CN101906447B

CN101906447B - 一种生物催化生产3,6-二氯吡啶-2-羧酸的方法

Info

Publication number: CN101906447B
Application number: CN200910264304A
Authority: CN
Inventors: 薛谊; 孔国平; 徐强; 蒋剑华; 江涛
Original assignee: Nanjing Huazhou Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Huazhou Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: CN101906447A

Abstract

本发明属于生物化工领域，公开了一种生物催化生产3，6-二氯吡啶-2-羧酸的方法。该方法以产腈水解酶活性细胞为生物催化剂，在水-有机溶剂两相系统中，温度为15～35℃，将底物3，6-二氯-2-氰基吡啶水解为3，6-二氯吡啶-2-羧酸。本发明将生物催化反应与产物分离进行耦合，既有效克服了高浓度底物和产物对细胞的毒害抑制作用，又实现了产物的有效分离，操作简单，反应条件温和，工艺适合工业化生产应用。

Description

一种生物催化生产3,6-二氯吡啶-2-羧酸的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种生物催化生产3，6-二氯吡啶-2-羧酸的方法。

背景技术

3，6-二氯吡啶-2-羧酸，又名二氯吡啶酸、毕克草，是一种内吸性芽后除草剂，可有效地防除菊科、豆科、茄科和伞形科杂草。目前主要以电解法合成3，6-二氯吡啶-2-羧酸，如美国专利US4217185、浙江工业大学CN1807691A、利尔化学股份有限公司CN101235512A等均以3，4，5，6-四氯吡啶甲酸为主要原料，在不同的反应体系下电解制得高纯度的3，6-二氯吡啶甲酸。美国专利US3317549采用甲基吡啶为原料，通过光催化，氯代水解后制得3，6-二氯吡啶-2-羧酸。1978年美国专利US4087431采用化学法还原3，4，5，6-四氯-2-氰基吡啶制得3，6-二氯吡啶-2-羧酸。1977年GB1469610中采用化学还原3，4，5，6-四氯吡啶甲酸制备3，6-二氯吡啶-2-羧酸，目前国内外还有几家单位在采用该法生产，如射阳黄海农药化工有限公司公开专利CN101139318A中以2-氰基吡啶和氯气为主要原料，采用传统的氯化、水解及还原生产路线，在传统的三氯化铁及盐酸介质中增加氯化锌与氯化钴组份作为主催化剂，控制好还原体系中碳酸钠浓度、氢氧化钠与四氯吡啶酸的质量比和反应体系的温度和pH环境，最终可使收率高达80％以上，含量高达98.8％以上。此法的不足之处在于环境污染较严重。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种生物催化生产3，6-二氯吡啶-2-羧酸的方法。本发明的另一目的是提供一株用于该方法的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

本发明以3，6-二氯-2-氰基吡啶为起始原料；产水解酶活性细胞为生物催化剂，采用水-水不溶性有机溶剂组成的两相系统进行催化反应生产3，6-二氯吡啶-2-羧酸。水-水不溶性有机溶剂组成的两相反应系统成功实现了反应与分离的耦合，细胞富集于水相中，底物3，6-二氯-2-氰基吡啶位于有机相中，减少了对细胞的毒害；一部分产物以铵盐的形式直接进入水相，另一部分产物以游离3，6-二氯吡啶-2-羧酸的形式被萃取到有机相中，有效降低了高浓度产物对细胞的抑制作用。分离阶段先静置数小时将两相分离，上层有机相经碱液洗涤后以3，6-二氯吡啶-2-羧酸盐的形式进入水相，其余有机相及其中未反应完的残余3，6-二氯-2-氰基吡啶底物继续套用到下批反应系统中。下层水相及上层有机相的洗涤液合并后过滤掉细胞及其大颗粒状物质即为3，6-二氯吡啶-2-羧酸的盐溶液，酸化后结晶即可得高纯度的3，6-二氯吡啶-2-羧酸。

一种生物催化生产3，6-二氯吡啶-2-羧酸的方法，该方法以产腈水解酶活性细胞为生物催化剂，在水-水不溶性有机溶剂两相系统中，温度为15～35℃，搅拌转速为100～300rpm下反应24～72小时，将底物3，6-二氯-2-氰基吡啶水解为3，6-二氯吡啶-2-羧酸。

所述的底物3，6-二氯-2-氰基吡啶以0.1～30％(g/100ml有机相)的量溶于有机相，有机相的初始体积为水相的5～60％，随着反应的进行采用分批补加或流加的形式逐渐提高其体积比，使其最终所占体积比不超过反应液体积总和的70％，且催化系统最终反应液的体积不超过反应容器的75％。

所述的有机相溶剂选自水不溶性有机溶剂正己烷、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种以任意比例的混合物。

所述的水相部分为去离子水，控制pH5～9，加入生物催化剂，制备成催化剂浓度为5～25％(％：g/100mL)的水相混合液，其中该催化剂为具有腈水解酶活性的静息游离细胞、固定化细胞或絮凝化细胞液，优选枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)静息游离细胞、固定化细胞或絮凝化细胞液。

所述的反应结束后将反应液放出后静置分层，先将上层有机相和下层水相进行分离。采用少量多次的原则用氨水对上层有机相洗涤1～3次后静置分层，水相与反应液的下层水相合并；有机相继续套用到下批反应系统中。合并后的水相采用0.2～0.5um膜过滤，滤液用浓度为0.1～5mol/L的无机酸酸化处理至pH 3～6，之后于1～4℃静置2h以上，等晶体析出后冷冻离心，干燥即可得纯度在95％以上的3，6-二氯吡啶-2-羧酸晶体。

所述的无机酸为盐酸、硫酸或者磷酸中的一种或几种组成的混合液。

一株用于生物催化生产3，6-二氯吡啶-2-羧酸的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KR2，该细菌保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.3242。

枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)具有以下微生物学特征：

1.形态学特征

在固体平板培养基上培养48小时后出现圆形光滑的单菌落，灰白色，不透明，表面湿润，边缘光滑，整个菌落凸起，易挑取；镜检成杆状，大小长为(0.5～0.8um)×(1.5～2.5um)，芽孢中生。

2.培养学特征

表1枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)在3种培养基上的培养特征

3.生理生化特征

表2枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)生理生化性质

(注：表中“+”表示阳性，“-”表示阴性。)

枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的培养方法如下：

(1)种子液制备：先进行枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)斜面种子制备，将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)接种到灭过菌的斜面培养基上后在20～35℃下培养3～7天，刮取3～5环菌种接种到装有已灭菌的液体培养基的三角瓶中，在温度为20～35℃，转速为100～300rpm下振荡培养30～120小时，即可作为枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)的一级种子。同样培养条件下，将一级种子按3～10％(％：v/v)的接种量转接第二批装有同样培养基的三角瓶中，同样条件下培养30～72小时后作为枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)的二级种子。

(2)扩大培养：将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)二级种子以3～10％(％：v/v)的接种量接种到7～300L发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：装液量：60～70％(％：v/v)，通气量：0.1～1(v/v.min)，罐压：0.02～0.05MPa，温度：20～35℃，转速：100～400rpm，发酵时间：30～120小时。

所涉及的培养基成分如下：

斜面培养基(g/L)：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，琼脂：15～20，pH：5～9，121℃灭菌20min。

一级、二级液体种子培养基(g/L)：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，己内酰胺：0.5～10，异戊腈：0.1～5，氯化钴：5～50ppm，pH：5～9。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖：10～50，酵母膏：2～10，蛋白胨：2～10，氯化钠：1～5，磷酸二氢钾：0.5～3，磷酸氢二钾：0.5～3，硫酸镁：0.2～2，异戊腈：0.1～5，己内酰胺：0.5～10，氯化钴：5～50ppm，pH：5～9。

本发明的有益效果：

本发明采用生物催化法生产3，6-二氯吡啶-2-羧酸的工艺在国内外尚未见相关报道，为本发明首创。与化学水解法相比较而言，本发明反应条件温和，环境友好；水-有机相两相系统的采用使反应与分离实现耦合，细胞富集于水相中，底物3，6-二氯-2-氰基吡啶位于有机相中，减少了高浓度底物对细胞的毒害；一部分产物以铵盐的形式直接进入水相，另一部分产物以游离3，6-二氯吡啶-2-羧酸的形式被萃取到有机相中，有效降低了高浓度产物对细胞的抑制作用。本发明工艺最终所得产物纯度超过95％，收率在85％以上。同时，本发明还具有产物与底物易分离，收率高，工艺简单，易于大规模工业应用的优点。

涉及的生物材料样品的保藏

本发明所要求保护的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.3242，保藏日期为2009年8月19日。

具体实施方式

实施例1菌种筛选

本发明所涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KR2是本公司生物化工研究组成员从受腈类化合物污染达15年以上的的农药厂土壤中筛选得到。

本发明中菌种的筛选方法如下：

从南京第一农药厂污水池不同角度取污泥样100余批，分批富集培养后进行筛选和鉴定：

称取10克污泥，加无菌水50mL，用玻璃珠摇碎后取5mL悬浊液接种到45mL富集培养基中，放置30℃摇床上，120rpm振荡培养3天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀释液涂布到含初筛固体培养基的平板上，置30℃恒温培养箱培养3～6天。挑取生长出的单菌落接种到新的初筛固体培养基上扩大培养，培养条件同上。待菌长出后刮取3～5环接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上120rpm下振荡培养3天，取15mL培养液3000rpm下离心10min，倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体，继续离心得菌体。将所得菌体添加到含1％(％：g/100mL)亚氨基二乙腈的PBS缓冲液中转化2小时，反应体系中菌体浓度为0.5g/L。取5mL转化液3000rpm下离心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果转化液含有亚氨基二乙酸则说明该菌对亚氨基二乙腈具有转化能力，选择其中亚氨基二乙酸转化率最高的一株，按《简明伯杰细菌鉴定手册》第八版进行鉴定为枯草芽孢杆菌。将该株枯草芽孢杆菌命名为KR2，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC NO.3242，保藏日期为2009年8月19日。

本发明中的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)能同时在分别以丙烯腈、烟腈、乳腈、羟基乙腈，亚氨基二乙腈为唯一氮源的固体初筛培养基上生长，底物范围广，降解腈类化合物能力强，适合用于本发明中3，6-二氯吡啶-2-羧酸的生物催化合成。

筛选方法中的所述的液体富集培养基、固体初筛培养基、液体复筛培养基分别如下：

富集培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，pH：7。

固体初筛培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，亚氨基二乙腈(或丙烯腈、或烟腈、或乳腈、或羟基乙腈)：1，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁：0.05，琼脂：2，pH：7。

液体发酵培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，尿素：0.5，pH：7。

实施例2生物催化剂的制备

在无菌超净工作台内用接种环刮取枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)斜面菌种3环，接种到一级液体种子培养基中(葡萄糖：15，酵母膏：5，蛋白胨：5，氯化钠：2，磷酸二氢钾：1，磷酸氢二钾：1，硫酸镁：0.5，己内酰胺：5，异戊腈：1，氯化钴：10ppm，pH：7.0，单位：g/L)。在温度为25℃，转速为150rpm下振荡培养48小时即可得一级枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)种子液，将该一级种子液按照10％的接种量转接到装有同样成分已灭菌的培养基中继续进行培养，48小时后可得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)二级种子液。

将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC No.3242)二级种子液按照10％的接种量接种到35L已灭菌的液体发酵培养基中，(葡萄糖：30，酵母膏：10，蛋白胨：10，氯化钠：2，磷酸二氢钾：1，磷酸氢二钾：1，硫酸镁：0.5，己内酰胺：5，异戊腈：1，氯化钴：10ppm，pH：7，单位：g/L)，发酵罐体积为50L，采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于10％，通气量：0.2v/v.min，罐压：0.03MPa，温度：25℃，起始转速100rpm，发酵过程中根据发酵液的溶氧水平有步骤的调节，最大转速不超过400rpm，发酵72小时后即可制得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)细胞发酵液。

取枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)发酵液3000rpm离心10min得沉淀细胞，用等体积去离子水冲洗一遍后继续3000rpm离心10min，弃上清得沉淀湿菌体。

实施例3 3，6-二氯-2-氰基吡啶的制备

在50L搅拌釜中，采用水-乙酸乙酯组成的两相系统作为整个催化反应的介质。将3Kg的3，6-二氯-2-氰基吡啶溶解于15L乙酸乙酯中作为催化反应的上层有机相。在20L去离子水中添加1Kg枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)湿菌体做生物催化剂作为反应体系的下层水相。先将5L含有底物的乙酸乙酯有机相与20L含生物催化剂的水相混合，维持反应系统温度30℃，150rpm下搅拌开始反应。之后每隔8h添加5L上述溶解有3，6-二氯-2-氰基吡啶的乙酸乙酯溶液，共2次，反应30h后即可终止反应。

将反应液放出后静置3小时等待分层，分层后将上层有机相与下层水相分离。向15L左右的有机相中用浓氨水2.5L搅拌洗涤2次后合并到釜中反应的下层水相中。合并后的水相用0.2um膜过滤得清液25L。向25L清液中添加0.5mol/L的盐酸后搅拌30min，放置于4℃下冷冻3小时，等待晶体物析出后于3000rpm下冷冻离心15min得沉淀，真空干燥后得纯度为96.6％的3，6-二氯吡啶-2-羧酸2.95kg，产物收率达85.1％。

3，6-二氯吡啶-2-羧酸采用HPLC法进行检测，检测参数如下：色谱柱：VP-ODS柱，150mm×4.6mm I.D；流动相：乙腈/水/磷酸(30/70/0.5)；流速：1mL/min；柱温：室温；检测：UV 268nm。

实施例4

本实施例仅改变底物的添加量，底物3，6-二氯-2-氰基吡啶的添加量为1kg，其他反应参数和操作方法等均与实施例3保持一致，最终得到纯度为95.3％的3，6-二氯吡啶-2-羧酸1.02kg，产物收率达87.1％。

实施例5

本实施例中参与催化反应的生物催化剂以絮凝细胞液的形式存在，其生物催化剂的添加量、底物添加量、反应参数和操作方法等均与实施例3保持一致。

絮凝细胞的制备方法如下：

将1kg枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)湿细胞与20L去离子水混合均匀，制成浓度为50g/L的菌悬液，调pH为6，向20L菌悬液中添加10g壳聚糖，搅拌均匀后即得絮凝细胞液。该20L絮凝细胞液可作为该催化反应中的下层水相部分。

本实施例反应结束后最终得到纯度为98.5％的3，6-二氯吡啶-2-羧酸3.14kg，产物收率达92.4％。由此可见，该生物催化剂以絮凝细胞液的形式参与催化反应对产品的纯度和收率具有改善效果。

实施例6

本实施例仅改变生物催化剂的添加量，将实施例3中枯草芽孢杆菌KR2(CGMCC NO.3242)湿菌体的量由1kg调整为2.5kg，其他反应参数和操作方法等均与实施例3保持一致，反应22小时后即可得到纯度为96.7％的3，6-二氯吡啶-2-羧酸3.1kg，产物收率达89.5％。

实施例7

本实施例仅改变生物催化过程中的反应温度，将实施例3中的反应温度由30℃调整为15℃，其他反应参数和操作方法等均与实施例3保持一致，反应45小时后得到纯度为95.5％的3，6-二氯吡啶-2-羧酸3.05kg，产物收率达87.0％。

Claims

1.一种生物催化生产3，6-二氯吡啶-2-羧酸的方法，其特征在于以保藏号为CGMCC NO.3242的枯草芽孢杆菌KR2为生物催化剂，在水-水不溶性有机溶剂组成的两相系统中，将底物3，6-二氯-2-氰基吡啶水解为3，6-二氯吡啶-2-羧酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的底物3，6-二氯-2-氰基吡啶在有机相中的浓度为0.1～30％，有机相的起始添加体积为水相的5～60％，采用分批补加或流加的形式逐渐提高其体积比，使其最终所占体积比不超过反应液总体积的70％，最终反应液总体积不超过反应容器的75％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的有机相溶剂选自水不溶性有机溶剂正己烷、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的水相为pH5～9的去离子水。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物催化剂添加到水相中，生物催化剂添加量为5～25％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的催化剂为保藏号为CGMCC NO.3242的枯草芽孢杆菌KR2静息游离细胞、保藏号为CGMCC NO.3242的枯草芽孢杆菌KR2固定化细胞或保藏号为CGMCC NO.3242的枯草芽孢杆菌KR2絮凝化细胞液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的催化反应的搅拌转速为100～300rpm，温度为15～35℃，反应时间为24～72小时。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的反应结束后将反应液放出后静置分层，分离水相和有机相，用氨水洗涤有机相1～3次后静置分层，有机相继续套用到下批反应系统中，氨水相与反应液的初始水相合并，合并后用0.2～0.5um膜过滤，再用浓度为0.1～5mol/L的无机酸酸化处理至pH3～6，于1～4℃静置2h以上，等晶体析出后冷冻离心、干燥即可得纯度在95％以上的3，6-二氯吡啶-2-羧酸晶体。