CN102286406A - 贪噬菌cgmcc4969及其在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了贪噬菌（Variovoraxboronicumulans）CGMCC4969生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺；该菌株产生的腈水合酶基因簇由具有序列表中SEQIDNo：1所示的DNA序列组成；由SEQIDNo：1序列组成的DNA重组于pET28a质粒上，并在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)菌株中诱导表达，含表达蛋白的大肠杆菌细胞和细胞提取液可将3-氰基吡啶生物转化为烟酰胺。

Description

贪噬菌CGMCC4969及其在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及贪噬菌V.boronicumulans CGMCC 4969 及其产生的腈水合酶基因簇应用于3-氰基吡啶生物转化为烟酰胺。 

背景技术

腈水合酶(nitrile hydratase，EC.4.2.1.84)(简写为NHase)催化腈化物水合生成相应的酰胺类化合物。来源于微生物的腈水合酶具有反应条件温和、产率高、副产物少、区域和立体选择性强等优点，已成功应用于医药、农药及其中间体、食品与饲料添加剂等精细化学品的生产，并显示出巨大发展潜力。 

目前报道的产生腈水合酶的微生物有：根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens d3、节杆菌Arthrobactersp. J-1、蜡状芽孢标杆菌Bacillus cereus、芽孢杆菌Bacillus sp. BR 449、史氏芽孢杆菌Bacillus smithii SC-J05-1、短杆菌Brevibacterium imperialis CBS 489-74、诺卡氏菌Nocardiasp. 108、绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis B23、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida、嗜热假诺卡氏菌Pseudonocardia thermophila JCM 3095、玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous J1、玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous R312、玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous LL 100-21、红平红球菌Rhodococcus erythropolis BL1、玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous A4、红球菌Rhodococcussp. AJ270、红球菌Rhodococcussp. SHZ-1、红球菌Rhodococcussp. ZJUT-N595、红球菌Rhodococcussp. N 774、高里假丝酵母Candida guilliermondii CCT 7207、著明假丝酵母Candida famata、黄隐球酵母Cryptococcus flavus UFMG-Y61（郑裕国等，腈转化酶在精细化学品生产中的应用，生物工程学报，2009，25 (12): 1795-1807）。对贪噬菌属Variovorax产生的腈水合酶而言，目前在Genbank数据库中有Lourenco等提交的224bp来源于Variovorax sp. DSM 11402的部分腈水合酶基因片段（genbank登录号：AJ577856）；来源于V. paradoxus EPS（Genbank登录号：NC_014931）和V. paradoxus S110（Genbank登录号：NC_012791）两个菌株的全基因组序列中的腈水合酶基因，然而上述腈水合酶基因均为生物信息学预测结果，未有实验证明其腈水合酶功能。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能产生腈水合酶的菌株及其在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用；以及从该菌株中克隆腈水合酶基因簇并在E. coli BL21（DE3）中诱导表达；重组表达菌株在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用。本发明的基本原理如图1所示。 

申请人筛选到一株命名为J1的菌株，该菌株可生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。从该菌株中克隆出完整的腈水合酶α和β亚基基因簇，其碱基由序列表中SEQ ID No：1组成。将由SEQ ID No：1组成的DNA重组于pET28a质粒上，重组质粒pET28a-NHase电转化至E. coli BL21（DE3）菌株中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，含表达腈水合酶的E. coli BL21（DE3）菌株可转化3-氰基吡啶生成烟酰胺，而不含腈水合酶基因的对照菌株不能转化3-氰基吡啶为烟酰胺。 

本发明所提供的菌株J1为一种贪噬菌V.boronicumulans，该菌株现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 4969 。 

本发明提供了V. boronicumulans CGMCC 4969菌株在生物转化3-氰基吡啶生成产物烟酰胺中的应用（如图2所示）。 

从V.boronicumulans CGMCC 4969菌株中克隆出的腈水合酶基因簇，其序列如SEQ ID No：1所示。该基因簇由1304个碱基组成，其中1-642位碱基编码腈水合酶α亚基基因，638-1304位碱基编码β亚基基因。 

上述所说的应用是将由SEQ ID No：1组成的DNA序列插入pET28a质粒上，得到重组质粒pET28a -NHase，pET28a-NHase质粒电转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)菌株中，经IPTG诱导，宿主菌表达腈水合酶（图3），然后利用含表达蛋白的E. coli BL21 (DE3)细胞或细胞提取液生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。 

本发明实验表明重组V. boronicumulans CGMCC 4969的腈水合酶基因簇的大肠杆菌细胞可将3-氰基吡啶生物转化为烟酰胺（如图4所示）；而不含重组腈水合酶的pET28a的E. coli BL21(DE3)不转化3-氰基吡啶（如图5所示）。 

附图说明

图1：微生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。 

图2：V. boronicumulans CGMCC 4969生物转化3-氰基吡啶的HPLC图。 

图3：E. coli BL21 (DE3) (pET28a-NHase)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。 

图4：E. coli BL21 (DE3) (pET28a-NHase)转化氰基吡啶生成烟酰胺的HPLC图。 

图5：E. coli BL21 (DE3) (pET28a)转化氰基吡啶的HPLC图。 

具体实施方式

实例一：可生物转化3-氰基吡啶为烟酰胺的菌株分离筛选、鉴定和生物学特性

1、菌株分离

从江苏省南京市仙林地区采集土壤，取1g土壤加入含5颗玻璃珠的19mL无菌水中，振荡5min，静置10min后，取1ml悬液加入19ml含1%3-氰基吡啶的矿物盐培养基中。矿物盐培养基的组成为： 1.36 g/L KH₂PO₄，2.13g/L Na₂HPO₄，0.5 g/L MgSO₄·7H₂O和10ml/L金属离子液，pH 7.5。金属离子液组成为：0.40 g/L CaCl₂·2H₂O, 0.30 g/L H₃BO₃, 0.04 g/L CuSO₄·5H₂O, 0.10 g/L KI, 0.20 g/L FeSO₄·7H₂O，0.40 g/L MnSO₄·7H₂O，0.20 g/L NaMoO₄·2H₂O和10.0 mL/L浓盐酸。样品于30℃、转速为220rpm的摇床中培养3天。取100μl样品稀释到10^-3-10^-5后，涂布LB培养基的平板。LB培养基组成为：蛋白胨10g/L；酵母膏5g/L；NaCl 10g/L；pH7.2。从LB平板挑取形态不同的单菌落划线至LB平板上，30℃培养1-2天后，再次进行菌种平板划线纯化。总共获得15株形态不同的细菌。

、菌株转化3-氰基吡啶为烟酰胺能力的测定

接种上述纯化菌种至LB液体培养基中，30℃培养24 h后离心收集细胞。细胞悬浮于含2.5%3-氰基吡啶的0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液中（pH 7.5），采用HPLC分析检测3-氰基吡啶的降解和烟酰胺的生成，同时以购于Sigma公司的3-氰基吡啶和烟酰胺标准品为对照。其中命名为J1的菌株具有较高的将3-氰基吡啶转化为烟酰胺的能力。转化48h后，剩余底物3-氰基吡啶的浓度为1.1g/L；产生烟酰胺的浓度为0.94 g/L。其他菌株没有3-氰基吡啶生物转化能力。

、J1菌株的鉴定及生物学特性

在LB固体培养基上，J1菌落呈米黄色、半透明、光滑、有粘液、凸起、边缘规整。革兰氏阴性。显微镜观察，J1菌体呈椭圆状，大小为0.5-0.7×1.3-1.5μm。无鞭毛，无芽孢。氧化酶和过氧化氢酶阳性。能利用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖，不能利用硝酸盐。

采用16S rDNA序列分析进行J1菌株的分子鉴定。从含LB固体培养基上用无菌牙签挑取j1单菌落接种于装有20mLLB液体培养基的100mL三角瓶中，于30℃、20rpm的摇床中培养16h。发酵液于13000rpm离心5min后收集菌体，采用TaKaRa公司的MiniBEST细菌基因组提取试剂盒提取J1菌株的基因组DNA。采用16S 核糖体DNA（rDNA）扩增通用引物K1和K2扩增j1菌株的16S rDNA基因。K1引物序列为：5′ -AACTGAAGAGTTTGATCC- 3′（SEQ ID No：2），K2引物序列为：5′ -TAGGTTACCTTGTTGTTACGACTT- 3′（SEQ ID No：3）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min后， 94℃变性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环，72℃延伸10min。所得序列由生工生物工程（上海）有限公司测序后，得到的部分16S rDNA序列（SEQ ID No：4）在美国国家生物技术信息中心的Genbank数据库中进行blast搜索。比对结果表明J1菌与贪噬属V. boronicumulans亲缘关系最近，相似性达到99%。因而J1菌株被鉴定为V. boronicumulans。J1菌株于2011年6月21日保藏于中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院研究所；菌株和分类命名为贪噬菌Variovoraxboronicumulans，保藏编号为CGMCC No.4969。 

实例二：V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶基因克隆

V. boronicumulans CGMCC 4969的基因组DNA的提取与实例一基因组DNA提取方法相同。

所涉及到的四种核苷酸分别为：三磷酸脱氧腺嘌呤核苷酸（简写为A）、三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸（记为T）、三磷酸脱氧鸟嘌呤（简写为G）、三磷酸脱氧胞嘧啶核苷酸（简写为C）。设计并合成腈水合酶基因的上游与下游引物。引物中R表示该位置的碱基为A或G，引物中S表示该位置的碱基为C或G，引物中Y表示该位置的碱基为C或T，引物中K表示该位置的碱基为G或T。 

首先采用简并引物克隆V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶α亚基基因片段。合成的引物NHCo-f序列为：5’- GTSGTGGCSARGGCCTGG -3’（ SEQ ID No：5），引物NHCo-r序列为：5’- GRKYGC CGATCATCGAGTC -3’ （SEQ ID No：6），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。合成引物用无菌水溶解至浓度为20μmol/L，备用。PCR扩增所用DNA聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均由宝生物工程（大连）有限公司购得。在一已灭菌的0.2mLPCR管中，依次加入10μL无菌水、2μL扩增缓冲液、2μL MgCl₂溶液，2μLdNTP、各0.4μL上游和下游引物、2μL步骤1制备的基因组DNA溶液、1μL 二甲基亚砜（DMSO）、0.2μL的Ex-taq DNA 聚合酶，总体积为20μL；将PCR管置于PCR仪中，条件设置为：升温至95℃，保持5min，接着按升温至95℃并保持30s、降温至63℃并保持40s、升温至72℃并保持50s的变化顺序循环30次，最后于72℃保持10min，结束扩增反应。PCR扩增产物采用pMD18-T载体试剂盒（TaKaRa公司）进行TA克隆后，送生工生物工程（上海）有限公司测序。PCR扩增出长度为421bp的DNA序列。该序列位于SEQ ID No：1序列中的184位碱基至604位碱基。 

采用简并引物进一步克隆V. boronicumulans CGMCC 4969基因组DNA上位于α亚基基因上游至β亚基基因下游保守序列之间的DNA片段，设计引物NHCo-f： 5’-GTCGTGGCGAGGGCCTGG-3’（SEQ ID No：7）和引物NHCo-β-r：5’-CTTGCCSYGCACRTAGCC-3’（ SEQ ID No：8）。从基因组DNA上PCR克隆目的DNA片段的步骤同上述方法，PCR反应体系（20μl）：10×Ex-taq 缓冲液2μl，dNTP混合液2μl，MgCl₂溶液2μl，引物各0.4μl，基因组DNA 2μl，Ex-taq聚合酶0.2μl，DMSO 1μl，加水至总体积20μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；65℃退火40s；72℃延伸1min；共30个循环；72℃ 10min。 PCR产物采用pMD18-T载体试剂盒（TaKaRa公司）进行TA克隆后，送生工生物工程（上海）有限公司测序。共测得927bp的DNA片段。该序列位于SEQ ID No：1序列中的184位碱基至1112位碱基。 

采用反向PCR法克隆α亚基基因的上游序列。选择PstI内切酶酶切基因组DNA，37℃孵育24h，用TaKaRa公司的T4连接酶对酶切产物进行连接环化,16℃孵育24h，以上述测得的927bp的DNA片段为模板，设计引物NHCO-αU-f：5′- CGGTGTAGCCCAGCGAGGCGAT -3′（ SEQ ID No：9）和引物NHCO-αU-r：5′- GACCTACACGAC GCATGCCGACCT -3′（ SEQ ID No：10）。反向PCR体系（20μl）：10×Ex-taq Buffer 2μl，dNTP Mix 2μl，MgCl₂溶液2μl，引物各0.4μl，模板（基因组经PstI酶切和环化后的产物）2μl，Ex-taq聚合酶 0.2μl，DMSO 1μl，加水至总体积20μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1.5min；65℃退火2min；72℃延伸4min；共30个循环；72℃ 10min。 PCR产物进行TA克隆、测序。获得1009 bp的DNA片段，其中包含了位于序列表SEQ ID No：1序列中的1位碱基至271位碱基。 

克隆β亚基基因下游序列。设计引物NHCO-βD-f：5’-CCGAGAACGTGCCCGCTGTGCT-3’（ SEQ ID No：11）和引物NHCO-βD-r：5’-CCGAGAACATCGACACCAAGGCCT-3’（ SEQ ID No：12）， PCR反应体系（20μl）：10×Ex-taq缓冲液 2μl，dNTP混合液 2μl，MgCl₂ 2μl，引物各0.4μl，基因组模板2μl，Ex-taq酶0.2μl，DMSO 1μl，加水至总体积20μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1.5min；65℃退火2min；72℃延伸4min；共30个循环；72℃ 10min。TA克隆测序，得到989 bp的碱基序列。其中包含了位于序列表SEQ ID No：1序列中的903位碱基至1304位碱基。 

将上述PCR获得的1009，927和989 bp的三段DNA序列进行拼接得到包括腈水合酶基因完整序列在内的序列2629 bp的DNA片段。将上述DNA片段序列进行开放阅读框（ORF）分析以及和V. paradoxus S110的腈水合酶基因进行比对。V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶α和β亚基编码基因组成的基因簇由序列表中的SEQ ID No：1组成。SEQ ID No：1序列由1304个碱基组成，其中位于1-642碱基编码腈水合酶α亚基基因，位于638-1304碱基编码腈水合酶β亚基基因。翻译后的α亚基基因编码213个氨基酸，β亚基基因编码221个氨基酸。 

实例三：腈水合酶基因的表达及含重组腈水合酶基因簇的E. coli用于3-氰基吡啶的生物转化

1、腈水合酶基因DNA片段连接至质粒pET28a

设计含EcoRI酶切位点的引物NHCo-E-f和含XhoI酶切位点的引物NHCo-E-r，引物NHCo-E-f的序列由28个核苷酸残基组成，依次为：5′- GGGGAATTCATGACCGGCCATGACCACT-3′（SEQ ID No：13）；引物NHCo-E-r的序列由27个核苷酸残基组成，依次为：5′-GGGCTCGAGTGCCGCG GGCTCCAGGTA-3′（SEQ ID No：14）。在一已灭菌的0.2mLPCR薄壁管中，依次加入10.8μL无菌水、2μL的扩增缓冲液、2μL的四种脱氧核苷酸、0.5μL的引物一、0.5μL的引物二、3μL的步骤1制备的基因组DNA溶液、1μL的DMSO、0.2μL的Angel DNA聚合酶，总体积为20μL；将PCR管置于PCR仪中，条件设置为：升温至95℃，保持5min，接着按升温至95℃并保持1 min、降温至55℃并保持1.5min、升温至72℃并保持3min的变化顺序循环35次，最后于72℃保持10min，结束扩增反应。

质粒pET28a、限制性核酸内切酶和相应缓冲液由宝生物工程（大连）有限公司购得。取24μL上述PCR产物和40μL pET28a质粒DNA分别进行酶切，酶切反应的体系组成分别为： 

PCR产物	24μL	pET28a质粒DNA	40μL
				EcoRI (15U/μL)	1.5μL	EcoRI (15U/μL)	2.5μL
XhoI  (10U/μL)	1.5μL	XhoI  (10U/μL)	2.5μL
				缓冲液(10×H Buffer)	3μL	缓冲液(10×H Buffer)	5μL
总体积	30μL	总体积	50μL

在37℃水浴锅中反应24 h，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到5.3 kb左右的酶切后pET28a质粒DNA片段以及约1.3Kb的酶切后PCR产物。用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶回收纯化DNA试剂盒纯化回收pET28a的DNA片段和酶切后的PCR产物。

将PCR产物和酶切后的pET28a质粒DNA片段进行连接。所用T4连接酶及相应缓冲液由宝生物工程（大连）有限公司购得。连接样品组成为： 

腈水合酶基因DNA片段	7.5μL
		PET28a质粒DNA片段(100ng/μL)	1μL
10×T4 连接酶缓冲液	1μL
		T4 连接酶	0.5μL
总体积	10μL

连接样品在16℃下反应20 h。

、制备大肠杆菌的感受态细胞（电转化感受态细胞制备法）

将E. coli BL21(DE3)划线于LB 固体培养基上，于37 °C 培养箱中培养。挑取单菌落，接种于含50 mL LB液体培养基的500 mL 锥形瓶中，37 ℃，220 rpm下振荡培养过夜。接种两份25 mL 的过夜培养物分别于装入500 mL预热LB液体培养基的2 L锥形瓶中，于37 ℃，220 rpm振荡培养，每隔20 min 测量波长为600nm的光密度值（OD₆₀₀）。当OD₆₀₀值达到0.4时，从摇床中取出摇瓶，迅速将培养物置于冰上冷却20min，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却，同时将离心管置于冰上预冷。将培养液转移至冰冷的离心管中，在4℃、5000 g下离心15 min，菌体沉淀用5 mL灭菌的冰水重悬浮。加500 mL灭菌的冰水，混匀，重复离心一次，弃去上清液，用残余液体重悬浮细胞。用40 mL灭菌的、冰冷后的10 %甘油重悬浮细胞，4 ℃、5000 g 下离心15 min，弃去上清液。加入等体积冰浴过的10 %甘油，重新悬浮菌体，按50 μL 等份装入预冷的微量离心管中，于-80℃保存。

、含腈水合酶基因的pET28a质粒转化宿主菌E. coli BL21（DE3）

在冰上解冻上述感受态细胞E. coli BL21(DE3)和SOC培养基，并预冷电转化仪样品池。SOC培养基成份(g/L)为: 胰蛋白胨 20，酵母粉 5.0，氯化钠 5.0，氯化钾 0.186，氯化镁0.95，硫酸镁 1.2，葡萄糖 3.6， pH值7.0 。调节电击仪，使电脉冲为200 Ω, 25 μFd, 1.8千伏。将细菌与DNA 混合物(1 μL 连接产物+50 μL E. coli BL21（DE3）感受态细胞)加至冷的电击杯内，轻击液体以确保细菌与DNA 悬液位于电击杯底部。将电转化杯放入电击仪按上述测定的参数，启动对细胞的电脉冲。脉冲结束后，快速取出样品池，室温下加入1 mL SOC液体培养基。将细胞转至1.5 mL 离心管中，37 °C 220 rpm 下培养细胞1 h 以复原。将菌液涂布于含卡那霉素抗性（30μg/mL）的LB 平板。室温下待培养板中的液体被完全吸收后，将平板置于37 °C 培养箱培养16 h。随机挑取若干单菌落接入含卡那霉素抗性的LB液体培养基，以碱裂解法提取质粒DNA。上述收获的质粒DNA进行酶切验证，以EcoRI 和XhoI内切酶切开PCR产物，然后将酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果得到1.3和5.3Kb的条带，分别对应于上述PCR产物的长度和线性化pET28a质粒DNA的长度。表明重组质粒pET28a-NHase成功转化到E. coli BL21（DE3）。

、基因工程菌中腈水合酶的诱导表达

将上述获得的基因工程菌E. coli BL21（DE3）pET28a-NHase菌株接种于LB液体培养基中（加入终浓度为0.1 mmol/L的CoCl₂），37℃ 220rpm摇床培养过夜。转接2mL菌液至含30μg/mL卡那霉素的100mL LB培养基的500mL的摇瓶中，于37℃、220rpm摇床中培养至菌液的OD₆₀₀接近0.6时，加入0.1mmol/L的IPTG，20℃、220rpm诱导培养20h，离心收集菌体。将收集的菌体进行菌体总蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（图3）。泳道1和泳道2分别为E. coli BL21 (DE3)和E. coli BL21 (DE3)-pET28a对照组的菌体蛋白；泳道3为IPTG诱导E. coli BL21 (DE3)-pET28a-NHase的总蛋白；泳道4为标准分子量蛋白 (116.0, 66.2, 45.0, 35.0, 25.0, 18.4和14.4 Kd)。结果表明泳道3出现了非常明显的与预测表达蛋白分子量相一致的条带（图中箭头所指），而E. coli BL21（DE3）(泳道1)和E. coli BL21（DE3）pET28a（泳道2）对照组中未出现目的表达条带。因而含腈水合酶基因簇可在E. coli BL21（DE3）中诱导表达。

、基因工程菌生物转化3-氰基吡啶

上述腈水合酶基因簇表达菌株进一步用于检测3-氰基吡啶的生物转化。取上述步骤（4）中诱导表达的基因工程菌E. coli BL21 （DE3）pET28a-NHase菌液50mL于4℃、8000rpm 离心5min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L Na₂HPO₄/KH₂PO₄，pH7.5）洗涤菌体一次，再次收集菌体，用15 mL 1g/L的3-氰基吡啶溶液（用磷酸盐缓冲液配制）在50 mL的离心管中重悬菌体。37℃，220rpm摇床反应35min。利用安捷伦1200型高效液相色谱仪检测反应产物来测定基因工程菌催化3-氰基吡啶生成烟酰胺的活性，结果显示剩余底物3-氰基吡啶的浓度为59.9mg/L；产物烟酰胺浓度为1.12g/L(图4)；而未重组腈水合酶的pET28a空质粒的对照组不能将3-氰基吡啶生物转化为烟酰胺（图5）。

本发明还采用基因工程菌的细胞提取液转化3-氰基吡啶。取步骤（4）中诱导表达的基因工程菌E. coli BL21 （DE3）(pET28a-NHase)菌液50mL，4℃ 8000rpm 离心5min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液（Na₂HPO₄-KH₂PO₄，pH7.5）洗涤菌体一次，再次收集菌体，用7.5 mL磷酸盐缓冲液（Na₂HPO₄-KH₂PO₄，pH7.5）重悬菌体，超声破碎20min，4℃、8000rpm 离心20min，取上清，加入等体积的用磷酸盐缓冲液溶解的浓度为2g/L的3-氰基吡啶溶液（3-氰基吡啶终浓度为1g/L）。37℃ ，220rpm摇床反应10min。利用高效液相色谱仪检测反应产物来测定其催化3-氰基吡啶生成烟酰胺的活性，结果显示剩余底物3-氰基吡啶的浓度为120.4mg/L；产生烟酰胺的浓度为1.06g/L；而未重组腈水合酶的pET28a空质粒的对照组不能将3-氰基吡啶生物转化为烟酰胺。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京师范大学

 

<120>  贪噬菌CGMCC 4969及其在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用

 

<130> 

 

<160>  14   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1304

<212>  DNA

<213>  V. boronicumulans

 

<400>  1

atgaccggcc atgaccactc ccacgaccat tcccacgacc acagcagcga actcggcgag     60

 

atggacctgc gcgtgcgcgc cctcgaaagc gtgctcacgc aaaaaggcta catcgacccc    120

 

gccgcgctcg atgcgctgat cgacacctac cagacccgca tcggcccgcg caacggcgca    180

 

cgggtggtgg cgcgggcctg ggtcgaccag acgttccatg actggctgat ggcggatgcc    240

 

acggcggcca tcgcctcgct gggctacacc ggccgacaag gcgagcacat ggtcgcggtg    300

 

gccaataccg acgaccagca ccacatggtc gtctgcaccc tgtgcagctg ctacccctgg    360

 

cccgtgctcg gcctgccgcc cacctggtac aagagcgcgc cctaccgctc gcgcgccgtg    420

 

aaagacccgc gcggcgtgct ggccgatttc ggcaccacct tgcccgagac cacgcgcatc    480

 

cgcgtctggg actcgaccgc cgaagtgcgc tacctcgtga tcccgcagcg gcccgtcggc    540

 

accgagggct ggagcgaaga cgaactcgcc gcgctggtct cgcgcgattc gatgatcggc    600

 

acgcgcgtgg tcgaggcgcc gtcggcaagg agcacgacat gacctacacg acgcatgccg    660

 

acctcggcgg acaacccggc ttcggccccg tcacgcccga acccgagggc gagctgttcc    720

 

atggcgcctg ggagccgcgc gcgctggcgc tcacgctggc catgggcgcc accggctcct    780

 

ggaacatcga caccagccgc gccgcgcgcg agacgctgcc cgattaccgc gacctgagct    840

 

actaccagat ctggctcggc gcgctggagc agctgatgct gcagcgcggc caggtcttcg    900

 

cggacgagat cgcgtccggg cagatgcacc atccggccgc gccggtcgcc cgcgtgctgc    960

 

aggccgagaa cgtgcccgct gtgctcgcca agggctccgg caccgagcgc cccgcatcgg   1020

 

cgcccgcgcg ctttgcggtc gggcaggccg tgcgcatgca cctcgggcgg gtcgaccacc   1080

 

acacgcgcct gccggcctat gtgcagggca agcgcggcac gatcgagcac atccatggcg   1140

 

cgcacgtgtt cgccgatgcg aatgcgcagg gcctcggcga gcagccgcaa tggctctaca   1200

 

ccgtggtctt cgacgaggcc gagctgtggg gcgagggcac gccgcgccag aacctcgcgg   1260

 

tatcggtcga tgcgtgggaa agctacctgg agcccgcggc atga                    1304

 

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

aactgaagag tttgatcctg gctc                                            24

 

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

taggttacct tgttacgact t                                               21

 

 

<210>  4

<211>  1447

<212>  DNA

<213>  V. boronicumulans

 

<400>  4

aaatttccct agcggctgcc ttacacatgc aagtcgaacg gcagcgcggg agcaatcctg     60

 

gcggcgagtg gcgaacgggt gagtaataca tcggaacgtg cccaatcgtg ggggataacg    120

 

cagcgaaagc tgtgctaata ccgcatacga tctacggatg aaagcagggg atcgcaagac    180

 

cttgcgcgaa tggagcggcc gatggcagat taggtagttg gtgaggtaaa ggctcaccaa    240

 

gccttcgatc tgtagctggt ctgagaggac gaccagccac actgggactg agacacggcc    300

 

cagactccta cgggaggcag cagtggggaa ttttggacaa tgggcgaaag cctgatccag    360

 

ccatgccgcg tgcaggatga aggccttcgg gttgtaaact gcttttgtac ggaacgaaac    420

 

ggtcttttct aatacagaag gctaatgacg gtaccgtaag aataagcacc ggctaactac    480

 

gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa    540

 

gcgtgcgcag gcggttatgt aagacagttg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc    600

 

atctgtgact gcatagctag agtacggtag agggggatgg aattccgcgt gtagcagtga    660

 

aatgcgtaga tatgcggagg aacaccgatg gcgaaggcaa tcccctggac ctgtactgac    720

 

gctcatgcac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgcccta    780

 

aacgatgtca actggttgtt gggtcttcac tgactcagta acgaagctaa cgcgtgaagt    840

 

tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca    900

 

caagcggtgg atgatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa aaaccttacc cacctttgac    960

 

atgtacggaa ttcgccagag atggcttagt gctcgaaaga gaaccgtaac acaggtgctg   1020

 

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc   1080

 

cttgtcatta gttgctacat tcagttgggc actctaatga gactgccggt gacaaaccgg   1140

 

aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttata ggtggggcta cacacgtcat   1200

 

acaatggctg gtacaaaggg ttgccaaccc gcgaggggga gctaatccca taaaaccagt   1260

 

cgtagtccgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagt cggaatcgct agtaatcgtg   1320

 

gatcagaatg tcacggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccatg   1380

 

ggagcgggtt ctgccagaag tagttagctt aaccgcaagg agggcgatac cacggcaggt   1440

 

tcgaggg                                                             1447

 

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gtsgtggcsa rggcctgg                                                   18

 

 

<210>  6

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

grkygccgat catcgagtc                                                  19

 

 

<210>  7

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

gtcgtggcga gggcctgg                                                   18

 

 

<210>  8

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

cttgccsygc acrtagcc                                                   18

 

 

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

cggtgtagcc cagcgaggcg at                                              22

 

 

<210>  10

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

gacctacacg acgcatgccg acct                                            24

 

 

<210>  11

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

ccgagaacgt gcccgctgtg ct                                              22

 

 

<210>  12

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

ccgagaacat cgacaccaag gcct                                            24

 

 

<210>  13

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

ggggaattca tgaccggcca tgaccact                                        28

 

 

<210>  14

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

gggctcgagt gccgcgggct ccaggta                                         27

 

 

Claims (4)

1.一种产生腈水合酶的菌株J1，其特征在于是贪噬菌V.boronicumulans，保藏编号为CGMCC 4969。

2.一种权利要求1所述菌株J1的腈水合酶基因簇，其特征在于具有SEQ ID No：1所示的DNA碱基序列；该基因簇由α亚基和β亚基的两个编码基因组成，其中1-642位碱基编码α亚基基因，638-1304位碱基编码β亚基基因。

3.权利要求1所述的菌株J1在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是将SEQ ID No：1所示序列的DNA片段重组于pET28a质粒上，并在大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)中诱导表达；然后利用重组E. coli BL21 (DE3)细胞或细胞提取液生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。

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