JPH0365951B2

JPH0365951B2 -

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Publication number: JPH0365951B2
Application number: JP1263766A
Authority: JP
Priority date: 1989-10-09
Filing date: 1989-10-09
Publication date: 1991-10-15
Also published as: JPH03127992A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、油化学工業、食品工業、医薬品工業
の基礎素材である脂肪酸エステルを製造するに際
して、未反応の脂肪酸をできるだけ減少させるた
めの固定化リパーゼを用いた脂肪酸エステルの製
造方法に関する。〔従来技術及びその問題点〕高酸価油、グリセリン及び陰イオン交換体に固
定化したリパーゼを含む反応液を用いて水分含量
３％以下にて反応を行ない、モノグリセライド高
含有物を生産する方法（特公昭62−51593号）が
あるが、親水性の陰イオン交換基を有する固定化
リパーゼによると反応系の水分調節が難しく、反
応後の酸価が高いものであつた。シクロヘキサン中で0.2Mの（Ｒ，Ｓ）−１−フ
エニルエタノールと0.3Mあるいは3Mのヘプタノ
イツク酸とのエステル合成を、オクタデシルトリ
クロロシランを導入した漂白土に固定化したリパ
ーゼを用いる方法（M.Norin et al.Appl.
Microbiol.Biotechnol.28，527（1988））がある
が、3Mのヘプタノイツク酸を基質としたエステ
ル合成においては基質濃度が高いにもかかわら
ず、0.3Mのヘプタノイツク酸を基質としたエス
テル合成速度程の合成速度が得られなかつた。〔発明が解決しようとする問題点〕担体表面に陰イオン交換基が存在する固定化リ
パーゼを用いて脂肪酸エステルを合成すると、固
定化リパーゼが親水基を有するため加水分解も起
こり易く、エステル中に脂肪酸が大量に残存し、
利用価値のあるエステルを得ることが困難であつ
た。また、高酸価油等を基質とするためには、15
〜50％の高濃度の脂肪酸を用いて反応を行う必要
があるが、高濃度の脂肪酸は遊離リパーゼ、及び
担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水性担
体に結合したリパーゼを阻害した。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、反応後のエステル中の遊離脂肪
酸含量を減少させるための固定化リパーゼによる
エステルの製造方法について、鋭意研究を重ねた
結果、本発明を完成したものである。すなわち、
本発明は、脂肪酸及びアルコールを含む基質を反
応させてエステルを製造するに際して、担体表面
に陰イオン交換基が存在する固定化リパーゼの存
在下で反応を行つた後、担体表面に陰イオン交換
基が存在しない疎水性担体に固定化したリパーゼ
の存在下で反応を行うことを特徴とする脂肪酸エ
ステルの製造方法である。本発明に用いる反応液は、通常、脂肪酸が15％
以上含まれる反応液で、脂肪酸成分としては、脂
肪酸又は遊離脂肪酸を含む油脂が用いられる。脂
肪酸のエステル化を完全にするためのアルコール
は、モル濃度において脂肪酸量の４倍量以上と反
応させるのがよい。アルコール成分としては、１
価アルコールの他、グリセロール等の多価アルコ
ールも含まれる。脂肪酸は、Ｒ−COOH（Ｒ：脂
肪族基）で表現される、リパーゼによるエステル
合成あるいはエステル交換の基質となるものを言
う。本発明に用いるリパーゼとは、脂肪酸（Ｒ−
COOH）と酵素（HO−Ｅ）又は、（HS−Ｅ）が
結合してアシル酵素（Ｒ−COO−Ｅ）又は、（Ｒ
−COS−Ｅ）をつくる酵素であつて、このよう
な機能を有する酵素であればホスホリパーゼ、リ
ポプロテインリパーゼ、プロテアーゼ等いずれの
ものを用いても差し支えない。耐熱性のシユウド
モナス属のリパーゼ又は水分含量を著しく少なく
しても活性を有するMucor属のリパーゼ（特公
昭62−51593号公報の第１図参照）などはより好
ましいものである。本発明の担体表面に陰イオン交換基が存在する
固定化リパーゼとは、リパーゼを結合させた担体
表面に、リパーゼの結合していない陰イオン交換
基が存在する固定化リパーゼである。この固定化
リパーゼは（特公昭63−18476号公報）のような
合成法で製造することができる。すなわち、イオ
ン強度を0.1以下にしたリパーゼ溶液を陰イオン
交換体と接触させると、一般に酸性蛋白質である
リパーゼは陰イオン交換体にイオン結合する他、
疎水基に親和性のあるリパーゼ蛋白は疎水性担体
と強固に疎水結合する。その後、未固定のリパー
ゼを水で洗浄することにより、容易に目的の固定
化リパーゼを得ることができる。なお、より強固
に固定化する場合には、グルタールアルデヒド等
の多価性反応試薬で処理する。しかし多価性反応
試薬は食品等に混入すると好ましくないので、反
応終了後、未反応の多価性反応試薬を還元剤等で
完全に除去した後、充分に洗浄する。また、担体
表面に陰イオン交換基が存在する固定化リパーゼ
を得るためには、できるだけ多くのイオン交換基
を導入した担体にリパーゼを吸着させる。リパー
ゼの吸着量を増していくと、未吸着のリパーゼも
徐々に増加するが、ある量以上になると急に増大
する。その量以下にリパーゼ吸着量を押えれば、
目的の固定化リパーゼを得ることができる。本発明の担体表面に陰イオン交換基が存在しな
い疎水性担体に固定化したリパーゼとは、疎水性
の担体にリパーゼを吸着させたものを言う。疎水
性担体とはマクロポーラスなポリスチレンの吸着
樹脂アンバーライトXAD−８（ローム、アンド、
ハース社製）、ダイアイオンHP−20、セパビー
ズSP−205（三菱化成社製）等やマクロポーラス
なフエノール樹脂デユオライトＳ−761、デユオ
ライトＳ−587（ダイヤモンド、シヤームロツク社
製）あるいはセラミツク粉末、ガラス粉末、金属
粉末等にシランカツプリング剤を用いて疎水基を
導入したもの等があげられる。リパーゼ溶液を疎
水性担体に接触させると、疎水基に親和性のある
リパーゼ蛋白は疎水性担体と強固に疎水結合す
る。リパーゼと疎水性担体の接触をよくするため
に超音波処理、脱気処理、極性溶媒処理等をすれ
ば、活性量の高い固定化リパーゼが得られる。そ
の後、未固定のリパーゼを水あるいは塩溶液で洗
浄することにより、容易に目的の固定化リパーゼ
を得ることができる。なお、より強固に固定する
にはグルタールアルデヒド等の多価性反応試薬で
処理し、吸着したリパーゼどうしの結合をつく
る。多価性反応試薬の後処理については、陰イオ
ン交換体に固定化した場合と同様である。本発明で脂肪酸エステルを製造するには、まず
最初に、担体表面に陰イオン交換基が存在する固
定化リパーゼを用いて反応を行なう。この場合、
反応液の水分含量は２％以下という広い水分範囲
に設定することができる。次に、担体表面に陰イ
オン交換基が存在しない疎水性担体に固定化した
リパーゼを用いて反応を行なう。これにより、反
応生成物中の未反応の脂肪酸を減少させる。第２
段の反応を行う場合、水分はできるだけ少ない方
が好ましく、通常、水分含量1.1％以下で行う。
反応液中からの水分の除去は、減圧留去の他、モ
ルキユラーシーブ等の脱水剤を用いることによ
り、あるいは窒素ガス等の不活性ドライガス等を
用いることによつて行うことができる。反応は流
動床式、固定床式リアクターのいずれでも良い。
第１図に向流式流動床式リアクターの説明断面図
を示す。このリアクターは特願昭62−2550587号
明細書に記載されている。このリアクターにおい
ては、上段の攪拌槽に、担体表面に陰イオン交換
基が存在しない疎水性担体に固定化したリパーゼ
を存在させ、下段の攪拌槽に、担体表面に陰イオ
ン交換基の存在する固定化リパーゼを存在させ
る。中下段より脂肪酸を含む基質を、中上段より
アルコールを供給して下端より未反応のアルコー
ルを採取し上端よりエステルが連続的に流出す
る。未反応のアルコールには反応により生成した
水が含まれているので、減圧蒸留、乾燥窒素等に
より脱水を行い再び中上段よりアルコールとして
供給する。〔作用〕脂肪酸が15〜30％含まれている高酸価油等の基
質は、これを担体表面に陰イオン交換基が存在す
る固定化リパーゼの存在下でアルコールと反応さ
せることにより、脂肪酸濃度を15％以下に減少さ
せることができる。上記固定化リパーゼは、担体
と多く結合して安定化すると同時に、陰イオン交
換基の微細環境効果により、リパーゼ周辺のプロ
トンを排除して、PHを至適PH付近に維持し、これ
により、脂肪酸の高濃度での反応を可能にする
（特公昭62−51593号参照）。また本願実施例１に
示すように、水分含量が２％以下であれば、グリ
セライド合成反応が進行する。したがつて、高濃
度脂肪酸含有基質の縮合反応によつて、多少の水
分が生成されても反応は妨げられない。本発明者
らは、以前に水分含量0.5〜3.0％の範囲で反応す
ると良いという実事を開示したが、未反応の脂肪
酸を除く目的の本発明においては、前反応におい
て水分含量を２％以下に保持し、後反応において
水分含量を1.1％以下に保持すると良い結果が得
られることが判明した。リパーゼを用いるエステルの合成反応は、アシ
ル酵素（Ｒ−COO＝Ｅ）が加溶媒分解し、再び
活性酵素（HO−Ｅ）になる反応の繰り返しであ
る。この時、アシル酵素の分解に際して、水に親
和性を持つ環境をつくるか、アルコール、グリセ
リンあるいは、ジグリセライド等の部分エステル
に親和性のある環境をつくるかで、加水分解が起
こるか、エステル合成又はエステル交換反応が起
こるかが決定される。本発明においては、エステ
ル合成反応の後期において、担体表面に陰イオン
交換基が存在しない疎水性担体に固定化したリパ
ーゼを用いることにより、未反応の脂肪酸や部分
エステルを減少させることができる。担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水性
担体に固定化したリパーゼは、水に対して親和性
が少なく、アルコールや、ジグリセライド等の部
分エステルに対して親和性を持つ。このものは、
水分含量が低い条件で有効にその機能を発揮す
る。また、上記担体に、膵臓リパーゼ、ムコール
属のリパーゼ等の水が著しく少ない系においても
活性を発現するリパーゼを固定化したものを用い
ることにより、本発明の効果はより向上する。〔実施例〕次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明す
る。実施例１マクロポーラスな陰イオン交換樹脂（ダウエツ
クスMWA−１、ダウケミカル社製）１ｇ、シユ
ウドモナス・メフイテイカ・バリアント・リポリ
テイカ（微工研菌寄502号）のリパーゼ1185単位
を脱塩濃縮したものを２ml吸着させた。この吸着
物をガラスフイルター上で吸引濾過しながら乾燥
させた。比活性2200単位／mg蛋白に精製した本リ
パーゼの蛋白の分子量を17500とすると、1185単
位の分子数は次のように計算される。リパーゼ数＝（1185／2200）×10^-317500≒4.3×
10^-8 このモル数を、ダウエツクスMWA−１の交換容
量と比較すると、 4.2×10^-3／（4.3×10^-8）＝9.8×10⁴ すなわち、リパーゼ１分子あたり9.8×10⁴個の
陰イオン交換基が疎水性のポリスチレン担体上に
存在している。一方、17500の蛋白上のイオン結
合に関与する酸性アミノ酸数は10以下と推定され
る。以上の計算例からも示されるように、本固定化
法により、担体表面に陰イオン交換基が存在する
固定化リパーゼが得られた。なおリパーゼ活性測
定法は、Nordらの変法（日農化36巻860ページ
（1960））で行い、PH7.0、60℃で反応し、１分間
に１マイクロ当量の酸を遊離する酵素量を１単位
とした。マクロポーラスな吸着樹脂（アンバーライト
XAD−８）１ｇに、シユウドモナス・メフイテ
イカ・バリアント・リポリテイカ（微工研菌寄
520号）のリパーゼを超音波をかけて分散溶解し
たもの２mlを吸着させた。この吸着物をガラスフ
イルター上で吸引濾過しながら乾燥させ、担体表
面に陰イオン交換基が存在しない疎水性担体に固
定化したリパーゼを得た。高酸価の米糠油（高酸原油）を脱蝋して高酸価
油を得た。高酸価油の酸価は75.0であつたので、
米糠油の脂肪酸平均分子量から計算すると、遊離
脂肪酸含量は36％であつた。精製米糠油に10％の
オレイン酸を添加して低酸価油を調製した。低酸
価油の酸価は21.9であつた。固定化リパーゼ調製時の酵素量を400単位とな
るような固定化リパーゼの乾燥重量である、ダウ
エツクスMWA−１固定化リパーゼを0.314ｇ、
アンバーライトXAD−８を0.407ｇを以下の反応
に用いた。先ず、１ｇの高酸価油、0.314ｇのダウエツク
スMWA−１固定化リパーゼ、各種の量のグリセ
リンを60℃で、120時間反応後の結果は、第１表
のとおりである。

【表】なお反応に用いたグリセリン量は高酸価油中の
脂肪酸モル数に対するグリセリンモル数の割合を
示した。酸価は、120時間後ベンゼン・エタノー
ル（１：１）で反応を止め、固定化リパーゼを濾
過除去してから測定した。表中の水分含量は、カ
ールフイツシヤー法及び乾燥法を用いて求めた反
応前の反応液中のものである。水分含量が２％以
下、望ましくは、1.84％以下、及びグリセリンが
脂肪酸の４倍以上ある時、酸価の減少能が高いこ
とがわかつた。次に、１ｇの低酸価油及びダウエツクスMWA
−１固定化リパーゼ、グリセリンを60℃で12時間
反応後の結果は第２表のとおりである。

【表】なお、グリセリン量は低酸価油中のモル数に対
するグリセリン脂肪酸モル数の割合で示した。ダ
ウエツクスMWA−１固定化リパーゼを用いる
と、低酸価油の酸価の減少はわずかであつた。次に、１ｇの高酸価油及びアンバーライト
XAD−８固定化リパーゼ、グリセリンを60℃で
120時間反応後の結果は第３表のとおりである。

【表】酸価の減少能を示す水分域が0.90％〜1.03％と
狭く、水分含量が0.84％以下になると、酸価の減
少能が低下した。これは、リパーゼ反応に必要な
水分量が不足するため、反応がうまく進まなかつ
たためと考えられる。次に、１ｇの低酸価油及びアンバーライト
XAD−８固定化リパーゼ、グリセリンを60℃で
120時間反応後の結果は第４表のとおりである。

【表】アンバーライトXAD−８を用いて、水分を1.1
％以下、望ましくは1.08％以下にすれば、低酸価
油の酸価が更に減少したことを示す。実施例２実施例１と同様に調製したダウエツクスMWA
−１固定化リパーゼ１ｇ、あるいはアンバーライ
トXAD−８固定化リパーゼ１ｇ及びグリセリン
１ｇ、高酸価油１ｇを60℃で133回／分振とうし
ながら120時間反応後、反応液を濾過除去して、
濾液の酸価を測定したところ、ダウエツクス
MWA−１固定化リパーゼを用いた方は28.6、ア
ンバーライトXAD−８を用いた方は56.1で、高
酸価油と最初に反応させるのには、前者の方が良
いことが分つた。次に、ダウエツクスMWA−１固定化リパーゼ
１ｇ、あるいはアンバーライトXAD−８固定化
リパーゼ１ｇ及びグリセリン１ｇ、低酸価油１ｇ
を60℃で120時間反応した。反応後に酸価はダウ
エツクスMWA−１固定化リパーゼを用いた方は
17.0、アンバーライトXAD−８固定化リパーゼ
を用いた方は11.0で、ある程度低酸価になつた油
脂に対しては、後者の方が酸価の減少能が高かつ
た。しかしこの場合でも、反応時間が６時間及び
12時間の反応初期においては、ダウエツクス
MWA−１固定化リパーゼを用いた方の酸価の減
少の方が大きかつた。実施例３第１図に示すようなリアクターに、上段二槽の
攪拌槽に実施例１と同様に調製したアンバーライ
トXAD−８固定化リパーゼを各々14.5ｇ、下段
２槽の攪拌槽に実施例１と同様に調製したダウエ
ツクスMWA−１固定化リパーゼを存在させた。
水溶性生産物回収口９をふさいで、水溶性基質供
給口３よりグリセリンを11ml／hr、油状基質供給
口７より高酸価油を5.5ml／hrで流した。高酸価
油はオレイン酸及び米糠油の１対１混液で酸価は
152.1であつた。リアクター中に基質が満たされ
た後、攪拌を開始し、反応温度を60℃にして、グ
リセリン流入量１ml／hr、高酸価油流入量１ml／
hr、水溶性生産物回収口９より水溶性生産物を１
ml／hrで回収すると、油状生産物回収口１より油
状生産物が約１ml／hrで連続的に溶出した。油状
生産物の酸価及び水溶性生産物中の水分量の経時
変化を第５表に示す。

〔発明の効果〕

リパーゼによりモノグリセライドやシユガーエ
ステル等の界面活性剤が合成できることが報告さ
れている。この場合、未反応の脂肪酸を除去する
ためにはアルカリ精製法が使えないため、未反応
の脂肪酸の出来るだけ少ない合成法が必要であ
る。高酸価油等から低酸価油等がリパーゼにより
製造する試みがあるが、加水分解を受けにくく、
結晶化速度の速いトリグリセライド含量のおおい
油脂の製造が必要である。本発明は、これらの技
術的要求に対する解決策を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本実施例において用いた反応器の説
明断面図である。１…油状生産物回収口、２…上端の静置槽、３
…水溶性基質供給口、４…攪拌羽根、５…静置
槽、６…攪拌槽、７…油状基質供給口、８…下端
の静置槽、９…水溶性生産物回収口、１０…攪拌
軸、１１…ふるい板、１２…攪拌軸カバー。

Claims

【特許請求の範囲】

１脂肪酸をアルコールと反応させてエステルを
製造するに際して、担体表面に陰イオン交換基が
存在する固定化リパーゼの存在下で反応を行つた
後、担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水
性担体に固定化したリパーゼの存在下でさらに反
応を行うことを特徴とする脂肪酸エステルの製造
方法。