DE3424440A1

DE3424440A1 - Verfahren zur herstellung optisch aktiver carbonsaeuren und deren ester in form der optischen antipoden

Info

Publication number: DE3424440A1
Application number: DE19843424440
Authority: DE
Inventors: Yuri Hiroshima Kagawa; Ryozo Ohtake Hiroshima Numazawa; Hisao Hiroshima Onishi; Akihiro Ohtake Hiroshima Sakimae
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1983-07-04
Filing date: 1984-07-03
Publication date: 1985-01-17
Also published as: US4629701A; EP0130752B1; DE3424440C2; EP0130752A3; EP0130752A2

Description

KERN & BREHM

Albert-Rosshaupter-Strasse 65 ■ D 8000 München 70 · Telefon (089) 7605520 ■ Telex 5-212284 patsd Tetepramme Kernpatent München

MITSUBISHI RAYON COMPANY, LIMITED, 3. Juli 1984

3-19, Kyobashi 2-chome, Chuo-ku, MI-03

Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Carbonsäuren und deren Ester in Form der optischen Antipoden

Beschreibung;

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Carbonsäuren der nachstehenden allgemeinen Strukturformel (I):

R₁-COS- (CH₂) ^CH-COOH (I)

wöbe i

R, für eine Alkylgruppe, vorzugsweise für eine C, _g-Alkylgruppe, für eine Aralkylgruppe, vorzugsweise für eine C^_g-Aralkylgruppe oder für eine Arylgruppe, vorzugsweise eine C_g__2g-Arylgruppe steht; R₂ für eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine C^g gruppe steht;
η einen Wert von 1 oder 2 hat.

" " ' 342A4A0

Im einzelnen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der optisch aktiven Carbonsäuren der genannten allgemeinen Strukturformel (I) und/oder deren Ester in Form der optischen Antipoden.

Optisch aktive Carbonsäuren der oben genannten allgemeinen Strukturformel (I) und/oder deren Ester werden als Zwischenprodukte für die Synthese verschiedener physiologisch aktiver Materialien mit optischer Aktivität eingesetzt.

Die bislang bekannt gewordenen Verfahren zur Herstellung der optisch aktiven Carbonsäuren der oben angegebenen allgemeinen Strukturformel (I) gehen von einem Carbonsäure-Racemat aus, das nach in der organischen Chemie geläufigen Methoden hergestellt wird, und daraufhin werden die gewünschten optisch aktiven Carbonsäuren mittels verschiedener optisch aktiver Trennmittel abgetrennt; d.h., ein optisch aktives Material wird auf physikalisch-chemischem Wege von seinem Antipoden getrennt (vgl. die offengelegten japanischen Patentanmeldungen 11 84 55/1980, 81 557/1981 und 18 85 63/1982, sowie Europäische Patentschrift Nr. 88 (hervorgegangen aus der Europäischen Patentanmeldung 79 20 0477.2]

Im Hinblick auf die gewerblichen Anforderungen haben diese Verfahren nicht immer befriedigt. Eine der wesentlichen Schwierigkeiten besteht darin, daß eine große Menge teures Trennmittel benötigt wird, wobei das Trennmittel häufig als Verunreinigung im Produkt verbleibt. Weiterhin sind die Trennschritte aufwendig.

Davon ausgehend besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein einfacheres Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Carbonsäuren der nachstehenden allgemeinen Formel (I):

^R2
Γ
R₁-COS-(CH₉) -CH-COOH (I)

wobei

R, für eine Alkylygruppe, eine Aralky!gruppe, oder eine Arylgruppe steht;

R~ für eine Alkylgruppe steht; und η einen Wert von 1 oder 2 hat;

und/oder optisch aktiven Carbonsäureestern der nachstehenden allgemeinen Strukturformel (II):

R₁-COS-(CH₂J_n-CH-COO-R₃ (II)

wobei

^Rl^{f R}2 ^un(^ ⁿ ^^^e °k^en angegebene Bedeutung haben; und R₃ für eine Alkylgruppe steht;

anzugeben, das die Herstellung dieser Verbindungen mit hoher Ausbeute erlaubt.

Zur erfindungsgemäßen Lösung dieser Aufgabe dient ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 oder mit den Merkmalen des Patentanspruches 2. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Im einzelnen ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur asymmetrischen Hydrolyse von Carbonsäureestern mit der oben genannten, allgemeinen Strukturformel (II) entwickelt worden, wonach die optisch aktiven Carbonsäuren mit der oben bezeichneten allgemeinen Strukturformel (I) in hoher Ausbeute anfallen. Nach diesem Verfahren läßt man auf Carbonsäureestern der oben bezeichneten allgemeinen Strukturformel (II) ein Medium einwirken, das ein Enzym enthält, welches diese Ester asymmetrisch zu hydrolisieren vermag, um die genannten optisch aktiven Carbonsäuren der allgemeinen Struk-

- 8 turformel (I) zu erhalten.

Demzufolge betrifft ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Carbonsäuren (dieses Verfahren wird nachstehend kurz auch als erstes Verfahren bezeichnet) der nachstehenden allgemeinen Strukturformel (I):

R₁-COS-(CH₉) -CH-COOH (I)

wobei R, für eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine C, ,-Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe, vorzugsweise eine C,_,g-Aralkylgruppe oder eine Arylgruppe, vorzugsweise eine Cg_₉g-Arylgruppe steht; R₂ für eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine C, g-Alkylgruppe steht; und η einen Wert von 1 oder 2 hat;

wobei man auf einen Ester der nachstehenden allgemeinen Strukturformel (II):

R₉ I² R₁-COS-(CH₉) -CH-COO-R₇ (II)

wobei R,, R₉ und η die oben angegebene Bedeutung haben; und R₃ für eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine C, ,-Alkylgruppe steht;

ein Medium einwirken läßt, das ein Enzym enthält, welches die Esterbindung dieses Esters asymetrisch zu hydrolisieren vermag.

3-4 ZU

Ein zweiter Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein modifiziertes Verfahren (das nachstehend kurz als zweites Verfahren bezeichnet wird) wobei in einem Gemisch der D- und L-Formen der Carbonsäureester der oben angegebenen allgemeinen Strukturformel (II) lediglich entweder die D-Form oder die L-Form dieser Ester umgelagert wird. Bei dieser Umlagerung kann auch eine selektive asymmetrische Hydrolyse auftreten oder nicht auftreten. Nach diesem zweiten Verfahren kann entweder die D-Form oder die L-Form der Carbonsäureester der oben angegebenen allgemeinen Strukturformel (II) in hoher Ausbeute erhalten werden. Hierbei kann als Enzym-haltiges Medium ein Enzym eingesetzt werden, wie etwa Lipase oder Esterase oder ein Enzym eingesetzt werden, das aus Mikroorganismen, etwa Mikroorganismen der Gattung Aspergillus, Bacillus, Torulopsis oder Pseudomonas isoliert worden ist.

Nach diesem zweiten Verfahren wird entweder die D-Form oder die L-Form der Carbonsäureester der allgemeinen Strukturformel (II) erhalten, wenn man das besondere Medium einwirken läßt, das ein Enzym enthält, welches die Carbonsäureester der allgemeinen Strukturformel (II) umzulagern vermag. In diesem Falle werden zusätzlich die Antipoden und somit die optisch aktiven Carbonsäuren der allgemeinen Strukturformel (I) erhalten, wenn das im Medium enthaltene Enzym auch die Esterbindung asymmetrisch zu hydrolisieren vermag.

In den oben bezeichneten Carbonsäuren der allgemeinen Strukturformel (I) und den Carbonsäureestern der allgemeinen Strukturformel (II) haben die Substituenten nachstehende Bedeutung:

R, steht für eine Alkylgruppe, z.B. für die Methylgruppe, die Äthylgruppe und dgl.; weiterhin für eine Aralkylgruppe, z.B. die Benzylgruppe; und schließlich für eine Arylgruppe, z.B. die Pheny!gruppe.

- ίο -

R₂ und R₃ stehen für Alkylgruppen z.B. die Methylgruppe, die Äthylgruppe und dgl..

Hinsichtlich der Carbonsäureester mit der allgemeinen Strukturformel (II) können im Rahmen der vorliegenden Erfindung beispielsweise die nachstehenden Verbindungen als Ausgangsmaterial dienen:

S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester; S-Acetyl-y-mercapto- oi. -methyl-n-buttersäure-Methylester; S-Phenylacety1-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester; S-Benzoyl-ß-mercapto-isobutter'säure-Methylester; und ähnliche Mercaptobuttersäureester.

Das im ersten Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzte "hydrolisierende Enzym" ist eine allgemeine Bezeichnung für solche Enzyme, welche die Esterbindung der oben bezeichneten Carbonsäureester der allgemeinen Strukturformel (II) asymmetrisch zu hydrolysieren vermögen. Zusätzlich kann eine Gruppe von Enzymen verwendet werden, die zumeist als Esterase und Lipase bezeichnet werden, ferner solche Enzyme, die zur Klasse der Proteasen gehören, soweit sie die genannten Ester zu hydrolisieren vermögen; zu geeigneten Proteasen gehört beispielsweise OC-Chymotripsin. Weiterhin sind diese Esterhydrolisierenden Enzyme hinsichtlich ihres Ursprunges, ihrer Reinheit und dgl. nicht weiter beschränkt; beispielsweise können diese Enzyme aus Pflanzen oder Tieren stammen, ferner aus Mikroorganismenzellen, aus zerkleinerten Zellen und aus Zellextrakten.

Als Mikroorganismen, welche solche Enzyme zu produzieren vermögen, seien beispielsweise Mikroorganismen genannt, die zur Gattung Agrobacterium, Aspergillus, Nocardia, Candida, Torulopsis Bacillus, Alcaligenes, Pseudomonas, Mycobacterium und zu ähnlichen Gattungen gehören.

- li -

Als Beispiele für aus solchen Mikroorganismen stammende und handelsüblich zugängliche Enzyme seien beispielsweise genannt:

Lipase AP, aus Aspergillus (hergestellt und vertrieben von Amano Pharmaceutical Co.);

Lipase aus Candida (hergestellt von Sigma Co.)·

Als weitere geeignete, aus tierischem Gewebe gewonnene Enzyme seien beispielsweise Esterase aus Schweineleber, oC-Chymotrypsin und Pancreatin aus Pancreasgewebe genannt.

Hinsichtlich geeigneter, oben lediglich gattungsmäßig bezeichneter Mikroorganismen wird beispielsweise auf die nachfolgenden Stämme verwiesen: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas ovalis, Alcaligenes faecalis, Nocardia erthropolis, Mycobacterium phlei, Agrobacterium radiobacter und ähnliche Stämme.

(A) Für den Fall, daß eines der oben bezeichneten Enzyme eingesetzt wird, kann die Reaktion in der Weise durchgeführt werden, daß man einem Reaktionsmedium das Enzym und den Ester zufügt. Als Reaktionsmedium kann beispielsweise durch Ionenaustausch-Reaktion entsalztes Wasser oder eine Pufferlösung dienen, welche organische Salze wie etwa Natriumphosphat und/ oder organische Salze wie etwa Natriumacetat enthält. Zur Erhöhung der Löslichkeit des Esters in dem Reaktionsmedium kann diesem ein organisches Lösungsmittel zugesetzt werden, wie beispielsweise Methanol oder Aceton. Obwohl das Esterhydrolisierende Enzym zumeist so wie es vorliegt, eingesetzt wird, könnte dieses Enzym auch in immobilisierter Form eingesetzt werden. Die Konzentration des Esters im Reaktionsmedium reicht vorzugsweise von 0,01 bis 50 %. Der Ester kann absatzweise, oder im Verlaufe der Reaktion auch fortlaufend zugesetzt werden. Gerade im letzteren Falle kann der Ester auch in Form

- 12 einer wässrigen Suspension zugesetzt werden.

Der pH-Wert des Reaktionsmediums wird im Bereich von 2 bis 11, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 8 gehalten. Sofern der pH-Wert des Reaktionsmediums aufgrund der mit fortschreitender Reaktion erzeugten Carbonsäure absinkt, kann vorzugsweise ein Neutralisierungsmittel zugesetzt werden, um den pH-Wert im optimalen Bereich zu halten. Die Reaktionstemperatur kann von 5 bis 50 C reichen. Die Reaktionsdauer kann in geeigneter Weise eingestellt werden und hängt vor allem von der Menge und der Aktivität des eingesetzten Enzymes ab.

(B) Im Falle des Einsatzes von Mikroorganismen erfolgt die Vermehrung dieser Mikroorganismen zumeist in einer Kulturflüssigkeit; jedoch kann auch die Kultur auf festem Nährboden vorgesehen werden. Zumeist wird ein Kulturmedium verwendet, das die für das Wachstum und die Vermehrung der Mikroorganismen notwendigen Komponenten enthält, wie etwa Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Vitamine, Mineralien und dgl.. Um die Fähigkeit der Mikroorganmismen zur hydrolytischen Spaltung zu steigern, kann dem Kulturmedium vorzugsweise eine kleine Menge Ester zugesetzt werden. Die Kultivierung erfolgt bei einer Temperatur von 10 bis 50 C und in einem pH-Bereich von 2 bis 11, vorzugsweise in einem pH-Bereich von 5 bis 8. Die Kultur kann belüftet und/oder bewegt (gerührt, geschüttelt und dgl.) werden, um das Wachstum der Mikroorganismen zu fördern.

Zur Durchführung der Hydrolysereaktion kann der Ester dem Kulturmedium zu Beginn oder im Verlauf der Züchtung zugesetzt werden; weiterhin kann der Ester der Kulturflüssigkeit zugesetzt werden, nachdem die darin vorher gezüchteten Mikroorganismen daraus entfernt worden sind. Weiterhin können Zellen der vermehrten Mikroorganismen durch Zentrifugieren oder sonstige Maßnahmen abgetrennt werden, und diese abgetrennten Zellen können dem, den Ester enthaltenden Reaktionsmedium zu-

3 A 2 4 4 4 O

gesetzt werden. In diesem Falle können beispielsweise wegen der einfacheren Handhabung getrocknete Zellen, lyophilisierte Zellen, sprühgetrocknete Zellen, mit einem organischen Lösungsmittel wie etwa Aceton oder Toluol behandelte Zellen, anderweitig behandelte, etwa zerkleinerte Zellen oder Zellextrakte verwendet werden.

Der pH-Wert des Reaktionsmediums hängt von der zu erzeugenden Carbonsäure und weiteren Umständen ab und kann mit fortschreitender Reaktion wegen der gebildeten Carbonsäure absinken. In diesem Falle wird vorzugsweise vorgesehen, den pH-Wert in einem optimalen Bereich zu halten, was durch Zusatz eines geeigneten Neutralisierungsmittels erfolgen kann. Die Esterkonzentration in dem Reaktionsmedium beträgt vorzugsweise 0,01 bis 50 Gew.-%. Weiterhin wird vorzugsweise vorgesehen, die Reaktion solange fortzusetzen, bis entweder die D-Form oder die L-Form des Esters vollständig hydrolisiert ist.

Die Abtrennung und Reinigung des Produktes aus dem Reaktionsmedium kann nach bekannten Verfahren erfolgen; beispielsweise kann Extraktion, Umkristallisieren und die Reinigung mittels Säulenchromatographie vorgesehen werden.

Im Falle des zweiten Verfahrens können die gleichen Enzyme und die gleichen Mikroorganismen eingesetzt werden, wie oben ausgeführt.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken. Sofern andere Angaben fehlen, beziehen sich % -Angaben auf Gewichts- %.

Beispiel It

Zellen von Torulopsis gropengiesseri (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 0659) wurden in 100 ml Kulturflüssigkeit (pH 6,0)

überführt, die 1,0 % Glukose, 0,3 % Malzextrakt, 0,3 % Hefeextrakt und 0,5 % Pepton enthält. Die Kultur wurde 2 Tage lang bei 30⁰C geschüttelt. Nach Beendigung der Vermehrung wurde die Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt. Die zurückbleibenden Zellen (0,4 g, bezogen auf Trockenbasis) wurden mit entsalztem Wasser gewaschen und daraufhin wieder in 50 ml M/10 Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) suspendiert. Dieser Zellsuspension wurden 1,0 ml (+) S-Acetylß-mercapto-isobuttersäure-Methylester zugesetzt. Zur Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch 24 h lang bei 30⁰C geschüttelt.

Daraufhin wurde der pH-Wert des Reaktionsmediums auf 7,0 eingestellt, und der nicht-umgesetzte Anteil an S-Acetyl-ß-mercaptoisobuttersäure-Methylester durch Extraktion mit Äthylacetat entfernt. Daraufhin wurde der pH-Wert der Wasserschicht durch Zugabe von Schwefelsäure auf 2,0 abgesenkt. Die in der wässrigen Schicht enthaltene S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure wurde mit Äthylacetat extrahiert. Aus dem erhaltenen Extrakt wurde nach Trocknung mit wasserfreiem Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels 0,25 g öliges Material erhalten. Dieses ölige Material wurde in Form einer Benzol-Lösung auf eine Silikatgel-Säule gegeben, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus 10 Teilen Benzol und 1 Teil Aceton eluiert. Der, die S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure enthaltende Teil des Eluates wurde fraktioniert, und nach Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurden 0,19 g gereinigte S-Acetyl-ß-mercapto-isosbuttersäure erhalten.

Die optische Drehung dieses gereinigten Materials wurde mittels eines automatisch arbeitenden, digital anzeigenden Meßgerätes zur Bestimmung der optischen Drehung (hergestellt von Union Gigen Co., vertrieben unter der Typenbezeichnung PM 101) bestimmt. Die optische Drehung dieses gereinigten Materials wurde bestimmt, und es ergab sich eine spezifische DrehungjjuLJ _D = = -45,0° (C = 1,1 Äthylacetat).

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Beispiel 2:

Zellen von Bacillus subtilis var niger (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 3108)wurden in 100 ml Kulturflüssigkeit (pH 7,0) überführt, die 1,0 % Fleischextrakt, 1,0 % Pepton und 1,5 % Natriumchlorid enthielt. Die Kultur wurde 1 Tag lang bei 30⁰C geschüttelt. Die Kulturflüssigkeit wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, und die zurückbleibenden Zellen (0,3 g) wurden analog zu Beispiel 1 gewaschen, mit S-Acetyl-ß-mercaptoisobuttersäure-Methylester umgesetzt, die gebildete S-Acetylß-mercapto-isobuttersäure mit Äthylacetat extrahiert und schließlich diese durch Säulenchromatographie gereinigt. Es wurden 0,16 g S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure mit einer spezifischen Drehung/^ 7 = + 42,8° (c = 1,4 Äthylacetat) erhalten.

Beispiele 3 und 4:

Zellen von Aspergillus sojae (Hinterlegungsbezeichnung: IAM 2703) bzw. Zellen von Candida rugosa (Hinterlegungsbezeichung: IFO 0750) wurden in 100 ml Kulturflüssigkeit der Zusammensetzung nach Beispiel 1 überführt. Die Kulturen wurden 2 bis 3 Tage lang bei 30⁰C geschüttelt. Die vermehrten Zellen wurden aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt, ausreichend mit entsalztem Wasser gewaschen und daraufhin in 50 ml M/10 Phosphatpufferlösung suspendiert, welche 1,0 ml ( + ) S-Acetylß-mercapto-isobuttersäure-Methylester enthielt. Daraufhin ließ man 24 h lang bei 30⁰C reagieren. Nach Einstellung des pH-Wertes der Reaktionsflüssigkeit auf 7,0, wurde der S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester durch Extraktion mit einem gleichen Volumen Äthylacetat entfernt; hierbei wurde ein neutraler Extrakt erhalten. Daraufhin wurde der pH-Wert der wässrigen Schicht auf 2,0 abgesenkt, und die S-Acetyl-ß-mercapto-Isobuttersäure mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert; hierbei wurde ein saurer Extrakt erhalten.

'3424UO

Die spezifischen optischen Drehungen des neutralen und des sauren Extraktes wurden mit dem oben bezeichneten Meßgerät (hergestellt von Union Giken Co., vertrieben unter der Bezeichnung PM 101) bestimmt; hierbei wurden die in der nachstehenden Tabelle 1 angegebenen Werte erhalten. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die angegebenen Stämme optisch aktive S-Acetyl-ß-mercaptö-isobuttersäure erzeugen, welche entweder (+)- oder (-)-Drehung aufweisen; weiterhin fällt S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester in Form des optischen Anitpoden an.

Tabelle Beispiel

Stamm

Optische Drehung

des neutralen Ex- des sauren Extrak traktes, enthaltend tes_f enthaltend S-Acetyl-ß-mercapto-S-Acetyl-ß-merisobuttersäurecapto-isobutter-Methylester säure

Aspergillus sojae
(IAM 2703)

Candida rugosa
(IFO 0750)

Beispiele 5 bis 7;

Zellen der folgenden Stämme, nämlich Pseudomonas ovalis (Hinterlegungsbezeichnung: IAM 1049), Pseudomonas fluorescens (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 3081), und Alcaligenes faecalis (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 13111) wurden in je 100 ml Kulturflüssigkeit (pH 7,0) überführt, die 1,0 % Fleischextrakt, 1,0 % Pepton und 0,5 % Natriumchlorid enthielt. Die Kulturen

wurden 1 Tag lang bei 30 C geschüttelt. Nach Abtrennung der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren wurden die verbleibenden Zellen gesammelt und mit entsalztem Wasser gewaschen. Die gewaschenenen Zellen wurden in 50 ml M/10 Phosphatpuffer-Lösung (pH 7_r0) suspendiert. Den jeweiligen Zellsuspensionen wurde je 1,0 ml (+) S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester zugesetzt. Zur Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch 24 h lang bei 30⁰C geschüttelt. Nach Abschluß der Umsetzung wurde der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit auf 7,0 eingestellt, und der S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methyl-

ester durch Extraktion mit Äthylacetat entfernt. Daraufhin wurde der pH-Wert der verbleibenden wässrigen Schicht durch Zugabe von Schwefelsäure auf 2,0 oder weniger abgesenkt, und die S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure mit Äthylacetat extrahiert. Nach Trocknung und Entfernung des Lösungsmittels wurde aus dem Extrakt ein öliges Material isoliert. Dieses ölige Material wurde in benzolischer Lösung auf eine Silikatgel-Säule (Wakogel Q-50, hergestellt von Wako Junyaku Co.) und mit einem Lösungsmittelgemisch aus 4 Teilen Benzol und 1 Teil Aceton eluiert. Der die S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure enthaltende Teil des Eluates wurde fraktioniert, und nach Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde die gereinigte S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure erhalten. Das gereinigte Material wurde in Chloroform gelöst, und an dieser Chloroformlösung die spezifische Drehung mittels des oben bezeichneten Meßgerätes (Typenbezeichnung PM 101 der Firma Union Giken Co.) bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle

Beispiel Stamm
Nr.

Ausnaß der S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäurg Hydrolyse Ausbeute an ge- Spezifische Drehung (%) reinigtem Pro- L·"/ in Chloroform dukt (g) ^{L JU}

Pseudomonas ovalis
(IAM 1049)

Pseudcmonas fluorescens (IPO 3081)

Alcaligenes faecalis
(IPO 13111)

42

0,32 0,42 0,35

-42,5^C

+40,5

Beispiele 8 bis 10;

Zellen von Pseudomonas putida (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 3738) wurden in die gleiche Kulturflüssigkeit wie in Beispiel 5 angegeben, überführt. Weiterhin wurden Zellen von Nocardia erythropolis (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 12538) und Zellen von Mycobacterium phlei (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 13160) in eine Kulturflüssigkeit (pH 7,2) überführt, die 1,0 % Glukose, 0,2 % Peptonextrakt und 0,1 % Hefeextrakt enthält. Die Kulturen wurden 1 bis 3 Tage lang bei 30⁰C geschüttelt. Daraufhin wurden die Zellen aus jeder Kulturflüssigkeit abgetrennt. Nachdem ausreichend mit entsalztem Wasser gewaschen worden war, wurden die Zellen in je 50 ml M/10 Phosphatpuffer-Lösung suspendiert, die 1,0 ml (+) S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester enthält.

Daraufhin ließ man 24 h lang bei 30 C reagieren. Nachdem man den pH-Wert der Reaktionslösung auf 7,0 eingestellt hatte, wurde der S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-

Methylester mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert;

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hierbei wurde ein neutraler Extrakt erhalten. Der pH-Wert des wässrigen Rückstandes wurde daraufhin auf 2,0 oder weniger abgesenkt, und die S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersaure mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert; hierbei wurde ein saurer Extrakt erhalten.

Sowohl am neutralen wie am sauren Extrakt wurde die optische Drehung bestimmt; die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführt. Aus diesen Ergebnissen folgt, daß die genannten Stämme optisch aktive S-Acetyl-ß-mercaptoisobuttersäure erzeugen, die entweder spezifische (+)- oder (-)-Drehung aufweist; weiterhin erzeugen diese Stämme den S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester in Form des optischen Antipoden.

Tabelle

Beispiel Stamm Nr.

Optische Drehung

des neutralen des sauren Extraktes, Extraktes, ent- enthaltend S-Acetylhaltend S-Acetyl ß-mercapto-isobutterß-mercapto-isosäure
buttersäure-Methy!ester

Pseudomonas putida
(IPO 3738)

Nocardia erythrcpolis
(IPO 12538)

Mycobacterium phlei
(IPO 13160)

Beispiel 11;

Zellen von Agrobacterium radiobacter (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 12607) wurden in 100 ml Kulturflüssigkeit (pH 7,2) überführt, die 1,0 % Fleischextrakt, 0,5 % Natriumchlorid und 1,0 % Pepton enthält. Die Kultur wurde 1 Tag lang bei 30⁰C geschüttelt. Nach Abschluß der Vermehrung wurde die Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Gesamtmenge der zurückbleibenden Zellen wurde mit entsalztem Wasser gewaschen, und die gewaschenen Zellen wurden erneut in 50 ml M/10 Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) suspendiert. Der erhaltenen Zellsuspension wurden 2,5 ml (+) S-Acetylß-Mercapto-isobuttersäure-Methylester zugesetzt. Zur Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch 48 h lang bei 30⁰C geschüttelt.

Nach Ablauf dieser Zeitspanne waren 49 % des S-Acetyl-ßmercapto-isobuttersäure-Methylesters umgesetzt bzw. umgelagert worden. Nachdem der pH-Wert der Reaktionslösung auf 7,0 eingestellt worden war, wurde der S-Acetyl-ß-mercaptoisobuttersäure-Methylester mit Äthylacetat extrahiert. Daraufhin wurde der pH-Wert der wässrigen Schicht mit Schwefelsäure auf 2,0 abgesenkt, und die S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel abgedampft. Nach einer entsprechenden Reinigungsoperation wurde die spezifische Drehung mit dem oben genannten Meßgerät (Typenbezeichnung PM 101 der Union Giken Co.) bestimmt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt.

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß bei der Reaktion sowohl die optisch aktive Carbonsäure, wie deren Ester in Form des optischen Antipoden angefallen ist.

Tabelle

Reaktionsprodukt Spezifische Drehung/O^ /_D

S-Acetyl-ß-mercapto-

isobuttersäure-Methylester +50 (C = 1,20, CHCl₃)

S-Acetyl-ß-mercapto- ·

isobuttersäure -48 (C = 1,15, CHCl₃)

20

Beispiel 12:

Zellen von Torulopsis gropengiesseri (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 0659) wurden in 2 L Kulturflüssigkeit (pH 6,0) überführt, die 1,0 % Glukose, 0,3 % Malzextrakt, 0,3 % Hefeextrakt und 0,5 % Pepton enthält. Die Zellenvermehrung erfolgte unter Belüftung in einer Fermentiervorrichtung mit

kleinem Gefäß im Verlauf von 2 Tagen bei 30⁰C. Der pH-Wert wurde stets bei 6,0 gehalten, was durch pH-Kontrolle sichergestellt wurde. Nach Abschluß der Vermehrung wurde die Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt.

Die zurückbleibenden Zellen (4,0 g auf Trockenbasis) wurden mit entsalztem Wasser gewaschen, und die gewaschenen Zellen wurden in 1800 ml entsalztem Wasser suspendiert. Der erhaltenen Zellsuspension wurden 40 ml (+) S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester zugesetzt. Zur Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch 30 h lang bei 30⁰C gerührt. Im Verlauf der Umsetzung wurde der pH-Wert durch Zugabe von 10 %-iger NaOH-Lösung bei 7,0 gehalten. Nach Abschluß der Umsetzung wurde der in der Reaktionslösung vorhandene S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methy!ester mit Äthylacetat extrahiert.

Der erhaltene Extrakt wurde unter vermindertem Druck destilliert, wobei 17,8 g gereinigter S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester (Siedepunkt: 83 bis 85°C bei 3 bis 3,5 mm Hg· Säule, das sind 4 bis 4,7 mbar). Die spezifische optische Drehung des gereinigten Materials wurde in Chloroform-Lösung

i" 125

= +45,0" (c = 2,0 Chloroform) erhalten.

Beispiel 13:

Zellen von Bacillus subtilis var niger (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 3108) wurden in 2 L Kulturflüssigkeit (pH 7,0) übertragen, die 1,0 % Fleischextrakt, 1,0 % Pepton und 0,5 % Natriumchlorid enthält. Die Vermehrung erfolgte unter Belüftung mit einer Fermentiervorrichtung mit kleinem Gefäß 1 Tag lang bei 30⁰C. Die Aufarbeitung erfolgte analog zum Verfahren nach Beispiel 12. Aus 6,2 g gewaschenen Zellen wurden nach der Umsetzung mit S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester 17,9 g gereinigter S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester mit einer spezifischen Drehung(ofj_D = -42,8° (c = 1,4 CHCl₃) erhalten.

Beispiel 14:

Zellen von Pseudomonas fluorescens (Hinterlegungsbezeichnung: IFO 3081) wurden in 2 L der gleichen Kulturflüssigkeit (pH 7,0) übertragen, wie in Beispiel 13 verwendet. Die Vermehrung erfolgte unter Belüftung in einer Fermentiervorrichtung mit kleinem Gefäß in Verlauf von 1 Tag bei 25 C. Die Aufarbeitung erfolgte entsprechend dem in Beispiel 12 angegebenen Verfahren. Aus 4,2 g gewaschenen Zellen wurden nach Umsetzung mit S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester aus dem resultierenden Extrakt nach destillativer Aufarbeitung 19,1 g S-Acetylß-mercapto-isobuttersäure-Methylester mit einer spezifischen Drehung [tkj^ = +46,2° (c = 4,21 CHCl₃) erhalten.

Beispiele 15 bis 20;

Zellen der in der nachstehenden Tabelle 5 angegebenen Stämme wurden in die gleiche Kulturflüssigkeit übertragen, wie in den Beispielen 12 oder 13 verwendet. Zur Vermehrung wurde 1 bis 3 Tage lang bei 30⁰C geschüttelt. Daraufhin wurden die Zellen von der Kulturflüssigkeit getrennt. Nachdem die Zellen ausreichend mit entsalztem Wasser gewaschen worden waren, wurden die Zellen in 500 ml M/2 Phosphatpuffer-Lösung suspendiert, die 10 ml (+) S-Acetyl-ß-mercapto-isobuttersäure-Methylester enthält. Zur Umsetzung wurde 24 h lang bei 30 C gehalten. Nachdem der pH-Wert der Reaktionslösung auf 7,0 eingestellt worden war, wurde der vorhandene S-Acetyl-ßmercapto-isobuttersäure-Methylester mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert.

Die spezifische optische Drehung des Produktes wurde bei einer Wellenlänge von 589,3 mm mit dem oben genannten Meßgerät (Typenbezeichnung PM 101 der Union Giken Co.) bestimmt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 aufgeführt. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die in Tabelle 5 genannten Stämme optisch aktiven S-Acetylß-mercapto-isobuttersäure-Methylester erzeugen, der entweder spezifische optische (+)- oder (-)-Drehung aufweist.

Tabelle

Beispiel	Stamm
Nr.
15	Aspergillus sojae (IAM 2703)
16	Candida rugosa (IPO 0750)
17	Pseudanonas ovalis (IAM 1049)
18	Alcaligenes faecalis (IPO 13111)
19	Nocardia erythrcpolis (IPO 12538)
20	Mycobacterium phlei (IPO 13160)

spez. optische Drehung des S-Acetyl-ß-mercaptoisobuttersäure-Methy!esters

Claims

^;-^:-fISCHER; KERN & BREHM

Albert-Rosshaupter-Strasge 65 · D 8000 München 70 · Telefon (089) 7605520 ■ Telex 5-212284 patsd · Telegramme Kernpatent München

MITSUBISHI RAYON COMPANY, LIMITED, 3. Juli 1984

3-19, Kyobashi 2-chome, Chuo-ku, MI-03

Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Carbonsäuren und deren Ester in Form der optischen Antipoden

Patentansprüche;

\ 1/ Ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Carbon säure der nachstehenden allgemeinen Strukturformel (I):

I²

R₁-COS-(CH₂) ^CH-COOH (I)

wobei

R. für eine Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine Arylgruppe steht;

R_ für eine Alkylgruppe steht; und

η einen Wert von 1 oder 2 hat,

wobei man auf einen Carbonsäureester der nachstehenden allgemeinen Strukturformel (II) :

■■ " ' 342A440

R₁-COS-(CH₂)_n-CH-C00R₃ (II)

wobei

R,, R_? und η die oben angegebene Bedeutung haben; und

R₃ für eine Alkylgruppe steht;

ein Medium einwirken läßt, das ein Enzym enthält, welches die Esterbindung dieses Esters asymmetrisch zu hydrolisieren vermag.
2. Ein Verfahren zur Herstellung entweder einer D-Form oder einer L-Form eines optisch aktiven Carbonsäureesters der nachstehenden allgemeinen Strukturformel (II):

R₁-COS-(CH₂)_n-CH-C00R₃ (II)

wobei

R, für eine Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine Arylgruppe steht;

R„ für eine Alkylgruppe steht;

R₃ für eine Alkylgruppe steht; und η einen Wert von 1 oder 2 hat;

bei welchem Verfahren gleichzeitig auch die Säure des optischen Antipoden des Carbonsäureesters anfällt oder nicht anfällt,

wobei man auf einen Carbonsäureester der nachstehenden allgemeinen Strukturformel (II):

R₉

I²

R₁-COS-(CH₂)_n-CH-C00R₃ (II)

wobei

R., R₂, R^ und η die oben angegebene Bedeutung haben;

ein Medium einwirken läßt, das ein Enzym enthält, welches die Esterbindung umzulagern vermag, wobei eine asymmetrische Hydrolyse der Esterbindung eintritt oder nicht eintritt.
3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym-haltiges Medium ein oder mehrere Enzym(e), Kulturbrühe, Zellen oder behandelte Zellen von Mikroorganismen dienen.
4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzyme Lipase, Esterase, c^-Chymotrypsin oder Pancreatin dienen.
5. Das Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Hefen dienen, etwa Hefen der Gattung Torulopsis oder Candida.
6. Das Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Pilze dienen, etwa Pilze der Gattung Aspergillus.
7. Das Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Bakterien dienen, etwa Bakterien der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes und Agrobacterium.

- - 3424U0
8. Das Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Actinomyceten dienen, etwa Actinomyceten der Gattung Mycobacterium und Norcardia.
9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R, für eine C, g-Alkylgruppe, eine C~_,g-Aralkylgruppe, eine C, „,-Arylgruppe steht; der Rest R₂ für eine C,_g-Alkylgruppe steht; und der Rest R₃ für eine Ci₆-Alkylgruppe steht.