DE3424440C2 - - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur asymmetrischen
Hydrolyse von racemischen Carbonsäureestern der
nachstehenden allgemeinen Strukturformel (I):
wobei
R₁ für eine C1-6-Alkylgruppe, für eine C7-18-Aralkylgruppe oder für eine C6-26-Arylgruppe steht; R₂ für eine C1-6-Alkylgruppe steht; R₃ für eine C1-6-Alkylgruppe steht; und n einen Wert von 1 oder 2 hat.
R₁ für eine C1-6-Alkylgruppe, für eine C7-18-Aralkylgruppe oder für eine C6-26-Arylgruppe steht; R₂ für eine C1-6-Alkylgruppe steht; R₃ für eine C1-6-Alkylgruppe steht; und n einen Wert von 1 oder 2 hat.
Optisch aktive Carbonsäuren der oben genannten allgemeinen
Strukturformel (I) und/oder deren Ester in Form der isolierten
optischen Antipoden werden als Zwischenprodukte für die
Synthese verschiedener physiologisch aktiver Materialien mit
optischer Aktivität eingesetzt.
Die bislang bekannt gewordenen Verfahren zur Herstellung der
optisch aktiven Carbonsäuren der oben angegebenen allgemeinen
Strukturformel (I) gehen von einem Carbonsäure-Racemat
aus, das nach in der organischen Chemie geläufigen Methoden
hergestellt wird. Daraufhin werden die gewünschten optisch
aktiven Carbonsäuren mittels verschiedener optisch aktiver
Trennmittel abgetrennt; d. h., ein optisch aktives Material
wird auf physikalisch-chemischem Wege von seinen Antipoden
getrennt (vgl. die offengelegten japanischen Patentanmeldungen
11 84 55/1980, 81 557/1981 und 18 85 63/1982, sowie
Europäische Patentschrift Nr. 88 33).
Im Hinblick auf die gewerblichen Anforderungen haben diese
Verfahren nicht immer befriedigt. Eine der wesentlichen
Schwierigkeiten besteht darin, daß eine große Menge teures
Trennmittel benötigt wird, wobei das Trennmittel häufig als
Verunreinigung im Produkt verbleibt. Weiterhin sind die
Trennschritte aufwendig.
Davon ausgehend besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
darin, ein einfacheres Verfahren zur asymmetrischen
Hydrolyse von racemischen Carbonsäureestern der oben angegebenen
allgemeinen Formel (I) bereitzustellen.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist ein Verfahren
zur asymmetrischen Hydrolyse von racemischen Carbonsäureestern,
wobei racemische Carbonsäureester der allgemeinen
Strukturformel (I)
wobei
R₁ für eine C1-6-Alkylgruppe, für eine C7-18-Aralkylgruppe oder für eine C6-26-Arylgruppe steht; R₂ für eine C1-6-Alkylgruppe steht; R₃ für eine C1-6-Alkylgruppe steht: n einen Wert von 1 oder 2 hat
R₁ für eine C1-6-Alkylgruppe, für eine C7-18-Aralkylgruppe oder für eine C6-26-Arylgruppe steht; R₂ für eine C1-6-Alkylgruppe steht; R₃ für eine C1-6-Alkylgruppe steht: n einen Wert von 1 oder 2 hat
mit einem enzymhaltigen Medium umgesetzt werden, das als
Enzyme Lipase, Esternase, α-Chymotrypsin und/oder Pancreatin
enthält; oder das Kulturbrühe, Zellen und/oder behandelte
Zellen von Mikroorganismen enthält, nämlich von Hefen der
Gattung Torulopsin oder Candida, oder von Pilzen der Gattung
Aspergillus, oder von Bakterien der Gattung Bacillus,
Pseudomonas, Alcaligenes oder Agrobacterium, oder von
Actinomyceten der Gattung Mycobacterium oder Norcardia und
die D- oder L-Form der Carbonsäure und/oder des Carbonsäureesters
gewonnen wird.
Zwar wird in einem Beitrag in J. C. S. Chem. Comm. 1981,
S. 185, die asymmetrische Hydrolyse von 3-Acetylthiocyclohepten
und 3-Acetoxycyclohepten mit mikrobieller Lipase
beschrieben, wobei gesagt wird, daß eine Lipase aus Candida
cyclindracea den Thioester stereoselektiver hydrolisiert, als
den Carbonsäureester analoger Struktur. Hieraus konnte jedoch
nicht geschlossen werden, daß Ester, die im Molekül
sowohl eine Thioestergruppe wie eine Carbonsäureestergruppe
enthalten, gezielt und in hoher Ausbeute mit mikrobiellem
Material asymmetrisch hydrolisierbar sind.
Dies war auch nach Kenntnis eines Beitrages in Agric. Biol.
Chem. 45, S. 1389-1392 (1981), nicht zu erwarten, welcher
die asymmetrische Hydrolyse von (±)-α-substituierten Carbonsäureestern
mit Mikroorganismen beschreibt. Dort wird lediglich
die asymmetrische Hydrolyse von verschiedenen Carbonsäureestern
mit mikrobiellem Material beschrieben. Esterverbindungen,
die sowohl eine Thioestergruppe wie eine
Carbonsäureestergruppe im Molekül enthalten, werden nicht
erwähnt.
In den oben bezeichneten Carbonsäureestern der allgemeinen
Strukturformel (I) haben die Substituenten nachstehende
Bedeutung:
R₁ steht für eine C1-6-Alkylgruppe, z. B. für die Methylgruppe
oder die Äthylgruppe; weiterhin für eine
C7-18-Aralkylgruppe, z. B. die Benzylgruppe; und schließlich
für eine C6-26-Arylgruppe, z. B. die Phenylgruppe.
R₂ und R₃ stehen je für eine C1-6-Alkylgruppe, z. B. die Methylgruppe oder die Äthylgruppe.
R₂ und R₃ stehen je für eine C1-6-Alkylgruppe, z. B. die Methylgruppe oder die Äthylgruppe.
Hinsichtlich der Carbonsäureester mit der allgemeinen Strukturformel
(I) können im Rahmen der vorliegenden Erfindung
beispielsweise die nachstehenden Verbindungen als Ausgangsmaterial
dienen:
S-Acetyl-b-mercapto-isobuttersäure-Methylester;
S-Acetyl-γ-mercapto-α-methyl-n-buttersäure-Methylester;
S-Phenylacetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester;
S-Benzoyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester;
und ähnliche Mercaptobuttersäureester.
S-Acetyl-b-mercapto-isobuttersäure-Methylester;
S-Acetyl-γ-mercapto-α-methyl-n-buttersäure-Methylester;
S-Phenylacetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester;
S-Benzoyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester;
und ähnliche Mercaptobuttersäureester.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die asymmetrische
Hydrolyse der oben bezeichneten Carbonsäureester u. a.
mit einer Gruppe von Enzymen, zu denen insbesondere Esterasen
und Lipasen gehören, ferner Proteasen, soweit sie die
genannten Ester zu hydrolisieren vermögen; zu geeigneten
Proteasen gehört beispielsweise α-Chymotripsin. Darüberhinaus
sind diese Ester-hydrolisierenden Enzyme hinsichtlich
ihres Ursprunges, ihrer Reinheit und dgl. nicht weiter beschränkt;
beispielsweise können diese Enzyme aus Pflanzen
oder Tieren stammen, ferner aus Mikroorganismenzellen, aus
zerkleinerten Zellen und aus Zellextrakten.
Als Mikroorganismen, welche solche Enzyme zu produzieren
vermögen, seien beispielsweise Mikroorganismen genannt, die
zur Gattung Agrobacterium, Aspergillus, Nocardia, Candida,
Torulopsis, Bacillus, Alcaligenes, Pseudomonas, Mycobacterium
und zu ähnlichen Gattungen gehören.
Als Beispiele für aus solchen Mikroorganismen stammende und
handelsüblich zugängliche Enzyme seien beispielsweise genannt:
Lipase AP, aus Aspergillus;
Lipase aus Candida.
Lipase AP, aus Aspergillus;
Lipase aus Candida.
Als weitere geeignete, aus tierischem Gewebe gewonnene
Enzyme seien beispielsweise Esterase aus Schweineleber,
α-Chymotrypsin und Pancreatin aus Pancreasegewebe genannt.
Hinsichtlich geeigneter, oben lediglich gattungsmäßig bezeichneter
Mikroorganismen, wird beispielsweise auf die
nachfolgenden Stämme verwiesen: Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas putida, Pseudomonas ovalis, Alcaligenes
faecalis, Nocardia erthropolis, Mycobacterium phlei und
Agrobacterium radiobacter.
(A) Für den Fall, daß eines der oben bezeichneten Enzyme
eingesetzt wird, kann die Reaktion in der Weise durchgeführt
werden, daß man einem Reaktionsmedium das Enzym
und den Ester zufügt. Als Reaktionsmedium kann beispielsweise
durch Ionenaustausch-Reaktion entsalztes
Wasser oder eine Pufferlösung dienen, welche organische
Salze wie etwa Natriumphosphat und/oder organische Salze
wie etwa Natriumacetat enthält. Zur Erhöhung der Löslichkeit
des Esters in dem Reaktionsmedium kann diesem
ein organisches Lösungsmittel zugesetzt werden, wie beispielsweise
Methanol oder Aceton. Obwohl das Ester-hydrolisierende
Enzym zumeist so wie es vorliegt, eingesetzt
wird, könnte dieses Enzym auch in immobilisierter
Form eingesetzt werden. Die Konzentration des Esters im
Reaktionsmedium reicht vorzugsweise von 0,01 bis 50%.
Der Ester kann absatzweise, oder im Verlaufe der Reaktion
auch fortlaufend zugesetzt werden. Gerade im
letzteren Falle kann der Ester auch in Form eine wäßrigen
Suspension zugesetzt werden.
Der pH-Wert des Reaktionsmediums wird im Bereich von 2
bis 11, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 8 gehalten.
Sofern der pH-Wert des Reaktionsmediums aufgrund der mit
fortschreitender Reaktion erzeugten Carbonsäure absinkt,
kann vorzugsweise ein Neutralisierungsmittel zugesetzt
werden, um den pH-Wert im optimalen Bereich zu halten.
Die Reaktionstemperatur kann von 5 bis 50°C reichen. Die
Reaktionsdauer kann in geeigneter Weise eingestellt werden
und hängt vor allem von der Menge und der Aktivität
des eingesetzten Enzymes ab.
(B) Im Falle des Einsatzes von Mikroorganismen erfolgt die
Vermehrung dieser Mikroorganismen zumeist in einer Kulturflüssigkeit;
jedoch kann auch die Kultur auf festem
Nährboden vorgesehen werden. Zumeist wird ein Kulturmedium
verwendet, das die für das Wachstum und die Vermehrung
der Mikroorganismen notwendigen Komponenten enthält,
wie etwa Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen,
Vitamine und Mineralien. Um die Fähigkeit der
Mikroorganismen zur hydrolytischen Spaltung zu steigern,
kann dem Kulturmedium vorzugsweise eine kleine Menge
Ester zugesetzt werden. Die Kultivierung erfolgt bei
einer Temperatur von 10 bis 50°C und in einem pH-Bereich
von 2 bis 11, vorzugsweise in einem pH-Bereich von 5 bis
8. Die Kultur kann belüftet und/oder bewegt (gerührt oder
geschüttelt) werden, um das Wachstum der Mikroorganismen
zu fördern.
Zur Durchführung der Hydrolysereaktion kann der Ester
dem Kulturmedium zu Beginn oder im Verlauf der Züchtung
zugesetzt werden; weiterhin kann der Ester der Kulturflüssigkeit
zugesetzt werden, nachdem die darin vorher
gezüchteten Mikroorganismen daraus entfernt worden sind.
Weiterhin können Zellen der vermehrten Mikroorganismen
durch Zentrifugieren oder sonstige Maßnahmen abgetrennt
werden, und diese abgetrennten Zellen können dem, den
Ester enthaltenden Reaktionsmedium zugesetzt werden. In
diesem Falle können beispielsweise wegen der einfacheren
Handhabung getrocknete Zellen, lyophilisierte Zellen,
sprühgetrocknete Zellen, mit einem organischen Lösungsmittel
wie etwa Aceton oder Toluol behandelte Zellen,
anderweitig behandelte, etwa zerkleinerte Zellen oder
Zellextrakte verwendet werden.
Der pH-Wert des Reaktionsmediums hängt von der zu erzeugenden
Carbonsäure und weiteren Umständen ab und kann
mit fortschreitender Reaktion wegen der gebildeten Carbonsäure
absinken. In diesem Falle wird vorzugsweise
vorgesehen, den pH-Wert in einem optimalen Bereich zu
halten, was durch Zusatz eines geeigneten Neutralisierungsmittels
erfolgen kann. Die Esterkonzentration in
dem Reaktionsmedium beträgt vorzugsweise 0,01 bis
50 Gew.-%. Weiterhin wird vorzugsweise vorgesehen, die
Reaktion so lange fortzusetzen, bis entweder die D-Form
oder die L-Form des Esters vollständig hydrolisiert ist.
Die Abtrennung und Reinigung des Produktes aus dem Reaktionsmedium
kann nach bekannten Verfahren erfolgen; beispielsweise
kann Extraktion, Umkristallisieren und die Reinigung
mittels Säulenchromatographie vorgesehen werden.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung
der Erfindung. Sofern andere Angaben
fehlen, beziehen sich %-Angaben auf Gew.-%.
Zellen von Torulopsis gropengiesseri (Hinterlegungsbezeichnung:
IFO 0659) wurden in 100 ml Kulturflüssigkeit (pH 6,0)
überführt, die 1,0% Glukose, 0,3% Malzextrakt, 0,3%
Hefeextrakt und 0,5% Pepton enthält. Die Kultur wurde 2 Tage
lang bei 30°C geschüttelt. Nach Beendigung der Vermehrung
wurde die Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt.
Die zurückbleibenden Zellen (0,4 g, bezogen auf
Trockenbasis) wurden mit entsalztem Wasser gewaschen und
daraufhin wieder in 50 ml M/10 Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0)
suspendiert. Dieser Zellsuspension wurden 1,0 ml (±) S-Acetyl-
β-mercapto-isobuttersäure-Methylester zugesetzt. Zur Umsetzung
wurde das Reaktionsgemisch 24 h lang bei 30°C geschüttelt.
Daraufhin wurde der pH-Wert des Reaktionsmediums auf 7,0 eingestellt,
und der nicht-umgesetzte Anteil an S-Acetyl-b-mercapto-
isobuttersäure-Methylester durch Extraktion mit Äthylacetat
entfernt. Daraufhin wurde der pH-Wert der Wasserschicht durch
Zugabe von Schwefelsäure auf 2,0 abgesenkt. Die in der wäßrigen
Schicht enthaltene S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure
wurde mit Äthylacetat extrahiert. Aus dem erhaltenen Extrakt
wurde nach Trocknung mit wasserfreiem Natriumsulfat und Abdampfen
des Lösungsmittels 0,25 g öliges Material erhalten. Dieses ölige
Material wurde in Form einer Benzol-Lösung auf eine Silikatgel-
Säule gegeben, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus 10 Teilen
Benzol und 1 Teil Aceton eluiert. Der, die S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure
enthaltende Teil des Eluates wurde fraktioniert,
und nach Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem
Druck wurden 0,19 g gereinigte S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure
erhalten.
Die optische Drehung dieses gereinigten Materials wurde mittels
eines automatisch arbeitenden, digital anzeigenden Meßgerätes
zur Bestimmung der optischen Drehung
bestimmt. Die optische Drehung dieses gereinigten Materials wurde
bestimmt, und es ergab sich eine spezifische Drehung [α] = -45,0° (C = 1,1 Äthylacetat).
Zellen von Bacillus subtilis var niger (Hinterlegungsbezeichnung:
IFO 3108) wurden in 100 ml Kulturflüssigkeit (pH 7,0)
überführt, die 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton und 1,5%
Natriumchlorid enthielt. Die Kultur wurde 1 Tag lang bei 30°C
geschüttelt. Die Kulturflüssigkeit wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt, und die zurückbleibenden Zellen (0,3 g) wurden
analog zu Beispiel 1 gewaschen, mit S-Acetyl-β-mercapto-
isobuttersäure-Methylester umgesetzt, die gebildete S-Acetyl-
β-mercapto-isobuttersäure mit Äthylacetat extrahiert und
schließlich diese durch Säulenchromatographie gereinigt. Es
wurden 0,16 g S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure mit einer
spezifischen Drehung [α] = +42,8° (c = 1,4 Äthylacetat)
erhalten.
Zellen von Aspergillus sojae (Hinterlegungsbezeichnung:
IAM 2703) bzw. Zellen von Candida rugosa (Hinterlegungsbezeichnung:
IFO 0750) wurden in 100 ml Kulturflüssigkeit
der Zusammensetzung nach Beispiel 1 überführt. Die Kulturen
wurden 2 bis 3 Tage lang bei 30°C geschüttelt. Die vermehrten
Zellen wurden aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt, ausreichend
mit entsalztem Wasser gewaschen und daraufhin in 50 ml M/10
Phosphatpufferlösung suspendiert, welche 1,0 ml (±) S-Acetyl-
β-mercapto-isobuttersäure-Methylester enthielt. Daraufhin ließ
man 24 h lang bei 30°C reagieren. Nach Einstellung des pH-Wertes
der Reaktionsflüssigkeit auf 7,0, wurde der
S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester durch Extraktion
mit einem gleichen Volumen Äthylacetat entfernt; hierbei wurde
ein neutraler Extrakt erhalten. Daraufhin wurde der pH-Wert der
wäßrigen Schicht auf 2,0 abgesenkt, und die S-Acetyl-β-mercapto-
isobuttersäure mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert;
hierbei wurde ein saurer Extrakt erhalten.
Die spezifischen optischen Drehungen des neutralen und des
sauren Extraktes wurden mit dem oben bezeichneten Meßgerät
bestimmt; hierbei wurden die in der nachstehenden
Tabelle 1 angegebenen Werte erhalten. Aus diesen
Ergebnissen ist ersichtlich, daß man mit den angegebenen Stämmen optisch
aktive S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure herstellen kann, welche
entweder (+)- oder (-)-Drehung aufweisen; weiterhin fällt
S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester in Form des
optischen Anitpoden an.
Zellen der folgenden Stämme, nämlich Pseudomonas ovalis
(Hinterlegungsbezeichnung: IAM 1049), Pseudomonas fluorescens
(Hinterlegungsbezeichnung: IFO 3081), und Alcaligenes faecalis
(Hinterlegungsbezeichnung: IFO 13111) wurden in je 100 ml Kulturflüssigkeit
(pH 7,0) überführt, die 1,0% Fleischextrakt,
1,0% Pepton und 0,5% Natriumchlorid enthielt. Die Kulturen
wurden 1 Tag lang bei 30°C geschüttelt. Nach Abtrennung der
Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren wurden die verbleibenden
Zellen gesammelt und mit entsalztem Wasser gewaschen. Die
gewaschenen Zellen wurden in 50 ml M/10 Phosphatpuffer-Lösung
(pH 7,0) suspendiert. Den jeweiligen Zellsuspensionen wurde
je 1,0 ml (±) S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester
zugesetzt. Zur Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch 24 h
lang bei 30°C geschüttelt. Nach Abschluß der Umsetzung wurde
der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit auf 7,0 eingestellt, und
der S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester
durch Extraktion mit Äthylacetat entfernt. Daraufhin
wurde der pH-Wert der verbleibenden wäßrigen Schicht durch
Zugabe von Schwefelsäure auf 2,0 oder weniger abgesenkt, und
die S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure mit Äthylacetat extrahiert.
Nach Trocknung und Entfernung des Lösungsmittels wurde
aus dem Extrakt ein öliges Material isoliert. Dieses ölige
Material wurde in bezolischer Lösung auf eine Silikatgel-
Säule und
mit einem Lösungsmittelgemisch aus 4 Teilen Benzol und 1 Teil
Aceton eluiert. Der die S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure
enthaltende Teil des Eluates wurde fraktioniert, und nach Entfernung
des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde die
gereinigte S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure erhalten. Das
gereinigte Material wurde in Chloroform gelöst, und an dieser
Chloroformlösung die spezifische Drehung mittels des oben bezeichneten
Meßgerätes
bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in
der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.
Zellen von Pseudomonas putida (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 3738)
wurden in die gleiche Kulturflüssigkeit wie in Beispiel 5
angegeben, überführt. Weiterhin wurden Zellen von Nocardia
erythropolis (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 12538) und Zellen
von Mycobacterium phlei (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 13160)
in eine Kulturflüssigkeit (pH 7,2) überführt, die 1,0% Glukose,
0,2% Peptonextrakt und 0,1% Hefeextrakt enthält. Die
Kulturen wurden 1 bis 3 Tage lang bei 30°C geschüttelt. Daraufhin
wurden die Zellen aus jeder Kulturflüssigkeit abgetrennt.
Nachdem ausreichend mit entsalztem Wasser gewaschen
worden war, wurden die Zellen in je 50 ml M/10 Phosphatpuffer-
Lösung suspendiert, die 1,0 ml (±) S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-
Methylester enthält.
Daraufhin ließ man 24 h lang bei 30°C reagieren. Nachdem man
den pH-Wert der Reaktionslösung auf 7,0 eingestellt hatte,
wurde der S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester
mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert;
hierbei wurde ein neutraler Extrakt erhalten. Der pH-Wert des
wäßrigen Rückstandes wurde daraufhin auf 2,0 oder weniger abgesenkt,
und die S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure mit einem
gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert; hierbei wurde ein
saurer Extrakt erhalten.
Sowohl am neutralen wie am sauren Extrakt wurde die optische
Drehung bestimmt; die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle 3 aufgeführt. Aus diesen Ergebnissen folgt,
daß mit den genannten Stämmen optisch aktive S-Acetyl-β-mercapto-
isobuttersäure hergestellt werden kann, die entweder spezifische (+)- oder
(-)-Drehung aufweist; zurück bleibt
S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester in Form des
optischen Antipoden.
Zellen von Agrobacterium radiobacter (Hinterlegungsbezeichnung:
IFO 12607) wurden in 100 ml Kulturflüssigkeit (pH 7,2)
überführt, die 1,0% Fleischextrakt, 0,5% Natriumchlorid
und 1,0% Pepton enthält. Die Kultur wurde 1 Tag lang bei
30°C geschüttelt. Nach Abschluß der Vermehrung wurde die
Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Gesamtmenge
der zurückbleibenden Zellen wurde mit entsalztem
Wasser gewaschen, und die gewaschenen Zellen wurden erneut
in 50 ml M/10 Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) suspendiert.
Der erhaltenen Zellsuspension wurden 2,5 ml (±) S-Acetyl-
β-mercapto-isobuttersäure-Methylester zugesetzt. Zur Umsetzung
wurde das Reaktionsgemisch 48 h lang bei 30°C geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeitspanne waren 49% des S-Acetyl-β-
mercapto-isobuttersäure-Methylesters umgesetzt.
Nachdem der pH-Wert der Reaktionslösung auf
7,0 eingestellt worden war, wurde der S-Acetyl-β-mercapto-
isobuttersäure-Methylester mit Äthylacetat extrahiert. Daraufhin
wurde der pH-Wert der wäßrigen Schicht mit Schwefelsäure
auf 2,0 abgesenkt, und die S-Acetyl-b-mercapto-isobuttersäure
mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden mit wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel abgedampft.
Nach einer entsprechenden Reinigungsoperation
wurde die spezifische Drehung mit dem oben genannten Meßgerät
bestimmt.
Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle 4 aufgeführt.
Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß bei der Reaktion
sowohl die optisch aktive Carbonsäure, wie deren Ester in Form
des optischen Antipoden angefallen ist.
| Tabelle 4 | |
| Reaktionsprodukt | |
| X:20:D&/UDF | |
| S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester | |
| +50° (C = 1,20, CHCl₃) | |
| S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure | -48° (C = 1,15, CHCl₃) |
Zellen von Torulopsis gropengiesseri (Hinterlegungsbezeichnung:
IFO 0659) wurden in 2 l Kulturflüssigkeit (pH 6,0) überführt,
die 1,0% Glukose, 0,3% Malzextrakt, 0,3% Hefeextrakt
und 0,5% Pepton enthält. Die Zellenvermehrung erfolgte unter
Belüftung in einer Fermentiervorrichtung mit
kleinem Gefäß im Verlauf von 2 Tagen bei 30°C. Der pH-Wert
wurde stets bei 6,0 gehalten, was durch pH-Kontrolle sichergestellt
wurde. Nach Abschluß der Vermehrung wurde die Kulturflüssigkeit
durch Zentrifugieren abgetrennt.
Die zurückbleibenden Zellen (4,0 g auf Trockenbasis) wurden
mit entsalztem Wasser gewaschen, und die gewaschenen Zellen
wurden in 1800 ml entsalztem Wasser suspendiert. Der erhaltenen
Zellsuspension wurden 40 ml (±) S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-
Methylester zugesetzt. Zur Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch
30 h lang bei 30°C gerührt. Im Verlauf der Umsetzung
wurde der pH-Wert durch Zugabe von 10%iger NaOH-Lösung bei
7,0 gehalten. Nach Abschluß der Umsetzung wurde der in der
Reaktionslösung vorhandene S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-
Methylester mit Äthylacetat extrahiert.
Der erhaltene Extrakt wurde unter vermindertem Druck destilliert,
wobei 17,8 g gereinigter S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-
Methylester (Siedepunkt: 83 bis 85°C bei
4 bis 4,7 mbar (3 bis 3,5 mm Hg-Säule)).
Die spezifische optische
Drehung des gereinigten Materials wurde in Chloroform-Lösung
bestimmt; hierbei wurde eine spezifische Drehung [α] = +45,0°
(c = 2,0 Chloroform) erhalten.
Zellen von Bacillus subtilis var niger (Hinterlegungsbezeichnung:
IFO 3108) wurden in 2 l Kulturflüssigkeit (pH 7,0) übertragen,
die 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton und 0,5%
Natriumchlorid enthält. Die Vermehrung erfolgte unter Belüftung
mit einer Fermentiervorrichtung mit kleinem Gefäß 1 Tag
lang bei 30°C. Die Aufarbeitung erfolgte analog zum Verfahren
nach Beispiel 12. Aus 6,2 g gewaschenen Zellen wurden nach
der Umsetzung mit S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-Methylester
17,9 g gereinigter S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-
Methylester mit einer spezifischen Drehung [α] = -42,8°
(c = 1,4 CHCl₃) erhalten.
Zellen von Pseudomonas fluorescens (Hinterlegungsbezeichnung:
IFO 3081) wurden in 2 l der gleichen Kulturflüssigkeit (pH 7,0)
übertragen, wie in Beispiel 13 verwendet. Die Vermehrung
erfolgte unter Belüftung in einer Fermentiervorrichtung mit
kleinem Gefäß in Verlauf von 1 Tag bei 25°C. Die Aufarbeitung
erfolgte entsprechend dem in Beispiel 12 angegebenen Verfahren.
Aus 4,2 g gewaschenen Zellen wurden nach Umsetzung mit S-Acetyl-
β-mercapto-isobuttersäure-Methylester aus dem resultierenden
Extrakt nach destillativer Aufarbeitung 19,1 g S-Acetyl-
β-mercapto-isobuttersäure-Methylester mit einer spezifischen
Drehung [α] = +46,2° (c = 4,21 CHCl₃) erhalten.
Zellen der in der nachstehenden Tabelle 5 angegebenen Stämme
wurden in die gleiche Kulturflüssigkeit übertragen, wie in
den Beispielen 12 oder 13 verwendet. Zur Vermehrung wurde 1
bis 3 Tage lang bei 30°C geschüttelt. Daraufhin wurden die
Zellen von der Kulturflüssigkeit getrennt. Nachdem die Zellen
ausreichend mit entsalztem Wasser gewaschen worden waren,
wurden die Zellen in 500 ml M/2 Phosphatpuffer-Lösung suspendiert,
die 10 ml (±) S-Acetyl-β-mercapto-isobuttersäure-
Methylester enthält. Zur Umsetzung wurde 24 h lang bei 30°C
gehalten. Nachdem der pH-Wert der Reaktionslösung auf 7,0
eingestellt worden war, wurde der vorhandene S-Acetyl-β-mercapto-
isobuttersäure-Methylester mit einem gleichen Volumen
Äthylacetat extrahiert.
Die spezifische optische Drehung des Produktes wurde bei
einer Wellenlänge von 589,3 mm mit dem oben genannten Meßgerät
bestimmt.
Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle 5 aufgeführt. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich,
daß die in Tabelle 5 genannten Stämme optisch aktiven S-Acetyl-
β-mercapto-isobuttersäure-Methylester erzeugen, der entweder
spezifische optische (+)- oder (-)-Drehung aufweist.
Claims (1)
- Ein Verfahren zur asymmetrischen Hydrolyse von racemischen Carbonsäureestern dadurch gekennzeichnet, daß racemische Carbonsäureester der allgemeinen Strukturformel (I): wobei
R₁ für eine C1-6-Alkylgruppe, eine C7-18-Aralkylgruppe oder eine C6-26-Arylgruppe steht; R₂ für eine C1-6-Alkylgruppe steht; R₃ für eine C1-6-Alkylgruppe steht: n einen Wert von 1 oder 2 hatmit einem enzymhaltigen Medium umgesetzt werden, das als Enzyme Lipase, Esterase, α-Chymotrypsin und/oder Pancreatin enthält; oder das Kulturbrühe, Zellen und/oder behandelte Zellen von Mikroorganismen enthält, nämlich von Hefen der Gattung Torulopsin oder Candida, oder von Pilzen der Gattung Aspergillus, oder von Bakterien der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes oder Agrobacterium, oder von Actinomyceten der Gattung Mycobacterium oder Norcardia und die D- oder L-Form der Carbonsäure und/oder des Carbonsäureesters gewonnen wird.
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