DE10155764A1

DE10155764A1 - Neue Sulfatasen und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE10155764A1
Application number: DE2001155764
Authority: DE
Inventors: Kurt Faber; Mateja Pogorevc; Thomas Riermeier
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-11-14
Filing date: 2001-11-14
Publication date: 2003-05-28
Also published as: WO2003042378A1; EP1444336A1; CN1592783A; JP2005508654A

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Alkylsulfatasen aus Actinomyceten und deren Verwendung, insbesondere bei der katalytischen Umsetzung sekundärer Sulfatester.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Sulfatasen aus Actinomyceten und deren Verwendung, insbesondere zur katalytischen Umsetzung sekundärer Sulfatester.
Sulfatasen sind Enzyme, die eine hydrolytische Spaltung von Sulfatestern zu anorganischem Sulfat und den entsprechenden Alkoholen katalysieren.
Die enzymatische Hydrolyse von Sulfatestern verläuft dabei nach folgendem, allgemeinem Reaktionsschema:

R-O-SO₃ ^- + H₂O → R-OH + SO₄ ^2- + H⁺.
Inzwischen ist eine große Anzahl von Sulfatasen bekannt, die sich in Bezug auf ihre bevorzugten Substrate in Alkyl-, Aryl- und Kohlenhydratsulfatasen klassifizieren lassen. In höheren Organismen vermitteln Sulfatasen vor allem die Hydrolyse von Glycolipid-, Glycosaminoglycan- oder Steroid-Sulfatestern. Im Gegensatz dazu spielt in Bakterien die Assimilation von Schwefel aus der Umgebung und vermutlich die Bereitstellung energiespeichernder, schwefelhaltiger Verbindungen für das Zellwachstum eine bedeutende Rolle.
Die am besten charakterisierte Gruppe von Sulfatasen sind die stark konservierten Arylsulfatasen, die aromatische, insbesondere phenolische Substrate akzeptieren. Einige Arylsulfatasen, z. B. die aus humanen Zellen isolierbaren, setzen allerdings bevorzugt Kohlenhydrat-Sulfatester um. Charakteristisch für Arylsulfatasen ist eine Serin-Semialdehyd-Einheit, d. h. eine C_α-Formylglycin(Fglyc)-Einheit im aktiven Zentrum des Enzyms, die aus einem posttranslational modifizierten Cystein- oder Serinrest gebildet werden kann. Diese posttranslationale Modifikation ist essentiell für die biochemische Funktion des Enzyms. Bakterielle Arylsulfatasen gehören zu den sogenannten "sulfate starvation-induced proteins" (SSI-Poteine), die z. B. bei einer Kultivierung mit alternativen Schwefelquellen, wie Arylsulfonaten, Alkylsulfiden, Thioethern etc. gebildet werden können.
Bei weitem weniger gut charakterisiert ist die Klasse der Alkylsulfatasen, die die Hydrolyse organischer Sulfatester von primären und sekundären Alkoholen katalysiert. Dies ist um so erstaunlicher vor dem Hintergrund, dass jährlich große Mengen an Alkylsulfaten als Bestandteil von Haushaltserzeugnissen (z. B. Detergentien) in die Umwelt freigesetzt und von Mikroorganismen abgebaut werden (Y.-C. Hsu, "Nature", 200, 1091-1092 (1963); Williams, J., et al., "Appl. Microbiol.", 12, 360-362 (1964); White, G. F., et al., "Environ. Pollut. Ser. A.", 37, 1-11 (1985)).
Die Existenz von spezifischen Alkylsulfatasen wurde erstmals von Dodgson, K. S. et al, "Sulfatases of Microbial Origin", 2 Vols., CRC Press, Inc., Boca Raton (1982) in einem umfangreichen Review beschrieben.
Die bisher am besten charakterisierten Alkylsulfatasen stammen aus den Gram- negativen Bakterienstämmen Pseudomonas C12B (NCIMB 11753 = ATCC 43648) und Comamonas terrigena (NCIMB 8193) (Dodgson, K. S. et al. "Sulfatases of Microbial Origin", 2 Vols., CRC Press, Inc., Boca Raton (1982)). Pseudomonas C12B kann bis zu fünf unterschiedliche Alkylsulfatasen, je nach Kutivierungsbedingungen, die für die Hydrolyse von primären oder sekundären Alkylsulfatestern geeignet sind, exprimieren (Dodgson, K. S., et al. Biochem. J. 138, 53-62 (1974); Bartholomew, B., et al. Biochem. J. 169, 659-667 (1978); Cloves, J. M., et al., Biochem. J. 185, 13-21 (1980)). Demgegenüber besitzt Comamonas terrigena nur zwei sekundäre Alkylsulfatasen (Fitzgerald, J. W., et al., Biochem. J. 149, 477-480 (1975); Barrett, C. H., et al., Biochem. J., 191, 467-473 (1980); Matcham, G. W. J., et al., Biochem. J. 167, 723-729 (1977)).
Darüber hinaus konnte bisher auch in Pseudomonas putida FLA, Aerobacter cloacae (Payne, W. J., et al. Nature 214, 623-624 (1967)) und vermutlich auch in Pseudomonas B-2 (Lijmbach, G. W. M., et al., J. Microbiol. Serol. 39, 415 (1973)) eine Alkylsulfataseaktivität nachgewiesen werden. Weiterhin konnte in einer Mischkultur aus Mikroorganismen, die aus aktivem Schlamm isoliert wurde, eine Alkylsulfataseaktivität festgestellt werden (Vacium, L. et al., Res. Roum. Biochim. 2, 149 (1976)).
Bisher zeigten als einzige Gram-positive Bakterienstämme Bacillus cereus (Singh, K. L., et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 14, 777-779 (1998)) und Coryneform sp. B1a (Payne, W. J., et al., Appl. Microbiol. 13, 698 (1965)) eine primäre Alkylsulfataseaktivität.
Bisher konnten nur in Einzelfällen Alkylsulfatasen tatsächlich bis zur Homogenität gereinigt werden. Über deren Struktur, Substratspezifität oder deren Eigenschaften liegen demgegenüber bisher kaum Erkenntnisse vor. Aus diesen Gründen wurden bisher Alkylsulfatasen z. B. in der organischen Synthese nicht genutzt, obwohl gerade bei der enantioselektiven Herstellung von sekundären Alkoholen solche Enzyme wertvolle Werkzeuge z. B. bei der Racematspaltung sein könnten. Das technische Potential der Alkylsulfatasen ist daher kaum erschlossen.
Davon ausgehend ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Alkylsulfatasen bereitzustellen, die z. B. als enzymatische Werkzeuge bei der Alkylsulfatesterspaltung Anwendung finden können.
Die große Mehrzahl der auf Alkylsulfatasen getesteten pro- und eukaryontischen Mikroorganismen, die für einen ausgeprägten Sekundärstoffwechsel bekannt sind, zeigt allerdings keine Aktivität bezüglich der Hydrolyse von sekundären Alkylsulfatestern (Tabelle 1).
Überraschend hat sich demgegenüber gezeigt, dass ganz im Gegensatz zu anderen Gram-positiven Bakterien in Actinomyceten, insbesondere in Rhodococcen, sekundäre Alkylsulfatasen exprimiert werden. Weiterhin können diese sekundären Alkylsulfatasen bis zur Homogenität gereinigt werden, ohne dass die Enzyme ihre enzymatische Aktivität verlieren. Die so erhaltenen, sekundären Alkylsulfatasen aus Actinomyceten, bevorzugt aus Rhodococcus sp., sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Tabelle 1 Ergebnisse der Suche nach sekundären Alkylsulfatasen in Gram-positiven Bakterien und in Pilzen unter Verwendung von rac-2-Octylsulfat als Testsubstrat
Enzymatisch aktive, sekundäre Alkylsulfatasen lassen sich aus dem jeweiligen Actinomyceten-Stamm isolieren, indem die folgenden Reiningungsschritte vorgenommen werden:

a) Grobreinigung eines zellfreien Lysates mittels einer Phenyl-Sepharose-Säule mit einem fallenden, sulfatfreien Salzgradienten,
b) weitere Reinigung der erhaltenen Fraktionen, die eine enzymatische Alkylsulfataseaktivität zeigen, mit einem Ionenaustauscher-, vorzugsweise einem Anionenaustauscherharz,
c) die durch Ionenaustauschchromatographie erhaltenen Fraktionen, die eine enzymatische Alkylsulfataseaktivität zeigen, werden über eine Blue Sepharose- Säule geschickt und
d) anschließend wird das Enzym aus den resultierenden Fraktionen, die eine enzymatische Alkylsulfataseaktivität zeigen, mit der Superdex 200-Säule zur Homogenität gereinigt.

Dabei ist es vorteilhaft, das zellfreie Lysat vorab mit DEAE-, TEAE- oder Ecteola- Cellulose oder mit DEAE-Sephadex A-25 zur Abtrennung von nicht peptidischen Bestandteilen zu behandeln. Dabei werden sekundäre Alkylsulfatasen an den Carrier gebunden und mit einem salzhaltigen Puffer von diesem zur weiteren Reinigung gelöst.
Ein Reinigungsschema, das sich im besonderen zur Isolierung von sekundären Alkylsulfatasen aus Rhodococcen bewährt hat, umfasst folgende Verfahrensschritte:

a) Behandlung eines Zelllysats eines Actinomycetenstammes mit DEAE- Cellulose im Batch-Verfahren zur Abtrennung von Carotinoiden, Lipiden etc.,
b) Elution des Enzyms mit einer Lösung aus 10 mM Tris/HCl und 0,5 M NaCl,
c) Zugabe von NaCl zum Eluat bis zu einer Endkonzentration 4 M NaCl und säulenchromatographische Reinigung der resultierenden Lösung über eine Phenyl-Sepharose-Säule, equilibriert mit einem 10-mM-Tris/HCl-Puffer, enthaltend 4 M NaCl, pH 7,5 (Puffer B), wobei zur Eluierung des Enzyms ein stufenweiser NaCl-Gradient von 4 M bis 0 M genutzt wird. Danach erfolgt zur weiteren Reinigung eine
d) Dialyse enzymatisch aktiver Fraktionen gegen 10-mM-Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, gefolgt von einer
e) Ionenaustauschchromatographie mit einer Q6-Säule (BioRad), wobei die Säule mit einem 10-mM-Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 (Puffer A) equilibriert ist und zur Eluierung ein NaCl-Gradient von 0 M bis 1 M benutzt wird. Der Gradient kann z. B. durch schrittweise Zugabe von Puffer-Mischungen aus Puffer A und Puffer C (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 M NaCl) erfolgen. Die weitere Reinigung erfolgt durch
f) Auftragen der enzymatisch aktiven Fraktionen an eine Blue Sepharose-Säule (Pharmacia), wobei die enzymatisch aktiven Fraktionen in einem 10-mM- Piperazin-Puffer, pH 6,0 vorgelegt und eluiert werden. Die Säule wird anschließend zusätzlich mit einem Tris/Glycin-Puffer, pH 8,9 gewaschen.
g) Reinigung zur Homogenität an einer Superdex-200-Säule mit einem 50-mM- NaH₂PO₄-Puffer, pH 7,0 bei einer NaCl-Konzentration von 0,15 M.

Zur Bestimmung enzymatisch aktiver Fraktionen kann die enzymatische Hydrolyse von sekundären Alkylsulfatestern genutzt werden, wobei entweder die Menge an freigesetztem Sulfat oder an freigesetztem Alkohol als Maß für die enzymatische Aktivität der einzelnen Fraktionen bestimmt werden kann. Das erste Verfahren ist z. B. in Dodgson, K. S., "Biochem. J.", 78, 312-319, 1961; Tudball, N., et al. "Biochem. J.", 126, 187-191, 1972 zu finden.
Die so isolierten, erfindungsgemäßen, sekundären Alkylsulfatasen aus Actinomyceten weisen vorzugsweise in denaturierter Form ein Molekulargewicht zwischen 30 und 60 kDa und/oder im nativen Zustand ein Molekulargewicht zwischen 60 und 80 kDa auf. Besonders bevorzugt sind sekundäre Alkylsulfatasen mit einem Molekulargewicht zwischen 41 und 45 kDa im denaturierten Zustand und/oder zwischen 65 und 69 kDa im nativen Zustand. Die Bestimmung des Molekulargewichts im denaturierten Zustand erfolgt gelelektrophoretisch mit dem SDS-PAGE-Verfahren.
Mit dem beschriebenen Verfahren können z. B. sekundäre Alkylsulfatasen RS1 und RS2 aus Rhodococcus ruber DSM 44541 isoliert werden. Das Molekulargewicht der denaturierten, sekundären Alkylsulfatase RS2 wurde mit dem SDS-PAGE-Verfahren bestimmt und liegt bei 43,3 kDa. Dieses Enzym besitzt im nativen Zustand ein Molekulargewicht von 67 kDa, bestimmt durch Eluierung an Superdex 200, was auf das Vorliegen eines Dimeren Enzyms hindeuten könnte. Der isoelektrische Punkt des Enzyms RS2 liegt bei 5,1.
Zur weiteren Charakterisierung der sekundären Alkylsulfatase RS2 aus Rhodococcus ruber DSM 44541 wurde das Enzym massenspektrometrisch untersucht. Dabei konnten einzelne, charakteristische Peptidfragmente mit Hilfe der Elektrospray-Tandemmassenspektrometrie nachgewiesen werden. Dazu kann z. B. die gelelektrophoretisch aufgetrennte Sulfatasefraktion isoliert und mit Trypsin verdaut werden. Die erhaltene Peptidmischung wird mittels ES MS/MS analysiert. So können für die sekundäre Alkylsulfatase RS2 aus Rhodococcus ruber DSM 44541 folgende fünf Peptidfragmente nachgewiesen werden:

[L,I]TAT[L,I][L,I]NN[L,I]QMPPR: Seq ID No. 1 (Sequenzprot.: Sequenzen 1-16)
T[L,I]AEGGTAWESPR: Seq ID No. 2 (Sequenzprot.: Sequenzen 17/18)
PEAV[L,I]VSAAR: Seq ID No. 3 (Sequeznprot.: Sequenzen 19/20)
NP[L,I]FADAEAR: Seq ID No. 4 (Sequenzprot.: Sequenzen 21/22)
E[L,I]G[L,I]TP[L,I]AR ([L, I] = Leucin oder Isoleucin): Seq ID No. 5 (Sequenzprot.: Sequenzen 23-30)

wobei die Fragmente Seq ID No. 1 und 2 keine signifikante Homologie zu anderen Proteinen zeigen. Seq ID No. 3 und 5 ist homolog zu einer putativen Thiolase aus Streptomyces coelicolor A3(2); Seq ID No. 5 ist darüber hinaus homolog zu einem Thiolasesegment aus Mycobacterium tuberculosis; Seq ID No. 4 ist homolog zu einer putativen Acetyl-CoA-Acetyltransferase aus Streptomyces venezuelae. Somit sind ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sekundäre Alkylsulfatasen aus Actinomyceten, die mindestens einen Aminosäuresequenzbereich gemäß Seq ID No. 1 bis 5 enthalten.
Die erfindungsgemäßen, sekundären Alkylsulfatasen sind nicht nur enzymatisch aktiv isolierbar, sondern zeichnen sich weiterhin durch ihre gute Stabilität aus, wodurch sie für die Verwendung in der enzymatisch-organischen Hydrolyse von Sulfatestern geeignet sind. Mögliche Verwendungen sind hierbei etwa der Einsatz in Klärvorrichtungen und/oder der Abbau von Sulfatestern aus Waschmitteln. Die Alkylsulfatasen behalten z. B. ihre enzymatische Aktivität in Gegenwart organischer Lösemittel, in einem weiten pH-Wert- und Temperaturbereich. Bevorzugt ist ein pH- Wertbereich zwischen pH 5,5 und pH 10 und eine Reaktionstemperatur unter 40°C.
Darüber hinaus ist der Einfluss vieler Detergenzien, Zucker und Polyalkohole auf die Aktivität der Enzyme gering. Auch der Einfluss der meisten Salze zeigt keinen starken Einfluss auf die Hydrolyseaktivität der getesteten Alkylsulfatasen. Einige dieser Additive zeigen hingegen einen positiven Effekt auf Umsatz oder Enantioselektivität der enzymatischen Hydrolyse von Alkylsulfatestern.
Weiterhin können die Enzyme problemlos ionisch immobilisiert und dadurch aus dem Reaktionsansatz entfernt und wiederverwendet werden, ohne dass die Sulfatasen ihre enzymatische Aktivität verlieren. Zur Immobilisierung geeignet sind insbesondere anionische Ionenaustauschharze, wie z. B. DEAE-Cellulose, TEAE- Cellulose, Ecteola-Cellulose oder DEAE Sephadex A-25. Die Immobilisierung erfolgt besonders effizient bei einem pH-Wert von 7,5. Als Puffer kann z. B. 0,1 M Tris- Puffer verwendet werden.
Daraus ergibt sich ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, nämlich die Verwendung der beanspruchten, sekundären Alkylsulfatasen zur enzymatischen Hydrolyse von Alkylsulfatestern oder zur enzymatischen Herstellung von sekundären Alkoholen.
So können z. B. die sekundären Alkylsulfatasen RS1 und RS2 aus Rhodococcus ruber DSM 44541 zur Herstellung von sekundären Alkoholen genutzt werden. Es werden als Substrate bevorzugt sekundäre Alkylsulfatester umgesetzt, die eine Kohlenstoffkette von 7 bis 10 Kohlenstoffatomen enthalten. Besonders bevorzugt ist eine Kettenlänge von 8 Kohlenstoffatomen. Weiterhin sind Sulfatester bevorzugt, deren Sulfatesterbindung an Position 2, 3 oder 4 der veresterten, alkoholischen Kohlenstoffkette sitzt.
Bei Verwendung der sekundären Alkylsulfatase RS2 zur Hydrolyse von Sulfatestern wird bevorzugt in einem pH-Wertbereich zwischen pH 7,0 und pH 8,5 bei Temperaturen zwischen 15°C und 36°C, besonders bevorzugt zwischen 27°C und 32°C gearbeitet.
Weiterhin hat sich bei der Hydrolyse von Alkylsulfatestern mit den erfindungsgemäßen Sulfatasen die Umsetzung unter sulfatfreien Bedingungen bzw. bei sehr niedrigen Sulfatkonzentrationen als vorteilhaft erwiesen. Praktisch sulfatfreie Bedingungen lassen sich z. B. durch den Zusatz von Bariumionen zum Reaktionsansatz erzeugen.
Die sekundären Alkylsulfatasen sind weiterhin in der Lage, die Hydrolyse von sekundären Alkylsulfatestern enantioselektiv zu katalysieren. Die Enantioselektivität kann durch Zusatz weiterer Additive, wie z. B. Eisen-(II)- oder Eisen-(III)-Ionen in geringer Konzentration gesteigert werden. Dabei haben sich Konzentrationen zwischen 1 mM und 15 mM für Eisen-(II)-Ionen und zwischen 3 mM und 6 mM für Eisen-(III)-Ionen, insbesondere wenn sekundäre Alkylsulfatasen aus Rhodococcen eingesetzt werden, als bevorzugt erwiesen. Auch durch den Zusatz von Cetyltrimethylammoniumbromid (CMAB) kann die Enantioselektivität der Hydrolyse erheblich gesteigert werden.
Neben dem Einsatz von freien, sekundären Alkylsulfatasen im Reaktionsansatz können auch immobilisierte, sekundäre Alkylsulfatasen eingesetzt werden. Dazu können die erfindungsgemäßen Alkylsulfatasen z. B. an anionischen Trägermaterialien, wie z. B. DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex A-25, TEAE- Cellulose oder Ectoela-Cellulose, immobilisiert werden. Ein besonders geeigneter Träger ist dabei Ecteola-Cellulose, da daran immobilisierte Alkylsulfatasen eine erhöhte Enantioselektivität zeigen.
Sekundäre Alkylsulfatasen sind folglich besonders gut zur Herstellung von sekundären Alkoholen aus deren Sulfatestern geeignet. Von besonderem Interesse ist ein solches Verfahren bei der enantioselektiven Herstellung von chiralen, sekundären Alkoholen, z. B. bei der Racematspaltung.
Je nach Art des enzymatischen Angriffs kann dabei die Hydrolyse der Alkylsulfatester unter Retention oder Inversion der Konfiguration erfolgen. Die aus Rhodococcus ruber DSM 44541 isolierten, sekundären Alkylsulfatasen RS1 und RS2 hydrolysieren z. B. (R)-(-)-2-Octylsulfat stereoselektiv unter Inversion der Konfiguration zu (S)-(+)-2-Octanol.
Im folgenden werden einige Ausführungsbeispiele zur Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Beispiel 1

Kultivierung von Rhodococcus ruber

Die Kultivierung von Rhodococcus-ruber-Zellen des Stammes DSM 44541 erfolgt in einem Flüssigmedium aus 10 g/l, Glucose, 10 g/l, Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2 g/l NaCl, 1,5 g MgSO₄.7H₂O, 1,3 g/l, NaH₂PO₄ und 4,4 g/l, K₂HPO₄ unter aeroben Bedingungen. Die Kulturlösung wird in einem Kolben mit Schikanen bei 30°C und 130 rpm geschwenkt; das Zellwachstum wird durch die Messung der optischen Dichte bei einer Absorptionswellenlänge von 546 nm verfolgt.

Beispiel 2

Reinigung der sekundären Alkylsulfatasen

Zum Aufbruch der Zellen werden 47 g Zellpaste (Naßgewicht) von Rhodococcus ruber DSM 44541 in 120 ml Tris-Puffer (10 mM, pH 7,5) suspendiert. Zu dieser Suspension werden 120 ml Glas-Beads mit einem Durchmesser von ca. 0,35 mm zugegeben. Die Zellen der Suspension werden mit einer Vibrationszellmühle mit externer Eis/Wasser-Kühlung bei einer Temperatur von unter 4°C aufgebrochen. Der Zellaufbruch erfolgt dabei in 4 Zyklen aus einer zweiminütigen Vibrationsphase und anschließender, fünfminütiger Kühlung. Nach Filtration der Glas-Beads wird das Zelllysat bei 4°C und 38000 × g zwei Stunden zentrifugiert.
Das zentrifugierte Zelllysat wird mit DEAE-Cellulose im Batch-Verfahren zur Abtrennung von Carotinoiden, Lipiden, usw. behandelt, wobei die Alkylsulfatasen an den DEAE-Cellulose-Carrier gebunden werden. Die Elution der Alkylsulfatasen erfolgt mit einer Lösung aus 10 mM Tris/HCl und 0,5 M NaCl. Zu dem so präparierten Enzym-Rohextrakt wird unter Rühren und unter Eiskühlung so lange NaCl zugesetzt, bis die Endkonzentration von 4 M erreicht ist. Danach erfolgt eine säulenchromatographische Reinigung des Enzym-Rohextraktes über eine Phenyl- Sepharose-Säule (Pharmacia V = 20 ml), wobei die Säule mit 80 ml eines 10-mM- Tris/HCl-4-M-NaCl-Puffers, pH 7,5 (Puffer B) zuerst equilibriert wird. Die Eluierung erfolgt durch stufenweise Reduktion der NaCl-Konzentration. Dazu werden Mischungen des Puffers B mit einem Puffer A (10 mM Tris/HCl, pH 7,5) verwendet. Dabei können zwei sekundäre Alkylsulfatasen aus Rhodococcus ruber DSM 44541 (RS1 und RS2) nachgewiesen werden; die Sulfatase RS1 wird bei einer NaCl- Konzentration von 1 M eluiert (25% Puffer B, 75% Puffer A); die lipophilere Sulfatase RS2 wird bei einer NaCl-Konzentration von 0 M eluiert (0% Puffer B, 100% Puffer A).
Nach der Dialyse der jeweiligen, erhaltenen Sulfatase-Fraktion gegen 10-mM- Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 werden die enzymatisch aktiven Fraktionen an einer Q6- Säule (BioRad, V = 6 ml), equilibriert mit einem 10-mM-Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, weiter gereinigt. Die Eluierung der Proteinbestandteile der eingesetzten Fraktion erfolgt mit einem 10-mM-Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, wobei ein stufenweiser NaCl- Gradient zwischen 0 M und 1 M NaCl verwendet wird. Die Desorption der sekundären Alkylsulfatasen RS1 und RS2 erfolgen bei einer NaCl-Konzentration zwischen 0,15 und 0,31 M. Die RS1 und RS2 enthaltenden Fraktionen werden anschließend in 10 mM Piperazin-Puffer, pH 6,0 auf eine Blue Sepharose-Säule (Pharmacia) aufgetragen. Unter den gegebenen Bedingungen bindet weder RS1 noch RS2 am Säulenmaterial und kann somit sofort gesammelt werden. Die Säule wird anschließend mit einem Tris/Glycin-Puffer, pH 8,9 ausgewaschen. Die erhaltenen, enzymatisch aktiven Fraktionen werden zu 1 ml aufkonzentriert (Centriplus 10, Amicon) und auf eine Superdex-200-Säule aufgebracht. Die Equilibrierung der Säule und die Eluierung der jeweiligen Sulfatase erfolgt mit einem 50-mM-NaH₂PO₄-0,15-M-NaCl-Puffer, pH 7,0.
Der Fortschritt der einzelnen Reinigungsschritte ist in Fig. 1 gezeigt. Fig. 1 zeigt eine SDS-PAGE-(12%ig)-Analyse der proteinhaltigen Probe:

Bahn A zeigt das Zell-Rohextrakt.
Bahn B zeigt die Probe nach der Behandlung mit DEAE-Cellulose.
Bahn C zeigt die Probe nach der Chromatographie an Phenyl-Sepharose.
Bahn D zeigt die Probe nach der Ionenaustauschchromatographie an Q6.
Bahn E zeigt die Probe nach der Chromatographie an Blue Sepharose.
Bahn F zeigt die Probe der gereinigten, sekundären Alkylsulfatase RS2 nach der Reinigung mit Superdex 200.
Bahn G zeigt Molekulargewichtsmarker.

Die Proben wurden mit Coomassie Brilliant Blue R gefärbt.

Beispiel 3

Assays zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität

a) Bestimmung der enzymatisch freigesetzten Menge an Sulfat-Ionen.
Zur Bestimmung der enzymatisch freigesetzten Sulfat-Ionen wird auf eine Methode von Dodgson, K. S. et al., Biochem. J., 78, 312-319, 1961 zurückgegriffen, die von Tudball, N. et al., Biochem. J., 126, 187-192, 1972 modifiziert wurde. Dabei werden 200 µl einer Alkylsulfatase-Lösung mit 200 µl einer 30-mM-3-Octylsulfatester-Lösung inkubiert. Es wird ein 0,1-M-Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 verwendet. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 30°C durchgeführt und nach 15 Minuten durch Zugabe von 15%iger Trichloressigsäure (w/v) abgebrochen. Nach kurzer Zentrifugation wird eine 200-µl-Probe der Reaktionslösung zur Sulfatbestimmung nach Tudball herangezogen.
Die Reaktionszeit wird auf 1 bis 2 Stunden verlängert, wenn 2-Octylsulfatester als Substrat zum Nachweis der enzymatischen Aktivität herangezogen wird.
b) Eine Enzymaktivitätseinheit (= Unit) wird als die Enzymmenge definiert, die 1 µmol SO₄ ^2--Ionen pro Minute freisetzt.
c) Bestimmung der enzymatisch freigesetzten Menge an Alkohol.
Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität werden 400 µl einer vollständig oder nicht vollständig aufgereinigten Enzymlösung, erhalten nach der Ionenaustauschchromatographie oder einer resuspendierten Lösung an lyophilisiertem Sulfatasepulver, erhalten nach der Chromatographie an Phenyl- Sepharose, in 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 mit 400 µl einer 30-mM-Substrat-Lösung im gleichen Puffer versetzt. Die Mischung wird abhängig vom Reaktionsverlauf zwischen 6 und 12 Stunden bei 24°C mit 130 rpm geschüttelt.

Beispiel 4

Bestimmung des Umsatzes

Ein 200-µl-Aliquot der Reaktionsmischung wird mit 200 µl Ethylacetat extrahiert. Nach 0,5 minütiger, gründlicher Durchmischung des Reaktionsansatzes und anschließender, fünfminütiger Zentrifugation der Mischung bei 13000 rpm wird eine 100-µl-Probe der organischen Phase des Überstandes mit 5 µl einer Stocklösung von Menthol in Ethanol (c = 15,4 mg/ml) versetzt, die als interner Standard dient. Der Umsatz wird mittels GC an achiralen Säulen bestimmt (HP 1301, 6% Cyanopropylphenylmethylpolysiloxan, 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm (Film) und HP-1, 30 m × 0,53 mm × 0,5 µm; N₂), wobei die Temperatur 2,5 Minuten bei 90°C gehalten wird, gefolgt von einer Temperatursteigerung auf 110°C mit einer Aufheizrate von 10°C/min. Das angegebene Temperaturprogramm ist abgestimmt auf die Messung von 2-, 3- und 4-Octanol.

Beispiel 5

Bestimmung des Enantiomerenüberschusses

Die Bestimmung des Enantiomerenüberschusses (ee) erfolgt an chiralen Chrompack- CP-7500-Säulen (Cyclodextrin-B-2, 25 m × 0,25 mm × 25 µm) und Chrompack Chirasil-Dex CB/G-PN (γ-Cyclodextrinpropionyl-Säule, 30 m × 0,32 mm) mit Wasserstoff als Trägergas. Die Identifizierung des (R)- oder (S)-Alkohols erfolgt durch Coinjektion eines entsprechenden chiralen Alkohols.

Derivatisierung von 2-Alkanolen

Zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses wird der Alkohol mit Triflouressigsäureanhydrid (TFA) derivatisiert. Dadurch wird eine verbesserte Separation der Enantiomere an der chiralen GC-Säule erreicht. Es werden dazu 400 µl der enzymatisch umgesetzten Reaktionsmischung mit 500 µl Dichlormethan extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach der Zugabe von 40 µl TFA wird die Lösung für 20 Minuten auf 60°C erhitzt. Nach Abkühlung der Lösung auf Raumtemperatur wird die Probe zweimal mit 0,5 ml 5%iger Natriumbicarbonat- Lösung extrahiert. Nach abschließender Trocknung der organischen Phase über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Probe gaschromatographisch analysiert.
Zur Vermeidung der Aufarbeitung des Natriumbicarbonatextraktes kann alternativ die Probe mit einer Lösung aus N-methyl-bis-trifluoracetamid in Dichlormethan (1 : 3 v/v) bei 40°C eine Stunde lang behandelt und anschließend direkt gaschromatographisch untersucht werden.
Ein weiteres alternatives Verfahren stellt die gaschromatographische Analyse der entsprechende Acetate dar. Dazu werden 400 µl der enzymatisch umgesetzten Reaktionslösung mit 400 µl Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach der Addition von 80 µl Acetanhydrid und cat. p-Dimethylaminopyridin wird die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wird die Lösung zweimal mit 0,5 ml Wasser extrahiert und anschließend wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und analysiert.
Zu beachten ist, dass die Trifluoracetate gegenüber den Acetatestern in umgekehrter Reihenfolge eluieren.

Beispiele 6

Enzymatische Hydrolyse von sekundären Alkylsulfatestern mit RS2

Die zu untersuchenden Substrate werden,wie in Beispiel 3 beschrieben,umgesetzt. Die Ergebnisse der Umsetzung sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Tabelle 2 Substrattoleranz der sekundären Alkylsulfatase RS2 aus Rhodococcus ruber DSM 44541
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass die mit der beschriebenen Methode isolierbaren,sekundären Alkylsulfatasen eine hohe Spezifität gegenüber potentiellen Substratenbesitzen. Im Falle der sekundären Alkylsulfatasen RS2 aus Rhodococcus ruber DSM 44541 sind geeignete Substrate lineare, aliphatische, sekundäre (C₇-C₁₀)- Alkylsulfatester ohne weitere Substituenten. Solche Ester werden mit guten Ausbeuten und mit guter Enantioselektivität umgesetzt.
RS1 zeigt eine ähnliche Substratspezifität wie RS2.

Beispiel 7

Einfluss von Salzen

Die Umsetzung folgt unter Zusatz des jeweils zu untersuchenden Additivs gemäß Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 bis 5 zusammengefasst.
Dabei stellt sich überraschend heraus, dass die Selektivität der erfindungsgemäßen, sekundären Alkylsulfatasen durch Zusatz von Eisenionen, bevorzugt durch Zusatz von Fe²⁺-Ionen gesteigert werden kann. So steigt z. B. die Enantioselektivität von RS2 gegenüber rac-3-Octylsulfat durch Zusatz von FeCl₂ von E = 4 auf E = 80 (Tabelle 3) und gegenüber rac-4-Octylsulfat von E = 1 auf E = 10 (Tabelle 4). Dies ist umso erstaunlicher, da weder der Zusatz von EDTA noch von Mercaptoethanol und Dithiothreithol einen Effekt auf die Aktivität der Alkylsulfatasen zeigt. Tabelle 3 Effekt der Zugabe von Salzen auf Ausbeute und Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung von rac-3-Octylsulfat mit RS2

Tabelle 4 Effekt der Zugabe von Salzen auf Ausbeute und Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung von rac-4-Octylsulfat mit RS2

Tabelle 5 Effekt der Zugabe von Salzen auf Ausbeute und Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung von rac-2-Octylsulfat mit RS2

Beispiel 8

Einfluss von Detergenzien

Die Umsetzung folgt unter Zusatz des jeweils zu untersuchenden Detergenz gemäß Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
Der Einfluss von Detergenzien auf die Aktivität der beanspruchten, sekundären Alkylsulfatasen ist je nach eingesetztem Detergenz unterschiedlich. Durch Zusatz von SDS oder Di-n-octylsulfosuccinat verlieren die Enzyme ihre Aktivität nahezu vollständig. Demgegenüber zeigen viele Detergenzien keinen oder nur einen geringen Einfluss auf den Umsatz, aber darüber hinaus besitzen einige Detergenzien sogar einen positiven Einfluss auf die Enantioselektivität der enzymatischen Reaktion (Tabelle 6). So kann z. B. eine Erhöhung der Enantioselektivität der Sulfatester-Hydrolyse durch den Zusatz von CMAB erreicht werden. Tabelle 6 Einfluß von Detergenzien auf den Umsatz und die Enantioselektivität von RS2 für das Substrat rac-3-Octylsulfat

Beispiel 9

Einfluss weiterer Additive

Die Umsetzung folgt unter Zusatz des jeweils zu untersuchenden Additivs gemäß Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Der Einfluss unterschiedlicher Zucker und Polyalkohole auf den Umsatz und die Enantioselektivität der enzymatischen Hydrolyse von sekundären Sulfatestern durch die erfindungsgemäßen, sekundären Alkylsulfatasen ist, mit wenigen Ausnahmen (wie z. B. CMAB), sehr gering (Tabelle 7 und 8). Tabelle 7 Einfluss von Zuckern und Polyalkoholen auf den Umsatz und die Enantioselektivität von RS2 für das Substrat rac-3-Octylsulfat

Tabelle 8 Effekt der Zugabe von weiteren Additiven auf Ausbeute und Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung von Octylsulfatestern mit RS2

Beispiel 10

Einfluss eines Trägers auf immobilisierte Enzyme

Eine Lösung einer Sulfatasepräparation (11 mg/ml) in 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 wird zu 100 mg eines Immobilisations-Trägers (DEAE-, TEAE-, Ecteola-Cellulose (Serva, Heidelberg), DEAE-Sephadex A-25) gegeben, der mit einem Puffer aus 0,1 M Tris/HCl, pH 7,5 vorher gewaschen wurde. Der Ansatz wird 5 Minuten vorsichtig vermischt und 30 Minuten bei 4°C stehen gelassen. Danach wird der Ansatz zentrifugiert; der Überstand wird entfernt, und der Immobilisationsträger wird kurz mit 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 gewaschen und auf Alkylsulfataseaktivität analog zu Beispiel 3 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Tabelle 9 Effekt der Zugabe von anionischen Carriern auf Ausbeute und Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung von rac-3-Octylsulfat mit RS2
Es kann folglich gezeigt werden, dass Ecteola-Cellulose als anionisches Trägermaterial zur Immobilisierung von sekundären Alkylsulfatasen positiv auf Umsatz und insbesondere auf die Enantioselektivität der Hydrolyse von Alkylsulfatestern wirkt.

Beispiel 11

Einfluss von organischen Lösemitteln

Die Umsetzung von rac-2-Octylsulfat (5% (v/v)) erfolgt bei 30°C mit RS2 in unterschiedlichen organischen Lösemitteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 wiedergegeben. Tabelle 10 Ausbeute und Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung von rac-2-Octylsulfat (5% (v/v)) mit RS2 in unterschiedlichen organischen Lösemitteln
Es zeigt sich ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen, sekundären Alkylsulfatasen, nämlich deren Stabilität in Gegenwart von organischen Lösemitteln ohne größeren Aktivitätsverlust. Ein besonders geeignetes, organisches Lösemittel für enantioselektive Umsetzungen von sekundären Alkylsulfatestern stellt t-BuOH dar.

Beispiel 12

Zusatz von Bariumionen

Der Einfluß von Ba²⁺ auf die enzymatische Aktivität der sekundären Alkylsulfatase RS2 wurde unter Verwendung von 15 mM rac-2-Octylsulfatester als Substrat in 0,1 M Tris/HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 7,5 und einer Temperatur von 24°C bestimmt.
Fig. 2 zeigt den Umsatz an sekundärem Alkylsulfatester in Abhängigkeit der Reaktionszeit mit und ohne Zusatz von Bariumionen zum Reaktionsansatz.

Beispiel 13

Biochemische Charakterisierung der sekundären Alkylsulfatase RS2 aus Rhodococcus ruber DSM 44541

a) Bestimmung des Molekulargewichts

Das Molekulargewicht von RS2 wurde durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Eine Überprüfung des mittels SDS-PAGE ermittelten Molekulargewichts erfolgt anhand der Enzymgröße mit einer Superdex-200-Säule. Die Kalibrierung erfolgt mit Chymotrypsinogen A (25 kDa), Ovalbumin (43 kDa), BSA (67 kDa), Alkohol-Dehydrogenase (150 kDa) und Blue Dextran (2000 kDa) als Molekulargewichts-Standards.
Die Molekulargewichtsbestimmung unter denaturierenden Bedingungen mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ergab ein Molekulargewicht von 43,3 kDa für die sekundäre Alkylsulfatase RS2. Die Eluierung des gereinigten Enzyms über die Superdex 200 ergab ein Molekulargewicht von ca. 67 kDa, was auf eine nicht- globulare oder dimere Struktur des Enzyms hindeutet.

b) Bestimmung des Isoelektrischen Punktes (pI)

Der isoelektrische Punkt der sekundären Alkylsulfatase RS2 wurde mit Hilfe eines BioRad-IEF-Ready-Gel-Systems bei einem pH-Wert zwischen pH 3 und pH 10 bestimmt. Die pI-Bestimmung von RS2 ergab einen Wert von 5,1.

c) Bestimmung des pH-Optimums

Das pH-Optimum der Sulfatase RS2 wurde unter Verwendung von 15 mM rac-2- Octylsulfatester als Substrat in 100 mM Tris/Maleat-Puffer bei 24°C über einen pH- Bereich von 6,0 bis 9,0 bestimmt. Das Aktivitätsmaximum der sekundären Alkylsulfatase RS2 liegt bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 8,0.
Fig. 3 zeigt die enzymatische Aktivität der Sulfatase RS2 in Abhängigkeit vom pH- Wert.

d) Bestimmung des Temperatur-Optimums

Der Einfluß der Temperatur auf die enzymatische Aktivität der sekundären Alkylsulfatase RS2 wurde unter Verwendung von 15 mM rac-2-Octylsulfatester als Substrat in 100 mM Tris/Maleat-Puffer bei einem pH-Wert von 7,5 in einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C bestimmt. Die enzymatische Aktivität von RS2 gegenüber 2-Octylsulfat zeigt ein Optimum bei ca. 30°C.
Fig. 4 zeigt die enzymatische Aktivität der Sulfatase RS2 in Abhängigkeit der Temperatur.

Beispiel 14

Substratsynthese, allgemeine Verfahrensvorschrift

Natrium-sec-(±)-alkylsulfate werden durch Sulfatation der korrespondierenden, sekundären Alkohole unter Zugabe von Triethylamin-SO₃-Komplexen in Anlehnung der Synthesevorschriften, wie sie in White, G. F. et al., "Biochem. J.", 187, 191, 1980 beschrieben sind hergestellt. Dabei werden 0,132 g Natriumhydrid (5,52 mmol, 60%ige Dispersion in Mineralöl, gewaschen mit Petrolether) unter Argonatmosphäre in 2 ml Dioxan suspendiert. Zu dieser Suspension werden 2,48 mmol des sekundären Alkohols durch ein Septum langsam zugetropft. Die Mischung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der Schwefeltrioxid-Triethylaminkomplex (0,5 g, 2,76 mmol) wird in 4 ml wasserfreiem Dioxan unter Erwärmung gelöst. Die erhaltene Lösung wird im Anschluss langsam zur Natriumalkoholat-Lösung tropfenweise zugegeben und über Nacht gerührt. Der Reaktionsabbruch erfolgt durch Zugabe von destilliertem Wasser. Danach wird die Lösung im Rotationsverdampfer vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in 15 ml destilliertem Wasser aufgenommen und 5 × mit 10 ml Ethylacetat extrahiert. Anschließend wird das Wasser durch Lyophilisation entfernt. Das resultierende Pulver wird in 30 ml Methanol aufgenommen und abfiltriert. Das Filtrat wird bei reduziertem Druck vom Lösemittel befreit.
1-Bromoctan-7-ol wird nach Yadav, J. S. et al., "Tedrahedron", 45, 6263-6270, 1989 synthetisch hergestellt und anschließend wie eben beschrieben sulfatiert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Sekundäre Alkylsulfatasen, erhältlich aus Actinomyceten.

2. Sulfatasen nach Anspruch 1, erhältlich aus Rhodococcus sp.

3. Sulfatasen nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich aus Rhodococcus ruber, Rhodococcus equi oder Rhodococcus sp. R 312.

4. Sulfatasen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfatasen im denaturierten Zustand ein Molekulargewicht zwischen 30 kDa und 60 kDa besitzen.

5. Sulfatasen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie im denaturierten Zustand ein Molekulargewicht von 41 bis 45 kDa besitzen.

6. Sulfatasen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfatasen im nativen Zustand ein Molekulargewicht zwischen 60 und 80 kDa besitzen.

7. Sulfatasen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfatasen mindestens einen Aminosäuresequenzbereich, ausgewählt aus der Gruppe Seq ID No. 1 bis 5, enthalten.

8. Verwendung von Sulfatasen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung von sekundären Alkoholen oder zum Abbau von Alkylsulfatestern.

9. Verwendung von Sulfatasen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur enantioselektiven Racematspaltung.

10. Verfahren zur Herstellung von sekundären Alkoholen, dadurch gekennzeichnet, dass sekundäre Alkylsulfatasen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur enzymatischen Hydrolyse eines Alkylsulfatesters herangezogen werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Eisen(II)- oder Eisen(III)-Salze und/oder CMAB dem Reaktionsansatz als Additiv zugesetzt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die sekundäre Alkylsulfatase an Ecteola-Cellulose immobilisert eingesetzt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Gegenwart eines organischen Lösemittels durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine sekundäre Alkylsulfatase nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Hydrolyse von sekundären (C₇-C₁₀)-Alkylsulfatestern verwendet wird.

15. Sekundäre Alkylsulfatasen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, erhältlich aus einem zellfreien Actinomyceten-Lysat durch:

a) Reinigung über eine Phenyl-Sepharose-Säule mit einem fallenden, sulfatfreien Salzgradienten und anschließender

b) chromatographischer Reinigung der erhaltenen Fraktionen, die eine enzymatische Alkylsulfataseaktivität zeigen, an einem Ionenaustauscher, wobei danach

c) die durch Ionenaustauschchromatographie erhaltenen Fraktionen, die eine enzymatische Alkylsulfataseaktivität zeigen, an Blue Sepharose chromatographiert werden und

d) die resultierenden Fraktionen, die eine enzymatische Alkylsulfataseaktivität zeigen, mit Superdex 200 filtriert werden.