DE69817763T2

DE69817763T2 - Verfahren zur biologischen Racematspaltung

Info

Publication number: DE69817763T2
Application number: DE69817763T
Authority: DE
Inventors: Ghulam Nabi Qazi; Rajinder Parshad; Surrinder Koul; Subhash Chandra Taneja; Kanaya Lal Dhar; Ravi Ji Kotru
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1998-03-31
Filing date: 1998-03-31
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2018-04-01
Also published as: DE69817763D1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biotechnologie. Sie beschreibt ein wirksames biologisches Trennungs- bzw. Racematspaltungsverfahren für die Herstellung des entzündungshemmenden Arzneimittels S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure (Naproxen) mit der Formel (2). Durch das biologische Trennungsverfahren werden zwei Enantiomere von (±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäurealkylestern getrennt. Die biologische Trennung erfolgt durch die Vermittlung eines Organismus, der zu der Gattung Trichosporon sp. gehört. Der Organismus kann in Form eines Pellets aus ganzen nassen Zellen bzw. nassen Ganzzellpellets oder eines trockenen Zellpulvers oder eines zellfreien Extrakts oder des reinen Enzyms, das aus der Zellkultur isoliert wurde, verwendet werden. Die Verwendung von Trichosporon sp. (RRLY-15) DSM 11829 für die kinetische Trennung dieser Verbindung durch ihre maximale Enantioselektivität und nahezu theoretische Ausbeuten ist neu.
Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
S(±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) gehört zu der Klasse der α-Methylarylessigsäuren, die auch als 2-Arylpropansäuren bezeichnet werden, welche ihrerseits zu einer wichtigen Klasse von nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln bzw. nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAID) gehören. Zu den am häufigsten verwendeten Arzneimitteln in dieser Klasse gehören neben Naproxen Ibuprofen, Ketoprofen und Fluriprofen. Diese Arzneimittel finden breite Anwendung bei der Bekämpfung von Schmerzen und Entzündungen, die durch Arthritis und verwandte Bindegewebserkrankungen verursacht werden (Shen, T. Y.; Angew. Chem, Int. Ed., 1972, 11, 460). Diese Arzneimittelmoleküle mit chiraler Beschaffenheit treten als Racemate auf, wenn sie durch ein normales chemisches Syntheseverfahren synthetisiert werden. In den letzten Jahren wurde die Verwendung von enantiomerenreinen Arzneimitteln in der Chemotherapie nahezu verpflichtend und die Zulassungsbehörden von vielen Ländern erlassen zu diesem Zweck neue Arzneimittelrichtlinien. Die Verwendung von enantiomerenreinen Arzneimitteln verbessert nicht nur die Wirkungsspezifität, sondern minimiert auch die Toxizität und die unerwünschte Belastung des Patienten. Diese Feststellung trifft auch für α-Arylpropansäure zu. Bei (±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure ist das S(+)-Enantiomer 28 mal aktiver als das R(–)-Enantiomer (Roszokwski, A. P., Rooks, W. H., Tomolonis, A. J. und Miller, L. M., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1971, 179, 114). Ein weiteres Arzneimittel, das zu der gleichen Klasse von nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln (NSAID) gehört, welches bis vor kurzem als racemische Mischung verschrieben wurde, ist Ibuprofen. Obwohl der inaktive R(–)-Antipode dieses Arzneimittels in vivo über ein CoA-Thioester-Zwischenprodukt in das S(+)-Enantiomerumgewandelt wird, wurde beobachtet, dass der Epimerisationsprozess zu metabolischen Komplikationen führt, da der R(–)-Ibuprofen-CoA-Komplex viele CoA-abhängige Reaktionen kompetitiv hemmt, was zu einer Störung des intermediären Metabolismus von Hepatozyten und der mitochondrialen Funktion führt. Reines S(+)-Ibuprofen könnte deshalb ein bevorzugtes Arzneimittel der Zukunft sein (Ann. Rep. Med. Chem. Band 30 (1995) S. 298, Hrsg. James a Bristol, Academic Press inc. California).
Da die chemische Synthese von Verbindung (2) zur Bildung einer racemischen Mischung führt, wird die eine oder andere Racematspaltungsmethode für die Trennung des S(+)-Enantiomers eingesetzt (Harrison, I. T., Lewis, B., Nelson, P., Rooks, W., Roszwkoski, A., Tomolonis, A. J. und Fried, J. H., J. Med. Chem., 1970, 13, 203). Diese Verfahren setzen im Allgemeinen die selektive Kristallisation von dl-stereoisomeren Salzen durch die Verwendung von teuren optisch aktiven Aminen wie Cinchonidin, Dehydroabietylaminacetat, Phenylethylamin etc. ein (Newman, P. in Optical Resolution Process for Organic Compound Band 2(II) S. 653 (1981), Manhatten College, New York). Die Racematspaltung von (2) wurde auch unter Verwendung von Campher-10-sulfonsäure durchgeführt (Tsuchihashi, G., Tetrahedron Lett., 1982, 23, 5427).
Die asymmetrische Synthese von α-Arylpropansäuren bietet eine weitere wichtige Methodologie zum Erhalten von enantiomerenreinen Verbindungen. Verschiedene Strategien, die in diesen Verfahren eingesetzt werden, umfassen eine Lewis-Säure-katalysierte 1,2-Aryl-Wanderung, die Verwendung von chiralen Katalysatoren bei einer stereo-selektiven C-C-Bindungs-Bildung, eine Hydroformylierung, eine asymmetrische Hydrierung usw. Vor kurzem wurde eine asymmetrische Synthese von α-Arylpropansäuren besprochen [Sonawane, H. R., Bellur, N. S., Ahuja, J. K. und Kulkarni, D. G., Tetrahedron Asym. 1992, 3(2), 162; Vill, C., Giordans, M., Pannosion, S. Sheldrak, G. N. in Naproxen: Industrial Asymmetric syn. (1992), S. 303 Hrsg. Collins, A. N. und Crosby, J. N., Chechester, U. K.: Jia, C., Le, J., Zhonogguo Yiyao Zazhi 1990, 21 3 , 137].
In den letzten zehn Jahren ist eine Reihe von Berichten erschienen, welche die biologische Trennung bzw. Racematspaltung von (±)-Naproxen betreffen, wobei Hydrolasen, Lipasen, Esterasen oder Proteasen aus bakteriellen, pilzlichen oder tierischen Ausgangsmaterialien verwendet werden. Eine kurze Übersicht wird in den folgenden Zeilen angegeben:
Candida cylinderacea-Lipase wurde erfolgreich für die Trennung von S(±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure über ihren Chlormethylester verwendet (Gu, Qui-Ming; Chen, C. und Sih, C. J., Tetrahedron Lett. 1986, 27 16 , 1763). Diese Arbeit wurde auch patentiert (Sih, C. J., Eur. Pat. Anmeldung EP-A-227078, 1. Juli 1987, US-Anmeldung 811,260, 20. Dezember 1985). Einige weitere wichtige Veröffentlichungen von Racematspaltungsverfahren für (±)-Naproxen und verwandte α-Methylarylessigsäurederivate umfassen (Quax, W. J., Broekhuizen, C. P., Applied Microbial Biotechnol. 1994, 41 4 , 425; Smeets, J. W. H., Kieboom, A. P. G., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1992, 111 11 , 490, CA, 118: 212077; Mutasaers, J. H., G. M., Kooreman, H. J., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1991, 110 05 , 185, CA, 115-207622t; Gu, Q.: Zhongguo Yiyao Gongyu Zazhi, 1991, 22 21 , 49, CA, 115, 88688; Alkumark, S., Anderson, S., Chirality 1992, 4(1), 24, Wu, S. H., Guo, Z. W., Sih, C. J., J. Am. Chem. Soc 1990, 112 5 , 1990). Eine enantioselektive Veresterung von racemischem Naproxen wurde auch unter Verwendung von Candida-Lipase in organischen Lösungsmitteln durchgeführt [Shan-Wei, T., Hwa-Jou, W., Biocat., 1994, 11(1), 33 und J. Chem. Technol. Biotechnol., 1996, 65 3 , 156].
In der Vergangenheit wurden einige weitere Verfahren für die kinetische Racematspaltung von (±)-Naproxen unter Verwendung verschiedener Enzyme patentiert. Zum Beispiel wurde beansprucht, dass die Alkylester von (±)-Naproxen durch die Verwendung von Enzymen aus Pseudomonas, Brevibacterium oder Mycoplana-Spezies getrennt wurden (Watanabe, I., Hosoi, A., Kobayashe, E., JP 6363396 , 19. März 1988, CA 109: 72056). Gist Brocades setzte Bacillus thai und andere Mikroorganismen zum Hydrolysieren von Alkylestern von (±)-Naproxen ein (Gist Brocades, N. V., JP 63, 45,234 , 26. Feb. 1988, FR-Anmeldung 88.245, 7. Jan. 1986, CA 109: 168975). Die Trennung von Estern von Naproxenstereoisomeren wurde in mehrphasigen extraktiven Membranbio reaktoren in Gegenwarf von Candida cylinderacea erzielt; optisch aktives Naproxen wurde in wässriger Phase gewonnen (Matson, S. L. PCT Int. Anmeldung WO-A-88/07 582, 6. Okt. 1988, US-Anmeldung 33,962, 1. April 1987: CA 111: 113732). Ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von S(+)-Naproxen wurde von Bianchi et al. offenbart, bei dem entsprechende Alkyl-, Phenyl-, Tetrahydropyranyl- oder Tetrahydrofuranylester verwendet wurden, wobei durch immobilisierte Candida cylinderacea-Lipase katalysiert wurde. Sie erhielten 1757 g S(+)-Naproxen aus 9387 g (±)-Ester nach 1200 Stunden ununterbrochenem Ablauf der Reaktion (Bianchi, D., Cesti, P., Pina, C., Battislet, E., Eur. Pat. Anmeldung EP-A-330 217, 30. August 1989, IT 88/19, 532, 25. Feb. 1988, CA 112: 215, 202). Wasserlösliche Ester von (±)-Naproxen wurden hydrolysiert, um chirale Arylpropansäuren in einem zweistufigen extraktiven Membranreaktor herzustellen (Matson, S. L., Wald, S. A., Zepp, C. M. und Dodds, D. R. PCT Int. Anmeldung WO 89,09,765, 19. Okt. 1989, US-Anmeldung 178 735, 7. April 1988, CA 113: 171683). Die hydrolytische Trennung von (±)-α-Methylnaphthylacetonitrilderivaten wurde durch Cornynebacterium nitrophilus mit 98% ee durchgeführt (Yamamoto, K., Otsubo, K., Oishi, K., Eur. Pat. Anmeldung EP-A-348 901, 3. Jan. 1990, JP-Anmeldung 88/156, 911, 27. Juni 1988, CA 113: 76605). Bei einer anderen Vorgehensweise zur Herstellung von S(+)-Naproxen wurde ein filamentöser Pilz Cordyceps milioris zur Isomerisierung von R(–)-Naproxen zu S(+)-Naproxen eingesetzt (Reid, A. J., Phillips, G. T., Marix, A. F und De Smet, M. J., Eur. Pat. Anmeldung EP-A-338 645, 25. Okt. 1989, GB-Anmeldung 88/9, 434, 21. April 1988, CA 113: 38895). Vinyl-, Ethyl- und Methylester von (±)-Naproxen wurden unter Verwendung verschiedener Hydrolasen, Lipasen, Esterasen usw. kinetisch getrennt; wobei behauptet wurde, dass der Vinylester eine maximale Trennung ergab (Flling, G., Schlingmann, M., Reinhold, K., Ger, Offen. DE., 3, 919029, 13. Dez. 1990, Anmeldung 10. Juni 1989. CA, 14; 245930). Ein Leberenzym aus Tieren wie Kaninchen, Pferden, Schafen usw. wurde ebenfalls verwendet (Goswami, A., PCT Int. Anmeldung WO, 9113163; 5. Sept. 1991, US-Anmeldung 484, 362, 21. Feb. 1990, CA, 115: 254315). Es wurde festgestellt, dass neue Exophiala withansia-Spezies in der Lage sind, α-substituierte Propansäure in optisch aktive Enantiomere aufzuspalten. S(+)-Naproxen wurde mit 92% ee erhalten (De Smet, Jose M., Eur. Pat. Anmeldung EP-A-386 848, 12. Sept. 1990, US-Anmeldung 308,591, 10. Feb. 1989, CA 115: 7022). M/S Syntex Pharmaceuticals Co patentierte ein Esterhydrolase-Gen aus Pseudomonas fluorescens, das in E. coli kloniert war, für die enantioselektive Hydrolyse von racemischen Alkylestern von Naproxen (Chan, H. W., Salazar, F. H., EP-A-414 247, 27. Feb. 1991, US-Anmeldung 398,102, 24. Aug. 1989, CA 115: 236 99). Ein wasserlösliches Ethylsulfat von (+)-Naproxen wurde in R(–)-Naproxen mit 79,8% Ausbeute umgewandelt, wobei Prozym 6 verwendet wurde (Serinprotease von Aspergillus oryzae) (Dodds, D. R., Zepp, C. M., Rossi, R. F., Eur. Pat. Anmeldung EP-A-461 043, 11. Dez. 1991, US-Anmeldung 535,303, B. Juni 1990, CA 116: 150171). Mikroben aus Brevibacterium, Bacteridium, Micrococcus, Bacillus usw. wurden kultiviert und für die Trennung von α-Arylpropansäureestern mit hohem ee verwendet (Battistel, E., Bianchi, D., Cesti, P., Franzosi, G., Tassinori, R., Spezia, S., Eur. Pat. Anmeldung EP-A-510 712, 28. Okt. 1992, 15. April 1991/M, 1154, 26. März 1991, CA 118: 58236). In ähnlicher Weise wurden Amide und Nitrile enzymatisch zu entsprechenden Säuren für die Herstellung von optisch reinem Naproxen hydrolysiert (Ootsubo, K., Yamamoto, K., J. P. 0576,390, 30. März 1993, Anmeldung 91/228,560, 15. Aug. 1991, CA 119: 93701 und Fallow, R. D., Steiglitz, B., PCT Int. Anmeldung WO-A-94/06930, 31. März 1994, US-Anmeldung 948,185, 21. Sept. 1992, CA 121: 81125). (±)-Naproxenmethylester wurde mit 35% Ausbeute in S(+)-Naproxen umgewandelt, wobei eine Reihe von Mikroorganismen verwendet wurde, von denen Zoffeillor latipes am geeignetsten war (Chan, H. W., Freeman, R., Salazar, N., Beck, S. R., Synder, R. C., Cain, R. O., Roberts, C. R., Felix, H., Phelps, P., Heefner, D. L., PCT Int. Anmeldung WO-A-93/23547, 25. März 1993, US-Anmeldung 883,658, 15. Mai 1992, CA 120: 189868). Ein Enzym aus einem Organismus der Gattung Ceracystis wurde identifiziert und sein Gen wurde in E. coli kloniert und exprimiert und für die Herstellung von R(–)-Naproxen mit > 95% ee und 26% Ausbeute verwendet (Julie, W., Hazel, B., Anthony, W. R., PCT Int. Anmeldung WO-A-94/20634, 15. Sept. 1994, GB-Anmeldung 93/4351, 3. März 1993 CA, 122: 8143).
Ein Verfahren zum Herstellen eines Enantiomers einer optisch aktiven Arylalkansäure aus einem Gemisch von Enantiomeren eines Esters der Arylalkansäure, vorzugsweise S-Ketoprofen, mit einem Mikroorganismus der Gattung Trichosporon ENZA I-3, IMI 348917 wurde in WO-A-93/04189 offenbart.
Die Anzahl der Übersichten und Patente, die in den letzten paar Jahren erschienen sind, für die Herstellung von optisch reinem Naproxen aus der racemischen Mischung und der rezeptfreie Verkaufsstatus (OTC-Status) dieses Arzneimittels in den USA unterstreichen die Bedeutung von S(+)-Naproxen und verwandten Verbindungen als entzündungshemmendes Arzneimittel der Wahl. Deshalb blieb die Herstellung von S(+)-Naproxen aus der racemischen Mischung enzymatisch oder durch andere Methoden, sowohl chemische als auch katalytische, an der Spitze der Prioritäten für viele R&D-Einrichtungen und pharmazeutische Firmen in der ganzen Welt. Die Haupthersteller von Naproxen setzen bis jetzt Wege ein, welche eine klassische Spaltung von Racematen über die Kristallisation von diastereomeren Salzen einsetzen.
In den letzten zehn Jahren waren jedoch größere Anstrengungen auf die Entwicklung von biologischen Racematspaltungsverfahren gerichtet. Biologische/enzymatische Spaltungsverfahren haben gegenüber chemischen oder anderen herkömmlichen Verfahren den Vorteil, dass sie einfach, katalytisch, relativ wirtschaftlich und umweltfreundlich sind. Da Enzyme sehr stereoselektiv und substratspezifisch sind, benötigt man folglich ein spezifisches Enzym für eine spezifische biologische Umwandlung. Die im Handel erhältlichen Enzyme für eine Biotransformation weisen möglicherweise nicht die geforderte Selektivität und Spezifität für die gewünschte biologische Umwandlung auf und sind möglicherweise nur von akademischem Interesse. Deshalb ist die Identifizierung, Selektion und Erzeugung eines geeigneten Enzyms eine wesentliche Voraussetzung für Biotransformationen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführungsform
Die Hefe RRLT-15, die in diesem Verfahren verwendet wird, ist von den Anmeldern aus einem lokalen fermentierten Käse "Kalari" gemäß dem von Beech und Davenport, Methods in Microbiology (Hrsg.) Booth, C. Band 14, S. 153, 1971, Academic Press N.Y. beschriebenen Verfahren isoliert worden. Das Ausgangsmaterial der Organismen, die lokalen Käseproben, wurden zerkleinert und 2 Tage bei 25°C in einem Medium inkubiert, das 0,025% (Gew./Vol.) Hefeextrakt und 0,5% (Vol./Vol.) Olivenöl enthielt. Die resultierende Kultur wurde außerdem auf Lipase/Esterase produzierende Kolonien abgesucht, die auf einem selektiven Medium isoliert wurden, das MYPG (Maltose, Hefeextrakt, Pepton, Glucose)-Agar umfasste, der 0,1 bis 0,2% (Gew./Vol.) Triglycerin wie etwa Triacetin und 0,005% Bromcresolgrün als Indikator enthielt. Die Hefekolonien, die klare Zonen aufgrund der Hydrolyse von Triglycerin und gelb gefärbte Zonen aufgrund der Freisetzung von organischer Säure verursachten, wurden als mutmaßliche Lipase/ Esterase-Produzenten betrachtet. Die ausgewählten Kolonien wurden außerdem durch einen Enzymassay auf eine Lipase/Esterase-Produktion hin untersucht, bei dem eine bekannte Menge eines frischen Ganzzellpellets in 0,05 M Tris-Puffer, der 200 μmol Triacetin enthielt, inkubiert wurde und die Hydrolysegeschwindigkeit durch Titration mit 10 mmol Natriumhydroxidlösung kontrolliert wurde. Die Stereoselektivität des primär selektierten Isolats wurde auf der Basis der selektiven Hydrolyse von Methylphenylcarbinol getestet. Verschiedene solche Kolonien, welche eine Stereoselektivität anzeigten, welche durch chirale Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)-Analyse festgestellt wurde, wurden einem Test auf die Esterhydrolyse von Alkylestern von S(±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure unterzogen. Eine solche Kolonie, welche eine maximale Hydrolaseaktivität unter mehreren hundert Kolonien aufwies, wurde für die weitere Verfahrensentwicklung verwendet. Der Organismus wurde gemäß Lodder, J. (Hrsg.), The Yeast – A taxonomic study 2. Auflage 1970, Amsterdam, North Holland identifiziert. Er wurde als Imperfekte Hefe klassifiziert, die zu der Familie Cryptococcaceae und der Unterfamilie Trichosporoidea gehörte. Der isolierte Stamm wurde außerdem als zur Gattung Trichosporon gehörig identifiziert und zwar aufgrund seiner charakteristischen Bildung von lose knospenden Zellen und einem echten Myzel, das in Arthosporen/Blastosporen auseinanderfällt, wodurch die Gattung sich von Candida unterscheidet. Sie ist auch von der Gattung Geotricum verschieden, welche keine Blastosporen bildet. Ein weiteres unterscheidendes Merkmal der zwei Gattungen, nämlich Geotricum und Trichosporon, ist die Bildung von septierten Lufthyphen, welche bei der erstgenannten zu trockenen Konidien auseinanderfallen, wogegen die letztere mukoide schleimige Kolonien aufweist und keine Lufthyphen vorhanden sind. Der in der vorliegenden Erfindung isolierte Organismus wurde auch wegen seiner enteroblastischen Blastokonidien, die ein typisches Merkmal für die Gattung sind, als Trichosporon identifiziert.
Der von uns als RRLY-15 bezeichnete Hefestamm wird in der Kulturensammlungsstelle des Regional Research Laboratory (CSIR), Jammu, einem konstituierenden Labor der Anmelder, aufbewahrt und wurde auch bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungs-Nr. DSM 11829 hinterlegt.
Der Hefestamm kann auf festem Medium gehalten werden, das Pepton, Hefeextrakt, Malzextrakt, Glucose und Agar enthält.
Bei dem Verfahren zur Vermehrung der Hefezellen und zur Herstellung des Enzyms ist die verwendete Kohlenstoffquelle ein Kohlenhydrat wie Glucose, Fructose, Sucrose, Lactose usw. oder ein Ausgangsmaterial, das diese Kohlenhydrate enthält. Die verwendete organische Stickstoffquelle ist Hefeextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Pepton usw. Die anorganische Stickstoffquelle kann Ammoniak, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Harnstoff usw. sein. Die Kultur kann unter aeroben Bedingungen in Schüttelkolben oder in gerührten Gefäßen hergestellt werden, worin die Kulturbrühe angemessen umgewälzt oder mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 200–700 Umdrehungen pro Minute (U/min), insbesondere mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 200–500 U/min mechanisch gerührt werden kann. Die Kulturbrühe kann mit einer Rate im Bereich von 0–2 Volumina pro Volumen (vvm), insbesondere mit einer Rate im Bereich von 0,1–1,2 vvm belüftet werden.
Das Zellvermehrungsverfahren kann auf einem Batch- oder Fed-Batch- oder kontinuierlichem Fermentationsverfahren beruhen. Die optimale Zelldichte und die Enzymaktivität kann in 15–24 h in einem Batch-Verfahren erhalten werden. Die Zellen können durch Ultrafiltration/Zentrifugation aus der Kulturbrühe geerntet werden. Die geernteten Zellen können entweder als solche verwendet werden oder in einem Gefriertrockenapparat getrocknet werden oder homogenisiert/ultrabeschallt werden und der resultierende zellfreie Extrakt zu einem trockenen Pulver lyophilisiert werden. Das nasse Zellpellet (20–25% Trockenmasse) kann eine Esterhydrolase-Aktivität von 15–20 KU/g aufweisen (eine Enzymeinheit ist die Menge an nassem Zellpellet, welche 1 μmol Triacetin in 1 min hydrolysiert und KU bedeutet 1000 Einheiten). Alternativ kann das nasse Zellpellet durch Ultrabeschallung, Homogenisierung mit und ohne Schleifmaterialien einer hohen Scherung ausgesetzt werden und der zellfreie Extrakt, der nach der Entfernung von Zelldebris erhalten wird, kann entweder direkt als das Enzym-Ausgangsmaterial verwendet werden oder es kann rohes Enzym durch fraktionierte Fällung mit Fällungsmitteln wie Aceton, Ethylalkohol, Polypropylenglycol, Ammoniumsulfat usw. isoliert werden und das resultierende Pulver als das Enzym verwendet werden. Alternativ kann das gewünschte Enzym aus dem rohen Protein gemäß den Standard-Enzymreinigungsverfahren isoliert werden, die im Stand der Technik verwendet werden, welche eine Reihe von Schritten wie Ammoniumsulfatfällung, Gelfiltration, Ionenaustausch und Affinitätschromatographie an Sephadex, DEAE-Sephadex und Phenylagarose umfassen können, wobei reines Protein mit einer Lipase/Esterase-Aktivität von 1500–1700 KU/g erhalten wird, und es wurde festgestellt, dass das Molekulargewicht des reinen Enzyms relativ zu Standardproteinen mit bekanntem Molekulargewicht 40 bis 50 Kilodalton betrug.
Die Herstellung einer Esterase/Lipase aus dem Stamm RRLY-15 (DSM 11829) ist eine wichtige Funktion dieses Stammes und das Enzym ist, was seine Substratspezifität und Stereoselektivität anbelangt, einzigartig. Der Stamm sowie die daraus isolierte stereoselektive Hydrolase wies 4–5 Tage lang stabile biochemische Eigenschaften bei 30–35°C bei einem pH-Wert von 6–9 auf. Das isolierte Enzym in seinem lyophilisierten Zustand in roher oder reiner Form verlor seine biochemischen Eigenschaften nicht, wenn es ein Jahr lang bei 4°C aufbewahrt wurde. Der Hefestamm RRLY-15 (DSM 11829) oder sein isoliertes Enzym in roher oder reiner Form kann entweder für eine einzelne Reaktion verwendet werden oder nach der Beendigung der Reaktion durch geeignete Mittel wie Ultrafiltration von dem Rektionsgemisch abgetrennt und für eine kinetische Racematspaltungsreaktion in Wasser oder in Puffern oder in organischen Lösungsmitteln wiederverwendet werden. Der Hefestamm RRLY-15 (DSM 11829) als solcher oder sein zellfreier Extrakt oder das daraus isolierte rohe oder reine Enzym erwies sich als sehr enantioselektiv und deshalb für die kinetische Racematspaltung von racemischen Mischungen, insbesondere für die von Alkylestern von (±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure (Naproxen) der Formel (1) brauchbar. Bei unserem Bemühen, die Verbindung der Formel (2) der Abbildung, die dieser Beschreibung beigefügt ist, herzustellen, haben wir die Biomasse von Trichosporon sp. RRLY-15, ihren zellfreien Extrakt, rohes und/oder reines Enzym, das daraus gewonnen wurde, verwendet und die entsprechenden Alkylester von Formel (1) erfolgreich in S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) aufgespalten, welche in den dieser Beschreibung beigefügten Abbildungen gezeigt ist.
Die kinetische Racematspaltung oder die bevorzugte Hydrolyse von nur einem der zwei enantiomeren Ester kann im vorliegenden Fall auf einen extrem großen Unterschied der Geschwindigkeit der Hydrolyse der zwei Enantiomere, welche die racemische Mischung umfasst, durch die Zellkultur oder den zellfreien Extrakt oder rohes oder reines Enzym, das aus dem Organismus isoliert wird, der zu der Gattung Trichosporon gehört und als RRLY-15 (DSM 11829) bezeichnet wird, zurückzuführen sein. Ein Racemat oder eine racemische Mischung ist eine äquimolare Mischung der enantiomeren Spezies und eine solche Mischung weist keinerlei optische Aktivität auf. In der chemischen Formel kann sie durch die Vorsilbe (±), (dl) oder (RS) oder rac- wiedergegeben werden und das einzelne Isomer oder Enantiomer wird durch die Vorsilbe (d) oder (l) oder (+) oder (-) wiedergegeben, wogegen (R) oder (S) die absolute Konfiguration wiedergibt.
Die aufgespaltene S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure (Naproxen) der Formel (2) weist die folgenden Spezifikationen auf
Weißer kristalliner Feststoff, kristallisiert aus Methanol, Schmelzpunkt 157°C, analysiert für C₁₄H₁₄O₃ (M⁺ bei m/e 230) [α]²⁵ _D + 67° (CHCl₃, C1,0)
Die Verwendung der Trichosporon-Spezies RRLY-15 (DSM 11829) in der Erfindung zum Zweck der kinetischen Racematspaltung ist neu, wie aus einer Durchsicht der Literatur hervorgeht. Der Stamm ist für die enantioselektive Hydrolyse des racemischen Esters von 6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (1) sehr spezifisch. Die katalytischen Eigenschaften für die kinetische Racematspaltung bleiben die gleichen, wenn die Trichosporon-Spezies RRLY-15 als nasse Ganzzellmasse oder lyophilisierte Zellmasse oder der zellfreie Extrakt oder rohes Enzym oder das reine isolierte Enzym in einer wässrigen Lösung oder Pufferlösung verwendet wird. Am meisten zeichnet sich das vorliegende Verfahren dadurch aus, dass eine Selektivität von 99 : 1 für S(+) bzw. R(–)-Ester erhalten wird, selbst wenn Substratkonzentrationen bis zu 160 g/l (> 650 mmol) verwendet werden.
Deshalb ist es die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein effizientes und wirtschaftliches Bioverfahren zur Herstellung von S(+)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (2) in einem einzigen Arbeitsgang unter Verwendung ganzer nasser oder trockener Mikrobenzellen oder von zellfreiem Extrakt oder dem rohen Enzym oder reinem Enzym, das aus Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) isoliert wird, bereit zu stellen.
Die kinetische Racematspaltung erfolgt durch enantioselektive Hydrolyse der entsprechenden S(±)-Alkylester wie etwa Methyl-, Ethyl-, Butylester und dergleichen der Formel (1), wobei das enantiomerenreine und geforderte Isomer (Eutomer) S(+)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure oder (Naproxen) der Formel (2) mit Ausbeuten bis zu 47 (94% der theoretischen Ausbeute) und einem enantiomeren Überschuss (ee ≥ 98%) erzeugt wird.
Eine weitere Aufgabe ist, reines S(+)-Natriumnaproxenat (eine weitere wünschenswerte Form des Arzneimittels) aus der racemischen Mischung von (±)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäurealkylestern wie etwa den Methyl-, Ethyl-, Butylestern und dergleichen der Formel (1) direkt herzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe ist, einen Alkylester von R(–)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (3) durch kinetische Racematspaltung von (±)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäurealkylestern, wie etwa den Methyl-, Ethyl-, Butylestern und dergleichen der Formel (1) abzutrennen und herzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, angereicherte Alkylester von R(–)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (3) herzustellen, welche nach der Racemisierung wiederverwendet werden können.
Entsprechend offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung von Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) als ganze Zellen in nasser oder trockener Form oder zellfreier Extrakt oder das rohe oder das reine isolierte Enzym für die Herstellung von S(+)-Naproxen der Formel (2) durch selektive Hydrolyse der Alkylester der Formel (1 ). Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte nach der Vermehrung von Trichosporon Sp. RRLY-15 durch Fermentationsmethoden gemäß dem vorstehend beschriebenen Stand der Technik:

(a) Behandeln von (±)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäurealkylestern wie etwa den Methyl-, Ethyl-, Butylestern und dergleichen der Formel (1) in einer Konzentration von 0,1 M bis 0,7 M mit einer Kultur von ganzen Hefezellen von Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) oder mit dem Pulver aus aufgebrochenen Zellen, das nach einer Lyophilisierung erhalten wird, oder mit dem daraus isolierten Enzym als zellfreier Extrakt oder dem rohen oder reinen Enzym als lyophilisiertes Pulver in Wasser oder Pufferlösung.
(b) Bewirken der kinetischen Racematspaltung bei einer Temperatur im Bereich von 5–45°C und einem pH im Bereich von 4–10.
(c) Trennen von S(+)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (2) und des Alkylesters von R(–)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (3) durch herkömmliche Verfahren. Die Trennung kann durch Lösungsmittelextraktion der angesäuerten Reaktionsmischung, die Zellmasse/Enzym, abgetrennte S(+)-Säure der Formel (2) und angereicherten R(–)-Ester der Formel (3) umfasst, unter Verwendung von Toluol, Dichlormethan, Ethylacetat, Butylacetat und dergleichen, gefolgt von einer Verteilung zwischen einer organischen Lösungsmittelschicht, die einen Ester der Formel (3) umfasst, und einer wässrigen basischen Schicht, die ein Alkalisalz von S(+)-Säure der Formel (2) umfasst, bewirkt werden. Die Salzbildung kann unter Verwendung einer Alkalilösung wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat oder dergleichen bewirkt werden. Das S(+)-Naproxen wird anschließend durch Ansäuerung ausgefällt, gefolgt von einer Filtration oder von einer Lösungsmittelextraktion.
(d) Alternativ kann das S(+)-Naproxen als sein Alkalisalz während des vorstehenden Verfahrens durch Ultrafiltration/Zentrifugation direkt aus der Reaktionsmischung erhalten werden. kann durch Lösungsmittelextraktion oder Salzbildung bewirkt werden.

Vorzugsweise kann die Salzbildung durch Verwenden einer Alkalilösung wie NaOH, KOH oder dergleichen bewirkt werden, gefolgt von einer Lösungsmittelextraktion zum Entfernen des Alkylesters von R(–)-Naproxen.
Vorzugsweise wird das S(+)-Naproxen anschließend durch Ansäuerung ausgefällt, gefolgt von einer Filtration oder Lösungsmittelextraktion.
Vorzugsweise wird die kinetische Racematspaltung in einer Pufferlösung, ausgewählt aus Phosphat-, Borat- und Trislösungen, durchgeführt.
Die kinetische Racematspaltung kann auch in gewöhnlichem destillierten Wasser durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird die S(+)-6-Methoxy-naphthalinessigsäure in Ausbeuten bis zu 47% (> 90% der theoretischen Ausbeuten) und mit einem enantiomeren Überschuss (ee) von > 98% gewonnen.
Vorzugsweise ist die Selektivität für den erhaltenen S(+)- und R(–)-Ester ein Verhältnis von 99 : 1, selbst wenn die verwendete Substratkonzentration bis zu 160 g/l (> 650 mmol) beträgt.
Vorzugsweise kann das S(+)-Naproxen (Säure) und der R(–)-Ester nach der Hydrolyse durch Lösungsmittelextraktion nach einer Ansäuerung gewonnen werden.
Vorzugsweise wird das für die Extraktion von S(+)-Naproxen verwendete Lösungsmittel aus chlorierten Lösungsmitteln wie Chloroform, Dichlormethan oder Lösungsmitteln mit mittlerer Polarität wie Ethylacetat, Diethylether oder Diisopropylether ausgewählt.
Vorzugsweise wird die Abtrennung der Zellen nach der Biotransformation durch Filtration oder Zentrifugation bewirkt.
Vorzugsweise kann die Mischung durch die Zugabe von 10% Gew./Vol. Schwefelsäure oder dergleichen auf pH 2–3 angesäuert werden und S(+)-Naproxen kann als Niederschlag erhalten werden.
Vorzugsweise wird das hydrolysierte S(+)-Naproxen (Säure) durch die Verwendung eines Alkalis wie NaOH oder KOH oder dergleichen in 10% Gew.-/Vol. als ihr Natriumsalz gewonnen, um Natriumnaproxen direkt herzustellen.
Vorzugsweise wird der unhydrolysierte Ester der Formel (3) durch Lösungsmittelextraktion oder Ansäuerung der wässrigen Lösung auf pH 2–4 gewonnen und die hydrolysierte Säure der Formel (2) kann durch Filtration oder Lösungsmittelextraktion gewonnen werden.
Die Erfindung wird in den nachstehend angegebenen Beispielen ausführlich beschrieben, welche nur zur Veranschaulichung angegeben sind, und deshalb sollten diese Bei spiele nicht so aufgefasst werden, als würden sie den Umfang der Reaktion beschränken.
Beispiel 1:
Herstellung von (+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) durch kinetische Trennung von (+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester der Formel (1) unter Verwendung einer nassen Ganzzellkultur von Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829)

(i) Es wurde ein Kulturmedium, das 1,5% Glucose, 0,05% Kaliumdihydrogenphosphat (KHP₂O₄), 1,0% Maisquellwasser und 0,3% Harnstoff enthielt, mit pH 6,8 vor der Sterilisierung und 6,5 nach der Sterilisierung, hergestellt und in Schüttelkolben (jeweils 200 ml) und in einen 10 l-Fermenter aus rostfreiem Stahl (SS 304s) (Arbeitsvolumen 7,5 l) eingefüllt und autoklaviert. Die Vorkultur des Stammes Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) wurde in dem Schüttelkolben durch Beimpfen mit dem Inhalt einer Öse der auf festem Agarmedium hergestellten Kultur und Inkubieren des Kolbens am Schüttler bei 30°C hergestellt. Die 24 h alte Vorkultur, die auf diese Weise hergestellt worden war, wurde in das Kulturmedium eingeimpft und die Fermentation bei 500 U/min, 0,5 vvm Belüftungsrate und einer konstanten Temperatur von 28°C 15–18 Stunden lang durchgeführt. Die Kultur wurde danach zentrifugiert, um die Hefezellen zu sammeln. Das Zellpellet wurde zweimal mit Wasser gewaschen und direkt für kinetische Trennungsstudien verwendet.
(ii) 122 g (500 mM) racemischer Methylester von 6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (1) wurde zu 1000 ml Wasser zugegeben, das 300–350 g der vorstehenden nassen Zellmasse von Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 48 h bei 30°C gerührt, wobei der pH der Lösung durch externe Zugabe von 1 M Natriumhydroxidlösung bei 8 ± 1 gehalten wurde. Danach wurde der Inhalt der Reaktionsmischung mit 10% Vol./Vol. Schwefelsäure auf pH 2–3 angesäuert und die gesamten Feststoffe durch Zentrifugation/Filtration abgetrennt. Die getrocknete feste Masse, welche die Zellmasse, S(+)-Naproxen und angereicherten R(–)-Naproxenester umfasste, wurde mit Ethylacetat (500 ml) extrahiert. Die freie S(+)-Naproxensäure wurde durch Extraktion mit 10% Gew./Vol. Natriumhydroxid von dem organischen Lö sungsmittel abgetrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Abstrippen des organischen Lösungsmittels ergab 66,5 g (270 mM) angereicherten R(–)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester der Formel (3). Die basisch gemachte wässrige Schicht, die S(+)-Natriumnaproxen enthielt, wurde mit verdünnter Säurelösung (10% Vol./Vol.) angesäuert und der weiße Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei (47,50 g, 210 mM) reine S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2), Schmelzpunkt 157°C, ee > 98% (chirale HPLC) erhalten wurde. Die Ausbeute der Esterhydrolyse entsprach 46,47%, was einer 93%igen theoretischen Umwandlung gleichkommt.

Beispiel 2:
Herstellung von Natrium-S(+)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) durch kinetische Trennung von (±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester der Formel (1) unter Verwendung einer getrockneten Ganzzellkultur von Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829)

(i) Die Hefezellmasse (300 g) Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829), die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurde bei 0°C lyophilisiert, um 90 g getrocknete Ganzzellkultur zu erhalten. Das lyophilisierte Hefepulver wurde direkt für die Katalyse der kinetischen Trennung verwendet.
(ii) 61 g (250 mM) racemischer Methylester von 6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (1) wurde zu 500 ml Wasser gegeben, das 50–60 g trockene Zellmasse von Trichosporon sp. RRLY-15 enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 45 h bei 30°C mit 800 U/min gerührt, wobei der pH der Lösung durch externe Zugabe von 1 M Natriumhydroxidlösung bei 7,0 ± 0,1 gehalten wird. Während der Reaktion wurde das gebildete Natriumsalz von S(+)-Naproxen durch Zentrifugation/Ultrafiltration als wässrige Lösung kontinuierlich entfernt und die Reaktionsmischung mit Wasser aufgefüllt, um das Volumen der Reaktionsmischung aufrecht zu erhalten. Diese Vorgang wurde während des Reaktionszeitraums viermal wiederholt, um den größten Teil des Natriumsalzes von S(+)-Naproxen zu entfernen. Die Reaktionsmischung wurde danach mit 10% Vol./Vol. Schwefelsäure auf pH 2–3 angesäuert und die gesamten Feststoffe wurden durch Zentri fugation/Filtration abgetrennt. Die nasse feste Masse, welche die Zellmasse, etwas S(+)-Naproxen und angereicherten R(–)-Naproxenester umfasste, wurde mit Toluol (500 ml) extrahiert. Die freie S(+)-Naproxensäure wurde durch Extraktion mit einer berechneten Menge von 10% Gew./Vol. Natriumhydroxid von dem organischen Lösungsmittel abgetrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Abstrippen des organischen Lösungsmittels ergab 33,25 g (136 mM) angereicherten R(–)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester der Formel (3). Die kombinierte wässrige Schicht, die S(+)-Natriumnaproxen umfasste, wurde unter Vakuum getrocknet, wobei (25,3 g, 105 mM) weißes Pulver von Natrium-S(+)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2), ee > 98% (chirale HPLC) erhalten wurde. Die Ausbeute entsprach 46,5% Hydrolyse (93% der theoretischen Ausbeute).

Beispiel 3:
Herstellung von S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) durch kinetische Trennung von (±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäureethylester der Formel (1) unter Verwendung einer nassen Ganzzellkultur von Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829).

(i) Die wie in Beispiel 1 hergestellte Hefezellmasse Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) wurde für die Katalyse der kinetischen Trennung verwendet.
(ii) Zu einer Suspension von 50 g (194 mM) racemischem Ethylester von 6-Methoxy-a-methylnaphthalinessigsäure der Formel (1) in 400 ml Phosphatpuffer (0,1 M) bei pH 8 wurden 150–160 g (22% Feststoff) nasse Zellmasse von Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 50 h bei 37°C mit 800 U/min gerührt und der pH der Lösung durch externe Zugabe von 1 M Natriumhydroxidlösung in einem pH-stat bei 7–8 gehalten. Das reine S(+)-Naproxen wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren von der Reaktionsmischung abgetrennt, wobei 28 g angereicherter R(–)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäureethylester der Formel (1) und 20,12 g (84 mM) S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) mit ee = 98% (chirale HPLC) erhalten wurden.

Beispiel 4:
Herstellung von S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) durch kinetische Spaltung von (±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester der Formel (1) unter Verwendung eines zellfreien Extrakt-Enzyms (rohen Enzyms), das aus den Zellen von Trichosporon sp RRLY-15 (DSM 11829) isoliert wurde.

(i) 400 g Zellmasse von Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, in 500 ml Wasser suspendiert und dazu 1000 ml Glasperlen mit einer Größe von 500 μm zugegeben und die Mischung wurde 15 min bei 0–4°C verwirbelt. Die verwirbelte Mischung wurde zentrifugiert, um 350 ml zellfreien Extrakt zu erhalten. Das Verfahren wurde dreimal wiederholt, um 1050 ml zellfreien Extrakt zu erhalten. Der zellfreie Extrakt wurde für die Katalyse der kinetischen Trennung verwendet.
(ii) Eine Suspension, umfassend 122 g (500 mM) racemischen Methylester von 6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (1) in 1000 ml wässriger Proteinlösung, die 7500 KU rohe Lipase enthielt, die aus Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) wie vorstehend beschrieben isoliert worden war, wurde 40 h bei 30°C gerührt, wobei der pH der Lösung durch externe Zugabe von 1 M Natriumhydroxidlösung bei 8 ± 1 gehalten wurde. Danach wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert/ultrafiltriert, um den löslichen Anteil, umfassend S(+)-Naproxensäure als Natriumsalz und Enzymprotein, abzutrennen. Die Feststoffe, die hauptsächlich den angereicherten R(–)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester umfassten, wurden mit 50 ml (100 mM) NaOH gefolgt von Wasser gewaschen. Die Feststoffe ergaben beim Trocknen 66,3 g (271 mM) des angereicherten R(–)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylesters der Formel (3). Die kombinierte wässrige Phase wurde durch ein Dialysiergerät/Ultrafilter geleitet, um die Enzymproteine zu entfernen. Der filtrierte wässrige Anteil wurde mit 1 M Schwefelsäure auf pH 3,0 angesäuert und der Niederschlag der freien Säure mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) erhalten wurde (52,50 g, 228 mM) ee > 98% (chirale HPLC). Somit wurden 46,5% Esterhydrolyse entsprechend einer 93%igen theoretischen Umwandlung erhalten.

Beispiel 5:
Herstellung von S-(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) durch kinetische Trennung von (±)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester der Formel (1) unter Verwendung von reinem Enzym das aus den Zellen von Trichosporon sp. RRLY-15 isoliert wurde.

(i) Rohes Enzym der Hefezelle Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) wurde wie in Beispiel 4 angegeben hergestellt. Das gewünschte Enzym wurde aus dem rohen Zellextrakt durch ein Reinigungsverfahren isoliert, welches eine Ammoniumsulfatfällung gefolgt von einer Gelfiltration, Ionenaustausch und Affinitätschromatographie auf Sephadex, DEAE-Sephadex und Phenylagarose umfasste. Das so erhaltene gereinigte Enzympräparat wurde für die Katalyse der kinetischen Trennung verwendet.
(ii) Eine Suspension, die 122 g (500 mM) racemischen Methylester von 6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (1) in 1000 ml wässrigen Proteinlösungen umfasste, die 7000 KU reines Lipaseenzym, das aus Trichosporon sp. RRLY-15 (DSM 11829) isoliert worden war, enthielten, wurde 40 h bei 30°C gerührt, wobei der pH der Lösung durch externe Zugabe von 1 M Natriumhydroxidlösung bei 8 ± 1 gehalten wurde. Danach wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert/ultrafiltriert, um den löslichen Anteil abzutrennen, der S(+)-Naproxensäure als Natriumsalz und Enzymprotein umfasste. Die Feststoffe, welche hauptsächlich den angereicherten R(–)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester umfassten, wurden mit 50 ml (100 mM) NaOH, gefolgt von Wasser gewaschen. Die Feststoffe ergaben beim Trocknen 66,4 g (272 mM) angereicherten R(–)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäuremethylester der Formel (3). Die kombinierten wässrigen Phasen wurden durch ein Dialysiergerät/Ultrafilter geleitet, um das Enzymprotein zu entfernen. Der filtrierte wässrige Anteil wurde mit 1 M Schwefelsäure auf pH 3,0 angesäuert und der Niederschlag der freien Säure mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei S(+)-6-Methoxy-α-methyl-2-naphthalinessigsäure der Formel (2) (52,40 g, 227 mM) mit ee > 98% (chirale HPLC) erhalten wurde. Die Ausbeute entsprach 46,3% Esterhydrolyse (92,6% der theoretischen).

Hinweis für die Beispiele 4 und 5
Eine Einheit des Enzyms ist die Menge an Enzym, welche 1 μmol Triacetin in 1 Minute hydrolysiert und KU bedeutet 1000 Einheiten.
Hinweis für die Beispiele 1–5
HPLC-Bedingungen:

Säule Lichro CART 250-4 (S,S)-Whelk-O 1,5 μm
Mobile Phase: n-Hexan: 2-Propanol : Essigsäure (90 : 10 : 0,25)
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min
Detektion: UV 254 nm

Claims

Trichosporon-Stamm, identifiziert als Trichosporon RRLY-15 DSM 11829.
Enzymatisches Trennungs- bzw. Racematspaltungsverfahren, umfassend die Trennung einer S(+)-α-Methylarylessigsäure oder eines Derivats davon, wobei das Trennungsverfahren mit einem Trichosporon-Stamm, identifiziert als Trichosporon RRLY-15 DSM 11829, bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Trichosporon-Stamm um ganze nasse Hefezellen oder lyophilisierte Zellen oder ihren zellfreien Extrakt oder das rohe Enzym oder das reine isolierte Enzym in Wasser oder Pufferlösungen handelt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die gewünschte Verbindung der Formel (2): –
mit 90 bis 93% theoretischer Ausbeute und > 98% optischer Reinheit bei einer Substratkonzentration von 60 bis 160 g/l hergestellt wird.
Verfahren wie in Anspruch 2 bis 4 beansprucht, wobei die Trennung durch Trichosporon sp als ganze nasse Zellmasse oder lyophilisierte Zellen oder ihren zellfreien Extrakt oder das rohe Enzym oder das reine isolierte Enzym in wässriger Phase oder in einem Puffer, ausgewählt aus Pufferlösungen wie Phosphat, Tris oder Borat und dergleichen, bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das kinetische Trennungsverfahren an (±)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäurealkylester der Formel (1): –
wobei R eine geradkettige oder verzweigte C₁-C₄-Alkylgruppe oder dergleichen bedeutet, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, welches den Schritt des Abtrennens von S(+)-6-Methoxy-α-methylnaphthalinessigsäure der Formel (2): –
oder eines Salzes davon einschließt.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 beansprucht, wobei S(+)-Naproxen während des vorstehenden Verfahrens als Natriumsalz isoliert wird.
Verfahren wie in den Ansprüchen 2 bis 8 beansprucht, wobei die Trennung in dem pH-Bereich von 5 bis 9 durchgeführt wird.
Verfahren wie in den Ansprüchen 2 bis 9 beansprucht, wobei die Trennung bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40°C bewirkt wird.