CN101942427B - 一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法 - Google Patents
一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法，涉及硫酸酯酶。提供一种烷基型硫酸酯酶SdsA及制备方法，以及烷基型硫酸酯酶基因sdsA。烷基型硫酸酯酶SdsA的生产菌株为假单胞菌株Pseudomonas sp.S9。制备时，克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，将烷基型硫酸酯酶基因sdsA插入表达载体，构建携带烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体；将烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取阳性克隆于培养基中培养；离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中，将裂解后的悬液离心，收集上清液，再与Ni-NTA Agarose混匀，纯化。
Description
技术领域
本发明涉及硫酸酯酶，特别涉及一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法。
背景技术
随着去污剂的滥用，废水严重影响了水生生物的生存环境，废水处理也逐渐成为当今社会亟待解决的问题之一。十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)作为一种表面活性剂，广泛应用于家用清洗剂以及工业生产中。废水中的SDS因其碳链过长而不易降解，对环境会造成一定的污染。对SDS进行生物降解的研究，在生物学、生态学和经济上都有重要意义。
烷基型硫酸酯酶(Alkylsulfatase)是硫酸酯酶(Sulfatases)(EC 3.1.6)中的一种，它能够水解硫酸酯键后释放无机硫酸根和相应的醇类。烷基型硫酸酯酶能够较好地降解表面活性剂，对废水中的表面活性剂成分进行有效的清除，即使针对不易分解的长链SDS也能发挥作用。因此，烷基型硫酸酯酶在废水处理中扮演了重要角色。
已发现的烷基型硫酸酯酶大多来源于革兰氏阴性菌中，研究最为透彻的是Pseudomonassp.strain C12B(＝NCIMB 11753＝ATCC 43648)和Comamonas terrigena NCIMB 8193。在Pseudomonas sp.strain C12B菌株中，研究者发现其具有5种不同的Alkylsulfatase(1.Bartholomew B，Dodgson KS，Gorham SD(1978)Purification and properties of the S1secondary alkylsulphohydrolase of the detergent-degrading microorganism，Pseudomonas C12B.Biochem J 169：659-667；2.Cloves JM，Dodgson KS，White GF，Fitzgerald JW(1980)Purificationand properties of the P2 primary alkylsulphohydrolase of the detergent-degrading bacteriumPseudomonas C12B.Biochem J 185(1)：23-31；3.Dodgson KS，Fitzgerald JW，Payne WJ(1974)Chemically defined inducers of alkylsulphatases present in Pseudomonas C12B.Biochem J138：53-62)；而在Comamonas terrigena NCIMB 8193中只有2种(4.Matcham GW，Dodgson KS(1977)Purification，properties and cellular localization of the stereospecific CS2 secondaryalkylsulphohydrolase ofComamonas terrigena.Biochem J167(3)：723-729.)。然而这两个菌株里的Alkylsulfatase并没有在外源得到表达，因此该酶无论是在酶量上、分离纯化方法上及其应用的广泛程度上都受到了限制。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种烷基型硫酸酯酶SdsA。
本发明的第二个目的是提供一种烷基型硫酸酯酶基因sdsA。
本发明的第三个目的是提供一种所述烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法。
所述烷基型硫酸酯酶命名为SdsA，所述烷基型硫酸酯酶SdsA的生产菌株为假单胞菌株Pseudomonas sp.S9，该菌株已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4026。
所述烷基型硫酸酯酶SdsA的氨基酸序列如下：
1 MKLNALSTAT HGSRSSPVKL WKFSTSFLLA ASIIVSGQSW AAETAKPATD ATKAANDALL
61 KELPFDDKTS FDLAHKGFIA PLPAEPIKGE KGNMIWDPSK YGFIKEGEAA PDTTNPSLWR
121 QSQLINISGL FEVTDGIYQV RNYDLSNMTI VEGKDGITIF DPLISQETAK AALDLYYKHR
181 PKKPVVAVIY THSHVDHYGG VRGVVDEADV KAGKVKIYAP LGFLEHAVAE NVMAGTAMSR
241 RASYMYGNLL PPDAKGQLGA GLGTTTSAGT VTLIPPTDII KETGETHVID GLTYEFMYAP
301 GSEAPAEMLY YIKEKKALNA AEDSTHTLHN TYSLRGAKIR DPLAWSKYLN EALKLWGDDV
361 QVMYAMHHWP VWGNKEVREQ LSLQRDMYRY INDETLRLAN KGYTMTEIAE QVKLPKKIAT
421 KFSNRGYYGS LNHNVKATYV LYLGWFIGNP ATLWELPPAD KAKRYVEMMG GADAVLKKAK
481 EYYDKGDFRW VAEVVNHVVF AEPNNQAAKN MQADALEQLG YQAESGPWRN FYLTGAQELR
541 NGVQQLPTPD TASPDTVKAM DLDLFFDFLA MRLKGPDVAD KHITLNLDFT DLKQKYTLEM
601 VNGVLNHTEG MQAKNADATV TLTRETLNNV MLKQTTLKDA ESSGDIKIEG DKGKLEELMS
661 YMDNFDFWFN IVTP
所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的序列如下：
1 ATGAAATTGA ATGCCCTATC GACCGCAACG CATGGGAGCC GGTCATCTCC AGTCAAATTA
61 TGGAAATTCA GCACTTCGTT TCTGCTTGCC GCATCCATCA TAGTATCTGG TCAAAGCTGG
121 GCTGCAGAAA CAGCTAAGCC TGCAACGGAT GCGACCAAAG CCGCTAACGA TGCTTTGCTC
181 AAAGAGCTGC CATTTGACGA CAAGACCTCC TTCGACTTAG CGCACAAAGG CTTTATTGCT
241 CCCCTGCCTG CAGAACCGAT CAAAGGCGAA AAGGGCAATA TGATCTGGGA CCCAAGCAAA
301 TATGGCTTTA TTAAAGAAGG TGAAGCCGCG CCGGACACGA CCAACCCAAG CTTGTGGCGC
361 CAATCTCAAC TAATCAATAT TTCTGGCCTG TTTGAAGTCA CCGACGGCAT TTACCAAGTC
421 CGCAACTATG ACTTGTCGAA CATGACCATC GTCGAAGGCA AAGATGGCAT CACCATATTC
481 GACCCACTGA TTTCACAAGA AACAGCGAAG GCAGCGCTCG ACCTGTACTA CAAACATCGG
541 CCGAAAAAAC CTGTGGTTGC AGTCATCTAC ACACACAGCC ACGTTGACCA CTACGGCGGC
601 GTGCGCGGTG TTGTCGATGA GGCAGATGTT AAGGCCGGCA AGGTTAAGAT CTACGCACCG
661 TTAGGTTTCC TTGAGCACGC CGTGGCCGAG AACGTTATGG CAGGTACTGC CATGAGCCGC
721 CGGGCCAGCT ATATGTACGG TAACCTGCTG CCGCCAGACG CCAAAGGGCA ATTAGGCGCT
781 GGTCTGGGTA CCACCACATC GGCAGGTACA GTAACGCTGA TTCCACCAAC CGACATCATC
841 AAAGAAACCG GTGAAACCCA CGTAATCGAC GGTCTCACTT ACGAGTTCAT GTATGCGCCT
901 GGCAGTGAAG CCCCGGCGGA GATGCTCTAC TACATCAAGG AGAAGAAAGC CCTTAACGCT
961 GCAGAAGACT CCACGCATAC GCTGCACAAT ACCTACTCGC TTCGTGGCGC CAAGATCCGT
1021 GACCCACTCG CTTGGTCGAA GTACCTCAAC GAAGCACTGA AACTCTGGGG TGATGACGTT
1081 CAAGTGATGT ATGCCATGCA CCACTGGCCG GTGTGGGGCA ACAAAGAAGT GCGCGAGCAG
1141 TTATCGCTAC AACGCGACAT GTACCGCTAC ATCAATGATG AAACCCTTCG CCTAGCGAAC
1201 AAGGGTTACA CCATGACCGA AATCGCGGAG CAGGTGAAAC TGCCAAAGAA AATTGCTACA
1261 AAATTCTCCA ACCGCGGTTA CTACGGCTCA CTGAATCACA ACGTCAAAGC CACTTATGTT
1321 CTGTATCTTG GCTGGTTCAT TGGCAACCCC GCCACATTGT GGGAGCTGCC ACCTGCAGAC
1381 AAGGCTAAGC GTTACGTTGA AATGATGGGT GGTGCTGACG CTGTGCTGAA AAAAGCCAAG
1441 GAGTATTACG ACAAAGGTGA TTTCCGCTGG GTAGCCGAGG TAGTCAACCA TGTGGTCTTT
1501 GCTGAACCGA ACAATCAAGC GGCAAAAAAT ATGCAAGCCG ACGCGCTGGA ACAGCTGGGT
1561 TATCAAGCTG AGAGCGGCCC ATGGCGCAAC TTCTACCTCA CAGGTGCGCA GGAACTTCGC
1621 AATGGCGTGC AACAACTTCC GACACCCGAT ACCGCAAGTC CTGACACCGT CAAGGCGATG
1681 GACTTGGATT TGTTCTTCGA CTTCCTGGCC ATGCGTTTGA AAGGGCCTGA TGTTGCCGAC
1741 AAGCACATCA CTCTCAACCT TGACTTTACC GATCTCAAAC AGAAGTACAC GCTCGAGATG
1801 GTAAACGGTG TGCTCAACCA CACCGAAGGC ATGCAAGCTA AGAACGCCGA CGCGACCGTC
1861 ACCTTAACGC GTGAAACCCT TAATAACGTG ATGCTAAAAC AGACCACGCT AAAAGATGCG
1921 GAAAGCTCAG GCGACATCAA AATCGAAGGT GACAAAGGCA AGCTCGAAGA GCTAATGAGC
1981 TACATGGATA ACTTCGACTT CTGGTTCAAC ATTGTGACGC CATAA
所述烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法包括以下步骤：
1)克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，将所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA插入表达载体，构建携带所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体；
2)将所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
3)离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬所述大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解，将裂解后的悬液进行离心，收集上清液；
4)将步骤3)所得上清液与Ni-NTA Agarose混匀，按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得所述烷基型硫酸酯酶SdsA。
在步骤1)中，所述表达载体可为pET-His载体。
在步骤2)中，所述培养基可为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，所述发酵培养的条件可为：温度为37℃，摇床培养至A600＝0.6时(A600为发酵液在600nm处的吸光度值)，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为50μmol/L，16℃诱导过夜。
在步骤3)中，所述裂解缓冲液的配方可为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/LNaH2PO4，去离子水定容至1L，pH 8.0。所述离心可为18000g，离心的时间可为20min。
本发明所述烷基型硫酸酯酶SdsA能够在大肠杆菌中稳定表达，并且纯化后的酶活力很高，热稳定性好，具备较广的pH耐受性，可以克服现有烷基型硫酸酯酶活力低下、酶分离纯化过程繁琐等不足，可广泛应用于降解SDS。
附图说明
图1为烷基型硫酸酯酶SdsA重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。在图1中，M为蛋白Marker，1为重组载体pET-SdsA在菌株BL21中的表达(未进行诱导)，2为重组载体pET-SdsA在菌株BL21中的诱导表达，3为经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白SdsA(70kDa)。
图2为烷基型硫酸酯酶SdsA重组蛋白的酶活性与pH值的关系。在图2中，横坐标为pH，纵坐标为酶活性(％)。
图3为烷基型硫酸酯酶SdsA重组蛋白的酶活性与反应温度的关系。在图3中，横坐标为温度(℃)，纵坐标为酶活性(％)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。
1.Pseudomonas sp.S9基因组DNA的提取
用接种环挑取-80℃保存的Pseudomonas sp.S9菌种，在LB培养基平板(一种细菌培养基，含有1％的胰蛋白胨，1％的氯化钠，0.5％的酵母提取物，1.5％的琼脂糖)上划线分离单菌落。划线后的平板置37℃培养过夜，挑取一个单菌落接种到5mL的LB培养液管中(一种细菌培养基，含有1％的胰蛋白胨，1％的氯化钠，0.5％的酵母提取物)，37℃摇动培养过夜，收集菌，6000g离心8min后弃去上清，沉淀重新悬浮于567μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，加30μL 10％SDS，摇匀，再加入3μL蛋白酶K(20mg/mL)，轻轻混匀，37℃水浴1h。加入100μL 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl (CTAB：十六烷基三乙基溴化铵)，轻柔混匀，65℃水浴10min。用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，15000g离心10min，上清小心转移至另一个离心管中。用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提一次，15000g离心10min，用异丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗涤两次，沉淀溶于重蒸水中，-20℃保存。
2.Pseudomonas sp.S9基因组文库的构建及产烷基型硫酸酯酶sdsA阳性克隆的筛选
用Sau3AI部分酶切Pseudomonas sp.S9总DNA，回收3～10kb的酶切片断。与pUC19/BamHI载体连接，电转化到大肠杆菌DH5α中。在含有0.1％SDS的LB/Amp+(Amp浓度为100μg/mL)平板上筛选能产生白色圈的阳性克隆子，挑选阳性克隆子进行测序。
3.烷基型硫酸酯酶sdsA基因的PCR扩增和序列分析
根据测序结果，在NCBI上比对序列，得到烷基型硫酸酯酶sdsA基因的全长序列(SEQID No.1)。根据筛库得到的脱硫酯酶结构基因序列(不含有信号肽)，设计引物：
F：5’ATAGGATCCGCAGAAACAGCTAAGCCT G-3’(划线为BamHI酶切位点)(SEQIDNo.3)；
R：5’AACGAA TTCTTA TGG CGT CAC AAT GTT G-3’(划线为EcoRI酶切位点)(SEQID No.4)。
以提取的Pseudomonas sp.S9基因组DNA为模板，用引物F和R扩增全长的sdsA基因。PCR反应条件为：在50μL的反应体系中含有，100ng模板，400nmo/L引物F，400nmo/L引物R，200μmo/L dNTP，2.5mmo/L Mg2+，5U Primer Star HSTaq酶(购自TaKaRa公司)，5L10×PCR反应缓冲液；反应条件：94℃5min；98℃10s、52℃45s、72℃2min(30cycles)；72℃10min；4℃保存。纯化后的PCR产物进行酶切，与同种酶酶切后的pET-His载体连接，CaCl2法转化到大肠杆菌Top10中，挑阳性克隆进行测序。
根据得到的核苷酸序列推导出烷基型硫酸酯酶SdsA的氨基酸序列，共675个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.2。
4.重组SdsA的表达和纯化
克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，将其插入表达载体pET-His中，构建携带烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体。将携带sdsA基因的重组表达载体pET-SdsA转化大肠杆菌BL21，选取阳性克隆在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇培至A600＝0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度50μmol/L，16℃诱导过夜后将菌液收集至200mL的离心管中，5000g离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的裂解缓冲液(裂解缓冲液配方为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)中，超声波处理至菌液成半透明，18000g离心20min，上清与预先用裂解缓冲液平衡的Ni-NTAAgarose混匀，4℃结合1h，纯化过程按照纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化的蛋白经8％的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为70kDa，纯度达95％以上(结果参见图1)
5.重组烷基型硫酸酯酶SdsA的酶学性质
5.1重组烷基型硫酸酯酶SdsA酶活力的测定方法如下：
10μL稀释纯化后的SdsA(150μg/mL)，加入到490μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)含0.01％(w/v)SDS中，70℃下反应5min后，取10μL反应液加入到200μL Stains-all(C30H27BrN2S2，Fluka)试剂中显色，438nm处测吸收值。酶活性定义为每分钟降解1μmol SDS的酶量为1U。通过酶活性检测，计算得到重组烷基型硫酸酯酶SdsA的酶活力为23U/mg。
5.2重组烷基型硫酸酯酶SdsA的最适pH测定方法如下：
经纯化的重组SdsA在不同的pH值下进行酶促反应以测定其最适pH。重组SdsA在不同pH的缓冲液中70℃温度下进行重组SdsA酶活力测定。结果表明(参见图2)，重组SdsA的最适pH为9.0，在pH6～11的范围内，酶活性都维持在最大酶活性的90％以上。
5.3重组烷基型硫酸酯酶SdsA的最适温度及温度稳定性测定方法如下：
重组SdsA的最适温度的测定为在Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)体系及不同温度下进行酶促反应。热稳定性测定为重组SdsA在60℃、65℃、70℃下分别处理不同时间，再在70℃下进行酶活性测定。酶促反应最适温度测定结果表明(参见图3)，其最适温度为70℃。酶的热稳定性试验表明，60℃处理1h后，剩余酶活还有95％以上；70℃处理1h后，酶活能维持在60％以上。
Claims (8)
1.一种烷基型硫酸酯酶SdsA，其特征在于所述烷基型硫酸酯酶SdsA的生产菌株为假单胞菌株(Pseudomonas sp.)S9，该菌株已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4026；
所述烷基型硫酸酯酶SdsA的氨基酸序列如下：
1 MKLNALSTAT HGSRSSPVKL WKFSTSFLLA ASIIVSGQSW AAETAKPATD ATKAANDALL
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661 YMDNFDFWFN IVTP。
2.一种烷基型硫酸酯酶基因sdsA，其特征在于所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的序列如下：
1 ATGAAATTGA ATGCCCTATC GACCGCAACG CATGGGAGCC GGTCATCTCC AGTCAAATTA
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1921 GAAAGCTCAG GCGACATCAA AATCGAAGGT GACAAAGGCA AGCTCGAAGA GCTAATGAGC
1981 TACATGGATA ACTTCGACTT CTGGTTCAAC ATTGTGACGC CATAA。
3.如权利要求1所述一种烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法，包括以下步骤：
1)克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，并将所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA插入表达载体，构建携带所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体；
2)将所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
3)离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬所述大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解，将裂解后的悬液进行离心，收集上清液；
4)将步骤3)所得上清液与Ni-NTA Agarose混匀，按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得所述烷基型硫酸酯酶SdsA。
4.如权利要求3所述一种烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表达载体为pET-His载体。
5.如权利要求3所述一种烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养基为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。
6.如权利要求3所述一种烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述发酵培养的条件为：温度为37℃，摇床培养至A600＝0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为50μmol/L，16℃诱导过夜。
7.如权利要求3所述一种烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述裂解缓冲液的配方为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4，去离子水定容至1L，pH8.0。
8.如权利要求3所述一种烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述离心为18000g，离心的时间为20min。
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| 吕吉祥 等.微生物中的烷基硫酸酯酶在生物转化中的应用研究进展.《化学工业与工程技术》.2007,第28卷(第4期),16-22. * |
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