CN101805712B - 一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化法生产(r)-扁桃酸中的应用 - Google Patents
一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化法生产(r)-扁桃酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物化工领域，公开了一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化法生产(R)-扁桃酸中的应用。在有机溶剂中利用枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)湿菌体与共价修饰剂混合所得的生物催化剂，在温度为15～35℃，搅拌转速为100～400rpm下将1～10％的扁桃腈催化水解为扁桃酸。该枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)对有机溶剂的耐受性强，克服了普通微生物细胞在有机溶剂系统中易受损、酶活低等不足，同时对底物表现出较好的立体选择性。所得(R)-扁桃酸的光学纯度达95％e.e以上，(R)-扁桃酸的收率达70％以上。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一株新菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2，以及该菌株在生物催化法生产(R)-扁桃酸中的应用。
背景技术
(R)-扁桃酸又称α-羟基苯乙酸、苯乙醇酸、苦杏仁酸，易溶于乙醚、异丙醇，溶于乙醇和水。该化合物是一种重要的手性药物中间体，被广泛应用于多种光学活性药物的合成，如半合成青霉素和头孢霉素等抗生素，减肥药物，抗肿瘤药物，农药以及其他药物。目前国际市场需求约以年均10％左右增长，市场潜力巨大。
扁桃腈又称苯乙醇腈、马来腈等，浅黄色透明油状液体，溶于乙醇、乙醚、氯仿，几乎不溶于水。将苯甲醛溶于氯仿中，加入无水氢氰酸可简单反应制得扁桃腈，再经过化学法或生物催化法水解得扁桃酸。其中以化学水解法三废量大，水污染严重，收率低，产品以外消旋扁桃酸形式存在于反应中，需进行复杂的拆分。生物催化法可采用高度立体选择性的腈水解酶将外消旋的扁桃腈一步水解制得具有光学活性的扁桃酸异构体。
除此之外，目前已具备的(R)-扁桃酸的制备方法主要有色谱法、化学拆分法和生物催化法。色谱法具有快速，产品纯度高和方法简便等特点，但需要昂贵的手性柱等设备，处理量小，成本高，不适合规模化生产。化学拆分法主要是采用手性拆分剂与扁桃酸两种对映体形成非对映体盐，以增加其物理性质的差异以便结晶分离。该法具有规模化生产的应用潜力，但表现出产率低、产物的光学纯度不高、拆分试剂较贵、对环境污染大等局限。生物催化法主要是利用生物体内相关酶对底物的高度立体选择性进行催化转化反应，产物光学纯度高，收率高，副反应少，可在常温常压下进行，安全环保。根据底物和催化剂(生物酶)种类不同又可以有多种路线选择，如：专利CN 1840671A和CN1715398A中均以外消旋的扁桃酸为底物，利用特定微生物对外消旋扁桃酸中两个对映异构体降解速度的不同实现拆分。该方法的不足之处在于以降解其中某一对映体的方式来获得另一种具有光学 活性的扁桃酸，其最终产率不高于50％，原料浪费较多。CN 1580270A、CN 1840670A和CN 1710087A中均报道了采用苯甲酰甲酸或其衍生物作为底物，分别采用不同的微生物进行拆分得到单一构型的手性扁桃酸。但苯甲酰甲酸属α-酮酸，容易氧化，脱羧，脱酮基，取制比较困难，价格较贵，以此作为扁桃酸工业化生产原料成本相对较高。
发明内容
本发明的目的在于针对以上现有技术的不足，提供一株新的芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KR2(CGMCC NO.3242)；本发明的另一目的是提供该细菌在非水相系统中以扁桃腈为底物，生物催化生产(R)-扁桃酸中的应用。本发明以扁桃腈为底物，采用非水相系统进行生物催化反应，旨在解决现有技术中以扁桃腈为底物生物催化产(R)-扁桃酸中产物收率低，底物和产物分离难等关键制约技术难题，借助原料的成本优势为规模化生产高纯度(R)-扁桃酸提供一条可行的途径。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)具有以下微生物学特征：
1.形态学特征
在固体平板培养基上培养48小时后出现圆形光滑的单菌落，灰白色，不透明，表面湿润，边缘光滑，整个菌落凸起，易挑取；镜检成杆状，大小长为(0.5～0.8um)×(1.5～2.5um)，芽孢中生。
2.培养学特征
本菌株在以下3种培养基中30℃下培养48～96小时后的培养特征见表1。
表1枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)在3种培养基上的培养特征
3.生理生化特征
表2枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)生理生化特征
(注：表中“+”表示阳性，“-”表示阴性。)
枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的培养：
先进行枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)斜面种子制备，将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)接种到灭过菌的斜面后在20～35℃下培养3～7天，刮取3～5环菌种接种到装有已灭菌的液体培养基的三角瓶中，在温度为20～35℃，转速为100～300rpm下振荡培养30～120小时，即可作为枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)一级种子。同样培养条件下，将一级种子按3～10％(％：v/v)的接种量转接第二批装有同样培养基的三角瓶中，同样条件下培养30～72小时后作为枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)二级种子。将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)二级种子以3～10％(％：v/v)的接种量接种到7～300L发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：装液量：60～70％(％： v/v)，通气量：0.1～1(v/v.min)，罐压：0.02～0.05MPa，温度：20～35℃，转速：100～400rpm，发酵时间：30～120小时。
发酵结束后将发酵罐内的发酵液3000rpm离心10min，弃上清，所得沉淀用去离子水重悬后3000rpm离心10min，弃上清，得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)湿菌体。
所涉及的培养基成分如下：
斜面培养基(g/L)：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，琼脂：10～30，pH：5～9。
一级、二级液体种子培养基(g/L)：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，己内酰胺：0.5～10，异戊腈：0.1～5，氯化钴：5～50ppm，pH：5～9。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖：10～50，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，己内酰胺：0.5～10，异戊腈：0.1～5，氯化钴：5～50ppm，pH：5～9。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2(CGMCC NO.3242)在生物催化法合成(R)-扁桃酸中的应用。
一种利用枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)在非水相系统中生物催化法生产(R)-扁桃酸的方法。该方法的工艺流程见图1。
该方法的具体步骤为：
(1)生物催化剂的制备
将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)湿菌体与共价修饰剂以1∶1～1∶50的质量比混合均匀，此混合液即可作为本发明的生物催化剂。所述的共价修饰剂选用分子量≤700的聚乙二醇，所述的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)湿菌体与共价修饰剂以1∶1～1∶5的质量比混合均匀。
(2)非水相催化反应
将制备好的生物催化剂以装液量体积的5～15％加入到装有有机溶剂的搅拌釜中，有机溶剂的加入量为搅拌釜体积的50～70％(v/v)，扁桃腈的添加量为装液量的1～ 10％(g/100mL)。在温度为15～35℃，搅拌转速为100～400rpm下将扁桃腈催化水解为扁桃酸。当底物浓度趋向于零时即可结束反应。
其中所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、甲苯、异丙基醚、甲基异丁酮、正丁醇、异丙醇中的任意一种，优选乙酸乙酯。
所述的催化剂除步骤(1)中所制备的经共价修饰的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)细胞外，还可以是枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的游离细胞、固定化细胞颗粒或絮凝细胞液，优选经共价修饰的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)细胞。
(3)产物分离
将超滤膜系统过滤出的反应液在75～85℃蒸馏浓缩，水洗后0～4℃结晶便得扁桃酸。蒸馏和水洗出的有机相均可继续套用到下批催化反应中去。
本发明的有益效果：
本发明主要利用枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)体内酶的催化作用在非水相系统中将扁桃腈水解成(R)-扁桃酸。该枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)对有机溶剂的耐受性强，克服了普通微生物细胞在有机溶剂系统中生物酶易失活、酶活低等不足，同时对底物表现出较好的立体选择性。所得(R)-扁桃酸的光学纯度达95％e.e以上，(R)-扁桃酸的产率达70％以上。反应液经过浓缩，水洗后，产物(R)-扁桃酸较好的溶解到水相中，残留的底物扁桃腈几乎不溶于水相，可以随有机相套用到下一批反应中，不仅实现了底物与产物较好的分离，而且间接的提高了底物利用率。
涉及的生物材料样品的保藏
本发明所要求保护的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.3242，保藏日期为2009年8月19日。
附图说明
图1枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)在非水相系统中生物催化法生产(R)-扁桃酸的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1 菌种筛选
本发明所涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2(CGMCC NO.3242)是本公司生物化工研究组成员从受腈类化合物污染达15年以上的的农药厂土壤中筛选得到。
本发明中菌种的筛选方法如下：
从南京第一农药厂污水池不同角度取污泥样100余批，分批富集培养后进行筛选和鉴定：称取10g污泥，加无菌水50mL，用玻璃珠摇碎后取5mL悬浊液接种到45mL富集培养基中，放置30℃摇床上，120rpm振荡培养3天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10-6、10-7、10-8的梯度稀释液涂布到含初筛固体培养基的平板上，置30℃恒温培养箱培养3～6天。挑取生长出的单菌落接种到新的初筛固体培养基上扩大培养，培养条件同上。待菌长出后刮去3～5环接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上120rpm下振荡培养3天，取15mL培养液3000rpm下离心10min，倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体，继续离心得菌体。将所得菌体添加到含1％(％：g/100mL)亚氨基二乙腈的PBS缓冲液中转化2小时，反应体系中菌体浓度为0.5g/L。取5mL转化液3000rpm下离心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果转化液含有亚氨基二乙酸则说明该菌对亚氨基二乙腈具有转化能力，选择其中亚氨基二乙酸转化率最高的一株，按《简明伯杰细菌鉴定手册》第八版进行鉴定为枯草芽孢杆菌。将该株枯草芽孢杆菌命名为KR2，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号待定CGMCC NO.3242，保藏日期为2009年8月19日。
本发明中的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)能同时在分别以丙烯腈、烟腈、乳腈、羟基乙腈，亚氨基二乙腈为唯一氮源的固体初筛培养基上生长，底物范围广，降解腈类化合物能力强，适合用作本发明中亚氨基二乙酸的生产应用。
筛选方法中的所述的液体富集培养基、固体初筛培养基、液体复筛培养基分别如下：
富集培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，pH：7，121℃灭菌20min。
固体初筛培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，亚氨基二乙腈(或丙烯腈、或烟腈、或乳腈、或羟基乙腈)：1，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05， 琼脂：2，pH：7，121℃灭菌20min。
液体发酵培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，尿素：0.5，pH：7，121℃灭菌20min。
实施例2 枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)生物催化剂的制备
在无菌超净工作台内用接种环刮取枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)斜面菌种3环，接种到一级液体种子培养基中(葡萄糖：15，酵母膏：5，蛋白胨：5，氯化钠：2，磷酸二氢钾：1，磷酸氢二钾：1，硫酸镁：0.5，己内酰胺：5，异戊腈：1，氯化钴：10ppm，pH：7.0，单位：g/L)。在温度为25℃，转速为150rpm下振荡培养48小时即可得一级枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)种子液，将该一级种子液按照10％的接种量转接到装有同样成分已灭菌的培养基中继续进行培养，48小时后可得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)二级种子液。
将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)二级种子液按照10％的接种量接种到35L已灭菌的液体发酵培养基中，(葡萄糖：30，酵母膏：10，蛋白胨：10，氯化钠：2，磷酸二氢钾：1，磷酸氢二钾：1，硫酸镁：0.5，异戊腈：1，己内酰胺：5，氯化钴：10ppm，pH：7，单位：g/L)，发酵罐体积为50L，采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于10％，通气量：0.2v/v.min，罐压：0.03MPa，温度：25℃，起始转速100rpm，发酵过程中根据发酵液的溶氧水平有步骤的调节，最大转速不超过400rpm，发酵72小时后即可制得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)细胞发酵液。该发酵液3000rpm离心10min得沉淀细胞，用去离子水重悬后继续3000rpm离心10min，弃上清得沉淀湿菌体。
将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)湿菌体与聚乙二醇(分子量为200)以1∶3的质量比混合均匀，此混合液即可作为本发明的生物催化剂。
实施例3 酶活检测
本实施例采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.3242的发酵液进行酶活的测定。酶活的定义：在25℃下，1克湿菌体与1毫升扁桃腈催化反应1小时后生成的扁桃酸的微克数，该微克数即为总酶活力单位数。扁桃酸的检测采用HPLC法，检测参数为色谱柱：LC-(R)-3，5-DNBPG手性柱，150mm×4.6mm I.D、流动相：异丙醇/水(30/70)、流速：0.5mL/min、柱温：25℃、检测：UV 230nm。在本发明条件下，每毫升发酵液中生 物量最高可达47mg湿菌体，总酶活最高可达985U。
实施例4非水相催化反应
在50L搅拌釜内，装有35L乙酸乙酯，添加1.8kg扁桃腈，平均分2次加入，搅拌均匀后加入3.5L实施例1中制备的生物催化剂。在温度为25℃，搅拌转速为150rpm下催化反应，每小时测定一次底物浓度，检测到扁桃腈的浓度趋向于零时结束反应。
实施例5 产物分离
将实施例4中的反应液用0.2um的超滤膜过滤，之后在80℃下蒸馏浓缩得粗产物，同时回收溶剂进行套用。将得到的粗产物用5倍体积的去离子水进行水洗，残留的不溶性有机相套用到下批次反应釜中。将水相在4℃下冷冻结晶，剩余的液体蒸发水分继续结晶，最后得光学纯度为96.6％e.e的(R)-扁桃酸1.503kg，收率达70.6％。
实施例6
本实施例仅改变催化剂的添加量，其余反应条件，底物添加量和产物分离过程完全与实施例4、实施例5一致。单独进行两批反应，反应釜中生物催化剂的添加量分别为2L和5L。最后分别在52小时和27小时后检测反应液中扁桃腈的含量基本为零，停止反应后进行产物分离。最后分别得到光学纯度为97.1％e.e的(R)-扁桃酸1.485kg和光学纯度为97.5％e.e的(R)-扁桃酸1.512kg，收率分别达70.1％和71.7％。
实施例7
本实施例仅改变反应釜中底物扁桃腈的添加量，其余反应条件，催化剂添加量和产物分离过程完全与实施例4、例5一致。本实施例中扁桃腈的累积添加量为3kg，分3次加入，每次添加量为1kg。最后得到光学纯度为95.2％e.e的(R)-扁桃酸2.631kg，收率达73.1％。
实施例8
本实施例仅改变催化反应的温度，其余反应条件，底物添加量和产物分离过程完全与实施例4、实施例5一致。控制反应温度为10℃，反应36小时后终止反应，最终得到光学纯度为96.8％e.e的(R)-扁桃酸1.55kg，收率达72.9％，。
实施例9
本实施例主要考查枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的遗传稳定性。将4℃冰 箱中保藏的该枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)放置30℃恒温培养箱中活化20分钟后取出接种到新鲜的斜面培养基中，之后放置30℃恒温培养箱培养3天，待斜面上长出新的划线菌落后即为该枯草芽孢杆菌的子一代，命名为KR2-1；之后以KR2-1为出发菌种，以同样的方式进行接种传代，培养出新划线菌落后命名为子二代KR2-2；再以KR2-2为出发菌种，以同样的方式转接新斜面培养基，得子三代KR2-3。以此方式连续传代30次，分别得到KR2-4、KR2-5......KR2-30。斜面培养基(g/L)：葡萄糖：15，酵母膏：5，蛋白胨：2，氯化钠：1，磷酸二氢钾：0.5，磷酸氢二钾：0.5，硫酸镁：0.5，琼脂：20，pH：7。
挑选以上传代培养中所得到KR2-10、KR2-20、KR2-30三株子代，以原始KR2(CGMCC NO.3242)为对照，同时进行一级液体种子、二级液体种子的制备，操作方法和培养基均与实施例1中相同。之后进行游离细胞的制备，将所得的二级液体种子以10％的接种量接种到装有已灭菌发酵培养基的摇瓶中，每500mL容量的摇瓶最终装液量为100mL，接完种之后放置温度为25℃的恒温摇床上振荡培养3天，转速为150rpm。所述的发酵培养基与实施例1中相同。
将以上所得的液体发酵液于3000rpm下冷冻离心10分钟，弃上清液后用等体积的去离子水冲洗沉淀菌体一遍后继续3000rpm离心10分钟，弃上清，得湿菌体。将所得的沉淀湿菌体与聚乙二醇(分子量为200)以1∶3的质量比混合均匀，作为本发明的生物催化剂添加形式。
在500mL烧瓶中，添加300mL乙酸乙酯，30mL以上制备好的KR2(KR2-10、KR2-20、KR2-30)生物催化剂，10g扁桃腈。在温度为25℃，搅拌转速为150rpm下催化反应30分钟，之后取样，经0.2um膜过滤后检测。结果KR2、KR2-10、KR2-20、KR2-30四株菌所对应的转化液中扁桃酸的浓度分别为1.25％、1.23％、1.20％、1.18％(％：g/100mL)。以上结果可见，该枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)在传代30次后仍然保持与亲代KR2菌几乎相当的转化率，具有很好的遗传稳定性。
Claims (3)
1.保藏号为CGMCC No.3242的枯草芽孢杆菌KR2在生物催化法合成(R)-扁桃酸中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于一种利用枯草芽孢杆菌KR2在非水相系统中生物催化合成(R)-扁桃酸方法的具体步骤为：
(1)生物催化剂的制备
将枯草芽孢杆菌KR2湿菌体与分子量≤700的聚乙二醇以1∶1～1∶50的质量比混合均匀，此混合液作为本发明的生物催化剂组成成分；
(2)非水相催化反应
将制备好的生物催化剂以装液量体积的5～15％加入到装有乙酸乙酯的搅拌釜中，乙酸乙酯的加入量为搅拌釜体积的50～70％，扁桃腈的添加量为装液量的1～10％，在温度为15～35℃，搅拌转速为100～400rpm下将扁桃腈催化水解为扁桃酸，当底物浓度趋向于零时即可结束反应；
(3)产物分离
将反应液经0.2～0.5μm膜超滤后于75～85℃蒸发浓缩，水洗后0～4℃结晶得扁桃酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌KR2湿菌体与分子量≤700的聚乙二醇的质量比为1∶1～1∶5。
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