DE3784853T2

DE3784853T2 - Verfahren zur herstellung von carbonsaeureestern.

Info

Publication number: DE3784853T2
Application number: DE8787310473T
Authority: DE
Inventors: Fumio Kikumoto; Kazuhiko Ohta; Takashi Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-11-28
Filing date: 1987-11-27
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2007-11-28
Also published as: EP0269453A2; HUT46742A; HU202283B; ZA878937B; ES2053568T3; DK623287A; ATE87036T1; KR960003550B1; EP0269453A3; US5156962A; KR880006363A; EP0269453B1; DE3784853D1; DK623287D0

Description

HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung eines Carbonsäureesters mittels einer Enzym- Reaktion. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Carbonsäureesters, das die Umsetzung einer Hydroxy-Verbindung mit einem Carbonsäure-Anhydrid in Gegenwart einer Carboxylesterase als Katalysator in einem organischen Lösungsmittel umfaßt.
Bislang werden synthetische Reaktionen unter Anwendung organisch-chemischer Arbeitsweisen und enzymatische Reaktionen zur Herstellung von Carbonsäureestern angewandt.
Bekannt als synthetische Reaktionen unter Anwendung organisch-cheinischer Arbeitsweisen sind beispielsweise die Veresterung, wie beispielsweise die Wasserabspaltungs- Reaktion gemäß der nachstehenden Gleichung
RaOH Hydroxy-Verbindung + RbCOOH Carbonsäure T RaO-CORb Ester + H&sub2;O ,
worin eine Hydroxy-Verbindung ein Acceptor für eine Acyl- Gruppe ist und eine Carbonsäure ein Donor einer Acyl-Gruppe ist, und die Umesterung gemäß der nachstehenden Gleichung
RaOH Hydroxy-Verbindung + RbCO-ORc Ester T RaO-CORb Ester + RcOH ,
worin eine Hydroxy-Verbindung ein Acceptor für eine Acyl- Gruppe ist und eine Ester-Verbindung ein Donor einer Acyl- Gruppe ist.
Kunio Yagi und Mitarbeiter veröffentlichten in J. Vitaminol. 7, 176-280 (1961), im Kontext ihrer Untersuchungen über Fettsäureester von Flavinen ihre Ergebnisse unter dem Titel "I. Chemical Syntheses of Fatty Acid Esters of Riboflavin". Zur Gewinnung fettlöslicher Riboflavin-Derivate synthetisierten die Autoren chemisch die Ester von Riboflavin mit verschiedenen Fettsäurechloriden oder -anhydriden. Die bei relativ niedrigen Temperaturen durchgeführte Veresterung des Vitamins mit einem Fettsäurechlorid wurde hauptsächlich für die Ester der höheren Fettsäuren angewandt, während die Veresterung mit einem Fettsäureanhydrid bei relativ höheren Temperaturen im Fall der Ester niederer Fettsäuren angewandt wurde. Riboflavinbutyrat wurde jedoch unter Anwendung beider Techniken synthetisiert, d.h. unter Einsatz von Butyroylchlorid bei einer Temperatur von anfangs 0 ºC (1 h) und danach 23 ºC (14 h) und unter Einsatz von Buttersäureanhydrid bei einer Temperatur von 130 ºC bis 140 ºC (6 h). Riboflavinbutyrat wurde auch dadurch hergestellt, daß das Vitamin mit Buttersäureanhydrid und Perchlorsäure umgesetzt wurde, wobei die Perchlorsäure tropfenweise unter Kühlung zugesetzt wurde. Riboflavinpropionat wurde durch Umsetzung des Vitamins mit Propionsäureanhydrid in der gleichen Weise wie Riboflavinbutyrat hergestellt.
Was die enzymatischen Reaktionen betrifft, so sind die Veresterung, d.h. die Umkehrreaktion der Hydrolyse, bei der eine Hydroxy-Verbindung und eine Carbonsäure als Substrat eingesetzt werden, und die Umesterung, bei der eine Hydroxy- Verbindung und eine Ester-Verbindung als Substrat eingesetzt werden, bekannt.
Kazunori Hatano und Mitarbeiter veröffentlichten in J. Antibiot. 28 (1), 15-20 (1975), im Kontext ihrer Untersuchungen über Antibiotika der Lankacidin-Gruppe (T-2636) ihre Ergebnisse unter dem Titel "IX Preparation of ¹&sup4;C-Labeled Lankacidin C 14-Propionate". Um das Schicksal des Lankacidin C- 14-propionats im Stoffwechsel bei Versuchstieren zu untersuchen, wurde das ¹&sup4;C-markierte Antibiotikum durch Fermentation von Streptomyces Rochei var. volubilis in Gegenwart verschiedener ¹&sup4;C-markierter organischer Carbonsäuren, Aminosäuren und Kohlenhydrate hergestellt. Lankacidin C- 14-propionat-¹&sup4;C wurde aus Lankacin C-¹&sup4;C und Ethylpropionat durch die Einwirkung einer Acylase des Streptomyces-Organismus erhalten, wobei das Ethylpropionat dem Kultur-Filtrat von S. Rochei var. volubilis unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt wurde.
Wenn jedoch die Hydroxy-Verbindung zwei oder mehr Hydroxy- Gruppen enthält, können eine oder mehrere der Hydroxy-Gruppen nicht unter Anwendung organisch-chemischer Arbeitsweisen selektiv und spezifisch in eine oder mehrere Acyloxy-Gruppe(n) überführt werden.
Beispielsweise kann in dem Fall, in dem Lankacidin A, d.h. eine Verbindung der Formel
[diese Verbindung ist als antibakterielles Mittel und Antibiotikum wirksam, z.B. als Antibiotikum gegen Schweine-Dysenterie-Infektionen (vgl. die US-Patente 3 676 300 und 4 480 033)] aus Lankacidin C, d.h. einer Verbindung der Formel
hergestellt wird, die zwei Hydroxy-Substituenten in den 8- und 14-Positionen aufweist, die Hydroxyl-Gruppe in der 14- Position mittels der synthetischen Reaktion nicht selektiv und spezifisch in eine Acyloxy-Gruppe überführt werden.
Dementsprechend ist für die Zwecke der selektiven und spezifischen Umwandlung der Hydroxy-Gruppe(n) in die Acyloxy-Gruppe(n) die synthetische Reaktion unter Anwendung organisch-chemischer Arbeitsweisen nicht effektiv.
Die enzymatische Reaktion unter Einsatz einer Hydroxy- Verbindung und einer Carbonsäure oder einer Ester-Verbindung als Substrat macht es möglich, eine oder mehrere Hydroxy- Gruppe(n) selektiv und spezifisch in eine oder mehrere Acyloxy-Gruppe(n) zu überführen (vgl. die US-Patente 3 676 300 und 4 480 033).
Bei diesen enzymatischen Reaktionen ist jedoch eine große Menge des Substrats, etwa einer Carbonsäure oder einer Ester-Verbindung, nötig, da die Enzyme die chemische Reaktion sowohl in der Vorwärts-Richtung als auch in der Rückwärts-Richtung katalysieren, wobei die Richtung jeweils hauptsächlich von den Konzentrationen der beteiligten Substrate abhängt. Daneben ist die Ausbeute der angestrebten Ester-Verbindung sehr niedrig.
Weiterhin muß bei der Veresterung mittels einer enzymatischen Reaktion unter Einsatz einer Hydroxy-Verbindung und einer Carbonsäure die Reaktion unter vollständig wasserfreien Bedingungen durchgeführt werden. Bei der Umesterung mittels einer enzymatischen Reaktion unter Einsatz einer Hydroxy-Verbindung und einer Ester-Verbindung erleidet die Ester-Verbindung als Acyl-Gruppen-Donor oft Hydrolyse durch den Carboxylesterase-Katalysator, und gleichzeitig schreitet die Hydrolyse der gebildeten Ester-Verbindung durch die Carboxylesterase fort. Dies macht es erforderlich, einen großen Überschuß der Ester-Verbindung (des Substrats) als Acyl-Gruppen-Donor einzusetzen.
Außerdem ist es schwierig, die Hydroxyl-Gruppe(n) vollständig in die Acyloxy-Gruppe(n) zu überführen, da die Umesterung mittels einer enzymatischen Reaktion ihrer Natur nach reversibel ist.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die enzymatische Reaktion zur selektiven und spezifischen Umwandlung der Hydroxyl-Gruppe(n) in die Acyloxy-Gruppe(n) in hoher Ausbeute aus einer kleinen Menge eines Acyl-Gruppen-Donors untersucht.
Als Ergebnis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, daß bei der enzymatischen Reaktion die Ausbeute sowie die Qualität der angestrebten Ester-Verbindung in bemerkenswertem Maße dadurch verbessert werden kann, daß ein Carbonsäureanhydrid als Acyl-Gruppen-Donor in einem organischen Lösungsmittel eingesetzt wird.
Diese Befunde wurden durch fortgesetzte Untersuchungen erweitert, die in der vorliegenden Erfindung kulminierten.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung macht ein neues Verfahren zur Herstellung eines Carbonsäureesters verfügbar, das die Umsetzung einer Hydroxy-Verbindung mit einem Carbonsäure- Anhydrid in Gegenwart einer Carboxylesterase als Katalysator in einem organischen Lösungsmittel umfaßt.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein Carbonsäureester leicht, in hoher Güte sowie in hoher Ausbeute erhalten werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist eine neue Esterase-Reaktion, die bis jetzt nicht bekannt gewesen ist. Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann(können) die Hydroxyl-Gruppe(n) selektiv und spezifisch in die Acyloxy-Gruppe(n) umgewandelt werden, und die Ester-Verbindung kann in hoher Ausbeute aus einer kleinen Menge eines Acyl- Gruppen-Donors erhalten werden, da die Esterase-Reaktion der vorliegenden Erfindung eine nahezu vollständig irreversible Reaktion ist. Somit ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung industriell von großem Vorteil.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Eingesetzt werden als die Carboxylesterase der vorliegenden Erfindung kann die Carboxylesterase, die in Enzyme Nomenclature, IUB, 3-1-1-1, Academic Press Inc., 1984, definiert ist. Die Carboxylesterase der vorliegenden Erfindung kann aus Bakterien, einschließlich Actinomyces, Mikroorganismen, z.B. Eumycetes, und dem Leben, z.B. Tieren oder Pflanzen, stammen.
Zu den Beispielen für die Carboxyesterase zählen Esterase aus tierischer Leber wie Schweineleber-Esterase [Sigma Co., USA. Diese Esterase kann nach der in Methods in Enzymology 1, 657 (1955) beschriebenen Arbeitsweise hergestellt werden] und T-2636-Esterase [vgl. The Journal of Antibiotics 24, 1 (1971)], die aus Streptomyces rochei var. volubilis stammt.
Die Carboxylesterase kann in natürlicher oder in gereinigter Form eingesetzt werden. Jeder Grad der Reinigung der Carboxylesterase ist in der vorliegenden Erfindung einsetzbar. Beispielsweise können Rohenzym-Systeme, die durch Extraktion von Proteinen aus Kulturbrühe erhalten wurden, oder die gereinigten Präparate des Einzel-Proteins eingesetzt werden.
Weiterhin kann, damit die Reaktion glatt abläuft, eine in dem organischen Lösungsmittel lösliche Carboxylesterase, die chemisch modifiziert ist, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Was die Verfahrensweise der chemischen Modifizierung der Carboxylesterase betrifft, so kann beispielsweise 2,4-Bis- (o-methoxypolyethylenglycol)-6-chloro-s-triazin (im folgenden kurz als aktiviertes PEG&sub2; bezeichnet) mit Enzym- Proteinen in Berührung gebracht werden, um modifizierte Proteine zu erhalten, die mit Polyethylenglycol gekoppelt sind [vfl. Biochemical and Biophysical Research Communications 122 (2), 845 (1984)].
In der vorliegenden Erfindung kann sowohl eine in dem organischen Lösungsmittel lösliche als auch eine in dem organischen Lösungsmittel unlösliche Carboxylesterase eingesetzt werden. Von diesen wird eine in dem organischen Lösungsmittel lösliche Carboxylesterase bevorzugt.
Die Carboxylesterase kann gewöhnlich in Form einer Lösung derselben in einem wäßrigen Lösungsmittel {z.B. einer Puffer-Lösung wie Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-Maleinsäure-Puffer} verwendet werden.
Im Fall der in dem organischen Lösungsmittel löslichen Carboxylesterase kann die Carboxylesterase in Form einer Lösung derselben in einem eine kleine Menge Wasser enthaltenden organischen Lösungsmittel verwendet werden.
Die Carboxylesterase kann in Form des Kulturfiltrats eines Carboxylesterase produzierenden Mikroorganismus als solchem eingesetzt werden.
Weiterhin kann die Carboxylesterase als immobilisiertes Enzym eingesetzt werden. In diesem Fall wird die Reaktion in wünschenswerter Weise unter Bedingungen durchgeführt, daß die Wasser-Phase fast nicht gebildet wird. Beispielsweise kann die Reaktion in solcher Weise durchgeführt werden, daß in dem organischen Lösungsmittel lösliche Carboxylesterase als Säule des immobilisierten Enzyms verwendet wird und die Elution mit einem eine Hydroxy-Verbindung sowie ein Carbonsäureanhydrid enthaltenden organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Als Carbonsäureanhydrid der vorliegenden Erfindung kann ein Carbonsäureanhydrid eingesetzt werden, das konventionell auf dem Gebiet der organischen Synthese, etwa der Synthese eines Peptids oder eines Antibiotikums, verwendet wird, ein Molekulargewicht unterhalb von 350, vorzugsweise unterhalb von 230, hat und sich in dem organischen Lösungsmittel aufzulösen vermag.
Die Beispiele des Carbonsäureanhydrids der vorliegenden Erfindung umfassen Anhydride, die durch intermolekulare Kondensation von 2 mol der strukturell gleichen Carbonsäure unter Austritt von 1 mol Wasser gebildet sind, wie Essigsäureanhydrid, Propionsäureanhydrid, n-Buttersäureanhydrid, iso-Buttersäureanhydrid, n-Pentansäureanhydrid, n-Capronsäureanhydrid oder Benzoesäureanhydrid; und gemischte Anhydride, die durch intermolekulare Kondensation von 2 mol strukturell unterschiedlicher Carbonsäuren unter Austritt von 1 mol Wasser gebildet sind, wie ein geinischtes Anhydrid aus Essigsäure und Propionsäure oder ein gemischtes Anhydrid aus Propionsäure und Buttersäure. Von diesen bevorzugt ist ein Carbonsäureanhydrid, das durch intermolekulare Kondensation von 2 mol der strukturell gleichen Carbonsäure gebildet ist.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Carbonsäureanhydrid als Acyl-Gruppen-Donor verwendet. Beispielsweise sind die Acyl-Gruppen, die als Donor angeboten werden, eine Acyl- Gruppe, die sich von einer Monocarbonsäure ableitet, wie Acetyl oder Propionyl; eine Acyl-Gruppe, die sich von einer ungesättigten aliphatischen Carbonsäure ableitet, wie Acryloyl oder Propioloyl, und eine Acyl-Gruppe, die sich von einer carbocyclischen Carbonsäure ableitet, wie Benzoyl oder Naphthoyl.
Das Carbonsäureanhydrid ist vorzugsweise eine Verbindung der Formel
worin
R und R&sub1; jeweils Wasserstoff, ein Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder Aralkyl ist.
Unter Bezugnahme auf die Formel (I) ist die Alkyl-Gruppe vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoff-Atomen, wie Methyl, Ethyl, n- Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert-Butyl, n-pentyl, n-Hexyl, Octyl, Nonyl oder Decyl; oder eine 5- bis 10-gliedrige Cycloalkyl-Gruppe wie Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclooctyl oder Cyclodecyl; und die Alkenyl-Gruppe ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Alkenyl-Gruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoff-Atomen, wie Vinyl, Allyl, Butadienyl, Hexadienyl oder Decenyl; oder eine 5- bis 10-gliedrige Cycloalkenyl-Gruppe wie Cyclopentenyl, Cyclohexenyl oder Cyclooctenyl; und die Alkinyl-Gruppe ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Alkinyl-Gruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoff-Atomen, wie Ethinyl, Propinyl, Pentinyl oder Decinyl; und die Aryl-Gruppe ist vorzugsweise eine Aryl-Gruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoff-Atomen wie Phenyl, Naphthyl oder Biphenylyl; und die Aralkyl-Gruppe ist vorzugsweise eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoff-Atomen wie Benzyl, Phenethyl oder Phenacyl. Wünschenswerterweise sind R und R&sub1; gleich. Vorzugsweise sind R und R&sub1; eine Alkyl- oder Aryl- Gruppe.
Mehr bevorzugt sind R und R&sub1; eine geradkettige oder verzweigte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl oder n-Pentyl; oder Phenyl.
Eine in der Erfindung eingesetzte Hydroxy-Verbindung bezeichnet eine organische Verbindung, die eine oder mehrere Hydroxy-Gruppen an die sie bildenden Kohlenstoff-Atome gebunden enthält.
Eingesetzt als Hydroxy-Verbindung wird eine organische Verbindung mit 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 5, Hydroxy-Gruppen, die ein Molekulargewicht unter 1 500, vorzugsweise unter 900, hat und sich in dem organischen Lösungsmittel aufzulösen vermag.
Zu den speziellen Beispielen für die Hydroxy-Verbindung zählen Alkohole wie einwertige Alkohole, z.B. Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol oder n-Butanol; zweiwertige Alkohole, z.B. Ethylenglycol oder 1,4-Butandiol; oder mehrwertige Alkohole. z.B. Glycerin; Phenole wie Phenol, Cresol, Benzoltriol oder Hydrochinon; heterocyclische Verbindungen wie 8-Chinolinol oder Hydroxypiperidin; Antibiotika wie Tetracyclin, Leukomycin A, Lankacidin C, Chloramphenicol, Cephalosporin, Maridomycin oder Erythromycin; und biologisch aktive Substanzen wie Fibrostatin E oder F.
Vorzugsweise ist die Hydroxy-Verbindung ein Alkohol oder ein Antibiotikum, mehr bevorzugt ein niederer (C&sub2;&submin;&sub4;-) Alkohol, Lankacidin C oder Maridomycin.
Wünschenswerterweise ist die Hydroxy-Verbindung eine Verbindung der Formel
R&sub2;OH (II),
worin
R&sub2; ein organischer Rest ist.
Unter Bezugnahme auf Formel (II) ist der organische Rest ein organischer Rest mit einem Molekulargewicht unter 1 000, etwa Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl oder eine heterocyclische Gruppe, die durch einen oder mehrere geeignete Substitenten substituiert sein kann.
Unter Bezugnahme auf Formel (II) ist die Alkyl-Gruppe vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoff-Atomen wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl, n-Hexyl, Octyl, Nonyl, Dodecyl, Undecyl oder Heneicosanyl; oder eine 5- bis 20-gliedrige Cycloalkyl-Gruppe wie Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclooctyl, Cyclodecyl oder Adamantyl, und die Alkenyl- Gruppe ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Alkenyl-Gruppe mit 2 bis 30 Kohlenstoff-Atomen wie Vinyl, Allyl, Butadienyl, Hexadienyl oder Undecenyl; oder eine 5- bis 20-gliedrige Cycloalkenyl-Gruppe wie Cyclopentenyl, Cyclohexenyl oder Cyclooctenyl, und die Alkinyl-Gruppe ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Alkinyl- Gruppe mit 2 bis 30 Kohlenstoff-Atomen wie Ethinyl, Propinyl, Pentinyl, Decinyl oder Undecinyl, und die Aryl- Gruppe ist vorzugsweise eine Aryl-Gruppe mit 6 bis 14 Kohlenstoff-Atomen wie Phenyl, Naphthyl, Anthracyl oder Biphenylyl, und die Aralkyl-Gruppe ist vorzugsweise eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoff-Atomen wie Benzyl, Phenethyl, Phenacyl oder Trityl, und die heretocyclische Gruppe ist vorzugsweise eine 5- bis 20-gliedrige, 1 bis 5 Stickstoff-Atome, 1 bis 5 Schwefel-Atome und/oder 1 bis 5 Sauerstoff-Atome enthaltende heterocyclische Gruppe, die mit einem 5- bis 8-gliedrigen alicyclischen Ring wie einem Cyclopentan- oder Cyclooctan-Ring, einem aromatischen Ring mit 6 bis 14 Kohlenstoff-Atomen wie einem Benzol- oder Anthracen-Ring oder einem 4- bis 8-gliedrigen heterocyclischen Ring wie einem Azetidin- oder Thiacyclohexan-Ring kondensiert sein kann.
Zu Beispielen für den(die) Substituenten an der genannten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppe zählen Hydroxy, Alkoxy (z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy oder t-Butoxy), Nitro, gegebenenfalls substituiertes Amino (z.B. acyliertes Amino oder geschütztes Amino), gegebenenfalls substituiertes Sulfo (z.B. Methylthio, Ethylthio oder Isopropylthio) und heterocyclische Gruppen (z.B. Pyridyl, Thienyl, Benzothienyl oder Chinolyl).
Zu Beispielen für den(die) Substituenten an der heterocyclischen Gruppe zählen Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Hydroxy, Alkoxy (z.B. Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy oder t-Butoxy), Nitro, gegebenenfalls substituiertes Amino (z.B. acyliertes Amino oder geschütztes Amino), gegebenenfalls substituiertes Sulfo (z.B. Methylthio, Ethylthio oder n- Propylthio). Die Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen sind solche, wie sie oben unter Bezugnahme auf die Formel (II) definiert sind.
Wenn Lankacidin C als Hydroxy-Verbindung verwendet wird, ist es praktisch, eine Lösung von Lankacidin C in einem organischen Lösungsmittel sowie das Filtrat der Kulturbrühe einzusetzen, wie in Beispiel 5 beschrieben wird.
Das Carbonsäureanhydrid wird in einer Menge von etwa 1 bis 100 Stoffmengen-Äquivalenten, vorzugsweise von 2 bis 20 Stoffmengen-Äquivalenten, relativ zu der Hydroxy-Verbindung eingesetzt.
Als organisches Lösungsmittel in der vorliegenden Erfindung kann ein organisches Lösungsmittel eingesetzt werden, dessen pH-Wert etwa 3 bis 10 beträgt und das unter den Reaktionsbedingungen Carboxylesterase nicht inaktiviert.
Zu Beispielen für das organische Lösungsmittel zählen Ketten-Kohlenwasserstoffe, z.B. n-Hexan, n-Heptan, n-Pentan, Isohexan, Methylendichlorid, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Ethylenchlorid, Ethylidenchlorid, Vinylidenchlorid, Butylchlorid, Amylchlorid, Allylchlorid, Ethylbromid, Ethylenbromid, Chloroethylbromid oder Fluortrichlormethan; cyclische Kohlenwasserstoffe, z.B. Cyclohexan, Methylcyclohexan, Decahydronaphthalin, Benzol, Toluol, Xylol, Ethylbenzol, 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalin, Chlorbenzol, o-Dichlorbenzol, Brombenzol, o-Chlortoluol oder α-Chlornaphthalin; Ether, z.B. Ethylether, Dichlorethylether oder Ethylenglycolmonomethylether; Acetale, z.B. Methylal oder Acetaldehyddiethylacetal; heterocyclische Verbindungen, z.B. Furan, Furfural, 2-Methylfuran, Tetrahydropyran, 1,2-Propylenoxid, Epichlorhydrin, 1,4-Dioxan, Pyridin, Morpholin; Ketone, z.B. Methylethylketon, Methyl-n-propylketon, Methyl- n-butylketon, Methylisobutylketon, Methyl-n-amylketon, Diethylketon, Ethyl-n-butylketon, Diacetonalkohol, Mesityloxid, Cyclohexanon, Methylcyclohexanon, Acetophenon oder Acetylaceton; Ester, z.B. Methylformiat, Ethylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Methylpropionat, Methylbutyrat, Ethylacetoacetat, Methylbenzoat, Methylsalicylat, Ethylabietat, Diethyloxalat, Diethylmalonat, Diethylphthalat oder Dioctyladipat; Phosphate, z.B. Triethylphosphat; Carbonate, z.B. Diethylcarbonat; Amine, z.B. Trimethylamin; Amide, z.B. Formamid, N,N-Dimethylformamid; Nitrile, z.B. Acetonitril; schwefelhaltige Verbindungen, z.B. Kohlenstoffdisulfid oder Dimethylsulfoxid; und Erdöl-Destillate, z.B. Petrolether, Petroleumbenzin oder Ligroin.
Bevorzugt wird ein organisches Lösungsmittel, das mit Wasser zwei Phasen zu bilden vermag.
Von diesen werden Ketone und Ester bevorzugt. Besonders bevorzugt werden Methylethylketon, Methyl-n-propylketon, Methyl-n-butylketon, Methylisobutylketon, Methylacetat und Ethylacetat.
Das oben genannte Carbonsäureanhydrid oder die oben genannte Hydroxy-Verbindung kann ebenfalls als organisches Lösungsmittel der vorliegenden Erfindung dienen.
Die Reaktion der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise durch Hinzufügen der Carboxylesterase zu einem Gemisch aus dem Carbonsäureanhydrid und einer Hydroxy-Verbindung in einem organischen Lösungsmittel und gutes Rühren des Gemischs durchgeführt werden.
In dem Fall, in dem eine große Menge Wasser an der Reaktion beteiligt ist, d.h. wo Carboxylesterase, die in einem organischen Lösungsmittel unlöslich ist, gewöhnlich eingesetzt wird, kann die Reaktion vorzugsweise in einem einphasigen System unter gutem Rühren durchgeführt werden, bis eine Wasser-in-Öl-Emulsion gebildet wird.
In dem Fall, in dem eine sehr kleine Menge Wasser an der Reaktion beteiligt ist, d.h. wo Carboxylesterase, die in einem organischen Lösungsmittel löslich ist, gewöhnlich eingesetzt wird, kann die Reaktion unter gutem Rühren durchgeführt werden, bis eine homogene Lösung gebildet wird.
Die Reaktionstemperatur und der pH-Wert sollten mit unterschiedlichen Typen der Kultur-Enzyme, Substrate oder Lösungsmittel variieren, und es ist gewöhnlich wünschenswert, die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 5 ºC bis 90 ºC, vorzugsweise bei etwa 20 ºC bis 70 ºC, und bei einem pH-Wert zwischen etwa 2 und 10, vorzugsweise etwa 3 und 9, durchzuführen.
Die auf diese Weise erhaltene Ester-Verbindung kann mittels herkömmlicher Arbeitsweisen isoliert und gereinigt werden, etwa durch Filtrieren, Destillieren, Konzentrieren, Konzentrieren unter reduziertem Druck, Chromatographieren, z.B. Chromatographieren unter Verwendung von Silicagel oder Aluminiumoxid, Kristallisieren oder Umkristallisieren.
Die folgenden Beispiele und Bezugsbeispiele werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung angegegeben, sollten jedoch nicht als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung verstanden werden.
In den folgenden Beispielen und Bezugsbeispielen sind alle Prozent-Angaben Angaben in Gew./Vol.-%, sofern nichts anderes vermerkt ist.

Bezugsbeispiel 1

Herstellung des Enzyms

500 ml eines Kultur-Mediums, das Glucose (3,0 %), Proflo (Traders Oil Mill Co., USA) (1,0 %), Maisquellflüssigkeit (3,5 %), Magnesiumsulfat (0,02 %), Dikaliumhydrogenphosphat (0,1 %), Sojabohnenöl (0,05 %) und Calciumcarbonat (1,5 %) enthielt, wurde mit einer 20-proz. wäßrigen Natriumhydroxid- Lösung auf den pH-Wert 7,0 eingestellt.
Das Kultur-Medium wurde in einen 2 Liter-Sakaguchi-Kolben gefüllt und nach dem Verschließen mit einem Watte-Stopfen sterilisiert. Das Kultur-Medium wurde dann mit einer Schrägkultur von Streptomyces rochei var. volubilis (IFO 12507; ATCC-21250) (vgl. JP-Offenlegungsschrift 183695/1984) inokuliert und auf einer Schüttelmaschine mit Hin- und Herbewegung (83 Cyclen/min) 24 h bei 28 ºC inkubiert.
30 l eines Kultur-Mediums der gleichen Zusammensetzung wie oben wurden in einen 50 l-Fermenter gefüllt und sterilisiert. 500 ml der oben bezeichneten Kulturbrühe wurden in das obige Kulturmedium inokuliert und 24 h bei 24 ºC unter Belüftung mit 1 VVM (Belüftungs-Volumen pro Minute pro Volumen des Mediums) und unter Rühren mit 150 UpM inkubiert.
Dies wurde als Impf-Kultur verwendet. In einen 200 l-Fermenter wurden 100 l eines Glycerin (10 %), Proflo (Traders Oil Mill Co., USA) (2,0 %), Maisquellflüssigkeit (0,5 %), Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals Ltd., Japan) (1,0 %), Eisen(II)-sulfat (0,1 %), Sojabohnenöl (0,01 %) und β-Cyclodextrin (2,0 %) enthaltenden Kultur-Mediums gefüllt, das danach mit einer 20-proz. wäßrigen Natriumhydroxid-Lösung auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und dann mit Dampf 20 min bei 120 ºC sterilisiert wurde.
In dieses Kultur-Medium wurden 5 l der oben erwähnten Impf- Kultur überführt und darin 96 h bei 24 ºC unter Belüftung mit 1 VVM und Rühren mit 165 UpM inkubiert. Zu 60 l der so erhaltenen Kulturbrühe wurden 20 l Wasser und 2 kg Hyflo- Supercel (Johns Manville Products Co., USA) hinzugefügt, und die Mischung wurde filtriert, um 70 l des Filtrats zu erhalten.
In ein 60 l-Gefäß wurden 10 l des Filtrats gefüllt, 40 l Ethanol wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde mit einem Rührstab gut gerührt. Die Mischung wurde 12 h bei 5 ºC stehen gelassen, so daß Proteine ausfielen. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgehebert, um weiß-trübe Niederschläge zu erhalten.
Die Niederschläge wurden bei 2000 x g zentrifugiert, wobei die Temperatur auf 5 ºC gehalten wurde, um den Wasser-Gehalt der Niederschläge so weit wie möglich zu reduzieren. Das erhaltene Produkt wurde mit Ethanol gewaschen und erneut nach der gleichen Arbeitsweise wie oben zentrifugiert. Die Niederschläge wurden gesammelt und unter vermindertem Druck von 50 mm Hg bei 10 ºC 24 h getrocknet, um etwa 200 g Pulver zu erhalten. In 500 ml 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) wurden unlösliche Stoffe durch Zentrifugieren bei 2000 x g entfernt, wobei die Temperatur auf 5 ºC gehalten wurde, um die Proteine enthaltende Lösung zu gewinnen.
Zu der so erhaltenen Lösung wurden 2 l Ethanol hinzugefügt und gut mit ihr vermischt, so daß die Proteine erneut ausgefällt wurden. Die Mischung wurde 24 h bei 5 ºC stehen gelassen, und die überstehende Flüssigkeit wurde abgehebert. Die Niederschläge wurden der Zentrifugation unter 2000 x g bei 5 ºC unterworfen, um die überstehende Flüssigkeit vollständig zu entfernen, und mit Ethanol gewaschen und nach der gleichen Arbeitsweise wie oben zentrifugiert, um die Niederschläge zu sammeln. Die Niederschläge wurden unter vermindertem Druck von 50 mm Hg bei 10 ºC 24 h getrocknet, um etwa 100 g Proteine als Pulver zu erhalten.
Die Pulver wurden in 300 ml 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) gelöst, und unlösliche Stoffe wurden durch Zentrifugieren unter 2000 x g bei 50 ºC entfernt.
Die so erhaltene Lösung wurde der Gel-Filtration unter Verwendung einer Säule (Durchmesser: 200 mm; Länge 1 500 mm) unterworfen, die mit Sephadex G-50 gepackt war, das mit 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit der gleichen Puffer-Lösung wie oben mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml pro 5 min eluiert.
Mit Hilfe eines Verfahrens zum Analysieren der Carboxylesterase-Aktivität unter Einsatz von p-Nitrophenylessigsäure [vgl. Journal of Biological Chemistry 170, 467 (1947)] wurden 400 ml an Fraktionen, die Carboxylesterase-Aktivität zeigten, gesammelt; hierzu wurden 2,4 l Ethanol gegeben, und die resultierende Mischung wurde mit einem Rührer in einem 3 l-Erlenmeyer-Kolben gerührt, wonach Protein-Niederschläge erhalten wurden. Die Mischung wurde 24 h bei 5 ºC stehen gelassen, und die Niederschläge wurden durch Zentrifugation unter 2000 x g bei 5 ºC gesammelt und danach unter vermindertem Druck von 50 mm Hg 24 h bei 10 ºC getrocknet, wonach 40 g Proteine als Pulver erhalten wurden.
Die Pulver wurden in 100 ml 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,4) gelöst. Die Lösung wurde der Gel-Filtration unter Verwendung einer Säule (Durchmesser: 100 mm; Länge 1 500 mm) unterworfen, die mit Sephadex G-100 gepackt war, wobei die Elution mit der gleichen Puffer-Lösung wie oben mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml pro 5 min erfolgt.
Die Carboxylesterase-Aktivität zeigenden Fraktionen wurden gesammelt und der Ionenaustausch-Chromatographie mittels eines linearen Gradienten durch Einsatz einer zunehmenden Salz-Konzentration unter Verwendung einer Säule (Durchmesser: 50 mm; Länge 400 mm) unterworfen, die mit DEAE-Sephadex A-50 gepackt war. Die Elution erfolgte mit 2 l 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer (pH 7,4), der Natriumchlorid in 1-molarer Konzentration enthielt, im 1. Gefäß sowie mit 2 l 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) im 2. Gefäß.
Jeweils 10 ml des Eluats wurden mit Hilfe eines Fraktionssammlers (Typ Toyo 5F-160K) fraktioniert, und 300 ml der Carboxylesterase-Aktivität zeigenden Fraktionen wurden gesammelt und unter Rühren in einem 1 Liter-Erlenmeyer- Kolben mit 200 g kristallinem Ammoniumsulfat ausgesalzen.
Die erhaltenen Produkte wurden 24 h bei 5 ºC stehen gelassen, so daß die Proteine vollständig ausfielen, und die Niederschläge wurden durch Zentrifugation unter 2000 x g bei 5 ºC gesammelt. In 50 ml 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) wurden die erhaltenen Niederschläge gesammelt, und die Lösung wurde der Gel- Filtration unter Verwendung von Sephadex G-100 in der gleichen Weise wie oben unterworfen.
Die Carboxylesterase-Aktivität zeigenden Fraktionen wurden gesammelt und der Ionenaustausch-Chromatographie mittels eines linearen Gradienten unter Verwendung von DEAE-Sephadex A-50 in der gleichen Weise wie oben unterworfen, wonach 250 ml an Fraktionen gesammelt wurden, die Carboxylesterase- Aktivität zeigten; hiernach folgte das Aussalzen durch Zusatz von 167 g Ammoniumsulfat unter Rühren.
Nach 24 h Stehenlassen bei 5 ºC wurden die Niederschläge durch Zentrifugieren in der gleichen Weise wie oben abgetrennt. Die Niederschläge wurden in 30 ml 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) gelöst und der Gel-Filtration unter Verwendung von Sephadex G-100 in der gleichen Weise wie oben unterworfen. Die erhaltenen, Carboxylesterase-Aktivität zeigenden Fraktionen wurden an einer Säule (Durchmesser: 10 mm; Länge: 100 mm) mit DEAE Sephadex A-50, das mit 0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) äquilibriert worden war, chromatographiert, wobei die Elution nacheinander mit 100 ml der gleichen Puffer-Lösung wie oben und 20 ml der gleichen Puffer-Lösung wie oben, die Natriumchlorid in 1 molarer Konzentration enthielt, durchgeführt wurde.
Die Carboxylesterase-Aktivität zeigenden Fraktionen wurden gesammelt, in ein aus Cellophan gefertigtes Rohr zur Dialyse eingespritzt und zur Durchführung der Dialyse unter 2 l Wasser in einen 3 l-Erlenmeyer-Kolben gebracht. Die Dialyse wurde 24 h unter Rühren des äußeren Wassers mit einem Magnetrührer fortgeführt. Nach Beendigung der Dialyse wurde die Lösung in dem Rohr in einen 2 l-Kolben des Auberginen- Typs gefüllt und 24 h unter einem verminderten Druck von 20 mm Hg unter Verwendung einer Gefriertrocknungs-Apparatur (No. 10-146, Typ MR-BA, The Virtis Co. Inc., USA) lyophilisiert, um pulverförmige Carboxylesterase zu erhalten [vgl. Enzyme Nomenclature, Section 3.1.1.1, Academic Press Inc., (1984)], die aus Streptomyces rochei var. volubilis stammt. Durch SDS-Gel-Elektrophorese und Ultrazentrifugen-Analyse wurde bestätigt, daß es sich bei der erhaltenen Carboxylesterase um ein einzelnes Protein handelt. Im folgenden wird die obige Carboxylesterase gelegentlich kurz als Carboxylesterase-Präparat bezeichnet.

Bezugsbeispiel 2

Herstellung des chemisch modifizierten Enzyms

In 8 ml 0,1 M Natriumborat-Puffer (pH 9,5) wurden 50 mg des Carboxylesterase-Präparats gelöst. Hierzu wurde 1,0 g 2,4-Bis(o-methoxypolyethylenglycol)-6-chlor-s-triazin (Molekulargewicht des Polyethylenglycols: 6 000) hinzugefügt, und die Mischung wurde anschließend 1 h bei 5 ºC gerührt. Der Reaktionsmischung wurden 72 ml 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) zugesetzt, um die Reaktion zu beenden.
Die Reaktionsmischung wurde der Ultrafiltration (Ultrafiltrator: Typ 8050, Amicon Division of GRACE Corp., USA) mit einem Milipor-Filter YM-10 unterworfen und mit 400 ml 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, um unumgesetztes 2,4-Bis(o-methoxypolyethylenglycol)-6-chlor-s-triazin zu entfernen.
Dann wurde die das mit Polyethylenglycol modifizerte Enzym enthaltende Lösung in einen 500 ml-Kolben des Auberginen- Typs gefüllt und 24 h unter einem verminderten Druck von 20 mm Hg lyophilisiert, um 600 mg mit Polyethylenglycol modifizierte Carboxylesterase zu erhalten (im folgenden kurz als PEG-modifizierte Esterase bezeichnet).

Beispiel 1

2 ml einer Lösung von Lankacidin C (Konzentration 11 mM) und Essigsäureanhydrid (Konzentration 50 mM) in Methylisobutylketon wurden in ein 20 ml-Proberöhrchen mit Stopfen gefüllt, und 0,3 ml einer Lösung der PEG-modifizierten Esterase in 0,2 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Maleinsäure-Puffer (pH 7,0) wurden hinzugefügt, wobei die Konzentration der PEG-modifizierten Esterase 12 mg/ml betrug; danach wurde bei 37 ºC auf einer Schüttelapparatur (80 Cyclen/min) geschüttelt.
Mit Hilfe der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (im folgenden kurz als HPLC-Methode bezeichnet), wie sie unten beschrieben wird, wurde die Menge des gebildeten Lankacidin A zu der in der Tabelle 1 angegebenen Zeit gemessen.
Die Bedingungen der HPLC-Methode waren folgende:
Gerät: Typ LC-5A (Shimazu Corporation, Ltd., Japan)
Säule: u-Poracil-Säule (300 x 3.9 mm ∅, Waters Division of Millipore, USA)
Temperatur: 45 ºC
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min
Die Retentionszeiten von Lankacidin C und Lankacidin A waren die folgenden:
Lankacidin C: 7,0 min;
Lankacidin A: 3,5 min.
Die Menge des Lankacidin A wurde unter Einsatz eines Detektors für die Ultraviolett-Absorption bei 254 nm quantitativ bestimmt.
Als Kontrolle wurden die gleichen Arbeitsweisen wie oben unter Einsatz von Ethylacetat (300 mM) oder Essigsäure (100 mM) an Stelle von Essigsäureanhydrid (50 mM) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Menge (mM) des in Zeitabständen gebildeten Lankacidin A Acetyl-Gruppen-Donor Reaktionszeit (min) Essigsäureanhydrid Ethylacetat Essigsäure

Anmerkung:

" - " in der Tabelle bedeutet nicht mehr als 0,1 mM.
Tabelle 1 zeigt deutlich, daß Essigsäureanhydrid dem Ethylacetat oder der Essigsäure hinsichtlich der Bildungsgeschwindigkeit und der Menge des gebildeten Lankacidin A überlegen ist und daß Essigsäure praktisch nicht verwendet werden kann.

Beispiel 2

Durch Veränderung der Konzentration des Acetyl-Gruppen- Donors zu den in Tabelle 2 angegebenen Werten und mit einer Reaktionszeit von 20 min wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Menge (mM) des durch verschiedene Acetyl-Gruppen-Donoren gebildeten Lankacidin A Acetyl-Gruppen-Donor Menge des gebildeten Lankacidin A (mM) Essigsäureanhydrid Ethylacetat

Anmerkung:

Bei Verwendung von Essigsäureanhydrid als Acetyl-Gruppen- Donor in der gleichen Konzentration wie Ethylacetat wurden Versuche durchgeführt. Die Bildung von Lankacidin A konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.
Unter Anwendung der Lineweaver-Burk'schen Gleichung der Formel (2) [Biochemical Dictionary, 1.Auflage, Seite 1314 (1984), Tokyokagakudozin Ltd.], die durch Modifizierung der Michaelis-Menten-Gleichung der Formel (1) [siehe oben, Seite 1239] abgeleitet worden war, wurde die Reaktion unter Einsatz von Essigsäureanhydrid als Acetyl-Gruppen-Donor mit derjenigen unter Einsatz von Ethylacetat als Acetyl-Gruppen- Donor verglichen.
ν : Reaktionsgeschwindigkeit
Vmax : maximale Reaktionsgeschwindigkeit
[S]&sub0; : Substrat-Konzentration
Km : Michaelis-Konstante
Durch Einsetzen der in Tabelle 2 angegebenen Konzentration des Acetyl-Gruppen-Donors an Stelle von [S]&sub0; und der Werte der in Tabelle 2 angegebenen Mengen des gebildeten Lankacidin A an Stelle von ν wurden die Werte von Km und Vmax nach der Methode der kleinsten Quadrate berechnet.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Acetyl-Gruppen-Donor Essigsäureanhydrid Ethylacetat
Tabelle 3 zeigt deutlich, daß im Falle der Verwendung von Essigsäureanhydrid als Acetyl-Gruppen-Donor Reaktionsprodukte in genügender Menge aus einer kleinen Menge Substrat erhalten werden können, weil der Wert von Km viel kleiner ist als in dem Fall, in dem Ethylacetat als Acetyl- Gruppen-Donor eingesetzt wird.

Beispiel 3

Ein mit Glas ausgekleideter 10 l-Reaktor, der mit einem Rührer ausgestattet war, wurde mit 2 l Methylisobutylketon beschickt, das bei 37 ºC gehalten wurde. In diesem wurden 10 g Lankacidin C aufgelöst. Zu der Mischung wurde eine Lösung von 1,2 g der PEG-modifizierten Esterase in 300 ml 0,2 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Maleinsäure-Puffer (pH 7,0) hinzugefügt. Nach dem Vermischen wurden 10 ml Essigsäureanhydrid zu der Mischung hinzugefügt, wonach 40 min bei 37 ºC gerührt wurde.
Der Reaktionsmischung wurden 2 l destilliertes Wasser unter Rühren zugesetzt. Nach dem Zumischen wurde die Reaktionsmischung in einen 10 l-Scheidetrichter überführt, um die Wasser-Schicht zu entfernen. Zu der erhaltenen organischen Lösung wurden 500 ml einer 2-proz. wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung hinzugefügt und gut gerührt, und die Wasser- Schicht wurde entfernt.
Die erhaltene Mischung wurde wieder mit der gleichen wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung wie oben gewaschen, um sämtliche überschüssige Säure zu entfernen. Das Waschen mit 2 l destilliertem Wasser wurde zweimal in einem Scheidetrichter vorgenommen, um die organische Schicht abzutrennen.
Die auf diese Weise erhaltene organische Lösung wurde in einen 3 l-Erlenmeyer-Kolben gebracht, 2 h über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, um 10 g Lankacidin A in Form roher Kristalle zu erhalten.
Die obigen Kristalle wurden in 1 Liter Chloroform aufgelöst, und die Lösung wurde auf einer Säule (∅: 80 mm; Länge: 500 mm) aus Silicagel (Merck Co., USA) absorbiert, die mit Chloroform äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit 2 l Chloroform erfolgte die Elution mit Ethylacetat:Chloroform (3 : 7 Vol./Vol.) In einem Fraktionssammler (Typ Toyo 5F- 160K) wurden Fraktionen von jeweils 20 ml gesammelt. Die Lankacidin A enthaltenden Fraktionen wurden unter Nutzung der UV-Spektroskopie gesammelt.
Die erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wonach Lankacidin A als Pulver erhalten wurde.
Das Pulver wurde mit 1 Liter Ethylacetat aufgenommen, und die resultierende Lösung wurde unter vermindertem Druck auf 40 ml eingeengt und dann auf 5 ºC abgekühlt. Kristalle von Lankacidin A, die sich abschieden, wurden auf einem Glasfilter gesammelt, mit n-Hexan gewaschen und unter einem Druck von 20 mm Hg bei 40 ºC getrocknet, wonach 8,1 g Lankacidin A in Form von Kristallen erhalten wurden.
Schmelzpunkt, optische Drehung, Ultraviolett-Spektrum und Elementaranalyse der erhaltenen Kristalle wurden jeweils als identisch mit denjenigen Werten bestätigt, die in Journal of Antibiotics 24, 13 (1971) beschrieben sind.
Die Retentionszeit der erhaltenen Kristalle bei der HPLC- Methode wurde als identisch mit derjenigen einer authentischen Probe von Lankacidin A bestätigt.

Beispiel 4

Ein mit Glas ausgekleideter 10 l-Reaktor, der mit einem Rührer ausgestattet war, wurde mit 2 l Methylisobutylketon beschickt, in dem 10 g Lankacidin C bei 37 ºC aufgelöst wurden. Zu der Lösung wurde 1 Liter einer Lösung des in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Carboxylesterase-Präparats in 0,2 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Maleinsäure-Puffer (pH 7,0) hinzugefügt; die Konzentration des Carboxylesterase-Präparats in dieser Lösung betrug 2 mg/ml.
Zu der Mischung wurden 10 ml Essigsäureanhydrid hinzugefügt, wonach 40 min bei 37 ºC gerührt wurde. Die Mischung wurde mit 2 l destilliertem Wasser versetzt und gut gerührt und dann in einen 10 l-Scheidetrichter überführt.
Nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 3 wurden 5,8 g Lankacidin A als Kristalle erhalten.

Beispiel 5

Das Filtrat der durch Kultivieren von Streptomyces rochei var. volubilis in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe enthält aus Streptomyces rochei var. volubilis stammende Carboxylesterase.
Es ist bereits bekannt, daß Streptomyces rochei var. volubilis befähigt ist, Lankacidin C in der Kulturbrühe anzureichern, d.h., daß Streptomyces rochei var. volubilis ein Mikroorganismus ist, der Lankacidin C zu produzieren vermag [The Journal of Antibiotics 24, 1 (1971)].
Der Gehalt an Lankacidin C in dem genannten Filtrat der Kulturbrühe wurde mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Methode gemessen. Es wurde festgestellt, daß das genannte Filtrat Lankacidin C in einer Konzentration von 3500 ug/ml enthielt.
In Beispiel 5 wurde das Filtrat der in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe als Ausgangsmaterial eingesetzt, das sowohl Carboxylesterase als auch eine Hydroxy-Verbindung enthielt. Ein mit Glas ausgekleideter 10 l-Fermenter, der mit einem Rührer ausgestattet war, wurde mit 1 Liter des Filtrats beschickt, und die Temperatur der Mischung wurde auf 37 ºC gehalten.
Zu der Mischung wurden 1 Liter Methylisobutylketon, das bei 37 ºC gehalten wurde, und 10 ml Essigsäure hinzugefügt, und das Gemisch wurde 60 min bei 37 ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter 2000 x g zentrifugiert, wobei die Temperatur durch Verwendung eines Niedertemperatur-Zentrifugalabscheiders (Typ RD-2 IV, Tomy Seiko Co. Ltd., Japan) auf 5 ºC gehalten wurde.
Die erhaltene Lösung wurde in einen 10 l-Scheidetrichter überführt, um die obere Lösung abzutrennen, und diese wurde mit 2 l destilliertem Wasser gewaschen.
Nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 3 wurden 2,8 g Lankacidin A erhalten.

Beispiel 6

Unter Einsatz von 10 ml Propionsäureanhydrid an Stelle der 10 ml Essigsäureanhydrid in Beispiel 3 wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 3 angewandt. Die in der Lösungsmittel-Schicht der Reaktionsmischung angereicherten Produkte wurden mittels der HPLC-Methode von Beispiel 1 identifiziert und analysiert, wo Lankacidin C-14-propionat, das nach der in The Journal of Antibiotics 26, 647 (1973) beschriebenen synthetischen Methode hergestellt worden war, als authentische Probe eingesetzt wurde.
Es wurde gefunden, daß die Lösungsmittel-Schicht Lankacidin C-14-propionat (Retentionszeit: 2,40 min) in einer Konzentration von 9,1 g/l enthielt. Nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 3 wurden 7,2 g Lankacidin C-14-propionat abgetrennt und gereinigt.
Schmelzpunkt, optische Drehung, Elementaranalyse und molekulare Extinktion wurden jeweils als identisch mit denjenigen Werten bestätigt, die in Journal of Antibiotics 26, 647 (1973) beschrieben sind.

Beispiel 7

Unter Einsatz von Buttersäureanhydrid, Isobuttersäureanhydrid, Capronsäureanhydrid oder Benzoesäureanhydrid an Stelle des Propionsäureanhydrids in Beispiel 6 wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 6 angewandt. Die Reaktionsmischung wurde mittels der HPLC-Methode von Beispiel 1 analysiert, und die Abtrennung und Reinigung erfolgte nach der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrensweise. Carbonsäureanhydrid Produkt Retentionszeit min Ausbeute g Buttersäureanhydrid Isobuttersäureanhydrid Capronsäureanhydrid Benzoesäureanhydrid Lankacidin C-14-n-butyrat Lankacidin C-14-isobutyrat Lankacidin C-14-caproat Lankacidin C-14-benzoat
Schmelzpunkt, optische Drehung, Elementaranalyse und molekularer Koeffizient wurden jeweils als identisch mit denjenigen Werten bestätigt, die in Journal of Antibiotics 26, 647 (1973) beschrieben sind.

Beispiel 8

Ein mit Glas ausgekleideter 10 l-Reaktor, der mit einem Rührer ausgestattet war, wurde mit 2 l Methylisobutylketon beschickt, das 1 M Ethanol enthielt, und die Temperatur der Lösung wurde bei 37 ºC gehalten. Zu dieser Lösung wurden 300 ml einer Lösung der in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen PEG- modifizierten Esterase in 0,2 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Maleinsäure-Puffer (pH 7,0) hinzugefügt, wobei die Konzentration der PEG-modifizierten Esterase 12 mg/ml betrug. Zu der Mischung wurde Essigsäureanhydrid in einer in Tabelle 4 angegebenen Konzentration hinzugefügt, wonach 20 min bei 37 ºC gerührt wurde.
Die Methylisobutylketon-Schicht wurde abgetrennt und der Analyse mittels Gaschromatographie (GC) unter den nachstehend genannten Bedingungen unterworfen.
Bedingungen der Gaschromatographie:
Gerät: Typ GC-9A (Shimazu Corporation, Ltd., Japan)
Säule: Porapak P (60-80 mesh; ∅: 3 mm, Länge: 2 m; Waters Co., USA)
Detektor: Typ FID (Shimazu Corporation, Japan)
Wasserstoff-Druck: 0,5 kg/cm²
Fließgeschwindigkeit des Wasserstoffs: 35 ml/min
Luft-Druck: 0,5 kg/cm²
Fließgeschwindigkeit der Luft: 480 ml/min
Säulen-Temperatur: 140 ºC
Detektor- und Injektor-Temperatur: 150 ºC
Proben-Menge: 5 ul
Retentionszeit jedes der Bestandteile:
Ethylacetat (Produkt): 4,1 min;
Ethanol: 1,3 min;
Essigsäure: 2,6 min;
Methylisobutylketon: 6,0 min.
Jeder der Bestandteile wurde unter Verwendung von Chemikalien spezieller Reinheit (Wako Pure Chem. Ltd., Japan) als authentische Proben analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Essigsäureanhydrid Ethylacetat Essigsäure Anfangs-Konzentration im Lösungsmittel mM resultierende Konzentration im Lösungsmittel mM

Beispiel 9

Im Fall der Konzentration von 30 mM Essigsäureanhydrid in Tabelle 4 des Beispiels 8 wurde das gebildete Ethylacetat gemäß der nachstehend beschriebenen Arbeitsweise abgetrennt.
Zu der Reaktionsmischung wurden 5 l destilliertes Wasser hinzugefügt, die Mischung wurde gut gerührt und dann in einen 10 l-Scheidetrichter überführt. Nach 1 h Stehenlassen wurde die Wasser-Schicht entfernt. Zu der erhaltenen organischen Schicht wurden 500 ml einer 2-proz. wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung hinzugefügt, und das Ganze wurde in einem Scheidetrichter gut vermischt.
Nach 1 h Stehenlassen wurde die Wasser-Schicht entfernt, und zu der erhaltenen organischen Schicht wurden 5 l destilliertes Wasser hinzugefügt. Die Wasser-Schicht wurde nach der gleichen Arbeitsweise wie oben entfernt.
Das erhaltene Gemisch wurde dreimal mit der wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung nach der gleichen Weise wie oben gewaschen, um Enzym-Protein, Ethanol und Essigsäure aus der Reaktionsmischung zu entfernen. Nach zusätzlichem Waschen mit 5 l destilliertem Wasser wurde die Mischung bei 77 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule destilliert, um Ethylacetat zu erhalten.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 10

Unter Verwendung von 2,4-Bis(o-methoxypolyethylenglycol)-6- chlor-s-triazin wurde PEG-modifizierte Esterase aus Carboxylesterase (Enzym-Nomenklatur 3.1.1.1) (Sigma Co., USA), die aus Schweineleber stammte, nach der gleichen Arbeitsweise wie in Bezugsbeispiel 2 hergestellt.
Unter Einsatz der PEG-modifizierten Esterase wurde Essigsäureanhydrid mit Ethanol nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 8 reagieren gelassen, und die resultierenden Ethylacetat und Essigsäure wurden nach der gleichen quantitativen Analysenmethode wie in Beispiel 8 analysiert.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 Essigsäureanhydrid Ethylacetat Essigsäure Anfangs-Konzentration im Lösungsmittel mM resultierende Konzentration im Lösungsmittel mM

Beispiel 11

Im Fall der Anfangs-Konzentration von 30 mM Essigsäureanhydrid in Tabelle 5 des Beispiels 10 wurde das gebildete Ethylacetat gemäß der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 9 abgetrennt, wonach 3,05 g Ethylacetat erhalten wurden.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 12

Ein mit Glas ausgekleideter 10 l-Reaktor, der mit einem Rührer ausgestattet war, wurde mit 2 l Methylisobutylketon beschickt, das Ethanol in 1-molarer Konzentration enthielt, und die Temperatur der Lösung wurde bei 37 ºC gehalten.
Zu dieser Lösung wurden 300 ml einer Lösung PEG-modifizierter Esterase, die aus Streptomyces rochei var. volubilis stammte und nach der gleichen Arbeitsweise wie in Bezugsbeispiel 1 präpariert worden war, in 0,2 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Maleinsäure-Puffer (pH 7,0) hinzugefügt, wobei die Konzentration der PEG-modifizierten Esterase 12 mg/ml betrug.
Nach 10 min Rühren bei 37 ºC wurden 7,8 g n-Propionsäureanhydrid zu der Mischung hinzugefügt, und das Gemisch wurde 20 min bei 37 ºC gerührt. Zu der Reaktionsmischung wurden 5 l destilliertes Wasser hinzugefügt, die Mischung wurde gut gerührt und dann in einen 10 l-Scheidetrichter überführt. Nach 1 h Stehenlassen wurde die Wasser-Schicht entfernt.
Zu der erhaltenen organischen Schicht wurden 500 ml einer 2-proz. wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung hinzugefügt, und das Ganze wurde in einem Scheidetrichter gut vermischt. Nach 1 h Stehenlassen wurde die Wasser-Schicht entfernt, und zu der erhaltenen organischen Schicht wurden 5 l destilliertes Wasser hinzugefügt, und dann wurde die Wasser-Schicht nach der gleichen Arbeitsweise wie oben entfernt.
Das erhaltene Gemisch wurde dreimal mit der wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung nach der gleichen Weise wie oben gewaschen, um Enzym-Protein, Ethanol und Propionsäure aus der Reaktionsmischung zu entfernen.
Die so erhaltene Mischung wurde bei 99 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule destilliert, um 5,5 g Ethylpropionat zu erhalten.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 13

Unter Einsatz von 9,4 g n-Buttersäureanhydrid an Stelle von n-Propionsäureanhydrid wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 178 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 6,3 g Ethyl-n-butyrat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 14

Unter Einsatz von 12,9 g n-Capronsäureanhydrid an Stelle von n-Propionsäureanhydrid wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 178 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 6,3 g Ethyl-n-caproat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 15

Unter Einsatz von n-Propanol an Stelle von Ethanol wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 124 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 6,0 g n-Propylpropionat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 16

Unter Einsatz von 9,4 g n-Buttersäureanhydrid an Stelle von Propionsäureanhydrid und von n-Propanol an Stelle von Ethanol wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 143 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 5,8 g n-Propyl-n-butyrat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 17

Unter Einsatz von 6,1 g Essigsäureanhydrid an Stelle von Propionsäureanhydrid und von Isopropanol an Stelle von Ethanol wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 89 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 5,0 g Isopropylacetat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 18

Unter Einsatz von 6,1 g Essigsäureanhydrid an Stelle von Propionsäureanhydrid und von n-Butanol an Stelle von Ethanol wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 126 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 5,2 g n-Butylacetat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 19

Unter Einsatz von n-Butanol an Stelle von Ethanol wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 147 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 5,1 g n-Butylpropionat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 20

Unter Einsatz von 13,6 g Benzoesäureanhydrid an Stelle von Propionsäureanhydrid wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 212 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 9,2 g Ethylbenzoat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 21

Unter Einsatz von 12,2 g Essigsäureanhydrid an Stelle von Propionsäureanhydrid und von Ethylenglycol an Stelle von Ethanol wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 12 angewandt.
Die Destillation bei 182 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 2,0 g 2-Hydroxyethylacetat.
Die Destillation bei 191 ºC und Atmosphärendruck als Charge über eine Fraktioniersäule ergab 2,2 g 2-Acetoxyethylacetat.
Das spezifische Gewicht bei 20 ºC, der Brechungsindex und der Siedepunkt der erhaltenen Verbindung wurden als identisch mit den im Merck Index, 8.Aufl. (1968), angegebenen Werten bestätigt.

Beispiel 22

In einen 200 l-Fermenter wurden 100 l eines Kultur-Mediums gefüllt, das Dextrin (10 %), Proflo (Traders Oil Mill Co., USA) (0,5 %), entfettetes Sojabohnenmehl (2,0 %), Maisquellflüssigkeit (1,0 %), Maisglutenmehl (1,3 %), p-Aminobenzoesäure (0,025 %), Ammoniumsulfat (0,2 %), Natriumchlorid (0,5 %), Eisen(II)-sulfat (0,1 %), Kupfer(II)-sulfat (0,005 %), Nickelsulfat (0,03 %), β-Cyclodextrin (2,4 %) und FS-Anti-Foam F20 (Antischaummittel, Dow Corning Co., USA) (0,2 %) enthielt, und 20 min einer Dampf-Sterilisation bei 120 ºC unterzogen.
Zu dem Kultur-Medium wurden 5 l der gleichen Impfkultur wie in Bezugsbeispiel 1 überführt und 96 h bei 25 ºC unter Belüftung mit 1 VVM und Rühren bei 165 UpM inkubiert.
Zu 60 l der so erhaltenen Kulturbrühe wurden 20 l Wasser und 2 kg Hyflo-supercel (Johns Manville Products Co., USA) hinzugefügt, und die Mischung wurde filtriert, wonach 70 l des Filtrats erhalten wurden.
Mittels der in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Methode wurde der Gehalt von Lankacidin C gemessen. Es wurde festgestellt, daß Lankacidin C in einer Konzentration von 4100 ug/ml des Filtrats enthalten war. Jeweils 1 Liter des Filtrats wurden in je einen von drei mit Rührern ausgerüsteten und mit Glas ausgekleideten 10 l-Reaktoren gefüllt, die von 1 bis 3 numeriert wurden.
Dem Reaktor Nr. 1 wurde 1 Liter Methylisobutylketon, das 100 mM Essigsäureanhydrid enthielt, zugesetzt, dem Reaktor Nr. 2 wurde 1 Liter Methylisobutylketon, das 200 mM Ethylacetat enthielt, zugesetzt, und dem Reaktor Nr. 3 wurde 1 Liter Methylisobutylketon, das 200 mM Essigsäure enthielt, zugesetzt.
Die Mischungen in den Reaktoren Nr. 1 bis 3 wurden jeweils 60 min bei 37 ºC gerührt, so daß die Acetylierungs-Reaktion ablief. Jeweils 1 ml der organischen Schicht des Gemischs wurde entnommen und der quantitativen Analyse auf Lankacidin A nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode unterzogen.
Die Reaktions-Ausbeute [Menge gebildetes Lankacidin A/Anfangs-Menge Lankacidin C x 100] wurde berechnet und ist in Tabelle 6 angegeben.
Weiterhin wurde aus jeder der Reaktions-Mischungen in den Reaktoren Nr. 1 bis 3 das Lankacidin A abgetrennt und nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 3 gereinigt.
Die Ausbeuten (g) an erhaltenem Lankacidin A sind in Tabelle 6 angegeben.
Tabelle 6 zeigt deutlich, daß bei Einsatz von Essigsäureanhydrid als Acetyl-Gruppen-Donor Lankacidin A in der höchsten Ausbeute (oder mit dem höchsten Ertrag) erhalten wird. Tabelle 6 Reaktions-Ausbeute (Gew./Gew.-%) Ertrag (g) 1: Essigsäureanhydrid, 100 mM Konzentration 2: Ethylacetat, 200 mM Konzentration 3: Essigsäure, 200 mM Konzentration Reaktionsausbeute: [Menge des in 1 Liter des Filtrats gebildeten Lankacidin A]/[Menge (4,1 g) des in 1 Liter des Filtrats als Ausgangsmaterial enthaltenen Lankacidin C] x 100 Ertrag: Menge des isolierten und gereinigten Lankacidin A.

Beispiel 23

Zwei von drei Probe-Röhrchen (jeweils 20 ml Fassungsvermögen mit Schliffstopfen) wurden mit je einem Anteil von 2 ml Ethylpropionat beschickt, und das verbliebene Röhrchen wurde mit 2 ml Methylisobutylketon gefüllt. In jedes dieser Proberöhrchen wurden 10 mg Maridomycin (der Formel III:
R&sub1; = R&sub2; = COCH&sub2;CH&sub3;; R&sub3; = H) gegeben, und das Gemisch wurde gut gerührt, um eine Lösung herzustellen.
Die beiden Ethylpropionat enthaltenden Probe-Röhrchen wurden als Reaktions-System (1) und Reaktions-System (2) bezeichnet, während das Methylisobutylketon enthaltende Probe-Röhrchen als Reaktions-System (3) bezeichnet wurde. Zu jedem dieser Reaktions-Systeme wurden jeweils 2 ml der Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Maleat-Puffer-Lösung (0,2 M; pH 7,0) hinzugefügt, in denen in Bezugsbeispiel 1 erhaltene Carboxylesterase zu einer Konzentration von 2 mg/ml aufgelöst worden war. Zu jedem der Reaktions-Systeme (2) und (3) wurden 20 ul Propionsäureanhydrid hinzugefügt; sofort danach wurden die mit dem Stopfen verschlossenen Probe- Röhrchen 30 min bei 28 ºC geschüttelt. Aus dem Lösungsmittel-Anteil jedes Reaktions-Systems wurden 50 ul der jeweiligen Lösung mikropipettiert und der Dünnschicht- chromatographie unterworfen (Kieselgel 60, 0,25 mm dick, 20 cm x 20 cm, Merck & Co., USA).
Neben diesen drei den Reaktions-Systemen (1), (2) und (3) entsprechenden Test-Proben wurden unter Einsatz von Maridomycin III (Formel III: R&sub1; = R&sub2; = COCH&sub2;CH&sub3;; R&sub3; = H) und von 9-Propionylmaridomycin III (Formel III: R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = COCH&sub2;CH&sub3;) dünnschicht-chromatographische Analysen unter Verwendung eines Lösungsmittel-Systems aus Aceton-Toluol (1 : 1) durchgeführt.
Mit Hilfe einer Farbentwicklung mit Iod-Dampf wurden die Rf-Werte von Maridomycin III und 9-Propionylmaridomycin zu 0,46 bzw. 0,57 bestätigt. Die Maridomycin III und 9-Propionylmaridomycin III entsprechenden Dünnschicht-Portionen in den Test-Proben jedes der Reaktions-Systeme wurden nach Abkratzen gesammelt und dann mit je einem kleinen Volumen Ethylacetat extrahiert. Die betreffenden Extrakt-Lösungen wurden der quantitativen Bestimmung des Substrats (Maridomycin III) und des Reaktionsprodukts (9-Propionylmaridomycin III) mit Hilfe der in Agricultural and Biological Chemistry 43, S. 847 (1979), beschriebenen "Colorimetric Quantitative Determination Method of Maridomycin Antibiotics" unterzogen.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Substrat Maridomycin III Reaktionsprodukt 9-Propionylmaridomycin III Reaktions-System Spur (Einheit: mg)

(Anmerkung)

Reaktions-System
(1): Ethylpropionat 2 ml;
(2): Ethylpropionat 2 ml; Propionsäureanhydrid 20 ul;
(3): Methylisobutylketon 2 ml; Propionsäureanhydrid 20 ul.

Beispiel 24

Ein mit Glas ausgekleidetes Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 10 Litern (mit Rührer) wurde mit 2 l zuvor auf 28 ºC erwärmtem Methylisobutylketon beschickt, in dem 10 g Maridomycin III gelöst wurden. Zu der Lösung wurden dann 2 l einer Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Maleat-Puffer- Lösung (0,2 M; pH 7,0) hinzugefügt, in denen 500 mg der Carboxylesterase gelöst waren, die in Bezugsbeispiel 1 erhalten worden war. Zu der Lösungsmittel-Schicht wurden 20 ml Propionsäureanhydrid hinzugefügt, und die Reaktion wurde 1 h unter Rühren ablaufen gelassen. Die Reaktions- Lösung wurde in einen Scheidetrichter von 10 l Fassungsvermögen überführt, und auf diese Weise wurde die wäßrige Phase entfernt. Zu dem verbliebenden Rest wurden 500 ml einer wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung (2 Gew./Vol.-%) hinzugefügt. Die Mischung wurde genügend gerührt, und danach wurde der wäßrige Anteil entfernt. Das Waschen mit einer wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung wurde noch einmal wiederholt, und danach wurde zweimal mit 2 l destilliertem Wasser in dem Scheidetrichter gewaschen. Die organische Phase wurde in einen konischen Kolben von 3 l Fassungsvermögen überführt und mit 100 g wasserfreiem Natriumsulfat versetzt und 2 h stehen gelassen. Das wasserfreie Natriumsulfat wurde über ein Papierfilter abfiltriert, und die Reaktionslösung wurde zur Trockne konzentriert, wonach 10 g 9-Propionylmaridomycin III in Form roher Kristalle erhalten wurden.
Die rohen Kristalle wurden in 1 Liter Toluol gelöst, und die Lösung wurde auf eine Säule (80 mm Durchmesser; 500 mm Länge) mit Silicagel (Merck; USA) gegossen, die mit Toluol äquilibriert worden war, um das 9-Propionylmaridomycin III daran zu adsorbieren. Drei Liter Toluol wurden durch die Säule hindurchgeleitet; danach erfolgte Elution mit 2,5 l eines Gemischs aus Toluol-Aceton (1 : 0,5) und dann mit einem Gemisch aus Toluol-Aceton (1 : 1). Das Eluat wurde in 20 ml-Anteilen mit Hilfe eines Toyo-Fraktionssammlers (Typ 5F-160) fraktioniert. Die Identifizierung der Verbindung erfolgte durch Dünnschicht-Chromatographie zum Identifizieren von Propionylmaridomycin III gemäß der Beschreibung in Beispiel 23. Die die Ziel-Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert, wonach 9,1 g weiße Kristalle erhalten wurden. Elementaranalyse der Kristalle: C:H:N = 59,7:8,0:1,6; [α]D = -61.3º (c = 1, CHCl&sub3;). Diese Analysenwerte stimmen mit den in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 4, S. 142 (1973), beschriebenen überein. Das IR-Spektrum war ebenfalls in Übereinstimmung mit dem in Chemotherapy 21, S. 908 (1973), beschriebenen.
Diese Kristalle sind leicht löslich in Methanol, Ethanol und Aceton, relativ löslich in Chloroform und kaum löslich in Wasser.
Wenn eine Lösung von 5 mg der Kristalle in 2 ml Aceton mit 2 ml Salzsäure geschüttelt wurde, entwickelte sich eine rötlich-purpurrote Färbung. Die Lösung wurde weiterhin mit 2 ml Chloroform geschüttelt und dann stehen gelassen; danach entwickelte sich die hell-purpurrote Färbung in der Chloroform- Schicht. Eine Mischung aus 20 mg der Kristalle, 2 mg Thiosemicarbazid und 2 ml Ethanol wurde 1 h in einem Reaktionsgefäß, das mit einem Rückflußkühler ausgerüstet war, auf einem Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 0,2 ml der Reaktionsmischung abgenommen, und 50 ml Ethanol wurden hinzugefügt. Das Absorptionsspektrum dieser Mischlösung wurde gemessen, und die maximale Absorption wurde bei der Wellenlänge 270-273 nm beobachtet. Die vorstehenden Eigenschaften der Kristalle sowie die Ergebnisse bestätigender Tests derselben waren in Übereinstimmung mit der Beschreibung (Propionsäure-Maridomycin) auf Seite 457 der "Explanation of Minimum Requirements of Antibiotics, Japan" (1986, Yakugyojihosha).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Carbonsäureesters, umfassend die Umsetzung einer Hydroxy-Verbindung mit einem Carbonsäure-Anhydrid in Gegenwart einer Carboxylesterase als Katalysator in einem organischen Lösungsmittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Carbonsäureanhydrid ein Molekulargewicht unterhalb von 350 hat und sich in dem organischen Lösungsmittel aufzulösen vermag.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Carbonsäureanhydrid eines der Formel

ist,

worin

R und R&sub1; jeweils Wasserstoff oder eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppe ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin R und R&sub1; gleich sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin R und R&sub1; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoff- Atomen oder Phenyl sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Hydroxy-Verbindung eine 1 bis 10 Hydroxy-Gruppen enthaltende organische Verbindung ist und ein Molekulargewicht unterhalb von 1 500 hat und sich in dem organischen Lösungsmittel aufzulösen vermag.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Hydroxy-Verbindung eine organische Verbindung der Formel R&sub2;OH ist, worin R&sub2; eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-Gruppe oder eine heterocyclische Gruppe ist, die substituiert sein kann.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Hydroxy-Verbindung ein Alkohol, ein Phenol, eine heterocylische Verbindung, ein Antibiotikum oder eine biologisch aktive Substanz ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Hydroxy-Verbindung ein niederer (C&sub2;&submin;&sub4;)-Alkohol, Lankacidin C oder Maridomycin ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Carboxylesterase eine in einem organischen Lösungsmittel lösliche, mit einem Polyethylenglycol-Derivat modifizierte Carboxylesterase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die in einem organischen Lösungsmittel lösliche Carboxylesterase eine ist, die mit 2,4-Bis(O-methoxypolyethylenglycol)-6-chlor-s- triazin modifiziert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Carboxylesterase in Form des Kulturfiltrats eines die Carboxylesterase produzierenden Mikroorganismus vorliegt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin das organische Lösungsmittel mit Wasser ein zweiphasiges System bilden kann.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das organische Lösungsmittel ein Keton oder ein Ester ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, worin das organische Lösungsmittel Methylethylketon, Methyl-n-propylketon, Methyl-n- butylketon, Methylisobutylketon, Methylacetat oder Ethylacetat ist.

16. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 5 ºC bis 90 ºC und bei einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 10 durchgeführt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin Lankacidin C mit Essigsäureanhydrid in Gegenwart des Kulturfiltrats eines die Carboxylesterase produzierenden Mikroorganismus in Methylisobutylketon vorliegt, um Lankacidin A zu liefern.