JP3670284B2 - 固定化酵素調製品の製造方法および固定化酵素調製品の使用 - Google Patents

Description

本発明は、自由水を欠いている主に有機媒質中で有機合成に対し適用可能な酵素を含んでなる固定化酵素調製品の製造方法、および固定化酵素調製品の使用に関する。自由水を欠いている主に有機媒質中で有機合成に対し適用可能な最も普通の酵素は、リパーゼである。この種の他の酵素の例は、プロテアーゼ、アミダーゼ、エステアーゼ、オキシドレダクターゼおよびニトラーゼである。以下において、本発明は、自由水を欠いている主に有機媒質中有機合成に適用可能な酵素の主な例としてリパーゼを参照しつつ記載されるであろう。語句「有機合成」とは、有機化学において一般に受け入れられるものとして理解されるべきである。従って、本発明の範囲内に含まれる有機合成の典型的例は以下の如くである：再エステル化、エステル交換、アシル化、エポキシ化、アミノリシス、アンモノリシス、酸化および還元。「自由水を欠いている主に有機媒質」とは、一つの相の媒質として理解でき、その有機部分は少なくとも50％ｗ／ｗに達する。
固定化リパーゼ調製品は、エステル交換および他の脂肪関連プロセス、例えばカカオ脂代替品製造に対する触媒として用いられる。バッチ反応の場合に、反応が終了すると触媒は再使用のため反応混合物から分解されねばならない。従って、触媒の良好な濾過性が、満足できる効能に対し必要とされる。
国際公開公報（WO）90／05778は、例えばマーガリン製造に対し使用できる固定化リパーゼ調製品の製造方法を記載している。この調製品は、マクロポーラスシリカ担体を含んでなる。
ヨーロッパ特許140542は、脂肪のエステル交換用の固定化リパーゼ調製品を記載している。この調製品はアニオン交換樹脂担体を含んでなる。
双方のこれらの従来技術固定化リパーゼ調製品は、それらが高価であるという不利益を有する。特に、マーガリン（これは世界的基準で１年当たり数百万トン生産される）の製造に関し、製造コストを最小化することは重要である。
従って、本発明の目的は特に仕上げられた回分式マーガリン製造後の濾過能力に関し並びに酵素がリパーゼである場合、連続実施に対しカラム内の圧力降下に関し、従来技術の固定化酵素調製品と同等又は殆ど同等である技術特性を示すべき安価な固定化酵素調製品の製造方法およびそのような固定化酵素調製品の使用を提供することにある。
自由水を欠いている主に有機溶剤中有機合成に適用できる酵素を含んでなる固定化酵素調製品の製造のための本発明方法は、液体酵素組成物および約100μｍ未満の粒径を有する粒状シリカ担体が、グラニュレータ又は押出機に導入されるべき物質として用いられ、しかる後造粒又は押出しが行なわれる。液体酵素組成物は、例えばアルコールの主成分に基づく非水性であってよく、あるいは又水性であってよい。粒状シリカ担体は、幅広い粒度分布、例えば約５μｍ〜100μｍを示すことができる。請求の範囲と共に本明細書において、「シリカ」はシリカ又は珪酸塩のいずれかのものとして理解されるべきである。本発明は以下の二つの態様を含んでなるものと理解すべきである：第一の態様では、粒状シリカ担体の粒度分布に類似の粒度分布を有する粒状固定化リパーゼ組成物を最初に製造し、しかる後造粒又は押出しを行う（例６および例７参照）；そして第二の態様では製造を１つの工程のみで行う（例１〜５参照）。また、次のように理解されるべきである；すなわち酵素は造粒又は押出し中結合剤として作用でき、および／又は特異的結合剤、例えばゼラチン又はポリビニルピロリドンが添加できる。本発明に係る発明中、好ましくは噴霧が行なわれるべきであり、通常液体酵素組成物の噴霧および／又は液体形の噴霧剤の噴霧が行なわれるべきである。また、次のように理解されるべきである；すなわち本発明に係る方法において使用される装置は任意のグラニュレータ、例えば流動噴霧グラニュレータに関する限り、本発明にとって特別な重要性を有さないか、又はミキサーが使用できる。
シリカをベースにした粉末固定化リパーゼ調製品は、例えばWO88／02775，11頁，21−24行に記載されている。固定化リパーゼ調製品は、バッチプロセス後の劣った濾過能力並びに連続カラムプロセス中の高い圧力損失の発生のため、回分式および連続式脂肪関連プロセスの双方に対し完全に不適当である。
固定化リパーゼ調製品は、ヨーロッパ特許579928およびAppl．Microbial．Biotechnol．（1988）28：527-530に記載されているが、これらの従来技術のリパーゼ調製品のいずれもシリカ担体を含んでなる。
Chem．Abstract Vol.118（1993）：55095vにおいて、シリカ担体上の固定化リパーゼ調製品が記載されている。しかし、担体の粒径および造粒又は押出しを含んでなる本発明に係る方法は記載されていない。
驚くべきことに、以下の内容が見出された；すなわち第一の場において本発明に係る方法は、比較し得る従来技術の固定化酵素調製品と比較して劇的により安価であり、そして第二の場においてそれはもしも酵素がリパーゼである場合、回分式脂肪関連プロセス後の濾過能力および連続脂肪関連プロセス中の低圧力損失の発生に関し、従来技術の固定化酵素調製品に等しいか又は殆ど等しい技術的性質を示す。
本発明に係る方法の好ましい態様は、酵素がリパーゼであることを特徴とする。
本発明に係る方法の好ましい態様は、液体リパーゼ組成物中のリパーゼが熱安定性リパーゼであることを特徴とする。
本発明に係る方法の好ましい態様は、液体リパーゼ組成物中のリパーゼが、フミコラ種、カンジダアンタルクチカ又はリゾムコールマイヘイの種から由来するリパーゼをコードしそして発現する遺伝子を含有する微生物を培養することにより生産される。
本発明に係る方法の好ましい態様は、液体リパーゼ組成物の量と粒状シリカ担体の重量間の割合は、１ｇ（乾燥重量）の担体当たり少なくとも100,000LUである。LUは、AF95．1/2-GB（これは、要求によりノボノルディスクＡ／Ｓから入手できる）において規定されたリパーゼ単位である。LU分析は、リパーゼ活性の測定に対する基質としてトリブチリンを用いる。
本発明に係る方法の好ましい態様は、少なくとも50％、好ましくは少なくとも75％の純度を有することを特徴とする。
本発明に係る方法の好ましい態様は、結合剤、好ましくはゼラチン又はポリビニルピロリドンの液体組成物を、造粒又は押出し中グラニュレータ又はミキサー内に噴霧により導入することを特徴とする。
本発明に係る方法の好ましい態様は、造粒又は押出しが少なくとも90％の量に相当する粒度分布50μｍ〜2,000μｍを有する固定化リパーゼ調製品の製造に対して行なわれることを特徴とする。
本発明に係る方法により製造される固定化酵素調製品の使用は、酵素により触媒化されるプロセスに対するものである。
本発明に係る方法によって製造される固定化リパーゼ調製品の使用は、脂肪関連プロセスに対するものである。そのような脂肪関連プロセスは、回分式又は連続的に行うことができると理解すべきである。回分式に行なわれるときに、以下の内容が見出された；すなわち本発明に係る方法により製造される固定化リパーゼ調製品は、酵素プロセスが終了に至ったとき満足な濾過能力を示しそして連続的に行なわれるとき、本発明に係る方法によって製造される固定化リパーゼ調製品は、カラムの満足できる性能をもたらす良好な物理的強度を示す。
本発明に係る使用の好ましい態様は、脂肪のエステル交換に対してでありそして脂肪酸又は脂肪エステルを含む液体脂肪又は脂肪混合物を、固定化リパーゼ調製品と接触させることを特徴とする。
本発明に係る使用の好ましい態様は、グリセリド又は他の脂肪酸エステルの合成に対するものでありそしてグリセロール又は置換グリセロール又は他のタイプのアルコールおよび遊離脂肪酸の混合物を、固定化リパーゼ調製品と接触させることを特徴とする。
本発明に係る使用の好ましい態様は、糖脂質の合成に対するものである。一般に、固定化リパーゼ調製品を用いた糖脂質の合成は、ブリックリング，Ｆ．等（1989），J．Chem．Soc．，Chem．Commun．，934-935頁に記載されている。
本発明を次の実施例により例示する。
製造例（１−８）は、本発明に係る方法の回分式態様を示す。工業的規模の製造に対し、通常連続式態様が好ましいであろう。例９は使用例である。
本発明に係る使用は、各BAUN測定が本発明に係る使用（エステル交換）を説明することの事実を考慮すると、例１−８に間接的に示される。
直接例９に関する図１は、時間に応じ、連続カラム操作として実施されるエステル合成における変換を示す。
実施例
例 １
合成ケイ酸マグネシウム（Celkate T-21（Manville））の粉末65ｇを、900rpmの速度で操作できるインペラを有する高速ミキサー中に導入した。75ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレート（フミコララヌギノサDSM3819を用い、デンマーク特許157560に従って調製、乾燥物質含量30％、700,000LU／mlの活性を有する）を、ランニングインペラーを用い約５分にわたりシリカ粉末上に連続的に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥しそして篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節し次いでサンプルを2.6BAUN／ｇに分析した。BAUN（Batch Acidolysis Units Novo）で測定したリパーゼ活性分析により、高級オレエートひまわり油（10％水、70℃）へのデカン酸の導入の初期速度を測定する。方法の詳細な記載（MP 9410704）は、要求によりノボノルディスクＡ／Ｓから入手可能である。
例 ２
65ｇのCelkate T-21を例１に示したように高速ミキサーに導入した。例１に示した如き1.25ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを、操作インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。しかる後、３％（ｗ／ｗ）Kollidon K25ポリビニルピロリドン（BASF）を有する50ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを粉末上に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節し次いでサンプルを分析し0.5BAUN／ｇを得た。
例 ３
40ｇの焼成珪藻上の粉末、Clarcel CBL3（Ceca S．A．）を、例１に示したように高速ミキサーに導入した。例１に示した如き11ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを、操作インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。しかる後、３％（ｗ／ｗ）Kollidon K25ポリビニルピロリドンを有する47ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを粉末上に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節し次いでサンプルを分析し2.4BAUN／ｇを得た。
例 ４
50ｇのClarcel CBL3を例１に示したように高速ミキサーに導入した。例１に示した如き1.72ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを、操作インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節し次いでサンプルを分析し5.1BAUN／ｇを得た。
例 ５
30ｇのClarcel CBL3および20ｇのタルク粉末を例１に示したように高速ミキサーに導入した。例１に示した如き1.20ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを、操作インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。しかる後、２％（ｗ／ｗ）Methoel A-15メチルセルロース（Dow）を有する28ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを粉末上に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節し次いでサンプルを分析し7.7BAUN／ｇを得た。
例 ６
250ｇのCelkate T-21を、３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH4.5）を用い30分間洗浄し、次いで真空濾過した。Celkate T-21の500,000LU／ｇに相当する量の例１に示す如きフミコララヌギノサリパーゼコンセントレートを、３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH4.5）と共に添加し次いで室温で２時間撹拌した。真空濾過後、固定化酵素を室温で24時間乾燥し、水分率を10％に調節し次いで分析し14.3BAUN／ｇを得た。濾液は、78％の吸着に相当する27565kLU（又は390kLU／ｇ）を含有していた。
Celkate T-21粉上でこのように乾燥した固定化酵素65ｇを、例１に示すように高速ミキサーに導入した。55ｇの５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を操作インペラを用い粉末上に噴霧した。しかる後、0.1ｇのAerosil 200二酸化ケイ素（Degussa）を添加した。水分率を10％に調節し次いで分析し5.9BAUN／ｇを得た。
例 ７
200ｇのClarcel CBL3を、３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH4.5）を用い30分間洗浄し、次いで真空濾過した。Clarcel CBL3の500,000LU／ｇに相当する量の例１に示す如きフミコララヌギノサリパーゼコンセントレートを、３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH4.5）と共に添加し次いで室温で２時間撹拌した。真空濾過後、固定化酵素を２−３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH4.5）で２回洗い次いで脱イオン水で２回洗った。濾液は、17％の吸着に相当する合計で82761kLU（又は86kLU／ｇ）を含有していた。
Clarcel CBL3粉上でこのように乾燥した固定化酵素55ｇを、例１に示すように高速ミキサーに導入した。２％（ｗ／ｗ）ゼラチンおよび１％（ｗ／ｗ）Methocel A-15メチルセルロース（Dow）を含有する1.61ｇの溶液を操作インペラを用い粉末上に噴霧した。しかる後、0.1ｇのAerosil 200二酸化ケイ素（Degussa）を添加した。水分率を10％に調節し次いで分析し8.4BAUN／ｇを得た。
別の部分、すなわち1.5ｇのClarcel CBL3粉末上にこのようにして形成された固定化リパーゼを例１に示すように高速ミキサー中に導入した。59ｇの５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を、操作インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。しかる後、0.1ｇのAerosil 200二酸化ケイ素（Degussa）を得た。形成した粒質物を室温で乾燥し次いで篩別した（300-700μｍ）。水分率を10％に調節し次いで分析し10.1BAUN／ｇを得た。
例 ８
これは例１−７と同様に製造例であるが、しかし別のリパーゼ生産微生物を用いた。
サンプルの調製１：250,000LU／ｇの活性を有する12.9ｇのカンジダアンタルクチカＢリパーゼ凍結乾燥粉末および1.4ｇのKollidon K25を、51mlの脱イオン水に溶解した。50ｇのCelkate T-21を例１に示すように高速ミキサーに導入し次いでカンジダアンタルクチカＢリパーゼの溶液を操作インペラを用い、粉末上に連続的に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−1000μｍ）。
サンプルの調製２：12.9ｇのカンジダアンタルクチカＢリパーゼおよび0.86ｇのMethocel A-15を、51mlの脱イオン水に溶解した。50ｇのCelkate T-21を高速ミキサーに導入し次いで前記溶液を操作インペラを用い、粉末上に連続的に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−1000μｍ）。
サンプルの調製３：12.8ｇのカンジダアンタルクチカＢリパーゼおよび0.81ｇのKollidon K25を、48mlの脱イオン水に溶解した。50ｇのCelkate T-21を高速ミキサーに導入し次いで前記溶液を操作インペラを用い、粉末上に連続的に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−1000μｍ）。
例 ９
これは、図１に関連し、例８に係る調製品を用いた使用例である。
例８で記載した３種のサンプルを、エチルグルコシド（EG）デカン酸を反応させることによるエチルグルコシドエステル（EGE）の連続合成によりカラムにおいて評価した。

サンプルを18時、44時、90時および162時後に採取し次いでEGEおよびEGの量をHPLCで測定し次いで％変換を計算した。結果を図１に示す。更に、サンプルの物理的安定性が良好であることは注目すべきであった。

Claims (4)

1. 自由水を欠いている主に有機性の媒質中での有機合成に適用可能な固定化リパーゼ調製品の製造方法であって、
   ａ）グラニュレータにおいて、液体形のリパーゼ及び結合剤を、噴霧によって100μｍ未満の粒径を有する粒状シリカ担体上に導入し、そして同時に、
   ｂ）固定化リパーゼ調製品を形成するために造粒を行うこと、
   を含んで成る方法。
2. 自由水を欠いている主に有機性の媒質中での有機合成に適用可能な固定化リパーゼ調製品の製造方法であって、
   ａ）100μｍ未満の粒径を有する固定化リパーゼ調製品を得るために、液体リパーゼ組成物を、100μｍ未満の粒径を有する粒状シリカ担体と接触させ、そして
   ｂ）粒状固定化リパーゼ調製品をグラニュレータへ導入し、
   ｃ）結合剤を含んで成る液体を、噴霧によってグラニュレータに導入し、そして
   ｄ）造粒を行うこと、
   を含んで成る方法。
3. 前記リパーゼが、フミコラ・ラヌギノサ又はカンジダ・アンタルクチカの菌株に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 結合剤がゼラチン又はポリビニルピロリドンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

Images