-
Gemäß dieser JA-OS wird der optisch aktive ß-(S)-Aminoglutarsäuremonoalkylester
aus dem entsprechenden ß-N-geschützten Aminoglutarsäuredialkylester durch enzymatische
und anschließend durch chemische Methoden gemäß folgendem Schema hergestellt
| Z Z |
| H H Schweineleber- H H H |
| \ ' Schweineleber- \ / |
| c esterase C |
| v |
| CH2 CH2- CH2 CH2 |
| MeOOC COOMe MeOOC COOH |
| II (1W |
| H2N H |
| Katalytische |
| > C |
| Reduktion / \ |
| CH2 CH2 |
| MeOOC COOH |
| (V)- |
worin Z für die Benzyloxycarbonylgruppe steht und Me die Methylgruppe ist Auf diese
Weise wird die optisch inaktive Verbindung der Formel III, d. h. der Z-N-ß-Aminoglutarsäuredimethylester,
in die optisch aktive Verbindung der Formel IV, d. h. in den (S)-Z-N-ß-Ami-
noglutarsäuremonomethylester,
durch die Wirkung von Schweineleberesterase umgewandelt. Dann wird die Verbindung
der Formel IV katalytisch mit Pd-C zu der Verbindung der Formel V, d. h. optisch
aktivem ß-(S)-Aminoglutarsäuremonomethylester, reduziert.
-
Daher ist die Reaktion mit der Schweineleberesterase
-
sehr wichtig im Hinblick auf die sterische Spezifität. Die Quellen
für derartige Schweineleberesterase sind jedoch begrenzt, wobei darüber hinaus ihr
Einsatz in industriellem Maßstabe unzweckmäßig ist.
-
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines industriell durchführbaren
Verfahrens zur Herstellung von ß-(S)-Aminoglutarsäuremonoalkylestern, das ohne Einsatz
von Schweineleberesterase durchgeführt werden kann.
-
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung durch ein Verfahren gemäß
dem Patentanspruch gelöst.
-
Als Alkylgruppe R in den Verbindungen der Formel I und II kommt insbesondere
die Methylgruppe in Frage, da sich in diesem Falle die partielle enzymatische Hydrolyse
des Diesters II am leichtesten durchführen läßt. Die Schutzgruppe A kann irgend
eine Gruppe sein, die sich leicht durch Reduktion mit Pd-C entfernen läßt, wie Aralkyl
oder Aralkyloxycarbonyl oder durch eine mäßige chemische Hydrolyse entfernbar ist,
wie tert.-Butyloxycarbonyl.
-
Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten
bakteriellen Esterasen hydrolysieren in selektiver, spezifischer Weise nur eine
der zwei Estergruppen -COOR in der Formel II, wodurch der Dialkylester II in den
entsprechenden optisch aktiven Monoalkylester umgewandelt wird.
-
Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen sind Flavobacterium
lutescens IFO 3084 (FERM P-6063) Achromobacter parvulus IFO 13 181 (FERM P-6068),
Achromobacter lyticus IFO 12725 (FERM P-6070), Alcaligenes faecalis IFO 13 111 (FERM
P-6069), Xanthomonas oryzae IAM 1657 (FERM P-6064), Serratia marcescens IAM 1022
(FERM P-6066), Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271 (FERM P-6067), Chromobacterium
chocolatum IFO 3758 (FERM P-6065) sowie Acetobacter aurantius IFO 3245 (FERM P-6071>
Diese Stämme sind bei dem Fermentation Research Institue, Agency of Industrial Science
and Technology, Japan unter den vorstehend angegebenen FERM P-Nummern am 13. Juli1981
hinterlegt worden.
-
IFO steht für Institute for Fermentation, Osaka während IAM die Abkürzung
für Institute of Applied Microbiology (Tokyo University) ist Diese Stämme wurden
ebenfalls hinterlegt.
-
Jeder der vorstehend angegebenen Mikroorganismen kann aerob in einem
Medium entsprechend den Nährerfordernissen gezüchtet werden. Im allgemeinen enthält
das Medium eine entsprechende Menge an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, wie Kohlehydrate
bzw. Proteine, die ohne weiteres von dem Mikroorganismus konsumiert werden. Ferner
kann das Medium eine Spurenmenge an Vitaminen, Mineralien oder anderen Wachstumsfaktoren
enthalten, die auf dem Gebiet des Züchtens von Mikroorganismen bekannt sind Der
pH des Mediums liegt zwischen 5 und 11. Die Züchtungstemperatur schwankt zwischen
15 und 50"C.
-
Um das Wachstum des Mikroorganismus zu begünstigen ist es vorzuziehen,
die Züchtung unter Belüftung und Rühren durchzuführen.
-
Die enzymatische Reaktion, d. h. die selektive Hydrolyse des ß-N-geschützten
Aminoglutarsäuredialkylesters der Formel (II) (manchmal als »Substrat« bezeichnet)
kann durch Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium erfolgen, der das Substrat
enthält, so daß die Hydrolyse entsprechend dem Wachstum des Mikroorganismus fortschreitet.
Partiell kann die Hydrolyse dadurch bewirkt werden, daß das Substrat mit dem Enzym
in einer Reaktionsmischung, die das Enzym enthält, kontaktiert wird. Beispielsweise
wird das Substrat einer Reaktionsmischung zugesetzt, welche die Mikroorganismenzellen,
die Kulturbrühe, ihr Filtrat oder einen flüssigen Extrakt der Zellen enthält, die
nach dem Züchten erhalten worden sind. Im Hinblick auf die Gewinnung des gewünschten
Produkts nach der Hydrolysereaktion ist es vorzuziehen, ein Konzentrat zu verwenden,
das durch Zentrifugenbehandlung der Kulturbrühe oder der Zellen erhalten worden
ist. Werden die Mikroorganismenzellen verwendet, dann können sie entweder intakt,
mit organischen Materialien (Lösungsmitteln und/oder Detergentien) behandelt oder
gefriergetrocknet worden sein.
-
In der Reaktionsmischung kann jede Substratkonzentration zwischen
0,1 und 50% (Gewicht/Volumen) eingehalten werden. Da das Substrat kaum in Wasser
löslich ist, ist es vorzuziehen, ein hydrophiles organisches Lösungsmittel (wie
Methanol oder Aceton) und/oder ein grenzflächenaktives Mittel (wie Triton@
X-100) in einer solchen Menge zuzusetzen, daß die Reaktion nicht inhibiert wird,
wenn die Substratkonzentration relativ hoch ist Auch dann, wenn das Substrat in
der Reaktionsmischung in einem nicht vollständig gelösten Zustand vorliegt, kann
die Reaktion gut ablaufen, wenn man das Substrat in einem guten Kontakt mit dem
Enzym durch eine entsprechende Methode, wie Belüftung oder Rühren, hält.
-
Der pH derReaktionsmischung schwankt zwischen 5 und 11 und vorzugsweise
zwischen 7 und 8,5. Erfolgt die Reaktion bei einer hohen Substratkonzentration,
darin neigt der pH zu einer Abnahme infolge einer Anreicherung des Hydrolysats (ß-N-geschützter
Aminoglutarsäuremonoalkylester) während des Fortschreitens der Hydrolyse. In einem
derartigen Falle ist es vorzuziehen, den pH auf seinen optimalen Bereich durch Zugabe
eines Neutralisationsmittels, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak, einzustellen.
-
Die Reaktion wird so lange fortgesetzt, bis die gewünschte Hydrolyse
beendet ist. Nach dieser Reaktion wird das Produkt, dh der ß-N-geschützte Aminoglutarsäuremonoalkylester,
aus der Reaktionsmischung vor der Entfernung der Schutzgruppe von dem Produkt isoliert.
Diese Isolierung -kann nach jeder geeigneten Methode durchgeführt werden. Beispielsweise
können unlösliche Verunreinigungen, wie Zellen, durch Filtration oder Zentrifugieren
entfernt werden, worauf das Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit auf einen
pH von 1 bis 2 mit einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Zitronensäure,
eingestellt wird. Dann wird die Lösung einer Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel,
wie Ethylether, Dichlormethan oder Ethylacetat, unterzogen. Der Extrakt wird mit
Natriumsulfat dehydratisiert und zur Gewinnung von Rohkristallen des Produktes konzentriert.
Die weitere Reinigung kann durch Säulenchromatographie erfolgen. Auf diese Weise
werden die Rohkristalle in dem Chloroform oben in eine Kieselgelkolonne eingeführt
und mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie einer Mischung aus Chloroform, Methanol,
Ethylacetat sowie Essigsäure (90 :5 :5- :2) chromatographiert Die Fraktionen, welche
ß-N-geschützten Aminoglutarsäuremonoalkylester enthalten, werden gesammelt, worauf
das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wird. Auf diese Weise werden farblose -Kristalle
von reinem ,ß-N-geschützten Aminoglutarsäuremonoalkylester erhalten.
-
Dann wird die Schutzgruppe von dem Monoalkylester entfernt. Dies
kann nach jeder geeigneten Weise erfolgen, wie sie zur Entfernung von Aminoschutzgruppen
bekannt ist. Beispielsweise werden die Kristalle in Methanol aufgelöst, worauf die
Lösung einer katalytischen Reduktion mit Wasserstoff in Gegenwart von Pd-C-Katalysator
unterzogen wird. Die Lösung kann auch einer milden Hydrolyse mit Trichloressigsäure
zur Entfernung der schützenden Gruppe unterzogen werden, wobei der (S)-8-Aminoglutars
äuremonoalkylester mit einer optischen Minusdrehung erhalten wird.
-
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
-
Beispiel 1 Ein Kulturmedium, das 8% Glukose und 3,7% einer Hirn/Herz-Infusion
enthält, wird auf einen pH von 7,0 mit 0,1 N Natriumhydroxid eingestellt. 250ml
dieses Mediums in einem Erlenmeyer-Kolben -(21) werden bei 1200C 15 min lang dampfsterilisiert.
Nach der Sterilisation werden 5 ml einer Saatkultur (die in einem Reagenzglas, welches
das gleiche Medium, wie vorstehend beschrieben, enthält und mit dem in der-Tabelle
I angegebenen Mikroorganismus gezüchtet worden ist) aufgeimpft und das Züchten unter
Rühren 18 h bei 300 C durchgeführt. Dann werden 4 Kolben für jeden Mikroorganismus
eingesetzt, so daß das Kulturmedium insgesamt 11 für jeden Mikroorganismus ausmacht.
Die Zellen, die in den 4 Kolben gewachsen sind, werden durch Zentrifugieren für
die anschließende Verwendung zur Durchführung der Hydrolysereaktion gesammelt.
-
Die gesammelten Zellen werden in 48 ml eines 0,15 M Tris-HCl-Puffers
(pH 8,0) suspendiert. Dieser Suspension werden 620 mg (2 mMol) ,B-Benzyloxycarbonylaminoglutarsäuredimethylester,
aufgelöst in 2 ml Aceton, zugesetzt. Die Reaktion wird bei 30"C 6 h lang unter Rühren
durchgeführt.
-
Nach der Reaktion wird die Mischung zentrifugiert und die überstehende
Flüssigkeit unter Einsatz von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von 1 eingestellt.
-
Die Mischung wird mit 100 ml Dichlormethan extrahiert
und der Extrakt
über Natriumsulfat dehydratisiert und im Vakuum getrocknet. Das Konzentrat wird
oben in eine Silikagelsäule eingefüllt, die mit Chloroform behandelt worden ist,
und mit einer Lösungsmittelmischung aus Chloroform, Methanol, Ethylacetat und Essigsäure
(90 : 5 :5 : 2) eluiert. Die Fraktionen des Produktes (B-Benzyloxycarbonylaminoglutarsäuremonomethylester)
werden gesammelt und das Lösungsmittel im Vakuum zur Gewinnung von farblosen Kristallen
abgedampft.
-
Die Kristalle zeigen die gleichen NMR- und IR-Spektren, ferner den
gleichen Rf-Wert (bei einer Silikageldünnschichtchromatographie bei Entwicklung
mit einer Lösungsmittelmischung aus Ethylacetat, Ethanol und Wasser in einem Verhältnis
von 5 :1:1) wie das Produkt, das gemäß der JA-OS 1 46344/80 erhalten worden ist
und werden als ß-(S)-Benzyloxycarbonylaminoglutarsäuremonomethylester identifiziert.
-
Die spezifische optische Drehung, d. h. [oc] 2D (c = 7, CHCl3) eines
jeden der Produkte, die durch enzymatische Reaktion mit gewachsenen Zellen eines
jeden der verschiedenen Mikroorganismen hergestellt worden ist, liegt zwischen +0,53
und +0,66, wie aus der Tabelle I hervorgeht Aus diesen Ergebnissen wird jedes der
Produkte als ,B-(S)-N-Benzyloxycarbonylaminoglutarsäuremonomethylester bestätigt,
wie er auch in der JA-OS 1 46 344/80 beschrieben wird.
-
250 mg (0,85 mMol) eines jeden der isolierten Produkte werden in
20 ml Methanol gelöst, worauf die Lösung mit 40 mg Pd-C (10%ig} versetzt und 30
min lang gerührt wird, wobei Wasserstoff eingeführt wird.
-
Die Reaktionsmischung wird filtriert und das Filtrat konzentriert,
wobei farblose Kristalle in den in der Tabelle I angegebenen Ausbeuten erhalten
werden.
-
Jedes Produkt wird als S-(S)-Aminoglutarsäuremonomethylester identifiziert,
da es die gleichen Spektren sowohl bezüglich NMR als auch IR wie in der JA-OS 1
46 344/80 angegeben besitzt. Die spezifische optische Drehung, und zwar [OC]2D (c=3,
H20) liegt zwischen - 5,32 und - 5,48, wie aus der Tabelle I hervorgeht.
-
Tabelle I Mikroorganismus ß(S)-Benzyloxycarbonylamino- ß-(S)-Aminoglutarsäuremonoglutarsäuremonomethylester*)
methylester**) Ausbeute [a] 2DO Ausbeute [a]25 (mg) [a3'' (mg) Flavobacterium 543
+0,62 92 -5,34 lutescens IFO 3084 Achromobacter 540 +0,66 116 -5,39 parvulus IFO
13181 Achromobacter 470 +0,53 87 -5,48 lyticus IFO 12725 Alcaligenes 225 +0,56 95
-5,34 faecalis IFO 13111 Xanthomonas 246 +0,62 110 -5,40 oryzae IAM 1657 Gluconobacter
325 +0,60 103 -5,32 dioxyacetonicus IFO 3271
Fortsetzung Mikroorganismus
ß-(S)-Benzyloxycarbonylamino- A-(S)-Aminoglutarsäuremonoglutarsäuremonomelhylester*)
methylester**) Ausbeute [aj 2DO Ausbeute [a]225 (mg) [α] D (mg) Chromobacterium
151 +0,56 96 -5,45 chocolatum IFO 3758 Serratia 62 +0,60 88 -5,39 marscens IAM 1022
Acetobacter 92 +0,60 92 -5,40 Aurantius IFO 3245 -Bemerkungen: *) Ausbeute aus 620
mg (2 mMol) ß-N-Benzyloxycarbonylaminoglutarsäuredimethylester durch enzymatische
Reaktion.
-
**) Ausbeute aus 250 mg (0,85 mMol) ß(S)-N-Benzyloxycarbonylaminoglutarsäuremonomethylester
durch katalytische Reduktion.
-
Beispiel 2 Jeweils Flavobacterium lutescens IFO 3084 und Achromobacter
parvulus IFO 13 181 werden gezüchtet, worauf die gewachsenen Zellen nach der in
Beispiel 1 beschriebenen Weise gesammelt werden. Unter Verwendung der gewachsenen
Zellen wird die enzymatische Reaktion nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode
durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 550 mg (2 mMol) ,B-N-tert.-Butyloxycarbonylaminoglutarsäuredimethylester
als Substrat in der Reaktionsmischung eingesetzt werden.
-
Nach der enzymatischen Reaktion wird die überstehende Flüssigkeit,
die durch das Zentrifugieren der Reaktionsmischung erhalten worden ist, auf einen
pH von 2 unter Einsatz von Zitronensaure eingestellt und
mit Ethylether extrahiert.
Der Ether wird im Vakuum von dem Extrakt abgedampft und das Konzentrat nach der
im Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt, wobei farblose Kristalle erhalten werden.
-
Die Schutzgruppe wird durch Hydrolyse mit Trifluoressigsäure entfernt
und das erhaltene Hydrolysat im Vakuum konzentriert, wobei farblose Kristalle mit
den in der Tabelle II angegebenen Ausbeuten erhalten werden.
-
Die NMR- und IR-Spektren dieser zwei Produkte fallen mit den entsprechenden
Spektren gemäß der JA-OS 1 46344/80 zusammen. Ihre spezifischen optischen Drehungen,
und zwar [a] 2D5 (c = 3, H20) betragen - 5,42 bzw.-5,35, wie aus der Tabelle II
hervorgeht.
-
Aus diesen Ergebnissen lassen sich diese Produkte als ß-(S)-Aminoglutarsäuremonomethylester
identifizieren.
-
Tabelle II Mikroorganismus S(S)-Aminoglutarsäuremonomethylester Ausbeute
tal205 (c =3, (mg)*) H2O) Flavobacterium 205 -5,42 lutescens IFO 3084 Achromobacter
129 -5,35 parvulus IFO 13181 Bemerkung: *) Ausbeute aus 550mg (2mMol) ß-N-tert.-Butyloxycarbonylaminoglutarsäuredimethylester.
-
Beispiel 3 Flavobacterium lutescens IFO 3084 wird in einem 1] Medium
gezüchtet und die gewachsenen Zellen nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode
gesammelt Die gesammelten Zellen werden gefriergetrocknet und
als Enzymquelle in
einer Reaktionsmischung (50ml) eingesetzt, die 1240 mg (4 mMol) ß-N-Benzyloxycarbonylaminoglutarsäuredimethylester
als Substrat sowie die anderen Bestandteile gemäß Beispiel 1 enthält Die Enzymreaktion
wird bei 30"C 12h unter Schütteln durchgeführt
Nach der Enzymreaktion
wird das Produkt nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise isoliert, wobei 752
mg farblose Kristalle, [α]D20 (c=7, CHCl3) + 0,58 erhalten werden.
-
Dann werden 250 mg der vorstehenden Kristalle
einer katalytischen
Reduktion unterzogen und nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt, wobei
85 mg farbloser Kristalle erhalten werden. Die spezifi sche optische Drehung, d.
h. [α] @@(c = 3, H20) beträgt -5,40.
-
- Leerseite -
- Leerseite -