JPS60156395A - 修飾リパーゼ - Google Patents

修飾リパーゼ

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JPS60156395A
JPS60156395A JP59006129A JP612984A JPS60156395A JP S60156395 A JPS60156395 A JP S60156395A JP 59006129 A JP59006129 A JP 59006129A JP 612984 A JP612984 A JP 612984A JP S60156395 A JPS60156395 A JP S60156395A
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alcohol
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、有機溶媒中で酵素活性を保持した修飾リパー
ゼによジカルボン酸エステルｋ　Ｍ　造する方法に関す
る。
一般に酵素は有機溶媒と接触すると変性して酵素活性を
失うので、水溶液中で基質に作用する。ＩＪ　、４’−
ゼは油脂の加水分解と合成を可逆的に触媒する酵素であ
るが、大部分の基質は水不溶性であるので、有機溶媒中
で酵素反応を行うことができれば、種々のエステル合成
やエステル交換による油脂の改質等の利用範囲が拡大さ
れる。
本発明者等は、これらの問題を解決する目的で、す゛ノ
々−ゼの化学修飾を試み、有機溶媒に可溶で酵素活性を
保持した修飾り・９−ゼを得、本発明を成した。
本発明の方法は、末端に疎水性基を有するポ。
リアルキレングリコールの活性誘導体をリパーゼに反応
させて得た修飾リパーゼの存在下、有機溶媒中で、カル
ボン酸とアルコールを反応させるか、或いはカルボン酸
エステルに他のカルボン酸又はアルコールを反応させて
エステル交換によジエステルを製造する方法である。
本発明の修飾ＩＪ　ノＪ？−７ゼは、疎水性と親水性の
両性質金有する置換ポリアルキレングリコールからなる
直鎖で修飾さ几ているため、水及び有機溶媒の両方に可
溶であり、かつり・臂−ゼ特有の高次構造がこれら直鎖
で保護され、有機溶媒との接触による失活を防いでいる
。
ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリ
コール、ポリプロピレングリコールなどをあげることが
できるが、好ましくは分子量５００　’Ｏ以上のポリエ
チレングリコールである。
また、疎水性基としては、例えばメチル、エチル、ヘキ
シル、オクチル、ノニルのようなアルキル基又ハフェニ
ル、アルキル置換フェニル、フェニル置換フェニル、ス
チリル置換フェニルのようなアリール基をあげることが
できるが、これら疎水性基はポリアルキレングリコール
ノ一方の末端水酸基とエーテル結合している。
ポリアルキレングリコールの他の末端をリノや一ゼ分子
に結合させるには、酵素を担体に固定化させる方法とし
て公知の例えばアルキル化法、酸アシド法、ジアゾ法、
縮合法等によって、活性誘導体に導き、リパーゼ中の遊
離のアミン基又はカルボキシル基と反応させ、結合させ
ることができる。
アルキル化法としては、トリアジン誘導体又はアセチル
誘導体に導き、活性化する方法があげられる。以下の記
載において、Ｐ−ＯＨは末端に疎水性基ヲ肩するポリア
ルキレングリコールを示し、Ｅはリパーゼ分子を示し、
Ｅに結合するアミン基又はカルボキシル基はリパーゼ分
子中の遊離基を示す。
１）　Ｐ−ＯＨと塩化シアヌルとを塩基の存在下、不活
性溶媒中で反応させ、Ｐ−ＯＨ直鎖が１又は２ヶ結合し
た活性誘導体を得る。活性誘導体は緩衝液中でリパーゼ
と反応させ、すｉ？−ゼ中の遊離アミノ基と結合させる
。
２）　Ｐ−ＯＨトプロモアセチルグロミド全ツブロム酢
酸−ジオキサン中で反応させてＰ−ブロモアセテートを
得る。このアセチル誘導体をリパーゼと反応させる。ジ
ブロモ無水こはく酸を用いて製造されるＰ−ジブロモサ
クシネートも又リパーゼと反応させうる。
Ｐ−０−ＣＯＣＨ２−ＮＨＥ 酸アジド法としては、Ｐ−ＯＨをクロル酢酸無水物、２
次いでジアゾメタンと反応させてＰ−酢酸メチルエーテ
ルを得、これをヒドラジンで処理して相当するヒドラジ
ドを得、亜硝酸ソーダで処理して酸アジド誘導体を得る
。この活性誘導体をり／４’−ゼと反応させて、リパー
ゼ中の遊離アミン基とアミド結合させる。
Ｐ−０−ＣＨ２ＣＯＮＨ−Ｅ ジアゾ法としては、例えばＰ−ＯＨ’ｉイサト酸無水物
と反応させてアントラニル酸エステルを得、次いで酸性
で岨硝酸ソーダで処理してジアゾニウム誘導体とし、こ
れをり／？−ゼとジアゾＰ−ＯＨの末端水酸基はアミン
基に変えうる。
この方法は、例えばＰ−ＯＨにトシルクロリドを反応さ
せてＰ−ＯＨ−）シレートとし、次にフタルイミド塩と
反応させ−ｐＮ−Ｐ置換フタルイミドを得、これをヒド
ラジンで処理するとω−アミノＰ−ＯＨが得られる。こ
のアミノ誘導体をカルデジイミド試薬やウッドワード試
薬Ｋによってリパーゼ中のカルボキシル基と直接結合さ
せる。
或いはＰ−０１（−）シレート又はノ・ロダ７化剤を反
応させて得られるＰ−ＯＨω−プロミドをナトリウムア
ジドでＰ−ＯＨω−アジドとし、水素還元してω−アミ
ノＰ−ＯＨとすることもできる。
また、Ｐ−ＯＨのカルがン酸誘導体は前記の方法の外に
、カリウムｔ−ブトキシドの存在下にブロモ酢酸エステ
ルを反応させ、加水分解してＰ−カルボキシメチルエー
テルを得ることができる。このカルボン酸誘導体をカル
ボジイミド試薬を利用してＮ−ヒドロキシこはく酸と反
応させて相当するこはく酸イミドエステルを得、これｋ
　’Ｊ　ハーゼ中のアミノ基と反応させる。
上記のようにして製造した修飾リパーゼは、常法により
精製し、凍結乾燥して保存される。
修飾リパーゼ中のポリアルキレングリコールの付加率は
、未反応のアミノ基をトリニトロベンゼンスルホン酸を
用いて測定することができ、ジノ９−ゼ分子中のアミン
基の約５０〜７０チに付加したものは最も好捷しい。
修飾リパーゼによるエステル合成は、修飾り／？−ゼ、
基質及び生成物を浴解する有機溶媒中で行われ、そのよ
うな溶媒としては、例えばベンゼン、クロルベンゼン、
ノオキサン、ジクロルメタンなどが用いられ、これらの
溶媒は少量の水を含むことが好ましい。
基質のカル＋にン酸は、種々のカルボン酸ヲ用いうるが
、例えば０２〜Ｃ２４の飽和又は不飽和の脂肪酸、例え
ばｆｆ１酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸
、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、プロスタグ
ランジン類が用いられる。アルコールは、Ｃ４−２４の
１級又は２級の脂肪族アルコール、ｆｉｌ、ｔｌｄ’メ
チルアルコール、エチルアルコール、オクチルアルコー
ル、ラウリルアルコール、ステアリルアルコール、エチ
レングリコール、グリセリン；Ｃ７〜Ｃ７の芳香族アル
コール、例工ばベンジルアルコール；ステｏ　−ル類、
例よりシトステロール、コレステロール、エルゴステロ
ールが用いられる。一般に脂肪族アルコールでは炭系数
の多いより疎水性の高いアルコールが好適に用いられる
が、エチルアルコールを用いる場合は、有機溶媒中での
エチルアルコールの最終濃度を５チとすることによって
最も冒い活性が得られる。また、原料のエステルは、好
適には上記脂肪酸とアルコールとのエステル又はトリグ
リセリドが用いられ、特にトリグリセリドの脂肪酸の一
部を他の脂肪酸基で交換するアシドリシスを行って油脂
を改質することができる。またエステルのアルコール部
分を他のアルコールで交換するアルコーリシスも可能で
ある。
エステル合成反応においては、生成物の増加に伴って水
が生成し、反応が平衡に達すると停止するので、常法に
より反応系から水を除去しながら反応を完結させること
が好ましい。
以下に実施例をあげて本発明の方法’（ｌ−説明する。
実施例１ １）　２．４−ビス（？−３メトキシポリオキシエチレ
ン）−６−クロル−５−）リアジンの合成１０ｆの無水
炭酸ソーダを含む１００　ｎ！の無水ベンゼンにモノメ
トキシポリエチレングリコ−Ａ／　（ＰＥＧ　部分の分
子ｚ５ｏｏｏ）２０　ｙ６溶解し、８０℃で３０分間還
流して反応させた後、２．４．６−　）リクロルー８−
トリアジン３６５ｒｎ９を加え、２４時間８０℃で還流
不反応させた。
反応残留物を沖天し、石油エーテル３００１ｎｌを加え
て沈澱音生ぜしめ、沈澱を数回石油エーテルで洗い、２
．４−ビス（メトキシポリオキシエチレン）−６−クロ
ル−Ｓ−トリアノンを製造した。
２）　２．４−ビス（メトキシポリオキシエチレン）−
６−トリアノンで修飾されたり・９−ゼの製シュードモ
ナス・フルオレッセンス菌かう得たリポプロティン・リ
パーゼ１０ｒｖｆｆｉ含む０．４Ｍはう酸緩衝液（ｐＨ
１０，０）２−に、１）で得た２゜４−ビス（メトキシ
ポリオキシエチレン）−６−クロル−８−トリアジン４
００ｒｎｇを加え、３７℃で１時間反応させた後、常法
により精製し、リパーゼ分子中のアミノ基の５２％が上
記トリアジン誘導体で修飾された修飾リパーゼを得た。
これを水に対して十分透析し、凍結乾燥した。
３）ステアリン酸ラウリルエステルの合成４００μｔの
水飽和ベンゼン（約３０　ｍＭの水を含む）に図に示す
種々の濃度のステアリン酸及びラウリルアルコールを溶
解し、この溶液に１００μｔの上記２）で得た修飾す・
ヤーゼ（１，５号旬）の水飽和ベンゼン溶液を加え、３
７℃で２０分間保温して反応させた。反応後、１００μ
ｔの０．２Ｎ硫酸のベンゼン溶液を加えて反応を停止し
たのち、１−の０．２５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、２
−の石油エーテル及び６００μｔのメチルアルコールを
加えて、生成した目的のエステルを分離した後、常法に
よジエステル生成量を比色定量した。
図１は、ステアリン酸の濃度を０．３　Ｍに一定し、ラ
ウリルアルコールの濃度を変化させたときのエステル生
成量を示し、図２は、ラウリルアルコールの濃度’ｋ　
０．４５　Ｍに一定し、ステアリン酸の濃度全変化させ
たときのエステル生成量を示す。この図から修飾リパ一
ゼは、最大４．５μｍ０１ｅ１０ｒｖ蛋白のエステル合
成活性を示した。
４）ラウリン酸のシトステロールエステルの合成 １ゴの０．２５Ｍシトステロールの水飽和ベンゼン溶液
に、４００μｔの１．８Ｍラウリン酸の水飽和ベンゼン
溶液を加え、更に２００μｔの上記２）で得た修飾リパ
ーゼ（０，７４１ψ／−）の水飽和ベンゼン溶ｉ全添加
した後、３７℃で５００時間反応せた。反応終了後、シ
リカゲルクロマトグラフィーによって生成した目的のエ
ステルを分離後、再結晶を行い３１℃ｇの目的のエステ
ルの純品を得た。
５）トリラウリンのエチルアルコールによるアルコーリ
シス ２００μｔの０．２　Ｍ　）リラウリンの水飽和ベンゼ
ン溶液に、１（１０μｔの種々＠度のエチルアルコール
の水飽和ベンゼン溶液を加え、史に１００μｔの上記２
）で得たイし飾り・９−ゼ（（１，２７ｍ９／ｎｔ　）
の水飽和ベンゼン浴ｉを加えた後、３７℃で１時間反応
させた。反応終了後、薄層クロマトグラフィーにより生
成物を分離し、生成したラウリン酸エチルを比色定量し
た。その結果、約１係のエチルアルコール中でアルコ−
リンス活性は最大値を示し、約０７μｍｏｌｅ７’分ｎ
１９蛋白であった。
６）酪酸メチルのラウリン酸によるアシドリシス ５０μＬの１．２Ｍラウリン酸の水飽和ベンゼン溶液に
５０μｔの酪酸メチルを加え、更に１（１０μｔの上記
２）で得た修飾リパーゼ（０，５ＩＩＶ″ｍｅ）の水飽
和ベンゼン溶液を加えた後、３７℃で２０分間保温し反
応させた。反応終了後、薄層クロマトグラフィーにより
生成したラウリン酸メチルを分離し、石油エーテルで抽
出後、常法によりラウリン酸メチルを比色定量した。そ
の結果、［１ｉリノに一ゼのアシドリシス活性は約１μ
ｍｏｌｅ／分〜蛋白を示した。
実施例２ １）メトキシポリオキシエチレン−酢酸アジドのエーテ
ル モノメトキシポリエチレングリコール（２８０部分の分
子量５０００）２．ＣＭ＋をクロル酢酸無水物５−と室
温で反応させてメトキシポリオキシエチレン−酢酸エー
テルを得、これに０．２　Ｍのノアジメタンのエーテル
溶液５　ｎｔ　ｆ加えて０　℃以下で反応させ相当する
メチルエステルとした。
このメチルエステル２．Ｏｆにヒドラジンヒトラード１
５−とメタノール３００ｍ’ｉ加えて還流下に反応させ
て相当するヒドラジドとした。ヒドラノド１．Ｏｆを希
塩酸にとかし冷却する。かくはん下に０．５Ｍ亜硝酸ナ
トリウム９ｆｎｌを滴下し、約１５分室温に放置してメ
トキシポリオキシエチレン−酢酸アジドのエーテルを得
た。
２）　メトキシポリオキシエチレンメトキシカルボニル
で修飾されたリパーゼの製造 シュードモナス・フルオレッセンスカラ得り５　ｎｖ）
のリパーゼを２１ｎｌのりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０）に浴解し、これに上記１）で得た酸アジド誘導体
１（）ｖを加え、室温で２時間攪拌下に反応させた後、
０．ＩＭはう酸緩衝’ＩＴ；１．　（ｐＨ８，５）１　
（１０ａｌｌを加え、アミコンＰＭ−３０メンブランフ
ィルタ−で限外濾過した。りん酸緩衝液で充分洗った後
、水に対して十分透析し、凍結乾燥した。
３）修飾り・ぐ−ゼの活性 上記２）で得た修飾リパーゼの活性を実施例１の３）の
方法によって測定したところ１μｍｏｌｅ／分ｌψ蛋白
を示した。
実施例３ １）メトキシポリオキシェチレンーノブロモサクシネー
トの合成 メトキシポリエチレングリコール１．Ｏｆを無水ベンゼ
ン１０ｎＬｅＫ溶かし、・ジブロモ無水こはく酸０．５
７を加えて一夜攪拌して反応させた後涙過し、Ｆ液を減
圧下で濃縮してメトキシポリオキシエチレン−ジブロモ
ザクシネ−トラ得た。
これをベンゼン−石油エーテルを用いて精製操作をくり
返した。
２）メトキシポリオキシエチレンがアセチル基を介して
結合した修飾り・９−ゼの製造シュードモナス・　フル
オレッセンスから得た５ｍ９のリパーゼ？ｃ−２ｄのり
ん酸緩衝液（ｐｌ］７．ｏ）に溶かし、−スタートをセ
ットして−１７０に保ちつつ、５（１０＋ｉｙの上記１
）で得たメトキシポリエチレン−ジブロモサクシネート
を加え、以下実施例２の２）と同様に操作して修飾ジノ
９−ゼを得た。
３）修触リパーゼの活性 上記２）で得た修飾リパーゼは、水飽和ベンゼン溶液中
でステアリン酸とラウリルアルコールから相当するエス
テルを合成することが確認された。
実施例４ １）メトキシポリオキシエチレンのアントラニル酸エス
テルのノアゾニウム塩の合成 メトキシポリエチレングリコールｉ、ｏｒ’ｌ炭酸す）
　ＩＪウム１０戸含む無水ベンゼン１０ｍ１に溶解し、
イサト酸無水物（１，２５ｔを加えて一夜放置し、溶液
を濾過して相当するイサト酸エステルを得た。このエス
テルの水溶液に塩酸音訓え、４℃に冷却し、攪拌下に０
．５　Ｍ　！ＩＩｉ硝酸ナトリウムを滴下してＮＯ２−
の残存が確認されるまで行う。ジアゾ化物’（ｉ−濾過
し、冷ｏ、　ｏ　ｈ酸で洗浄後、更に水で洗浄した。
２）メトキシポリオキシエチレンがジアゾベンゾイル基
を介して結合した修飾リパーゼシュードモナス・フルオ
レッセンスより得たリパーゼ２５〃夕をりん酸緩衝Ｗ　
（Ｐ８７〜７．５）５−に溶かし、０〜２℃に冷却し、
これに上記１）で得たジアゾ化ｆ６液を滴下し、−スタ
ート全７に保ちつつ、２時間反応させた。以下実施例２
の２）と同様に操作して修飾リパーゼを得た。
３）修飾り・９−ゼの活性 上記２）で倚た修飾リパーゼは水飽和ベンゼン溶液中で
ステアリン酸とラウリルアルコールから相当するエステ
ルを合成することが確認された。
実施例５ １）ω−アミノ−メトキシポリエチレングリコールの合
成 メトキシポリエチレングリコール３ｆｉ５０−のクロロ
ホルムに溶かし、２ｔｎｌのピリジン及び３．８１のト
シルクロリドを加え、２２時間還流下に反応させた後、
減圧下に蒸留した。反応残渣を水に溶かし濾過後クロロ
ホルムで抽出した。抽出液を無水硫酸す）　ＩＪウムで
乾燥後、溶媒を留去し、これをクロロホルムに溶かし、
更にエーテルで沈澱させ精製した。
得られたトシル化物３１を３０−のジメチルホルムアミ
ドに俗かし、１ｔのフタルイミドカリウムを加え、反応
溶液を窒素気流下に１２０℃で３日間反応させた。得ら
れた相当するフタルイミド誘導体ｆ　１０ｒｎｌのクロ
ロホルムに溶かし、５０ｍ１Ｖのヒドラジンヒドラ−ト
ラ加え、７０１稀 ℃で３日間反応させ、得られた重合物を常法により精製
した。更にこれを４Ｘ６０ｃｆｒＬのＳＰ−セファデッ
クスＣ−２５（Ｈ＋型）カラムにかケ、（）〜３０　ｍ
Ｍの塩化ナトリウムで傾斜ｆ６離し、ω−アミン物を分
画した。これをクロロホルムで抽出し、抽出後無水硫酸
ナトリウムで乾燥し、目的物葡得た。
２）メトキシポリオキシエチレンがアミド結合した修飾
リパーゼ ５００　ｍｇの上記１）で得たω−アミノ−メトキシポ
リエチレングリコールをりん酸緩衝液（ｐＨ６、０）　
３　ｍｌに溶かし、シュードモナス・フルオレッセンス
から得たり・９−ゼ１０ｍｇを加え、次いでエチルゾメ
チルアミノグロビルヵルがジイミド６０　ｍｇを加え、
ｐｌ（スタートを６．０に保ちつつ、１時間後過剰の酢
酸塩によって反応を停止し、得られた修飾リパーゼを常
法によって精製した。
３）修飾リノや一ゼの活性 上記２）で得た修飾すｉＲ−ゼは、水飽和ベンゼン溶液
中でステアリン酸とラウリルアルコールから相当するエ
ステルを合成することが確認された。
実施例６ １）メトキシ７式すオキシエチレンー酢酸こはく酸イミ
ドエステルのエーテル メトキシポリエチレングリコール１４ｔと１゜？のカリ
ウムｔ−ブトキシドを１５ｏｒｎｔのｔ−ブチルアルコ
ールに加え、４０℃に加熱して溶かした。これに５１ｎ
ｌのブロモ酢酸エチル’ｋｌＯ分間かけて添加し、更に
２時間攪拌した。これを減圧下で蒸留し、生成物を１０
０＋＋＋ｊ！のＩＮ水酸化ナトリウムに浴がし、２時間
後塩酸で−■を２とし、これをクロロホルムで抽出し、
相当する酢酸エーテルを得た。この酢酸エーテル１５ｔ
を１３　ｆｌ　ｍｇの無水ジオキサンに溶がし、３．５
２のＮ−ヒドロキシこはく酸イミドを加え、更に６ｔの
ジシクロへキシルカルボソイミド金加えて、室温で一夜
反応させた。得られた沈澱物ｋＷ適過後Ｐ液にヘキサン
５００１ｎｌｅ加えて生成物を得た。これをベンゼン１
００７！に溶かし、更にヘキサンで沈澱させる精製操作
をくりかえシ、目的の酢酸こはく酸イミドエステルエー
テルを得た。
２）メトギシポリオキシエチレンメトキシ力ルポニルで
修飾されたリパーゼの製造 シュードモナス・フルオレッセンスカラ得ｉす・９−ゼ
１０’ｎ９’　ｋ　２　ｍｅのほう酸緩衝液（ｐＨ９，
０）に浴かし、１）で得た酸イミドエステルエーテル誘
導体５００　〃夕を力１え、３７℃で１２時間反応させ
た。反応終了後ＰＭ−３０を用いた限外濾過によって精
製し、目的の修飾り・ゼーゼを製造した。
３）修飾リパーゼの活性 上記２）で得た修飾り・ヤーゼは、水飽和ベンゼン溶液
中でステアリン酸とラウリルアルコールから相当するエ
ステルヶ合成することが確認された。
【図面の簡単な説明】
図１及び図２は、本発明の修飾リパーゼによるエステル
の合成を示す。 特許出願人　美　浜　久　春 ラウリルアルコール　（門） ステアワン酸　（１−１） 手続補正書（自発） 昭和６０年３月ｑ日 昭和５９年特許願第６１２９号 ２　発明の名称 修２ｉ　ＩＪ・ぐ−ゼによるエステルの製造方法３　補
正葡する者 事件との関係　特許出願人 ５　補正の対象 ６　補正の内容 別紙の通り １　願書及び明細書の発明の名称を「修飾リパーゼ」と
訂正する。 の特許請求の範囲全別紙のとおり訂正 ３　同、発明の詳細な説明の１頁末行〜３頁１行の記載
全欠のとおり訂正する。 「本発明は、有機溶媒に可溶であり、かつ有機溶媒中で
も酵素活性を保持した修飾リパーゼに関する。 酵素は有機溶媒と接触すると変性して を失うか、または有機溶媒に不溶であ 酵素の利用は水系での反応に限られて いた。そこで、酵素ケ化学修飾することによって、有機
溶媒に可溶で、かつ酵素活性奮発現す得られれば、製造
工程中の有機溶媒溶 液中で酵素反応を行わせたり、水不溶物質も酵素の基質
として用いられる可能性があるため、酵素の工業的利用
範囲が著しく拡大される。す・ぐ−ゼは油脂の加水分解
と合成を可逆的に触媒する酵素であるが、大部分の基質
は水不溶性であるので、有機溶媒中で酵素反応を行うこ
とができれば、種々のニス、チルの分解・合成やエステ
ル交換による油脂の改質等の利用範囲が拡大される。 本発明者等は、これらの問題音解決する目的で、リパー
ゼの化学修飾會試み、有機俗媒に可溶で酵素活性を保持
した修飾リパーゼを得、本発明葡成した。 本発明は、末端に疎水性基を有するポリアルキレングリ
コールの活性誘導体かり・ぐ−ゼ分子に部分的に置換し
た修飾り・や−ゼである。す・ぐ−ゼは、動物のスイ液
又は胃液中に存在するもの及びカビ、酵母、細菌等から
生産されるものが用いられる。」 ４　同３頁下から５行の「　・ことができるが、」を「
・・・ことができるが、好丑しくはメチルである。」と
訂正する。 ５　同７頁末行の後に次の記載を挿入する。 ［上記修飾り・ぐ−ゼのうち、特に式 （式中、Ｒは末端に疎水性基を有するｓｃ？ＩＪアルキ
レングリコール基を示す。）を有する基がリパーゼ分子
のアミ７基に部分的に置換した修飾ＩＪ　ｉＲ−ゼは、
本発明の目的のために好適に使用される。更に好適なも
のは、ポリオキシエチレン部分が分子量５０００以上で
ある２、４−ビス（メトキシポリオキシエチレン）−６
−）リアジンが置換した上記修飾す・り−ゼである。」
６　同８頁８行〜１４行の記載を次のとおり訂正する。 「本発明の修飾リパーゼは、有機溶媒中でエステルの分
解、合成、エステル交換、アミツリシスの各種反応を行
える。 修飾ＩＪパーゼによるエステルの分解、合成等は、修飾
す・クーゼ、基質及び生成物を溶解する有機溶媒中で行
われ、そのような溶媒としては、例、ｔ　ハベンゼン、
トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類、クロロ
ホルム、１，１．１−トリクロロエタン、トリークロロ
エチレン、テトラクロロエチレンのような塩素化炭化水
素が好適に用いられ、これらの溶媒はエステル合成にお
いても少量の水を含むことが好ましい。 エステルの合成に際して基質のカルボン酸は、種々のカ
ルボ゛ン酸葡用」 ７　同１０ｉ３行の「の方法」を削除する。 ８　同工２頁１０行の［４５μｍｏ］、ｅ／分２ｎｇ　
Ｊを［４５μｍｏ］、ｅ乃Ｖｔｎｙ　Ｊと訂正する。 ９　同１２頁１０行と１１行の間に次の記載を挿入する
。 「４）種々の有機前媒中での修飾リパーゼの溶解性 溶解性は、凍結乾燥した上記２）で得た修飾り・ぐ−ゼ
（修飾率５５％）　１　ｍｇｋ　ｉ　ｍｐの水飽和有機
溶媒に加えて攪拌した後、遠心分離して不俗物會除き、
溶解１〜だ蛋白量全測定した。また、酵％活性は、５０
　ｔｒ、ｅのそれぞれの溶媒にラウリン酸とラウリルア
ルコール葡溶がした溶液に上記２）で得た修飾り・ぐ−
ゼ１　ｍｆｌ／　ｍｅを加え、２５℃で２０分間保持し
た後、合成されたラウリン酸ラウリルエステルを定量し
た。この結果全第１表に示す。ここで、ベンゼン中での
酵素活性は７．１　μｍｏｌｅ／分／ｍｇ蛋白である。 第　１　表 ベンゼン　０．９５’　１００ トルエン　１０　８７ クロロホルム　１０　６７ １．１．１−　）リクロロエタン　０．７５　３−８０
トリクロロエチレン　１０　４８ テトラクロロエチレン　０．２３　４８未修飾リパーゼ
は上記溶媒には全く溶解しないが、修飾リパーゼは上記
の表から明らかなように溶解するようになり、そして有
機溶媒中とくにトリクロロエタン及びベンゼン中では高
い活性全示すことがわかる。また、この修飾リパ合成酵
素活性を４０％保持していた。さらに、修飾リパーゼ浴
液にｎ−ヘキサンや石油エーテル全灯えること［Ｊ：す
、酵素活性の失活を伴なうことなく、有（表出媒中から
沈澱として１００係回収することができた。」 １０　同１２頁１１行の１４）」を「５）」と訂正、１
３頁２行の１５）」奮「６）」と訂正、及び１３頁１５
行の「６）」荀「７）」と訂正する。 １１　同１３頁１３行の「０．７　μｍｎｏ１．ｅ　／
分ｎ＋ｙｊ−（ｒｒｏ、７μｍｏｌｅ　／分／１ｎｇ」
と訂正する。 １２　同１４頁５〜６行の「１μｍｏ］ｅ／分ｍグ」を
「１μｍｏｌｅ／分／ｍ１」と訂正する。 １３　同１４頁６行と７行の間に次の記載全挿入する。 「８）トリラウリンの分解 ２００　ｉｔ、ｅの水飽和ベンゼンにトリラウリン１０
０　ｍＭ　′ｆｆ：浴かした溶液に、上記２）で得た修
飾り・ぐ−ゼｉ　ｍｙ／ｍｅ　ｋ加え、３７℃で２０分
間保持した後、遊離したラウリン酸量を定量した結果、
この修飾リパーゼは１６μｍｏｌｅ／分／　ｍｇ蛋白の
酵素活性全示した。」 １４　同１５ｍ１６〜１７行のｒ　１　μｍｏｌｅ／分
ｍ１ＦＪｋｒ　１　μｍｏｌｅ／分／ｍｙ」と訂正する
。 特許請求の範囲 「１　末端に疎水性基全有する目？リアルキレングリコ
ールの活性誘導体かり・９−ゼ分子に部分的に置換した
修飾リパーゼ。 求の範囲第１項の修飾り・々−ゼ。 である特許請求の範囲第１項の修飾り・ぐ−ヒ・。 誘導体、ノアゾニウム誘＞２体、アミン誘導体、カル＋
ｊ？ン酸誘導体である特許請求の範囲第１項の修飾り・
９−ゼ。 （式中、Ｒは末端に疎水性基を有するポリアルキレング
リコール基を示す。）を有する基かり・ぞ−ゼ分子のア
ミノ基に部分的に置換した特許請求の範囲第１項の修飾
り・や−ゼ。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、　末端に疎水性基を有するポリアルキレングリコー
    ルの活性誘導体をり・！−ゼに反応させて得た修飾リパ
    ーゼの存在下、有機溶媒中で、カルがン酸とアルコール
    とを反応させてエステル化するか、或いはカルざン酸エ
    ステルに他のカルボン酸又はアルコールを反応させてエ
    ステル交換によりエステルを製造する方法。 ２、活性誘導体がトリアジン誘導体、アセチル誘導体、
    ジアゾニウム誘導体、アミン誘導体、カルボン酸誘導体
    である特許請求の範囲第１項の方法。 ３、　ポリアルキレングリコールの末端疎水基がアルキ
    ル基又はアリール基である特許請求の範囲第１項の方法
    。
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