DE69914458T2 - Verfahren zur enzymatischen auflösung von laktamen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die enzymatische Trennung von Lactamestern. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Herstellung von Verbindungen nützlich, die als pharmazeutische, landwirtschaftliche und veterinäre Produkte oder als Ausgangsmaterialien und Intermediate für deren Synthese Nutzwert besitzen können.
  • Diskussion des Standes der Technik
  • Es ist im Stand der Technik bekannt, dass die chirale Trennung von Verbindungen unter Verwendung von Enzymen erzielt werden kann. Chirale Trennung unter Verwendung von Enzymen wie Esterasen bei aliphatischen Estern und cyclischen Verbindungen, die Ester enthalten, wird beispielsweise in W. Boland et al., Synthesis, 1049–1072, 1991, beschrieben. Chirale Trennungen unter Verwendung von Enzymen bei der Hydrolyse von aliphatischen Methylestern ist beispielsweise in H. Ohta et al., Chem. Lett., 657–660, 1992, beschrieben. Chirale Trennungen unter Verwendung von Enzymen bei Cyclohexansystemen sind unter anderem in M. Ohno, Tet. Lett., 29, 6961–6964, 1988; H. Hemmerle, Tet. Lett., 28, 3471–3474, 1987; und B. Brion, Tet. Lett., 33, 4889–4892, 1992, beschrieben. Chirale Trennungen unter Verwendung von Lipasen oder Acetylcholin-Esterasen bei Cycloheptanen, die Diacetate enthalten, werden bei. A. J. Pearson et al., JOC, 54, 3882, 1989, gefunden. Es ist berichtet worden, dass beta-Lactame durch Lipase an der Stickstofffunktion selektiv acyliert werden (C. Sih et al., JOC, 58,1068, 1993).
  • Jedoch gibt es für die enzymatische Trennung von Lactamestern keinen Stand der Technik. Häufig wird es gewünscht, ein einzelnes Enantiomer eines racemischen Lactamesters zu erhalten. Diese Verbindungen können als Intermediate zur Herstellung von Verbindungen verwendet werden, die als Ausgangsmaterialien und Intermediate für die Synthese pharmazeutischer, landwirtschaftlicher und veterinärer Produkte Nutzwert besitzen. Beispielsweise ist die enantiomer reine Form von 7-Carbomethoxycaprolactam eine nützliche Zwischenstufe bei der Synthese von pharmazeutischen Wirkstoffkandidaten.
  • Roberge, C. et al., "Process development for the production of the (S)-acid precursor of a novel elastase inhibitor through the lipase-catalyzed kinetic resolution of a β-lactam benzyl ester", Chemical Abstracts (1997), Bd. 126, Nr. 17 beschreiben Lipase PS-800 als geeigneten Biokatalysator für die Spaltung eines racemischen β-Lactambenzylesters zur (S)-Säure.
  • Das Dokument WO91/00362 beschreibt ein Enzymverfahren zur racemischen Trennung von 4-Aryl-2-oxopyrrolidin-3-carbonsäureestern.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Trennen enantiomerer Lactamester gerichtet. Die Lactamester werden mit einem Biokatalysator, der ein thermostabiles Enzym ist, in einer wässrigen Lösung, einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus organischen und wässrigen Lösungsmitteln in Kontakt gebracht, wobei nur ein Enantiomer unter Erhalt des optisch aktiven Isomers der entsprechenden Säure selektiv hydrolysiert wird. Das Hydrolyseprodukt wird dann von den nicht-umgesetzten Lactamestern unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardverfahren abgetrennt. Diese Erfindung offenbart auch ein neuartiges Verfahren zur Rückgewinnung und Wiederverwendung der Enzyme ebenso wie zur Racemisierung beider Enantiomere des Lactamesters nach enzymatischer Spaltung.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung ist auf das Inkontaktbringen racemischer Lactamester mit einem Biokatalysator gerichtet, der thermostabil ist, wobei eines der optischen Isomere selektiv unter Erhalt des optisch aktiven Isomers der entsprechenden Säure hydrolysiert wird. Die optisch aktiven Produkte werden nachfolgend unter Verwendung geeigneter Verfahren isoliert/gereinigt.
  • Nur zu Anschauungszwecken wird das erfindungsgemäße Verfahren durch das folgende Beispiel der enzymatischen Spaltung eines racemischen 7-Carbomethoxycaprolactams, in dem die S-Konfiguration in die entsprechende Säure umgewandelt wird, veranschaulicht:
  • Figure 00020001
  • Wegen der Einfachheit wird hierin das Verfahren unter Verwendung racemischer Lactamester beschrieben. Jedoch ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung der racemischen Form beschränkt. Die Lactamester können in der optisch aktiven Form oder in nicht-racemischen Gemischen, die einen Überschuss an einem der optischen Isomeren aufweisen, vorliegen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, dass das Lactamgemisch auf eine derartige Weise reagiert, dass nur eines der beiden enantiomeren Ester des Lactams in seine Säure umgewandelt wird.
  • Der Begriff "stereoselektive Hydrolyse" bezeichnet die begünstigte Hydrolyse eines Enantiomers relativ zum anderen. Der Begriff "Gemisch", wie er hierin in Verbindung mit enantiomeren Verbindungen verwendet wird, bedeutet Gemische mit gleichen (racemischen) oder nicht-gleichen Mengen der Enantiomeren. Der Begriff "Trennung" bzw. "Spaltung" (resolution) bedeutet teilweise ebenso wie, vorzugsweise, vollständige Trennung bzw. Spaltung. Der Begriff "enzymatischer Prozess" oder "enzymatisches Verfahren" oder "enzymatische Reaktion" bedeutet ein Prozess oder ein Verfahren oder eine Reaktion der vorliegenden Erfindung, wobei ein Enzym oder ein Mikroorganismus verwendet wird. Der Begriff "Enantiomerenüberschuss"/"Enantiomerenüberschüsse" bezieht sich auf den älteren Begriff "optische Reinheit". In einem Gemisch eines reinen Enantiomers (R oder S) und eines Racemats ist der Enantiomerenüberschuss der Über schuss des Enantiomers im Vergleich zum Racemat in Prozent. Er kann beispielsweise durch die folgende Gleichung ausgedrückt werden:
  • Figure 00030001
  • Das Enzym kann irgendein Enzym sein, das aus Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen usw. erhalten werden kann. Das Enzym kann in irgendeiner herkömmlichen Form, wie in einer gereinigten Form, in einer Rohform, im Gemisch mit anderen Enzymen, in einer mikrobiellen Fermentationsbrühe, in einer Fermentationsbrühe, in einem mikrobiellen Körper, in einem Filtrat einer Fermentationsbrühe und dergleichen entweder allein oder in Kombination verwendet werden. Zusätzlich kann das Enzym oder der mikrobielle Körper an einem Harz immobilisiert sein.
  • Die Aktivitäten der in dieser Erfindung verwendeten Enzyme werden in "Einheiten (units)" ausgedrückt. Einheiten sind als die Geschwindigkeit der Hydrolyse von p-Nitrophenylpropionat pro Minute, ausgedrückt in μmol/min bei Raumtemperatur, definiert.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung thermostabiler Esterasen und gentechnisch veränderter bzw. hergestellter Esterasen zur Trennung der Lactamester gerichtet. Diese Enzyme, kommerziell von ThermoGen, Inc., erhältlich, sind insbesondere zur Verwendung in industriellen Verfahren geeignet und leicht zu verwenden. Zusätzlich dazu, dass sie über einen weiten Temperaturbereich einschließlich höherer Temperaturen arbeiten, besitzen diese thermostabilen Enzyme eine erhöhte Lebensdauer, was die Handhabung verbessert. Die Enzyme sind auch dazu in der Lage, aufgrund ihrer Stabilität unter Betriebsbedingungen gegenüber rauen, nicht-biologischen Bedingungen (pH, Salzkonzentrationen usw.) beständig zu sein, die gewöhnlicherweise mit industriellen Verfahren in Verbindung stehen. Sie können zur Wiederverwendung in mehreren Anwendungen immobilisiert sein und damit die Kosteneffektivität des Verfahrens verbessern. Während der Isolierung der Produkte nach der enzymatischen Trennung werden die Enzyme häufig Spuren organischer Lösungsmittel ausgesetzt. Darüber hinaus hat man herausgefunden, dass einige enzymatische Trennungen am besten in einem Gemisch von wässrigen und organischen Lösungsmitteln oder in organischen Lösungsmitteln allein funktionieren. Die Esteraseenzyme der vorliegenden Erfindung sind toleranter gegenüber Denaturierung durch viele organische Lösungsmittel im Vergleich zu herkömmlichen Enzymen, was eine längere Halbwertszeit im Betrieb zulässt. Die meisten Esteraseenzyme werden unter Verwendung von gentechnischen Methoden des Genklonens hergestellt, was die Reinheit dieser Enzyme und die Erleichterung der Prozesskontrolle beim Scale-up gewährleistet.
  • Man entdeckte, dass viele Esterase- und Lipaseenzyme ein hohes Maß an Stereoselektivität bei der Trennung von Lactamestern bieten. Die bevorzugten Enzyme zur Trennung von Lactamestern schließen die Thermoesterasen THERMOCAT E002, THERMOCAT E010, THERMOCAT E015 und THERMOCAT E020 von ThermoGen, Inc., ein, wobei das am meisten bevorzugte Enzym THERMOCAT E020 ist.
  • Anstelle der isolierten Enzyme kann ebenso ein Mikroorganismus verwendet werden, der eines der oben aufgeführten Enzyme produzieren kann.
  • Das Enzym oder die Mikroorganismen können allein oder in Kombination verwendet werden. In Abhängigkeit von der An des verwendeten Enzyms oder Mikroorganismus wird eines der optischen Isomere des Lactamesters unter Erhalt der optisch aktiven Säure überwiegend hydrolysiert. Eines der optischen Isomere kann durch die Wahl eines geeigneten Enzyms oder Mikroorganismus erhalten werden.
  • Die enzymatische Hydrolyse der vorliegenden Erfindung kann durch Inkontaktbringen der Lactamester mit dem Enzym oder Mikroorganismus üblicherweise in einem wässrigen Puffermedium unter gutem Rühren durchgeführt werden.
  • Das Puffermedium können anorganische Säuresalzpuffer (z. B. Kaliumdihydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat), organische Säuresalzpuffer (z. B. Natriumcitrat) oder ein anderer geeigneter Puffer sein. Die Konzentration des Puffers kann zwischen 0,005 und 2 M, vorzugsweise zwischen 0,005 und 0,5 M schwanken und wird von dem speziellen Lactamester und den verwendeten Enzymen oder dem verwendeten Mikroorganismus abhängen.
  • In Abhängigkeit von der Löslichkeit der Lactamester kann ein oberflächenaktiver Stoff zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden um das Substrat zu solubilisieren. Bevorzugte oberflächenaktive Mittel schließen nicht-ionische, oberflächenaktive Mittel, wie Alkylarylpolyetheralkohole, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Ein bevorzugtes oberflächenaktives Mittel ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, kommerziell als Triton X-100 (von Sigma Chemical Company) erhältlich. Eine wirksame Menge eines oberflächenaktiven Mittels wird verwendet. Typische Mengen können zwischen 0,05% und etwa 10% schwanken.
  • Manchmal ist es bevorzugt, eine wirksame Menge eines organischen Co-Lösungsmittels zuzugeben um die Produktlöslichkeit zu erhöhen um die Reaktion zu ermöglichen. Beispiele von Lösungsmitteln schließen Acetonitril, THF, DMSO, DMF, Alkohole usw. ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Wirksame Mengen eines Co-Lösungsmittels schließen 1% bis 30%, in Abhängigkeit vom speziellen Lactamester und den verwendeten Enzymen oder dem verwendeten Mikroorganismus ein.
  • Der pH-Wert der Puffer oder der pH-Wert der Reaktion beträgt normalerweise 4 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9 und am meisten bevorzugt 7 bis 8. Die Reaktionstemperatur kann zwischen 0 und 100°C schwanken und wird vom speziellen Lactamester und den verwendeten Enzymen oder dem verwendeten Mikroorganismus abhängen. Die Reaktionszeit beträgt im Allgemeinen 1 Stunde bis 70 Stunden und wird vom speziellen Lactamester, der Enzymkonzentration sowie den verwendeten Enzymen oder dem verwendeten Mikroorganismus abhängen. Normalerweise lässt man die enzymatische Hydrolyse für eine Zeit ablaufen, die dazu ausreichend ist, eine zufrieden stellende Menge der gewünschten Ester oder der gewünschten Säure in zufrieden stellender optischer Reinheit zu bilden. Während des Ablaufs der Reaktion können die Menge des gewünschten Esters oder der gewünschten Säure und ihre optischen Reinheiten durch HPLC und chirale HPLC beobachtet werden. Normalerweise wird die Umwandlung bis annähernd 50% durchgeführt. Danach werden die Säure und die Ester gewöhnlicherweise nach der Isolierung in guten Ausbeuten erhalten.
  • Die Menge des verwendeten Enzyms kann über einen weiten Bereich von 5 Einheiten bis 12.000 Einheiten Enzym pro mol Ausgangsmaterialien schwanken. (Die Aktivitäten der in dieser Erfindung verwendeten Enzyme werden in "Einheiten" ausgedrückt. Einheiten sind als die Geschwindigkeit der Hydrolyse von p-Nitrophenylpropionat pro Minute, ausgedrückt in μmol/min bei Raumtemperatur, definiert). Die erforderliche Menge an Enzym wird von der Temperatur, dem speziellen Lactamester, den verwendeten Enzymen und/oder dem verwendeten Mikroorganismus sowie der erstrebenswerten Reaktionszeit abhängen. Es kann ebenso erstrebenswert sein, in einigen Fällen eine große Menge an Enzymen zu verwenden um eine praktikabel kurze Reaktionszeit zu gewährleisten, besonders wenn die Enzyme immobilisiert sind und für viele Turnovers verwendet werden können. Die Konzentration des Estersubstrats kann zwischen 0,1 g/l bis 100 g/l liegen und hängt vom speziellen Lactamester und dem verwendeten Enzym und/oder Mikroorganismus ab.
  • Die Enzyme und/oder Mikroorganismen, die in dieser Erfindung verwendet werden, können in roher Form oder in einer immobilisierten Form sein. Sie können an verschiedene feste Träger ohne Verlust an Stereospezifität oder Änderung in der Stereoselektivität immobilisiert sein. Die festen Träger können inerte Absorbentien sein, an die das Enzym nicht covalent gebunden ist. Stattdessen ist das Enzym beispielsweise durch Wechselwirkungen hydrophober oder hydrophiler Teile eines Proteins mit ähnlichen Bereichen des inerten Absorbens durch Wasserstoffbrückenbindung, durch Salzbrückenbildung oder durch elektrostatische Wechselwirkungen adsorbiert. Inerte Absorbensmaterialien schließen synthetische Polymere (z. B. Polystyrol, Poly(vinylalkohol), Polyethylen und Polyamide), mineralische Verbindungen (z. B. Diatomeenerde und Fuller-Erde) oder natürlich vorkommende Polymere (z. B. Cellulose) ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Spezielle Beispiele derartiger Materialien schließen Celite 545-Diatomeenerde, Abelite XAD-8-Polymerharzperlen und Polyethylenglykol 8000 ein.
  • Das Enzym kann ebenso an dem Träger immobilisiert sein, an den das Enzym covalent gebunden ist (z. B. Oxiran-Acrylperlen und Glutaraldehyd-aktivierte Träger). Spezielle Beispiele schließen Eupergit C-Oxiran-Acrylperlen und Glutaraldehyd-aktiviertes Celite 545 ein. Andere mögliche Immobililsierungssysteme sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymimmobilisierung gut bekannt und leicht zugänglich.
  • Anstelle des oben erwähnten, herkömmlichen Immobilisierungsverfahrens wurde entdeckt, dass Enzyme auch auf herkömmliche Weise zur Wiederverwendung zurückgewonnen werden konnten, indem die verwendeten Enzyme einfach mit Ammoniumsulfat ausgefällt wurden. Das ausgefällte Enzym-Ammoniumsulfat konnte direkt in der nächsten enzymatischen Hydrolyse eingesetzt werden. Salze werden üblicherweise zur Reinigung von Enzymen verwendet. Im Allgemeinen schützen sie die Proteinenzyme, indem sie die Lösungsmittel-Aktivität verringern.
  • Man entdeckte, dass Ammoniumsulfat, Kaliumsulfat, Kaliumphosphat, Natriumchlorid usw. beim Regenerieren der Enzymaktivität von Thermoesterase (E020) wirksam sind. Unter diesen Salzen ist Ammoniumsulfat das bevorzugte.
  • Die gewünschten Produkte, der optisch reine (oder angereicherte) nicht-umgesetzte Ester und die optische reine (oder angereicherte) Säure kann aus dem Hydrolysegemisch unter Verwendung herkömmlicher Methoden, wie Extraktionen, Säure-Base-Extraktionen, Filtration, Chromatographie, Kristallisation oder Kombinationen davon, isoliert werden. Das zurückgewonnene Enzym oder der zurückgewonnene Mikroorganismus kann wie oben beschrieben wieder verwendet werden.
  • Bei einem geeigneten Isolationsverfahren wird der pH-Wert nach der enzymatischen Hydrolyse auf pH 7,5 bis 8 (im Falle immobilisierter Biokatalysatoren wird der Biokatalysator zuerst durch Filtration abgetrennt), die Produktsäure wird vom nicht-umgesetzten Ester durch Extraktion des Esters mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Ethylacetat, Diethylether, Methyl-t-butylether oder irgendeinem anderen Lösungsmittel, in dem das Substrat löslich und stabil ist, abgetrennt. Das Einengen der organischen Extrakte liefert den optisch reinen (oder angereicherten) nicht-umgesetzten Ester. Das Einengen der wässrigen Phase liefert die optisch reine (oder angereicherte) Säure.
  • Die Säure kann aus den Puffersalzen und dem Enzym durch selektives Ausfällen oder Chromatographie oder andere, dem Fachmann bekannte Verfahren freigesetzt werden. Diese schließen das Ansäuern der wässrigen Phase auf pH 3 (oder niedriger) und Isolieren der Säure durch Extrahieren der Säure mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Ethylacetat, Diethylether, Methyl-t-butylether oder irgendeinem anderen Lösungsmittel, in dem die Säure löslich und stabil ist, ein. Einengen der organischen Extrakte liefert den optisch reinen (oder angereicherten) nicht-umgesetzten Ester und die optisch reine (oder angereicherte) Säure, die von den Puffersalzen und dem Enzym durch selektives Ausfällen oder Chromatographie oder andere, dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannte Verfahren gereinigt und freigesetzt werden.
  • Sowohl der optisch reine (oder angereicherte), nicht-umgesetzte Ester als auch die optisch reine (oder angereicherte) Säure könnte racemisiert werden, wenn dies so gewünscht wird. Der optisch reine (oder angereicherte), nicht-umgesetzte Ester könnte durch Erwärmen in der geeigneten Base unter geeigneten Bedingungen racemisiert werden. Alternativ dazu könnte der optisch reine (oder angereicherte), nicht-umgesetzte Ester durch Erwärmen in Säure in Gegenwart eines Alkohols unter geeigneten Bedingungen racemisiert werden. Die optisch reine (oder angereicherte), nicht-umgesetzte Säure könnte ebenso zu den racemischen Estern durch Erwärmen in Säure in Gegenwart eines Alkohols unter geeigneten Bedingungen racemisiert und umgewandelt werden. Auf diese Weise lassen sich ausgezeichnete Ausbeuten sowohl an optisch reinem (oder angereichertem), nicht-umgesetzten Ester oder an optisch reiner (oder angereicherter) Säure durch diese Kombination von stereoselektiver, enzymatischer Hydrolyse und Racemisierungstechniken erzielen.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die enzymatische Trennung von Lactamestern der Formel II gerichtet:
    Figure 00070001
    wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein können: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy und Halogen;
    L ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus keiner Gruppe oder Alkylen, Alkenylen und Alkinylen;
    worin L gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein kann: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyl, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Arylamino, Aminoaryl, Alkylaminoaryl, Cyano und Halogenalkyl;
    X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (CH2)p und CH=CH;
    wobei p = 1 bis 4;
    Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NH, O, (CH2)q und CH=CH;
    wobei q = 1 bis 2;
    Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (CH2)v und CH=CH;
    wobei v = 1 bis 2;
    R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Cyano und Halogenalkyl, wobei alle Substituenten gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein können: Halogen, Alkyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Hydroxy und Alkoxy;
    wobei die enzymatische Trennung das Inkontaktbringen der Lactamester mit einem Biokatalysator in wässriger Lösung, einem organischen Lösungsmittel oder in einem Gemisch aus organischen und wässrigen Lösungsmitteln, wobei nur ein Enantiomer selektiv unter Erhalt des optisch aktiven Isomers der entsprechenden Säure hydrolysiert wird, und das Abtrennen des Hydrolyseprodukts von den nicht-umgesetzten Lactamestern umfasst, wobei der Biokatalysator aus wärmebeständigen Enzymen stammt.
  • Bevorzugter ist die vorliegende Erfindung auf die enzymatische Trennung von Lactamestern der Formel (III) gerichtet:
    Figure 00080001
    wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein können: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy und Halogen;
    Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NH, O, (CH2)q und CH=CH;
    wobei q = 1 bis 2;
    Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (CH2)v und CH=CH;
    wobei v = 1 bis 2;
    R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Cyano und Halogenalkyl, wobei all diese Substituenten gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein können:
    Halogen, Alkyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Hydroxy und Alkoxy;
    Sogar noch bevorzugter ist die vorliegende Erfindung auf die enzymatische Trennung der Lactamester der Formel (IV) gerichtet:
    Figure 00080002
    wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein können: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy und Halogen;
    Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NH, O, (CH2)q und CH=CH;
    wobei q = 1 bis 2;
    R2, R3 und R4 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Cyano und Halogenalkyl, wobei all diese Substituenten gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein können: Halogen, Alkyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Hydroxy und Alkoxy.
  • Am bevorzugtesten ist die vorliegende Erfindung auf die enzymatische Trennung von Lactamen der Formel (V)gerichtet:
    Figure 00090001
    wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein können: Alkyl, Alkenyl, Alkenyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy und Halogen;
    R2, R3 und R4 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Cyano und Halogenalkyl, wobei all diese Substituenten gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein können: Halogen, Alkyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Hydroxy und Alkoxy.
  • Wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Begriff "Alkyl" allein oder in Kombination eine acyclische Alkylgruppe, die 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 8, Kohlenstoffatome und bevorzugter 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele derartiger Gruppen schließen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Isoamyl, Hexyl, Octyl und dergleichen ein.
  • Der Begriff "Alkenyl" bezeichnet eine ungesättigte acyclische Kohlenwasserstoffgruppe, sofern sie mindestens eine Doppelbindung enthält. Derartige Gruppen enthalten 2 bis 10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 2 bis 8 Kohlenstoffatome und bevorzugter 2 bis 6 Kohlenstoffatome. Beispiele geeigneter Alkenylgruppen schließen Propylenyl, Buten-1-yl, Isobutenyl, Pentenylen-1-yl, 2,2-Methylbuten-1-yl, 3-Methylbuten-1-yl, Hexen-1-yl, Hepten-1-yl und Octen-1-yl und dergleichen ein.
  • Der Begriff "Alkenyl" bezeichnet eine ungesättigte acyclische Kohlenwasserstoffgruppe, sofern sie eine oder mehrere Dreichfachbindungen enthält, wobei derartige Gruppen 2 bis 10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 2 bis 8 Kohlenstoffatome und bevorzugter 2 bis 6 Kohlenstoff atome enthalten. Beispiele geeigneter Alkinylgruppen schließen Ethinyl-, Propinyl-, Butin-1-yl-, Butin-2-yl-, Pentin-1-yl-, Pentin-2-yl-, 3-Methylbutin-1-yl-, Hexin-1-yl-, Hexin-2-yl-, Hexin-3-yl-, 3,3-Dimethylbutin-1-yl-Gruppen und dergleichen ein.
  • Der Begriff "heterocyclische Gruppe" bedeutet eine ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 3 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, wobei 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatome durch Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ersetzt sind. Die "heterocyclische Gruppe" kann an eine aromatische Kohlenwasserstoffgruppe kondensiert sein. Geeignete Beispiele schließen Pyrrolyl, Pyridinyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Indolyl, Thiophenyl, Furanyl, Tetrazolyl, 2-Pyrrolinyl, 3-Pyrrolinyl, Pyrrolidinyl, 1,3-Dioxolanyl, 2-Imidazolinyl, Imidazolidinyl, 2-Pyrazolinyl, Pyrazolidinyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, 1,2,3-Oxadiazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,3,4-Thiadiazolyl, 2H-Pyranyl, 4H-Pyranyl, Piperidinyl, 1,4-Dioxanyl, Morpholinyl, 1,4-Dithianyl, Thiomorpholinyl, Pyrazinyl, Piperazinyl, 1,3,5-Triazinyl, 1,3,5-Trithianyl, Benzo(b)thiophenyl, Benzimidazonyl, Chinolinyl und dergleichen ein.
  • Der Begriff "Aryl" bedeutet eine aromatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 6 bis 12 Kohlenstoffatomen und bevorzugt 6 bis 10 Kohlenstoffatomen. Beispiele geeigneter aromatischer Kohlenwasserstoffgruppen schließen Phenyl, Naphthyl und dergleichen ein.
  • Der Begriff "Heteroaryl" bedeutet eine aromatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 6 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen und bevorzugter 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatome durch Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ersetzt sind.
  • Der Begriff "Cycloalkyl" oder "Cycloalkenyl" bedeutet eine alicyclische Gruppe in einem Ring mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele geeigneter alicyclischer Gruppen schließen Cyclopropyl, Cyclopropylenyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, 2-Cyclohexen-1-ylenyl, Cyclohexenyl und dergleichen ein.
  • Der Begriff "Alkoxy", allein oder in Kombination, bedeutet eine Alkylethergruppe, wobei der Begriff Alkyl wie oben definiert ist und die am meisten bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele geeigneter Alkylethergruppen schließen Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, iso-Butoxy, sek.-Butoxy, tert.-Butoxy und dergleichen ein.
  • Der Begriff "Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
  • Der Begriff "Pro-Pharmakon" bezeichnet eine Verbindung, die in vivo wirksamer gemacht wird.
  • Wie sie hierin verwendet wird, soll eine Bezugnahme auf "Behandlung" eines Patienten Prophylaxe einschließen.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Enzymatische Trennung von racemischem 7-Carbomethoxycaprolactam
  • Vier Enzyme wurden jeweils in 20 ml Puffer (pH 7, Sigma-Phosphatpuffer mit einer Konzentration von 0,1 mol/Liter) gelöst, wodurch vier getrennte Lösungen gebildet wurden. Racemi sches 7-Carbomethoxycaprolactam wurde zu jeder Lösung gegeben. Nachfolgend ließ man jede Lösung bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) reagieren. Nach speziellen Zeitintervallen wurden Proben gezogen (nicht-einheitlich im Volumen) und deren pH-Wert wurde gemessen.
  • Jede Probe wurde dann mit 0,5 N KHSO4 auf pH = 1 angesäuert und dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO4), filtriert, im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und einer HPLC-Analyse unterzogen. Der Anteil der wiedergewonnenen Masse betrug durchschnittlich 60%. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1 Daten für Enzyme von Alltus Biologics
    Figure 00110001
  • Beispiel 2: Enzymatische Trennung von racemischem 7-Carbomethoxycaprolactam
  • Sieben Enzyme wurden jeweils in 50 ml Puffer (pH 7) (zu Sigma-Phosphatpuffer mit einer Konzentration von 0,1 mol/Liter und einem pH-Wert von 7,4 wurde Phosphorsäure gegeben) gelöst, wobei sieben getrennte Lösungen gebildet wurden. Racemisches 7-Carbomethoxy caprolactam wurde zu jeder Lösung gegeben, so dass 500 Einheiten des Enzyms pro 500 mg Estersubstrat verwendet wurden. Man ließ jede Lösung nachfolgend bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) reagieren. Nach speziellen Zeitintervallen wurden Proben gezogen (nicht-einheitlich im Volumen) und deren pH-Wert wurde gemessen.
  • Jede Probe wurde dann mit 1M KHSO4 auf pH = 1 angesäuert und nachfolgend mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO4), filtriert, im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und einer HPLC-Analyse unterworfen. Der Anteil der wiedergewonnenen Masse betrug durchschnittlich 50 bis 60%. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2 – Aufarbeitung durch Extraktion
    Figure 00120001
  • Vier der Enzyme wurden ebenfalls getrennt mit 1M KHSO4 aufgearbeitet und nachfolgend lyophilisiert. Der Rückstand wurde umfassend mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte wurden im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und einer HPLC-Analyse unterzogen. Dieses Verfahren verbesserte den Anteil der zurückgewonnenen Masse auf etwa 90%. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Wie aus Tabelle 3 zu sehen ist, sinkt der pH-Wert stetig während der Hydrolysereaktion.
  • Tabelle 3 – Aufarbeitung durch Lyophilisierung
    Figure 00130001
  • Beispiel 3: Enzymatische Trennung von racemischem 7-Carbomethoxycaprolactam
  • Eine Reaktion wurde unter Verwendung von E002 unter den in Beispiel 2 aufgeführten Bedingungen mit der Ausnahme durchgefüfrt, dass während der gesamten Reaktion ein pH-Stat zum Aufrechterhalten eines konstanten pH-Werts von 7 eingesetzt wurde. Das Enzym wurde mit 1M KHSO4 aufgearbeitet und dann lyophilisiert. Der Rückstand wurde mit Methylenchlorid umfassend extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und einer HPLC-Analyse unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4 – Aufarbeitung durch Lyophilisierung
    Figure 00140001
  • Beispiel 4: Enzymatische Trennung von racemischem 7-Carbomethoxycaprolactam bei Temperaturen oberhalb von Raumtemperatur
  • Eine Lösung von 33,3 g Natriumhydrogenphosphat in 2000 ml entionisiertem Wasser und dann eine Lösung von 22,4 g Kaliumdihydrogenphosphat in 1300 ml entionisiertem Wasser wurde in ein Reaktionsgefäß eingefüllt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten lang bei 47°C bis 48°C gerührt und 2,28 g ThermoCat-Biokatalysator E020 (Aktivität: 18,5 Einheiten/mg) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten lang oder bis eine homogene Lösung erhalten wurde, gerührt. Zu dem obigen Gemisch wurden 60 g 7-Carbomethoxycapro-lactam gegeben und das Reaktionsgemisch bei 47°C bis 48°C gerührt. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch HPLC beobachtet. Als das ungewünschte Ester-Enantiomer vollständig verschwunden war, was 3 bis 8 h dauerte, wurde die Temperatur des Reaktionsgemisches auf 25°C bis 27°C gesenkt. Das Produktgemisch wurde mit 3 x 1100 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, über Celite filtriert und unterhalb von 25°C zur Trockene eingeengt, was 22 g eines weißen wachsigen Feststoffs ergab (73% der Theorie). HPLC-Analyse und ein Vergleich mit Standardproben zeigten, dass der isolierte Feststoff das gewünschte R-Enantiomer ist.
  • Beispiel 5: Verfahren zur Wiedergewinnung und Wiederverwendung von Enzymen
  • Enzymfällung
  • Ein 20 ml-Reaktionsgemisch, das 2 mmol Phosphatpuffer (pH 7,6), 140 Einheiten der Thermoesterase ThermoCat E020 und 200 mg des Substrats, 7-Carbomethoxycaprolactam, enthielt, wurde 2 Stunden lang bei 48°C in einem Wasserbadrüttler inkubiert. Parallel dazu wurde ein Kontrolllauf ohne die Zugabe des Enzympräparats durchgeführt. Am Ende der Reaktion wurde eine 18 ml-Probe gesammelt und behutsam mit 7,2 g Ammoniumsulfat vermischt. Nachdem das Salz vollständig gelöst war, erreicht die Lösung annähernd 60% Sättigung und das Proteinenzym wurde ausgefällt. Das Proteinenzym wurde dann durch 20-minütige Zentrifugation bei 4°C zurückgewonnen.
  • Rückgewinnung und Wiederverwendung des Enzyms
  • Das ausgefällte Proteinenzym wurde in 1,8 mmol Phosphatpuffer (pH 7,6) erneut aufgelöst und in einer Reaktion einer zweiten Charge eines erneut gebildeten 18 ml-Gemisches getes tet. Das Substrat 7-Carbomethoxycaprolactam wurde auf 180 mg verringert und nachfolgend wurde die Reaktion gemäß dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben durchgeführt. Am Ende der zweiten Reaktion wurde eine 16 ml-Probe gesammelt und 6,4 g Ammoniumsulfat wurden zur Isolierung des Enzyms verwendet. Die dritte Wiedergewinnungsreaktion wurde gemäß demselben Verfahren in einem erneut gebildeten 16 ml-Gemisch durchgeführt, das 160 mg Substrat enthielt. Die Produkte wurden durch HPLC-Analyse analysiert. Die Ergebnisse (HPLC-Flächenprozentsätze) dieser Experimente sind in Tabelle 5 gezeigt.
  • Tabelle 5
    Figure 00150001
  • Aus den obigen Daten kann gefolgert werden, dass diese Enzym-Wiedergewinnungsverfahren mit einer Ammoniumsulfatausfällung ein einfaches Verfahren zur Wiedergewinnung des Enzyms zur erneuten Verwendung sind.
  • Beispiel 6: Verfahren zur Racemisierung von chiralem 7-Carbomethoxycaprolactam
  • Methode A
  • Zu einem Gemisch aus 5 Mikrolitern 25%igem Natriummethoxid in Methanol (22 Mikromol Natriummethoxid) und 1 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF) wurden unter Stickstoff 54 mg optisch reines (R)-7-Carbomethoxycaprolactam zugegeben. Das Gemisch wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch ein Dowex® 50WX200-Ionenaustauschharz (Dowex-50W-Wasserstoff, stark sauer, vorher mit Wasser gewaschen, aber nicht getrocknet) filtriert, mit zusätzlichem THF gewaschen und zur Trockene eingeengt, was 44 mg Produkt ergab. Die HPLC-Analyse des Produkts zeigte, dass das Ausgangsmaterial, (R)-7-Carbomethoxycaprolactam, vollständig zu einem 50/50-Gemisch der R- und S-Isomere (R)-7-Carbomethoxycaprolactam und (S)-7-Carbomethoxycaprolactam, racemisiert hat.
  • Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass man, wenn man von (S)-7-Carbomethoxycaprolactam als Ausgangsmaterial ausgehen würde, dasselbe racemische Produktgemisch erhalten würde.
  • Methode B
  • Zu einem Gemisch von 1 ml trockenes Tetrahydrofuran (THF) und 54 mg optisch reines (R)-7-Carbomethoxycaprolactam wurden unter Stickstoff 0,47 ml Lithiumdiisopropylamid (LDA)/THF in Cyclohexan (1,5M, 70 Millimol LDA) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch ein Dowex® 50WX200-Ionenaustauschharz (Dowex-50W-Wasserstoff, stark sauer, vorher mit Wasser gewaschen, aber nicht getrocknet) filtriert, mit zusätzlichem THF gewaschen und zur Trockene eingeengt, was 34 mg Produkt ergab. Die HPLC-Analyse des Produkts zeigte, dass das Ausgangsmaterial, (R)-7-Carbomethoxycaprolactam, vollständig zu einem 50/50-Gemisch der R- und S-Isomere, (R)-7-Carbomethoxycaprolactam und (S)-7-Carbomethoxycaprolactam, zusammen mit etwas racemisierter Carbonsäure, racemisiert hat.
  • Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass man, wenn man von (S)-7-Carbomethoxycaprolactam als Ausgangsmaterial ausgehen würde, dasselbe racemische Produktgemisch erhalten würde.
  • Methode C
  • Zu 20 ml 25%igem Natriummethoxid in Methanol wurden 64 mg optisch reines (R)-7-Carbomethoxycaprolactam gegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang unter Refluxieren gerührt. Das Produkt wurde auf 0°C gekühlt, das Produkt wurde angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde eingeengt, was 5 mg Feststoff ergab. Die wässrige Schicht wurde zur Trockene eingeengt, der feste Rückstand mit THF extrahiert, filtriert und zur Trockene eingeengt, was 24 mg braunes Öl ergab. Die HPLC-Analyse des Produktes zeigte, dass das Ausgangsmaterial, (R)-7-Carbomethoxycaprolactam, vollständig racemisiert hatte und zu einem 50/50-Gemisch des R- und S-Isomers der entsprechenden racemischen Säuren, (R)-7-Carboxycaprolactam und (S)-7-Carboxycaprolactam hydrolysiert war.
  • Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass man, wenn man vom (S)-7-Carbomethoxycaprolactam als Ausgangsmaterial ausgehen würde, dasselbe racemische Produktgemisch erhalten würde.

Claims (9)

  1. Verfahren zur Trennung enantiomerer Lactamester der Formel (II):
    Figure 00170001
    wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein können: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy und Halogen, L ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus keiner Gruppe oder Alkylen, Alkenylen und Alkinylen, worin L gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein kann: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Arylamino, Aminoaryl, Alkylamino, Cyano und Halogenalkyl, X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CH2)p und CH=CH, wobei p = 1 bis 4, Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH, O, (CH2)q und CH=CH, wobei q = 1 bis 2, Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CH2)v und CH=CH, wobei v = 1 bis 2, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Cyano und Halogen-alkyl, wobei all diese Substituenten gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein können: Halogen, Alkyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Hydroxy und Alkoxy, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen des Lactamesters mit einem Biokatalysator in wässriger Lösung, einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus organischen und wässrigen Lösungsmitteln, wobei nur ein Enantiomer selektiv unter Erhalt des optisch aktiven Isomers der betreffenden Säure hydrolysiert wird, und das Abtrennen des Hydrolyseprodukts von den nicht umgesetzten Lactamestern umfasst, wobei der Biokatalysator aus wärmebeständigen Enzymen stammt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Biokatalysator in einer wässrigen Pufferlösung vorliegt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lactamester racemisch vorliegen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionstemperatur für die enzymatische Trennung im Bereich von 0°C bis 100°C liegt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das unerwünschte Isomer nach der enzymatischen Trennung unter basischen Bedingungen racemisiert und in den Kreislauf zurückgeführt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym durch Ausfällung mit einem Salz zurückgewonnen und zur Wiederverwendung in den Kreislauf zurückgeführt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lactamester die Formel (III) besitzen:
    Figure 00190001
    wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein können: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy und Halogen, Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH, O, (CH2)q und CH=CH, wobei q = 1 bis 2, Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CH2)v und CH=CH, wobei v = 1 bis 2, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkyaminoalkyl, Cyano und Halogenalkyl, wobei all diese Substituenten gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein können: Halogen, Alkyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Hydroxy und Alkoxy.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lactamester die Formel (IV) besitzen:
    Figure 00190002
    wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein können: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, und Halogen, Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH, O, (CH2)q und CH=CH, wobei q = 1 bis 2, R2, R3 und R4 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Cyano und Halogenalkyl, wobei all diese Substituenten gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein können: Halogen, Alkyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamio, Aminoalkyl, Hydroxy und Alkoxy.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lactamester die Formel (V) besitzen:
    Figure 00200001
    wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein können: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy und Halogen, und R2, R3 und R4 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxy, Alkoxy, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Cyano und Halogenalkyl, wobei all diese Substituenten gegebenenfalls mit einem oder mehreren der Folgenden substituiert sein können: Halogen, Alkyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Aminoalkyl, Hydroxy und Alkoxy.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919672A (en) * 1998-10-02 1999-07-06 Schering Corporation Resolution of trans-2-(alkoxycarbonylethyl)-lactams useful in the synthesis of 1-(4-fluoro-phenyl)-3(R)- (S)-hydroxy-3-(4-fluorophenyl)-propyl!-4(S)-(4-hydroxyphenyl)-2-azetidinone
GB9907415D0 (en) * 1999-03-31 1999-05-26 Chirotech Technology Ltd Biocatalyst and its use
US6548293B1 (en) 1999-10-18 2003-04-15 Fsu Research Foundation, Inc. Enzymatic process for the resolution of enantiomeric mixtures of β-lactams
EP1791965A1 (de) * 2004-08-26 2007-06-06 Pfizer, Inc. Enantioselektive biotransformation zur herstellung von zwischenprodukten aus protein-tyrosinkinasehemmern
EP3208272B1 (de) 2005-11-08 2020-01-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclische modulatoren von atp-bindenden kassettentransportern
US7671221B2 (en) 2005-12-28 2010-03-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modulators of ATP-Binding Cassette transporters
US7754739B2 (en) 2007-05-09 2010-07-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modulators of CFTR
JP5265513B2 (ja) * 2007-02-19 2013-08-14 株式会社カネカ 光学活性３−アミノピペリジン又はその塩の製造方法
EP2164840A2 (de) 2007-05-09 2010-03-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modulatoren von cftr
US8367847B2 (en) * 2007-10-01 2013-02-05 Cargill, Incorporated Production of monatin enantiomers
US8003361B2 (en) * 2007-10-01 2011-08-23 Cargill Incorporated Production of monatin enantiomers
US8076107B2 (en) * 2007-10-01 2011-12-13 Cargill, Incorporated Production of monatin stereoisomers
EA201070700A1 (ru) 2007-12-07 2011-06-30 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Способы получения циклоалкилкарбоксамидопиридинбензойных кислот
RS55559B1 (sr) 2007-12-07 2017-05-31 Vertex Pharma Čvrste forme 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline
JP5523352B2 (ja) 2008-02-28 2014-06-18 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｃｆｔｒ修飾因子としてのへテロアリール誘導体
NZ602838A (en) 2010-04-07 2015-06-26 Vertex Pharma Pharmaceutical compositions of 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl) cyclopropanecarboxamido)-3-methylpyridin-2-yl)benzoic acid and administration thereof
FR2986804A1 (fr) * 2012-02-09 2013-08-16 Servier Lab Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique ou de ses esters, et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
JP6963896B2 (ja) 2013-11-12 2021-11-10 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドVertex Pharmaceuticals Incorporated Ｃｆｔｒ媒介性疾患の処置のための医薬組成物を調製する方法
RU2691136C2 (ru) 2014-11-18 2019-06-11 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Способ проведения высокопроизводительной тестовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57198098A (en) * 1981-05-29 1982-12-04 Sagami Chem Res Center Preparation of optically active monoester monocarboxylic acid
EP0115860B1 (de) 1983-02-03 1988-10-12 Sumitomo Chemical Company, Limited Optisch aktive 4-Hydroxy-2-Cyclopentenonen und ihre Darstellung
US5585252A (en) 1988-08-30 1996-12-17 G. D. Searle & Co. Enantio- and regioselective synthesis of organic compounds using enol esters as irreversible transacylation reagents
US5106750A (en) 1988-08-30 1992-04-21 G. D. Searle & Co. Enantio- and regioselective synthesis of organic compounds using enol esters as irreversible transacylation reagents
DE3921593A1 (de) * 1989-06-28 1991-01-10 Schering Ag Verfahren zur racemattrennung von 4-aryl-2-oxo-pyrrolidin-3-carbonsaeure-ester
US5420037A (en) 1989-09-26 1995-05-30 E. R. Squibb & Sons, Inc. Process for separation of enantiomeric 3-mercapto-2-substituted alkanoic acid using lipase P30 and synthesis of captopril type compounds
CA2068038A1 (en) 1991-05-08 1992-11-09 Christopher Yee Enzymatic resolution of .alpha.-tertiary carboxylic acid esters
US5620876A (en) 1992-04-29 1997-04-15 E. R. Squibb & Sons, Inc. Enzymatic hydrolysis and esterification processes for the preparation of HMG-CoA reductase inhibitors and intermediates thereof
US5447865A (en) 1992-06-10 1995-09-05 Amprost Pharmaceutical, Inc. Method of resolution of hydroxy substituted cyclopentanone enantiomers using lipase and lithium salt complexation
IT1259583B (it) 1992-06-19 1996-03-20 Gianfranco Palumbo Imballaggio per confezioni, ad esempio confezioni di prodotti igenico sanitari.
US5258517A (en) 1992-08-06 1993-11-02 Sepracor, Inc. Method of preparing optically pure precursors of paroxetine
NL9202208A (nl) 1992-12-18 1994-07-18 Dsm Nv Werkwijze voor de enzymatische bereiding van optisch aktieve glycidezure esters.
JPH06192221A (ja) * 1992-12-25 1994-07-12 Taiho Yakuhin Kogyo Kk 光学活性な１−（４−ｔ−ブチルフェニル）−５−オキソ−３−ピロリジンカルボン酸の製造方法
JPH06199221A (ja) * 1992-12-28 1994-07-19 Daihatsu Motor Co Ltd アンチスキッド装置の故障検出方法
US5516676A (en) 1993-06-15 1996-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Preparation of C-13 hydroxyl-bearing taxanes using nocardioides or a hydrolase isolated therefrom
TW397866B (en) 1993-07-14 2000-07-11 Bristol Myers Squibb Co Enzymatic processes for the resolution of enantiomeric mixtures of compounds useful as intermediates in the preparation of taxanes
US5523233A (en) * 1995-05-03 1996-06-04 Merck & Co., Inc. Enzymatic hydrolysis of 3,3-diethyl-4-[(4-carboxy)phenoxy]-2-azetidinone esters
US5529929A (en) 1995-06-07 1996-06-25 Seprachem, Inc. Optical resolution of alkyl 1,4-benzodioxan-2-carboxylates using esterase from serratia marcescens
EP0964928A1 (de) * 1996-12-27 1999-12-22 Smithkline Beecham Plc Enzymatische auflösung von benzodiazepin essigsäure estern mit einer lipase
JPH11113594A (ja) * 1997-10-20 1999-04-27 Taiho Yakuhin Kogyo Kk 光学活性な１−（４−ｔ−ブチルフェニル）−５−オキソ−３−ピロリジンカルボン酸および／またはその鏡像対掌体エステルの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK1054996T3 (da) 2004-05-24
US6277626B1 (en) 2001-08-21
ES2216495T3 (es) 2004-10-16
ATE258604T1 (de) 2004-02-15
EP1054996A1 (de) 2000-11-29
US20010055798A1 (en) 2001-12-27
PT1054996E (pt) 2004-05-31
JP2003517266A (ja) 2003-05-27
AU2758899A (en) 1999-08-30
US6638758B2 (en) 2003-10-28
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