｋｇとされている。この程度
の必要量であれば、腸内細菌によってビタミンＫが生産
されるので、食品などで特別に供給しなくても充分であ
る。従って通常は血液凝固作用に関するビタミンＫ2欠
乏病はほとんど観察されておらず、抗生物質の多量投与
後や生後７〜１０日の新生児のように腸内細菌の数が少
ない時に発生することがある程度である。
として発見され、その血液凝固作用に対する１日当たり
の必要量は約１μｇ／体重ｋｇとされている。この程度
の必要量であれば、腸内細菌によってビタミンＫが生産
されるので、食品などで特別に供給しなくても充分であ
る。従って通常は血液凝固作用に関するビタミンＫ2欠
乏病はほとんど観察されておらず、抗生物質の多量投与
後や生後７〜１０日の新生児のように腸内細菌の数が少
ない時に発生することがある程度である。
【０００４】しかし、最近そのビタミンＫに骨強化作用
があることが解明されてきている。例えばビタミンＫ2
の一種であるＭＫ─４について骨粗しょう症治療薬とし
ての臨床試験が行われ、成人１日当たり１５〜４５ｍｇ
の投与で骨粗鬆症改善効果が認められている。また、骨
粗しょう症で見られる大腿骨頚部の骨折患者の血清中の
ＭＫ─７やＭＫ─８の濃度は、骨折していない患者に比
べて、有意に低い値を示す事などから、日常からビタミ
ンＫを摂取して血液中のビタミンＫ濃度を高濃度に維持
することが、骨粗鬆症の予防すなわち骨強化につながる
ものと考えられている。
があることが解明されてきている。例えばビタミンＫ2
の一種であるＭＫ─４について骨粗しょう症治療薬とし
ての臨床試験が行われ、成人１日当たり１５〜４５ｍｇ
の投与で骨粗鬆症改善効果が認められている。また、骨
粗しょう症で見られる大腿骨頚部の骨折患者の血清中の
ＭＫ─７やＭＫ─８の濃度は、骨折していない患者に比
べて、有意に低い値を示す事などから、日常からビタミ
ンＫを摂取して血液中のビタミンＫ濃度を高濃度に維持
することが、骨粗鬆症の予防すなわち骨強化につながる
ものと考えられている。
【０００５】なお、ＭＫ─４の骨強化作用は、全てのビ
タミンＫに共通する基本骨格部分がオステオカルシンを
活性化することによる骨合成の促進効果と、ＭＫ─４の
側鎖部分であるゲラニルゲラニオール部分の作用による
骨吸収(骨の分解)の抑制効果の両方の効果によるもので
あることが解明されつつある。
タミンＫに共通する基本骨格部分がオステオカルシンを
活性化することによる骨合成の促進効果と、ＭＫ─４の
側鎖部分であるゲラニルゲラニオール部分の作用による
骨吸収(骨の分解)の抑制効果の両方の効果によるもので
あることが解明されつつある。
【０００６】そしてビタミンＫの骨強化作用の発現に
は、従来から言われている血液凝固作用の場合よりも多
量のビタミンＫが必要であり、腸内細菌等による生産量
だけでは不足すると推定されることから、食品などによ
る供給が必要になるものと考えられている。
は、従来から言われている血液凝固作用の場合よりも多
量のビタミンＫが必要であり、腸内細菌等による生産量
だけでは不足すると推定されることから、食品などによ
る供給が必要になるものと考えられている。
【０００７】ビタミンＫを含有する食品としては、ビタ
ミンＫ1を含有する緑黄色野菜類や海藻類、ビタミンＫ2
を含有する納豆などが知られており、これらの食品を摂
取することでビタミンＫを補給することができる。
ミンＫ1を含有する緑黄色野菜類や海藻類、ビタミンＫ2
を含有する納豆などが知られており、これらの食品を摂
取することでビタミンＫを補給することができる。
【０００８】なかでも納豆はビタミンＫ2を最も多く含
有しており、例えば第４訂食品成分表によれば納豆中の
ビタミンＫ2は納豆１００ｇ当たり８６４μｇの濃度で
あるとされている。また、疫学的な研究からは、納豆の
消費量が多いと大腿骨頚部の骨折頻度は少ないとの関係
が見出されており、さらに納豆中の主要なビタミンＫ 2
であるＭＫ─７がＭＫ─４と同程度の能力でカルシウム
を骨芽細胞へ沈着させることができるという報告もあっ
て、骨強化作用を期待する際のビタミンＫの供給源とし
て納豆は優良な食品であると考えられている。
有しており、例えば第４訂食品成分表によれば納豆中の
ビタミンＫ2は納豆１００ｇ当たり８６４μｇの濃度で
あるとされている。また、疫学的な研究からは、納豆の
消費量が多いと大腿骨頚部の骨折頻度は少ないとの関係
が見出されており、さらに納豆中の主要なビタミンＫ 2
であるＭＫ─７がＭＫ─４と同程度の能力でカルシウム
を骨芽細胞へ沈着させることができるという報告もあっ
て、骨強化作用を期待する際のビタミンＫの供給源とし
て納豆は優良な食品であると考えられている。
【０００９】しかし、骨強化作用を期待するためには、
納豆の現状のビタミンＫ2含有量のままでは不足してい
ると考えられることから、さらに高濃度にビタミンＫ2
を含有する納豆を開発することが求められているが、納
豆中のビタミンＫ2含有量を高めようとする工夫は非常
に少なく、天然物から抽出したビタミンＫ2を亜鉛とと
もに納豆などの食品に添加する方法（特開平１０─３６
２５６）や発酵方法を改良して納豆菌による生産量を増
加させるに方法（特開平８─９９１６）が知られている
程度であった。
納豆の現状のビタミンＫ2含有量のままでは不足してい
ると考えられることから、さらに高濃度にビタミンＫ2
を含有する納豆を開発することが求められているが、納
豆中のビタミンＫ2含有量を高めようとする工夫は非常
に少なく、天然物から抽出したビタミンＫ2を亜鉛とと
もに納豆などの食品に添加する方法（特開平１０─３６
２５６）や発酵方法を改良して納豆菌による生産量を増
加させるに方法（特開平８─９９１６）が知られている
程度であった。
【００１０】前記のビタミンＫ2を添加する方法につい
ては、天然物からのビタミンＫ2の抽出作業が煩雑であ
り、費用もかかる上に、納豆に食品添加物を添加するこ
と自体が品質上好ましいことではなく、従って納豆製造
工程の工夫などにより自然な形でビタミンの含有量を高
めることが求められている。
ては、天然物からのビタミンＫ2の抽出作業が煩雑であ
り、費用もかかる上に、納豆に食品添加物を添加するこ
と自体が品質上好ましいことではなく、従って納豆製造
工程の工夫などにより自然な形でビタミンの含有量を高
めることが求められている。
【００１１】その点で、発酵方法を改良する特開平８─
９９１６号明細書に開示の方法はより優れた方法である
と考えられるが、この方法は、一般に納豆は高圧釜で蒸
煮した大豆に対して納豆菌胞子を植菌し、高湿度下で温
度を３７〜４５℃に制抑して１５〜１８時間程度発酵さ
せる工程を経て製造されるのに対して、比較的高温（４
２〜５０℃）で長時間（２４〜４８時間）発酵させるこ
とによってビタミンＫ 2の含有量を通常の納豆の約７倍
程度まで高める方法である。
９９１６号明細書に開示の方法はより優れた方法である
と考えられるが、この方法は、一般に納豆は高圧釜で蒸
煮した大豆に対して納豆菌胞子を植菌し、高湿度下で温
度を３７〜４５℃に制抑して１５〜１８時間程度発酵さ
せる工程を経て製造されるのに対して、比較的高温（４
２〜５０℃）で長時間（２４〜４８時間）発酵させるこ
とによってビタミンＫ 2の含有量を通常の納豆の約７倍
程度まで高める方法である。
【００１２】この方法によってビタミンＫの含有量が高
くなるとすれば、一応ビタミンＫ高含有納豆としては目
的が果たされていることになる。しかし、この方法は比
較的高温で長時間発酵させることが特徴であり、このよ
うな発酵を行うといわゆる過発酵の状態となってしま
い、出来上がった納豆の香りが悪化し、豆色も黒くなる
し、いわゆるシャリが発生するなど、納豆そのものの品
質がかなり劣化してしまうため、おいしく食べて健康を
維持するという食品に本来期待されるべき姿からは、逸
脱してしまうなどの欠点があった。
くなるとすれば、一応ビタミンＫ高含有納豆としては目
的が果たされていることになる。しかし、この方法は比
較的高温で長時間発酵させることが特徴であり、このよ
うな発酵を行うといわゆる過発酵の状態となってしま
い、出来上がった納豆の香りが悪化し、豆色も黒くなる
し、いわゆるシャリが発生するなど、納豆そのものの品
質がかなり劣化してしまうため、おいしく食べて健康を
維持するという食品に本来期待されるべき姿からは、逸
脱してしまうなどの欠点があった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、納豆の品質
は通常のものと変わりなく風味豊かで、かつ骨強化作用
があると期待できるビタミンＫ2を親株や市販納豆菌よ
りも高濃度で含有する納豆を提供することを目的として
いる。
は通常のものと変わりなく風味豊かで、かつ骨強化作用
があると期待できるビタミンＫ2を親株や市販納豆菌よ
りも高濃度で含有する納豆を提供することを目的として
いる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、納豆の発
酵条件などを変化させる従来の方法ではなく、納豆菌自
体の生産能力を高めてやる方が、発酵条件や発酵設備な
どを大きく変える必要がなくて、品質は通常のものと変
わりなく風味豊かで、かつビタミンＫ2を高濃度で含有
する納豆を効率よく製造することができると考えて本発
明を進めた。
酵条件などを変化させる従来の方法ではなく、納豆菌自
体の生産能力を高めてやる方が、発酵条件や発酵設備な
どを大きく変える必要がなくて、品質は通常のものと変
わりなく風味豊かで、かつビタミンＫ2を高濃度で含有
する納豆を効率よく製造することができると考えて本発
明を進めた。
【００１５】納豆菌は、枯草菌バチルス・サチリス（Ba
cillus subtilis）に分類されているが、粘質物（糸引
物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことがで
き、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育に
ビオチンを要求するとされるなどの特性を有しているこ
となどから、バチルス・ナットウ（Bacillus natto）と
して分類されたり、枯草菌の変種としてBacillus subti
lis var. nattoあるいはBacillus subtilis(natto）な
どと枯草菌と区別して分類している文献もある。納豆菌
としては、Bacillus natto IFO3009、Bacillus subtili
s IFO3335、同IFO3336、同IFO3936、同IFO13169などが
あり、また市販の納豆種菌である高橋菌(Ｔ 3株、東京農
業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）な
ど各種の納豆菌がある。
cillus subtilis）に分類されているが、粘質物（糸引
物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことがで
き、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育に
ビオチンを要求するとされるなどの特性を有しているこ
となどから、バチルス・ナットウ（Bacillus natto）と
して分類されたり、枯草菌の変種としてBacillus subti
lis var. nattoあるいはBacillus subtilis(natto）な
どと枯草菌と区別して分類している文献もある。納豆菌
としては、Bacillus natto IFO3009、Bacillus subtili
s IFO3335、同IFO3336、同IFO3936、同IFO13169などが
あり、また市販の納豆種菌である高橋菌(Ｔ 3株、東京農
業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）な
ど各種の納豆菌がある。
【００１６】この納豆菌のビタミンＫ2生合成経路は完
全に解明されておらず、かつビタミンＫ2生産能力が向
上させる試みも全く行われていないのが現状であった。
一方、納豆菌以外の微生物でのビタミンＫ2の生産につ
いては、生産性の高い微生物を自然界から選抜した結果
として、フラボバクテリウム（Flavobacterium）を取得
した例（J. Ferment. Technol., Vol.62,P.321─327, 1
984）、及びコリネバクテリウム（Corynebacterium）、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、ミクロバクテ
リウム(Microbacterium）、クルトバクテリウム(Curtob
acterium）、オーレオバクテリウム（Aureobacteriu
m）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）などの多
くの細菌を取得した例（特開昭６１─１７３７９２）な
どがある。
全に解明されておらず、かつビタミンＫ2生産能力が向
上させる試みも全く行われていないのが現状であった。
一方、納豆菌以外の微生物でのビタミンＫ2の生産につ
いては、生産性の高い微生物を自然界から選抜した結果
として、フラボバクテリウム（Flavobacterium）を取得
した例（J. Ferment. Technol., Vol.62,P.321─327, 1
984）、及びコリネバクテリウム（Corynebacterium）、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、ミクロバクテ
リウム(Microbacterium）、クルトバクテリウム(Curtob
acterium）、オーレオバクテリウム（Aureobacteriu
m）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）などの多
くの細菌を取得した例（特開昭６１─１７３７９２）な
どがある。
【００１７】しかし、これらの微生物により生産される
ビタミンＫ2はＭＫ─４、ＭＫ─５やＭＫ─６であって
納豆菌が生産するＭＫ─７とは異なっていることや、か
つ納豆菌ではビタミンＫ2生合成経路が不明であること
などから、前記の各種の方法が納豆菌のビタミンＫ2の
生産能向上に有効かどうかは全く不明であった。
ビタミンＫ2はＭＫ─４、ＭＫ─５やＭＫ─６であって
納豆菌が生産するＭＫ─７とは異なっていることや、か
つ納豆菌ではビタミンＫ2生合成経路が不明であること
などから、前記の各種の方法が納豆菌のビタミンＫ2の
生産能向上に有効かどうかは全く不明であった。
【００１８】そこで、本発明者らは、変異処理して得た
変異納豆菌を１─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸含有培地
で培養して得られた耐性株についてその性質を検討した
ところ、全く予期せざることに、該耐性株はビタミンＫ
2の生産性が向上しているという新知見を得、更に、上
記アナログのみでなく、３─ヒドロキシ─２─ナフトエ
酸の耐性株も上記した特性を有することも見出した。
変異納豆菌を１─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸含有培地
で培養して得られた耐性株についてその性質を検討した
ところ、全く予期せざることに、該耐性株はビタミンＫ
2の生産性が向上しているという新知見を得、更に、上
記アナログのみでなく、３─ヒドロキシ─２─ナフトエ
酸の耐性株も上記した特性を有することも見出した。
【００１９】すなわち本発明者らは、選択培地としてビ
タミンＫ2の前駆体と考えられるジヒドロキシナフトエ
酸のアナログ含有培地を使用するビタミンＫ2高生産性
納豆菌の育種に成功しただけでなく、本育種方法は納豆
菌のみでなく他のバチルス属細菌には適用可能である点
にも着目し、本発明を完成させるに至った。そしてジヒ
ドロキシナフトエ酸のアナログに対する耐性を有する変
異納豆菌はビタミンＫ 2のうちのＭＫ─７を多く含む品
質良好な納豆を発酵生産することが可能であることを見
出し、さらに保存安定性に優れた菌株であることを確認
して、本発明を完成するに至った。
タミンＫ2の前駆体と考えられるジヒドロキシナフトエ
酸のアナログ含有培地を使用するビタミンＫ2高生産性
納豆菌の育種に成功しただけでなく、本育種方法は納豆
菌のみでなく他のバチルス属細菌には適用可能である点
にも着目し、本発明を完成させるに至った。そしてジヒ
ドロキシナフトエ酸のアナログに対する耐性を有する変
異納豆菌はビタミンＫ 2のうちのＭＫ─７を多く含む品
質良好な納豆を発酵生産することが可能であることを見
出し、さらに保存安定性に優れた菌株であることを確認
して、本発明を完成するに至った。
【００２０】すなわち本発明は、ジヒドロキシナフトエ
酸のアナログを含有する選択培地を用いて、ビタミンＫ
2生産性が向上した納豆菌その他のバチルス属細菌を育
種、分離する方法に係り、更に具体的態様は次のとおり
である。
酸のアナログを含有する選択培地を用いて、ビタミンＫ
2生産性が向上した納豆菌その他のバチルス属細菌を育
種、分離する方法に係り、更に具体的態様は次のとおり
である。
【００２１】本発明は、本質的には、ジヒドロキシナフ
トエ酸のアナログに対する耐性を有し、且つ、ビタミン
Ｋ2を高濃度に生産する保存安定性に優れたバチルス・
サチリス（Bacillus subtilis）に属する納豆菌に関
し、更には、１─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸、３─ヒ
ドロキシ─２─ナフトエ酸から選ばれた少なくともひと
つのアナログ耐性を有し、且つ、ビタミンＫ2を高濃度
に生産する保存安定性に優れたバチルス・サチリス（Ba
cillus subtilis）に属する保存安定性に優れた納豆菌
に関するものである。また、本発明は、バチルス・サチ
リス（Bacillus subtilis）に属する納豆菌を、突然変
異処理または自然変異処理によってビタミンＫ2生産性
を向上させた後、ジヒドロキシナフトエ酸のアナログを
含有する選択培地を用いて分離し、さらに保存安定性に
優れた菌株を選択するビタミンＫ2を高濃度に生産する
保存安定性に優れた納豆菌に関するものである。そし
て、本発明は、ビタミンＫ2を高濃度に生産する保存安
定性に優れた納豆菌を使用することを特徴とする納豆の
製造方法に関する。さらに、本発明は、ビタミンＫ2を
高濃度に生産する保存安定性に優れた納豆菌を用いて製
造されたビタミン高含有納豆に関する。また、バチルス
属細菌において、ジヒドロキシナフトエ酸アナログ耐性
によるビタミンＫ2生産性向上については、従来全く知
られていない、ましてや、ビタミンＫ2、特にＭＫ─７
を高生産し且つ優良な納豆を製造できる保存安定性に優
れた納豆菌は、従来未知の新規微生物であって、本発明
は、上記選択方法のみに限定されることなく、他の方法
で分離された該納豆菌をすべて包含するものである。
トエ酸のアナログに対する耐性を有し、且つ、ビタミン
Ｋ2を高濃度に生産する保存安定性に優れたバチルス・
サチリス（Bacillus subtilis）に属する納豆菌に関
し、更には、１─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸、３─ヒ
ドロキシ─２─ナフトエ酸から選ばれた少なくともひと
つのアナログ耐性を有し、且つ、ビタミンＫ2を高濃度
に生産する保存安定性に優れたバチルス・サチリス（Ba
cillus subtilis）に属する保存安定性に優れた納豆菌
に関するものである。また、本発明は、バチルス・サチ
リス（Bacillus subtilis）に属する納豆菌を、突然変
異処理または自然変異処理によってビタミンＫ2生産性
を向上させた後、ジヒドロキシナフトエ酸のアナログを
含有する選択培地を用いて分離し、さらに保存安定性に
優れた菌株を選択するビタミンＫ2を高濃度に生産する
保存安定性に優れた納豆菌に関するものである。そし
て、本発明は、ビタミンＫ2を高濃度に生産する保存安
定性に優れた納豆菌を使用することを特徴とする納豆の
製造方法に関する。さらに、本発明は、ビタミンＫ2を
高濃度に生産する保存安定性に優れた納豆菌を用いて製
造されたビタミン高含有納豆に関する。また、バチルス
属細菌において、ジヒドロキシナフトエ酸アナログ耐性
によるビタミンＫ2生産性向上については、従来全く知
られていない、ましてや、ビタミンＫ2、特にＭＫ─７
を高生産し且つ優良な納豆を製造できる保存安定性に優
れた納豆菌は、従来未知の新規微生物であって、本発明
は、上記選択方法のみに限定されることなく、他の方法
で分離された該納豆菌をすべて包含するものである。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明において、変異納豆菌を得
るための変異方法としてはいかなる変異方法を用いても
よい。納豆菌は特別に人工的な変異処理を施さなくても
ある程度の確率で自然に変異を起こすので、このような
自然変異によって目的のビタミンＫ2の生産性が向上し
た変異納豆菌を取得することが可能である。また、人工
的な手段による突然変異を起こさせて取得する方法もあ
る。突然変異には物理的方法と化学的方法が用いられ
る。突然変異の物理的方法としては、紫外線照射、放射
線照射などがあり、化学的方法としては、例えばエチル
メタンスルホン酸（ＥＭＳ）やＮ─メチル─Ｎ'─ニト
ロ─Ｎ─ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の
溶液に菌体を懸濁させる方法などがあり、これらの方法
を単独または組み合わせて適宜実施することができる。
るための変異方法としてはいかなる変異方法を用いても
よい。納豆菌は特別に人工的な変異処理を施さなくても
ある程度の確率で自然に変異を起こすので、このような
自然変異によって目的のビタミンＫ2の生産性が向上し
た変異納豆菌を取得することが可能である。また、人工
的な手段による突然変異を起こさせて取得する方法もあ
る。突然変異には物理的方法と化学的方法が用いられ
る。突然変異の物理的方法としては、紫外線照射、放射
線照射などがあり、化学的方法としては、例えばエチル
メタンスルホン酸（ＥＭＳ）やＮ─メチル─Ｎ'─ニト
ロ─Ｎ─ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の
溶液に菌体を懸濁させる方法などがあり、これらの方法
を単独または組み合わせて適宜実施することができる。
【００２３】本発明では、変異納豆菌の選抜培地に特色
を有するものである。即ち、選択培地にジヒドロキシナ
フトエ酸のアナログを添加することが望ましい。これら
のアナログとしては多くのものが知られており、任意の
ものが使用できるが、特に１─ヒドロキシ─２─ナフト
エ酸、３─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸などを用いるの
が望ましい。ジヒドロキシナフトエ酸のアナログの添加
は、変異処理をする納豆菌の耐性度を勘案して実施する
必要があるが、５〜１０００、好ましくは５０〜５００
ｍｇ／ｌ程度の濃度で選択培地に添加しておくとよい。
を有するものである。即ち、選択培地にジヒドロキシナ
フトエ酸のアナログを添加することが望ましい。これら
のアナログとしては多くのものが知られており、任意の
ものが使用できるが、特に１─ヒドロキシ─２─ナフト
エ酸、３─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸などを用いるの
が望ましい。ジヒドロキシナフトエ酸のアナログの添加
は、変異処理をする納豆菌の耐性度を勘案して実施する
必要があるが、５〜１０００、好ましくは５０〜５００
ｍｇ／ｌ程度の濃度で選択培地に添加しておくとよい。
【００２４】変異処理される元の納豆菌としては、基本
的に優れた納豆生産能を有している必要があるが、その
他の性質として栄養源要求性や薬剤抵抗性などを有して
いても構わない。具体的には、通常的に納豆工業で使用
されている発酵能力に優れた納豆菌や、新たに自然界か
ら分離取得された優れた納豆菌、市販の納豆から分離し
た納豆菌、及びさらに改良を重ねた納豆菌などを用いる
ことができ、市販納豆から分離されたＯ─２株や、市販
の種菌である高橋菌（Ｔ３株、東京農業大学菌株保存
室）、宮城野菌（宮城野納豆製造所）などが適宜使用で
きる。
的に優れた納豆生産能を有している必要があるが、その
他の性質として栄養源要求性や薬剤抵抗性などを有して
いても構わない。具体的には、通常的に納豆工業で使用
されている発酵能力に優れた納豆菌や、新たに自然界か
ら分離取得された優れた納豆菌、市販の納豆から分離し
た納豆菌、及びさらに改良を重ねた納豆菌などを用いる
ことができ、市販納豆から分離されたＯ─２株や、市販
の種菌である高橋菌（Ｔ３株、東京農業大学菌株保存
室）、宮城野菌（宮城野納豆製造所）などが適宜使用で
きる。
【００２５】これらの各種納豆菌から適宜選択した納豆
菌を変異処理した後、ジヒドロキシナフトエ酸のアナロ
グを含む固体培地に塗抹して、３７℃で３日間程度培養
し、そこで生じたコロニーを単コロニー分離した後、納
豆を製造した際にビタミンＫ 2を多く含有し、かつ風味
豊かで物性的にも優れた品質の納豆を生産し、保存安定
性に優れた納豆菌を取得することによって目的の変異納
豆菌が取得できる。
菌を変異処理した後、ジヒドロキシナフトエ酸のアナロ
グを含む固体培地に塗抹して、３７℃で３日間程度培養
し、そこで生じたコロニーを単コロニー分離した後、納
豆を製造した際にビタミンＫ 2を多く含有し、かつ風味
豊かで物性的にも優れた品質の納豆を生産し、保存安定
性に優れた納豆菌を取得することによって目的の変異納
豆菌が取得できる。
【００２６】このようにして開発されたビタミンＫ2高
生産性の変異納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実
施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
このようにして、従来納豆と品質的に差異はなく風味豊
かで、かつビタミンＫ2を高濃度で含有する納豆が生産
可能となる。本発明に係る納豆菌は、ビタミンＫ2含量
が９７０μｇ／１００ｇ納豆以上の納豆を生産すること
ができ、このようにビタミンＫ2を高生産する菌株は、
従来知られておらず、新規である。本発明に係る納豆菌
は、ビタミンＫ2高生産性という特徴を有し、親株ない
し市販納豆菌に比して１．１倍〜１．６倍以上のビタミ
ンＫ2を生産することができ、さらにより高い生産性を
有する菌株もスクリーニング可能である。したがって本
発明に係る選択方法によれば、上記よりも更にビタミン
Ｋ2を高生産し得る新規菌株を選択することも可能であ
る。
生産性の変異納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実
施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
このようにして、従来納豆と品質的に差異はなく風味豊
かで、かつビタミンＫ2を高濃度で含有する納豆が生産
可能となる。本発明に係る納豆菌は、ビタミンＫ2含量
が９７０μｇ／１００ｇ納豆以上の納豆を生産すること
ができ、このようにビタミンＫ2を高生産する菌株は、
従来知られておらず、新規である。本発明に係る納豆菌
は、ビタミンＫ2高生産性という特徴を有し、親株ない
し市販納豆菌に比して１．１倍〜１．６倍以上のビタミ
ンＫ2を生産することができ、さらにより高い生産性を
有する菌株もスクリーニング可能である。したがって本
発明に係る選択方法によれば、上記よりも更にビタミン
Ｋ2を高生産し得る新規菌株を選択することも可能であ
る。
【００２７】以下に本発明の実施例について述べる。
【００２８】
【実施例１】納豆菌の培養には、表１、表２及び表３に
記載のNutrient Broth及び改変Spizizen培地及びＳＧ培
地を用い、常法に従って実施した。
記載のNutrient Broth及び改変Spizizen培地及びＳＧ培
地を用い、常法に従って実施した。
【００２９】（表１：Nutrient Broth） ─────────────────────── 成 分 濃 度 ─────────────────────── 肉エキス １％ ポリペプトン １％ 塩化ナトリウム ０．５％ ─────────────────────── （注）ｐＨは７．０とし、固体培地には寒天１．５％を
添加した。
添加した。
【００３０】 （表２：改変Spizizen培地） ───────────────────────── 成 分 濃 度 ───────────────────────── 硫酸アンモニウム ０．２％ リン酸水素２カリウム １．４％ リン酸２水素カリウム ０．６％ クエン酸ナトリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム７水和物 ０．０２％ ブドウ糖 ０．０５％ グルタミン酸ナトリウム ０．０１％ ビオチン（ビタミンＨ） １００μｇ／ｌ ───────────────────────── （注）ｐＨは７．０とし、固体培地には寒天１．５％を添加した。
【００３１】 （表３：ＳＧ培地） ───────────────────────── 成 分 濃 度 ───────────────────────── ショ糖 ５％ グルタミン酸ナトリウム １．５％ リン酸水素１カリウム ０．２７％ リン酸水素ナトリウム１２水和物 ０．４２％ 塩化ナトリウム ０．０５％ 硫酸マグネシウム７水和物 ０．０５％ ビオチン（ビタミンＨ） １００μｇ／ｌ ───────────────────────── （注）ｐＨは７．０とし、固体培地には寒天１．５％を添加した。
【００３２】市販納豆から分離した納豆菌Ｏ─２株を常
法によりＮ─メチル─Ｎ'─ニトロ─Ｎ─ニトロソグア
ニジン（生存率０．１〜１０％）で変異処理し、改変Sp
izizen培地において分岐鎖脂肪酸（イソ吉草酸、イソ酪
酸、２─メチル酪酸）要求性を示す変異株を取得し、こ
れらの株のなかからＮ─６４株を選択した。Ｎ─６４株
は、ロイシンデヒドロゲナーゼ活性が検出されず、分岐
鎖脂肪酸含量が１０ｍｇ／１００ｇ納豆以下（詳細に
は、２─メチル酪酸を含むイソ吉草酸が２ｍｇ／１００
ｇ納豆、イソ酪酸が２ｍｇ／１００ｇ納豆）である納豆
を製造可能な優れた株である。このＮ─６４株を０．１
ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─
メチル酪酸を含む上記Nutrient Brothに白金耳で植菌
し、一晩３７℃で振とう培養した後、遠心分離して滅菌
生理食塩水で洗浄した。
法によりＮ─メチル─Ｎ'─ニトロ─Ｎ─ニトロソグア
ニジン（生存率０．１〜１０％）で変異処理し、改変Sp
izizen培地において分岐鎖脂肪酸（イソ吉草酸、イソ酪
酸、２─メチル酪酸）要求性を示す変異株を取得し、こ
れらの株のなかからＮ─６４株を選択した。Ｎ─６４株
は、ロイシンデヒドロゲナーゼ活性が検出されず、分岐
鎖脂肪酸含量が１０ｍｇ／１００ｇ納豆以下（詳細に
は、２─メチル酪酸を含むイソ吉草酸が２ｍｇ／１００
ｇ納豆、イソ酪酸が２ｍｇ／１００ｇ納豆）である納豆
を製造可能な優れた株である。このＮ─６４株を０．１
ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─
メチル酪酸を含む上記Nutrient Brothに白金耳で植菌
し、一晩３７℃で振とう培養した後、遠心分離して滅菌
生理食塩水で洗浄した。
【００３３】この約１０7ｃｆｕ／ｍｌの濃度の洗浄菌
体に、１６０ｍｇ／ｌとなるようにＮ─メチル─Ｎ'─
ニトロ─Ｎ─ニトロソグアニジンを添加し、６０分間振
とうして、変異処理を行った。この時の生存率は１％前
後であった。
体に、１６０ｍｇ／ｌとなるようにＮ─メチル─Ｎ'─
ニトロ─Ｎ─ニトロソグアニジンを添加し、６０分間振
とうして、変異処理を行った。この時の生存率は１％前
後であった。
【００３４】変異処理した菌体を０．１ｍＭイソ吉草
酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪酸を
含む上記Nutrient Brothで培養して形質を発現させ、そ
の後に滅菌生理食塩水で洗浄し、さらに０．１ｍＭイソ
吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪
酸を含む改変Spizizen培地に９０ｍｇ／ｌとなるように
１─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸を添加した固体培地に
塗沫した。
酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪酸を
含む上記Nutrient Brothで培養して形質を発現させ、そ
の後に滅菌生理食塩水で洗浄し、さらに０．１ｍＭイソ
吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪
酸を含む改変Spizizen培地に９０ｍｇ／ｌとなるように
１─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸を添加した固体培地に
塗沫した。
【００３５】３７℃で３〜４日間培養した後、得られた
コロニーを、０．１ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍＭイソ酪
酸、０．１ｍＭ２─メチル酪酸を含む固体Nutrient Bro
thで単コロニー分離し、さらに上記のジヒドロキシナフ
トエ酸のアナログ及び０．１ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍ
Ｍイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪酸を添加した改変
Spizizen培地にてアナログ耐性を再確認した。このよう
にして得られたアナログ耐性株を０．１ｍＭイソ吉草
酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪酸を
含むＳＧスラント培地に植菌し、３７℃で１日間培養し
た。ＳＧスラント培地上の菌体を用いアナログ耐性株の
胞子液を作製し、納豆を試作した。一方、ＳＧスラント
培地上の菌体の一部を１５％グリセロール水溶液に懸濁
し─８０℃で１ヶ月間冷凍保存した後、０．１ｍＭイソ
吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪
酸を含むＳＧスラント培地に植菌して再生させ、さらに
胞子液を作製し、納豆を試作した。これら試作した納豆
のビタミンＫ2含量を調べ、菌株の保存安定性に優れ、
ビタミンＫ2を高濃度に生産するアナログ耐性株とし
て、ＢＨ─７９株を得た。尚、納豆の試作は常法通り納
豆を作製した。すなわち、浸漬した大豆を水切りし、
１．８Ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮した。蒸煮大豆１
ｇあたり３，０００〜４，０００個の胞子を植菌し、５
０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い皮膜で表面を覆い、
蓋をした後、バッチ式納豆発酵室へ入れ、室温４０〜４
５℃で高湿度下で醗酵を行った。また、この菌株は、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ─７１８６として、工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されてい
る。
コロニーを、０．１ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍＭイソ酪
酸、０．１ｍＭ２─メチル酪酸を含む固体Nutrient Bro
thで単コロニー分離し、さらに上記のジヒドロキシナフ
トエ酸のアナログ及び０．１ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍ
Ｍイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪酸を添加した改変
Spizizen培地にてアナログ耐性を再確認した。このよう
にして得られたアナログ耐性株を０．１ｍＭイソ吉草
酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪酸を
含むＳＧスラント培地に植菌し、３７℃で１日間培養し
た。ＳＧスラント培地上の菌体を用いアナログ耐性株の
胞子液を作製し、納豆を試作した。一方、ＳＧスラント
培地上の菌体の一部を１５％グリセロール水溶液に懸濁
し─８０℃で１ヶ月間冷凍保存した後、０．１ｍＭイソ
吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２─メチル酪
酸を含むＳＧスラント培地に植菌して再生させ、さらに
胞子液を作製し、納豆を試作した。これら試作した納豆
のビタミンＫ2含量を調べ、菌株の保存安定性に優れ、
ビタミンＫ2を高濃度に生産するアナログ耐性株とし
て、ＢＨ─７９株を得た。尚、納豆の試作は常法通り納
豆を作製した。すなわち、浸漬した大豆を水切りし、
１．８Ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮した。蒸煮大豆１
ｇあたり３，０００〜４，０００個の胞子を植菌し、５
０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い皮膜で表面を覆い、
蓋をした後、バッチ式納豆発酵室へ入れ、室温４０〜４
５℃で高湿度下で醗酵を行った。また、この菌株は、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ─７１８６として、工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されてい
る。
【００３６】この変異納豆菌ＢＨ─７９株のビタミンＫ
2生産性を評価するため、ＢＨ─７９株の胞子液と親株
であるＮ─６４株の胞子液及び市販納豆菌胞子液を用い
て、常法通り納豆を作製した。すなわち、浸漬した大豆
を水切りし、１．８ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮し
た。蒸煮大豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の胞
子を植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜
で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入
れ、室温４０〜４５℃で高湿度下で発酵を行った。発酵
終了後、熟成させ、その後に納豆中のビタミンビタミン
Ｋ2の含量、及びムレ臭を評価した。尚、納豆中のムレ
臭の原因物質である分岐鎖脂肪酸(イソ吉草酸、イソ酪
酸、２─メチル酪酸)の納豆中の含有量を評価した。表
４には、ビタミンＫ2及び分岐鎖脂肪酸含量とジヒドロ
キシナフトエ酸のアナログへの耐性を示す。
2生産性を評価するため、ＢＨ─７９株の胞子液と親株
であるＮ─６４株の胞子液及び市販納豆菌胞子液を用い
て、常法通り納豆を作製した。すなわち、浸漬した大豆
を水切りし、１．８ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮し
た。蒸煮大豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の胞
子を植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜
で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入
れ、室温４０〜４５℃で高湿度下で発酵を行った。発酵
終了後、熟成させ、その後に納豆中のビタミンビタミン
Ｋ2の含量、及びムレ臭を評価した。尚、納豆中のムレ
臭の原因物質である分岐鎖脂肪酸(イソ吉草酸、イソ酪
酸、２─メチル酪酸)の納豆中の含有量を評価した。表
４には、ビタミンＫ2及び分岐鎖脂肪酸含量とジヒドロ
キシナフトエ酸のアナログへの耐性を示す。
【００３７】 （表４：納豆菌のビタミンＫ2生産性、分岐鎖脂肪酸とジヒドロキシナフトエ酸 のアナログ耐性） ──────────────────────────────────── 使用した納豆 ビタミンＫ2含量 ジヒドロキシナフトエ酸 分岐鎖脂肪酸 菌株 （ＭＫ─７） アナログ耐性 含 量 （μｇ/100g納豆） (固体培地で判定) (mg/100g納豆) ──────────────────────────────────── 市販納豆菌 ９００ × ７２ Ｎ─６４株 ９１８ × ２ ＢＨ─７９株 １４３６ ○ ３ ────────────────────────────────────
【００３８】変異納豆菌ＢＨ─７９株は、親株であるＮ
─６４株や市販納豆菌に比較して、ジヒドロキシナフト
エ酸のアナログに対する耐性を獲得しており、それと同
時にビタミンＫ2生産性が約１．６倍に向上しているの
が確認された。また、分岐鎖脂肪酸の生産量は親株であ
るＮ─６４株と同様に市販納豆に比べ著しく低く、官能
的な評価においてもムレ臭を感じられないことが確認さ
れた。なお、３─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸を使用し
た場合も、同様の結果が得られることが確認された。
─６４株や市販納豆菌に比較して、ジヒドロキシナフト
エ酸のアナログに対する耐性を獲得しており、それと同
時にビタミンＫ2生産性が約１．６倍に向上しているの
が確認された。また、分岐鎖脂肪酸の生産量は親株であ
るＮ─６４株と同様に市販納豆に比べ著しく低く、官能
的な評価においてもムレ臭を感じられないことが確認さ
れた。なお、３─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸を使用し
た場合も、同様の結果が得られることが確認された。
【００３９】
【実施例２】常法に従い、１２０ｋｇの浸漬大豆を１．
８ｋｇｆ／ｃｍ2で２２分間加圧釜で蒸煮した。蒸煮大
豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の変異納豆菌Ｂ
Ｈ─７９株の胞子を植菌し、以下常法に従って５０ｇず
つＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋をし
た後連続式発酵装置へ入れ、室温４０〜４４℃で高湿度
下で発酵を行った。発酵終了後、熟成させて得られた納
豆のビタミンＫ2を分析し、さらに２つの市販納豆製品
と比較して、官能的な評価を行った。その結果を表５及
び図１に示す。
８ｋｇｆ／ｃｍ2で２２分間加圧釜で蒸煮した。蒸煮大
豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の変異納豆菌Ｂ
Ｈ─７９株の胞子を植菌し、以下常法に従って５０ｇず
つＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋をし
た後連続式発酵装置へ入れ、室温４０〜４４℃で高湿度
下で発酵を行った。発酵終了後、熟成させて得られた納
豆のビタミンＫ2を分析し、さらに２つの市販納豆製品
と比較して、官能的な評価を行った。その結果を表５及
び図１に示す。
【００４０】なお、官能評価は納豆を常用するパネル８
０名にて５段階評価法にて行い、その平均値を示した。
５点を良い、４点をやや良い、３点をどちらでもない、
２点をやや悪い、１点を悪いと評価した。それぞれの評
価項目を下表に示す。 ──────────────────────────────────── 評価項目 評価内容 ──────────────────────────────────── 外観 納豆菌膜の皮膜の状態 香り アンモニア臭などがなく納豆特有の香りがある 味 苦みがなく、納豆特有の旨さがある 食感 納豆豆の適度の硬さがある 糸引き 納豆特有のかき混ぜ時の糸引きが強い 総合評価 上記５項目の総合評価 ────────────────────────────────────
０名にて５段階評価法にて行い、その平均値を示した。
５点を良い、４点をやや良い、３点をどちらでもない、
２点をやや悪い、１点を悪いと評価した。それぞれの評
価項目を下表に示す。 ──────────────────────────────────── 評価項目 評価内容 ──────────────────────────────────── 外観 納豆菌膜の皮膜の状態 香り アンモニア臭などがなく納豆特有の香りがある 味 苦みがなく、納豆特有の旨さがある 食感 納豆豆の適度の硬さがある 糸引き 納豆特有のかき混ぜ時の糸引きが強い 総合評価 上記５項目の総合評価 ────────────────────────────────────
【００４１】 （表５ 納豆のビタミンＫ2含量と品質評価） ────────────────────────────── ビタミンＫ2含量 納豆名 （ＭＫ─７） （μｇ/100g納豆） ────────────────────────────── 市販納豆Ａ ９６２ 市販納豆Ｂ ９５８ BH─79株使用納豆 １４８２ ──────────────────────────────
【００４２】 （表５：続き） ──────────────────────────────────── （品質評価） 菌株名 外観 色 香 糸引 食感 味 総合評価 ──────────────────────────────────── 市販納豆Ａ 3.0 3.0 3.0 2.6 2.6 3.0 2.7 市販納豆Ｂ 3.2 3.2 3.4 3.4 3.0 3.0 3.1 BH─79株使用納豆 2.9 2.6 4.3 3.5 2.8 3.0 3.2 ────────────────────────────────────
【００４３】変異納豆菌ＢＨ─７９株で製造した納豆
は、市販の納豆と比べて、香りが特にすぐれており、ム
レ臭が殆ど感じられず、またその他の品質もほとんど遜
色のないものであり、かつビタミンＫ2含量が向上した
納豆であることが確認された。
は、市販の納豆と比べて、香りが特にすぐれており、ム
レ臭が殆ど感じられず、またその他の品質もほとんど遜
色のないものであり、かつビタミンＫ2含量が向上した
納豆であることが確認された。
【００４４】
【実施例３】市販納豆菌胞子液とビタミンＫ2高生産性
の変異納豆菌ＢＨ─７９株の胞子液を用い、市販納豆菌
胞子液を用いた場合は特開平８─９９１６号公報に開示
の方法に準じ、室温４２℃と一定にして発酵時間を１８
時間（条件１）、２４時間（条件２）、４８時間（条件
３）と変化させた以外は実施例１に記載の方法と同様に
して、また変異納豆菌ＢＨ─７９株の胞子液を用いた場
合は、室温４０〜４５℃、高湿度下で発酵時間を１８時
間とする実施例１と同様の方法で、バッチ式納豆発酵室
で納豆製造を行った。
の変異納豆菌ＢＨ─７９株の胞子液を用い、市販納豆菌
胞子液を用いた場合は特開平８─９９１６号公報に開示
の方法に準じ、室温４２℃と一定にして発酵時間を１８
時間（条件１）、２４時間（条件２）、４８時間（条件
３）と変化させた以外は実施例１に記載の方法と同様に
して、また変異納豆菌ＢＨ─７９株の胞子液を用いた場
合は、室温４０〜４５℃、高湿度下で発酵時間を１８時
間とする実施例１と同様の方法で、バッチ式納豆発酵室
で納豆製造を行った。
【００４５】すなわち、４℃で一晩浸漬した大豆を１．
８ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあ
たり３，０００〜４，０００個の胞子を植菌し、５０ｇ
ずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋を
した後にバッチ式納豆発酵室で１８〜４８時間発酵を行
った。発酵終了後、熟成して得られた納豆のビタミンＫ
2の分析を行い、さらに官能的評価を行った結果を表５
に示す。
８ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあ
たり３，０００〜４，０００個の胞子を植菌し、５０ｇ
ずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋を
した後にバッチ式納豆発酵室で１８〜４８時間発酵を行
った。発酵終了後、熟成して得られた納豆のビタミンＫ
2の分析を行い、さらに官能的評価を行った結果を表５
に示す。
【００４６】 （表５ 納豆のビタミンＫ2含量と品質評価） ──────────────────────────────────── 発 酵 ビタミンＫ2 揮発性アンモニア 納豆の種類 時 間 （ＭＫ─７） （ｐｐｍ） （hr） （μg/100g納豆） ──────────────────────────────────── BH─79株納豆 １８ １４０８ １９ 市販納豆菌納豆（条件１） １８ ７１２ １５ 市販納豆菌納豆（条件２） ２４ １０１２ ６２ 市販納豆菌納豆（条件３） ４８ １６０２ １３０ ────────────────────────────────────
【００４７】 （表６：続き） ──────────────────────────────────── 納豆の種類 （納豆の品質） ──────────────────────────────────── BH─79株納豆 良好（通常の品質） 市販納豆菌納豆（条件１） 良好（通常の品質） 市販納豆菌納豆（条件２） やや不良（少しアンモニア臭、苦味、 少しシャリ発生、豆色濃化、菌膜溶解気味） 市販納豆菌納豆（条件３） 不良（強いアンモニア臭、シャリ発生、 豆色こげ茶色、菌膜溶解、糸引き弱化） ────────────────────────────────────
【００４８】長時間発酵させることによって、確かに納
豆中のビタミンＫ2含量は増加することが確認された
が、発酵時間を２４時間、４８時間と長くすることによ
って、アンモニア濃度が増加するとともに、アンモニア
臭の強い納豆となり、またシャリが発生して食感が低下
するとともに、豆色が悪くなって菌膜も溶解して外観が
悪くなるなど品質は劣化することが確認された。これに
対して、変異納豆菌ＢＨ─７９株で発酵したものは、１
８時間と通常の発酵時間であっても、市販納豆菌で長時
間の発酵を行ったものと同程度の高い濃度のビタミンＫ
2を含有しており、かつ品質的にも通常の納豆とほぼ同
等の品質であることが確認された。すなわち、ビタミン
Ｋ2を高濃度で含有する高品質の納豆を通常の納豆と同
程度の発酵時間で効率良く製造できることが確認され
た。
豆中のビタミンＫ2含量は増加することが確認された
が、発酵時間を２４時間、４８時間と長くすることによ
って、アンモニア濃度が増加するとともに、アンモニア
臭の強い納豆となり、またシャリが発生して食感が低下
するとともに、豆色が悪くなって菌膜も溶解して外観が
悪くなるなど品質は劣化することが確認された。これに
対して、変異納豆菌ＢＨ─７９株で発酵したものは、１
８時間と通常の発酵時間であっても、市販納豆菌で長時
間の発酵を行ったものと同程度の高い濃度のビタミンＫ
2を含有しており、かつ品質的にも通常の納豆とほぼ同
等の品質であることが確認された。すなわち、ビタミン
Ｋ2を高濃度で含有する高品質の納豆を通常の納豆と同
程度の発酵時間で効率良く製造できることが確認され
た。
【００４９】
【実施例４】変異納豆菌ＢＨ─７９株を生育させた０．
１ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２
─メチル酪酸を含むＳＧスラント培地から菌体を得て、
１５％グリセロール水溶液に懸濁し、１ヶ月、３ヶ月及
び６ヶ月間、─８０℃で凍結保存した。凍結保存した菌
体を０．１ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．
１ｍＭ２─メチル酪酸を含むＳＧスラント培地に植菌
し、胞子液を作成した後、納豆を試作し納豆のビタミン
Ｋ2含有量を調べた。尚、納豆の試作は実施例１の記載
と同様に、常法に従い実施した。すなわち、浸漬した大
豆を水切りし、１．８Ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮し
た。蒸煮大豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の胞
子を植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜
で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入
れ、室温４０〜４５℃で高湿度下で醗酵を行い、醗酵終
了後、熟成させた。表７に凍結保存した菌体で製造した
納豆のビタミンＫ2含有量を示す。
１ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．１ｍＭ２
─メチル酪酸を含むＳＧスラント培地から菌体を得て、
１５％グリセロール水溶液に懸濁し、１ヶ月、３ヶ月及
び６ヶ月間、─８０℃で凍結保存した。凍結保存した菌
体を０．１ｍＭイソ吉草酸、０．１ｍＭイソ酪酸、０．
１ｍＭ２─メチル酪酸を含むＳＧスラント培地に植菌
し、胞子液を作成した後、納豆を試作し納豆のビタミン
Ｋ2含有量を調べた。尚、納豆の試作は実施例１の記載
と同様に、常法に従い実施した。すなわち、浸漬した大
豆を水切りし、１．８Ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮し
た。蒸煮大豆１ｇあたり３，０００〜４，０００個の胞
子を植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜
で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入
れ、室温４０〜４５℃で高湿度下で醗酵を行い、醗酵終
了後、熟成させた。表７に凍結保存した菌体で製造した
納豆のビタミンＫ2含有量を示す。
【００５０】 （表７：凍結保存した菌体で製造した納豆のビタミンＫ2含有量） ────────────────────────────── 使用した納豆菌株 ビタミンＫ2含量 （ＭＫ─７） （μg/100g納豆） ────────────────────────────── 凍結保存前菌株 １４３６ １ヶ月保存菌株 １４１５ ３ヶ月保存菌株 １３５０ ６ヶ月保存菌株 １４９０ ──────────────────────────────
【００５１】変異納豆菌ＢＨ─７９株を─８０℃で６ヶ
月間凍結保存しても、ビタミンＫ2の生産量は減少しな
かった。すなわち、ＢＨ─７９株は少なくとも数カ月間
はビタミンＫ2生産能力を安定に保持しており、実生産
に使用可能な保存安定性に優れたビタミンＫ2高生産生
の納豆菌株であることが確認された。
月間凍結保存しても、ビタミンＫ2の生産量は減少しな
かった。すなわち、ＢＨ─７９株は少なくとも数カ月間
はビタミンＫ2生産能力を安定に保持しており、実生産
に使用可能な保存安定性に優れたビタミンＫ2高生産生
の納豆菌株であることが確認された。
【００５２】
【発明の効果】本発明によれば、通常の品質とほとんど
変わりなく風味豊かで、かつ骨強化作用があると期待で
きるビタミンＫ2を高濃度で含有する納豆を安定して提
供することができる。また、納豆菌その他のバチルス属
細菌において、保存安定性に優れたビタミンＫ2高生産
株を極めて効率良く育種、分離することができる。
変わりなく風味豊かで、かつ骨強化作用があると期待で
きるビタミンＫ2を高濃度で含有する納豆を安定して提
供することができる。また、納豆菌その他のバチルス属
細菌において、保存安定性に優れたビタミンＫ2高生産
株を極めて効率良く育種、分離することができる。
【００５３】本発明によれば、ビタミンＫ2、その中で
も特に骨強化作用があると期待されるＭＫ─７を多量に
含有する納豆が得られるので、特にＭＫ─７が有する骨
強化作用、骨粗しょう症改善作用等の有用な機能を利用
して、特定保健用食品、健康食品等として、幼児〜高齢
者に至るまで、広く利用することができる。
も特に骨強化作用があると期待されるＭＫ─７を多量に
含有する納豆が得られるので、特にＭＫ─７が有する骨
強化作用、骨粗しょう症改善作用等の有用な機能を利用
して、特定保健用食品、健康食品等として、幼児〜高齢
者に至るまで、広く利用することができる。
【００５４】また、更に本発明で得られたビタミンＫ2
高生産株を変異処理し、ｐ（又はｍ）─フルオロ─Ｄ，
Ｌ─フェニルアラニン、β─２─フェニル（又はチエニ
ル）アラニン、フェニルアラニンヒドロキサム酸の少な
くともひとつを含有する選択培地を用いることにより、
更にすぐれた菌株を選択、分離することができる。
高生産株を変異処理し、ｐ（又はｍ）─フルオロ─Ｄ，
Ｌ─フェニルアラニン、β─２─フェニル（又はチエニ
ル）アラニン、フェニルアラニンヒドロキサム酸の少な
くともひとつを含有する選択培地を用いることにより、
更にすぐれた菌株を選択、分離することができる。
【図１】ビタミンＫ2高含有納豆と市販納豆の品質評価
を示す。
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｘ (72)発明者 角田 宏之 神奈川県藤沢市大鋸１−８−７ マイライ フ21 101号室 (72)発明者 円谷 悦造 愛知県半田市横川町２−44−１ (72)発明者 秋田 澄男 愛知県名古屋市瑞穂区高田町１−23−３ (72)発明者 塚本 義則 愛知県半田市清城町３−３−23 Ｆターム(参考） 4B018 LB04 MD58 MD88 ME05 MF13 4B020 LB13 LC05 LG01 LK17 LP18 LY04 4B065 AA19X AC14 BA16 BA18 BA23 BA24 CA02 CA41
Claims (9)
- 【請求項１】 ジヒドロキシナフトエ酸のアナログに対
する耐性を有し、且つ、ビタミンＫ2を高濃度に生産す
る保存安定性に優れたバチルス・サチリス（Bacillus s
ubtilis）に属する納豆菌。 - 【請求項２】 ジヒドロキシナフトエ酸のアナログが１
─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸、３─ヒドロキシ─２─
ナフトエ酸から選ばれる少なくともひとつであることを
特徴とする請求項１に記載の納豆菌。 - 【請求項３】 ジヒドロキシナフトエ酸のアナログを含
有する選択培地を用いること、を特徴とするビタミンＫ
2生産性が向上し、且つ保存安定性に優れたたバチルス
（Bacillus）属細菌の育種方法。 - 【請求項４】 バチルス・サチリス（Bacillus subtili
s）に属する納豆菌について、これを突然変異処理した
後、あるいは自然界の中に存在するビタミンＫ2高生産
性菌をジヒドロキシナフトエ酸のアナログ含有選択培地
で選択、分離し、さらに保存安定性に優れた菌株を選択
すること、を特徴とするビタミンＫ2生産性が向上し、
且つ保存安定性に優れた納豆菌の育種方法。 - 【請求項５】 ジヒドロキシナフトエ酸のアナログが１
─ヒドロキシ─２─ナフトエ酸、３─ヒドロキシ─２─
ナフトエ酸から選ばれる少なくともひとつであることを
特徴とする請求項３又は請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 請求項４又は５の方法によって分離、育
種してなる保存安定性に優れたビタミンＫ2高生産性納
豆菌。 - 【請求項７】 請求項１、２又は６に記載の保存安定性
に優れたビタミンＫ 2高生産性納豆菌を使用すること、
を特徴とするビタミンＫ2高含有納豆の製造方法。 - 【請求項８】 請求項１、２又は６に記載の保存安定性
に優れたビタミンＫ 2高生産性納豆菌を用いて製造され
たビタミンＫ2高含有納豆。 - 【請求項９】 ビタミンＫ2がＭＫ─７であることを特
徴とする請求項８に記載の納豆。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000229239A JP2002034554A (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ビタミンｋ２高生産納豆菌、その育種方法及び納豆 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000229239A JP2002034554A (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ビタミンｋ２高生産納豆菌、その育種方法及び納豆 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002034554A true JP2002034554A (ja) | 2002-02-05 |
Family
ID=18722394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000229239A Pending JP2002034554A (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ビタミンｋ２高生産納豆菌、その育種方法及び納豆 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002034554A (ja) |
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-
2000
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