JPH0585157B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、担持された酵素に関し、その製造及
び用途に関する。より詳細に述べると、本発明
は、キヤリヤー物質上に担持されたリパーゼから
成る生体触媒（biocatalytic）物質に関する。 キヤリヤー物質上に担持されたリパーゼは、そ
の酵素を何回も繰り返し使うことを可能にするも
のであり、化学反応を行わせるのに貴重な物質で
ある。それらは当技術分野で公知であり、通常、
リパーゼの水性溶液からリパーゼを適当なキヤリ
ヤー物質上に吸着させ、その後乾燥することによ
つて調製されている。 このような物質が有する欠点の１つは、リパー
ゼのキヤリヤー上への通常の吸着技術によつては
リパーゼの活性のかなりのパーセンテージが失わ
れるということである。 この現象に対する幾つかの仮定が提案されてお
り、その１つは、例えば、キヤリヤーへの吸着に
よつて酵素のコンホーメーシヨンが変化し、これ
が酵素の活性の部分的損失につながる、というも
のである。 より詳細に述べると、担持物質上の酵素、特に
リパーゼは、欧州特許公開公報第322213号（ユニ
リーバー）から公知であり、この引用例は、特
に、疎水性、多孔質、固体、担持物質上に吸着に
よつて直接物理的に付着しているリパーゼを使用
する脂肪酸エステルの調製を開示している。 米国特許第4798793号及び第4818695号［ノボ
（Novo）］には、弱いアニオン交換樹脂上へのリ
パーゼの不動化が記載されている。 本発明は、キヤリヤー物質上に担持されたリパ
ーゼであつて、キヤリヤー物質にかなりの割合の
非リパーゼタンパク質の被覆（coating）と少な
くとも１部のリパーゼの被覆とが設けられている
ことを特徴とするものを提供する。 このキヤリヤー物質上に担持されたリパーゼ
は、等量のリパーゼが担持されているが非リパー
ゼタンパク質で被覆されていないものよりも、か
なり高い活性を有しており、従つてリパーゼのも
ともとの活性がより多く保持されている。 キヤリヤー物質は、疎水性物質及びイオン交換
樹脂から選択されるのが好ましい。微粒状キヤリ
ヤー物質が好ましく、特に100乃至2000μmの粒度
（particle size）を有するものが好ましい。キヤ
リヤー物質は膜の形態でもよい。 キヤリヤー物質は多孔質であり、50ナノメータ
ーより大きい平均細孔直径（average
porediameter）を有しているのが好ましい。キ
ヤリヤー物質が疎水性物質から選択される場合、
これはポリプロピレン、ポリオレフイン、ポリス
チレン、ポリアクリレート（エステル）、シリケ
ート、シリカ、ガラス、その他のような無機物
質、又はそれらの組み合わせから選択できる。こ
の実施態様に関して、通常親水性であるシリカな
どの物質は、シランなどの適当な化合物で処理し
て疎水性にしなければならない。 キヤリヤー物質がイオン交換樹脂から選択され
る場合、これはポリスチレン、ポリアクリレー
ト、フエノール−ホルムアルデヒド樹脂、及びシ
リカを主材料とするイオン交換樹脂から選択でき
る。イオン交換樹脂がアニオン交換樹脂であるの
が理想的であり、マクロ多孔質（macroporous）
の弱いアニオン交換樹脂であるのが特に理想的で
ある。適する例には、フエノール−ホルムアルデ
ヒド樹脂、ポリスチレン性樹脂、及びスチレン−
DVB樹脂が含まれ、例えば、デユオライト
（DUOLITE）ES568及びアンバーリスト
（AMBERLYST）A21の商標で市販されている
ようなものがある。 担持物質は微粒状形態であるのが好ましい。粒
子サイズは、0.1乃至2.0mmの範囲内で変えること
ができる。 キヤリヤー微粒子を被覆するために使用する非
リパーゼタンパク質は、卵白アルブミン、ゼラチ
ン、ウシ血清アルブミン、及び／又はカゼインナ
トリウムのような水溶性タンパク質であるのが好
ましい。タンパク質物質によるこの被覆は、キヤ
リヤーの表面が、単分子層までの非リパーゼタン
パク質で実質的に被覆されるように塗布する。被
覆プロセスにおいて、担持物質の細孔容積及び非
リパーゼタンパク質水溶液の量と濃度は、担持物
質の表面が実質的に完全に被覆されるように選択
する。実質的に完全な被覆とは、利用可能な表面
積の少なくとも50％、好ましくは85％より多くが
被覆されることを意味する。同時に、或いはその
後、キヤリヤー物質は少なくとも部分的にリパー
ゼで被覆される。 本発明を実施するのに使用するリパーゼは、適
当な微生物を培養し、その後酵素を単離すること
によつて得ることができる。この目的のために適
する微生物は、ムコル（Mucor）、アスペルギル
ス（Aspergillus）、リゾプス（Rhizopus）、シユ
ードモナス（Pseudomonas）、カンジダ
（Candida）、フミコラ（Humicola）、テルモミセ
ス（Thermomyces）、及びペニシリウム
（Penicillium）に属する。 さらに、本発明によつて提供されるキヤリヤー
上に担持されたリパーゼは、非リパーゼタンパク
質の0.5乃至75重量％の量で存在するのが好まし
い。リパーゼが非リパーゼタンパク質の１乃至50
重量％の量で存在するのがより好ましい。リパー
ゼを吸着させた後、キヤリヤーの利用可能表面積
を２分子層（bilayer）までのタンパク質物質で
被覆する。 本発明によつて提供されるキヤリヤー上に担持
されたリパーゼは、疎水性キヤリヤー物質を非リ
パーゼタンパク質の溶液で、キヤリヤー粒子の利
用可能な表面が単分子層までの非リパーゼタンパ
ク質で実質的に覆われるように処理し、この被覆
されたキヤリヤーの上にリパーゼの被覆を部分的
に付着させることによつて簡便に調製できる。 本発明によつて提供されるキヤリヤー物質上に
担持されたリパーゼは、本発明によつて提供され
るキヤリヤー上に担持されたリパーゼの存在下
に、カルボン酸とエステルとを加熱し反応させる
ことによつて行われるエステル交換によつてエス
テルを調製する方法において有利に使用すること
ができる。キヤリヤー物質上のリパーゼを使用す
ることを含む製造技術は、例えば、固定床又はパ
イプ反応器のような連続式法、或いは攪拌タンク
反応器のような回分式方法において、リパーゼ物
質を繰り返し使用できるようにする。 本発明によるキヤリヤー物質上のリパーゼは、
本発明によつて提供されるキヤリヤー上に担持さ
れたリパーゼの存在下に、アルコールとカルボン
酸を反応させることによつて行われるエステル化
によつてエステルを調製する方法においても使用
できる。本発明を以下の実施例によつて説明す
る。本明細書において使用した分析は以下のよう
にして行つた。 分 析 Ａ エステル化 触媒（投入量に応じて５〜20mg）をバイアルの
中にいれ、5.88ｇのオレイン酸（92％、BDH製）
及び2.70ｇのオクタン−１−オール（GPRグレー
ド、BDH製）を含有する水飽和混合物を添加し
た。バイアルを密封し、50℃の水浴中の振盪機に
入れ、200ストローク／分で30分間振盪した。一
定量（0.1ml）を取り出し、即座に、小さいアル
ミナカラム（塩基性、活性２）にジエチルエーテ
ルを用いて、内部標準としてステアリン酸メチル
（2.5mg）の溶液とともに溶出させた。その後、ジ
エチルエーテルを蒸発によつて除去し、石油エー
テル（4.0ml、沸点60〜80℃）で置換した。次ぎ
に、オレイン酸オクチルのステアリン酸メチルに
対する比率をGLC（気液クロマトグラフイー）に
よつて測定した。この比からエステル形成の速度
を計算し、この速度を理論リパーゼ装填量
（loading）で割つたものとして効率を表わした。 Ｂ エステル交換 直径15mmのガラス製カラム中に、触媒（0.5〜
1.0ｇ）を、プレカラム（pre−column）として
の、3.2ｇの水を含有する4.0ｇの湿潤IDシリカゲ
ル［英国、ウオーリングトンのジヨセフ・クロス
フイールズ・アンド・サンズ（Joseph
Crosfields ＆ Sons）社製］とともに充填し
た。１重量部の高オレエートヒマワリ油、0.7重
量部のラウリン酸（98％、ユニケマ社製）、及び
４重量部の石油エーテル（沸点100〜120℃）を含
む水飽和供給物を、25ml／時の流速でカラムにポ
ンプ送入した。水ジヤケツトを用いて、カラム温
度を50℃に保持した。トリグリセリド中に組み入
れたラウリン酸の量をFAME（脂肪酸メチルエス
テル）／GC（ガスクロマトグラフイー）分析によ
つて測定した。このカラムを連続的に５日間運転
し、２日めに得られた活性を実施例において使用
した。 活性は、以下の式を使用して計算した。 活性＝（−ln（１−DC）×流量）／触媒重量
（ｇ） （ｇトリグリセリド／時／ｇ触媒） 流量＝ｇトリグリセリド／時 DC＝％（組み入れられたラウリン−初期含
量）／ ％（平衡含量−初期含量） DC＝転化度 以下の実施例において、初期ラウリン含量は０
％であり、平衡含量は31.3％であつた。 効率は、得られた活性を理論リパーゼ装填量で
割ることによつて計算した。これは、mgトリグリ
セリド／時／1000リパーゼ単位（mgTg／時／
KLU）の単位で表される。 実施例 １ 2.0ｇのマクロ多孔質ポリプロピレン粒子（平
均細孔直径139ナノメーター、粒度0.2〜0.4mm）
に、6.0mlのエタノールを全ポリマー粒子が確実
に濡れるように振盪しながら添加した。このスラ
リーに、54mlの0.01Mの燐酸ナトリウム緩衝剤
（PH７）を完全に混合するように攪拌しながら添
加した。予備処理タンパク質（下記の表を参照の
こと）を516mgを含有する前述と同じ緩衝剤を200
mlの量でさらに添加し、この混合物を20℃で24時
間ゆつくりと攪拌した。その後、処理された担持
体を濾過によつて溶液から分離し、同じ緩衝剤
（各100ml）で４回洗浄した。この物質の１ｇを40
mlの同じ燐酸塩緩衝剤中に懸濁させた。 この懸濁された予備処理担持体に、下記の表で
説明するある量のムコル・ミエヘイ
（Mucormiehei）リパーゼ（10000LU／ｇ、
11000LU／ml）を含有する同じ燐酸塩緩衝剤の
100mlを添加した。この混合物を20℃で24時間ゆ
つくりと攪拌した。達成された酵素装填量を、グ
リセリルトリブチレートの加水分解速度によつて
測定した溶液から失われた酵素活性から計算し
た。得られたキヤリヤー上のリパーゼを濾過によ
つて分離し、同じ燐酸塩緩衝剤（200ml）で２回
洗浄し、蒸留水（100ml）で１回洗浄し、そして
減圧下20℃で乾燥した。
び用途に関する。より詳細に述べると、本発明
は、キヤリヤー物質上に担持されたリパーゼから
成る生体触媒（biocatalytic）物質に関する。 キヤリヤー物質上に担持されたリパーゼは、そ
の酵素を何回も繰り返し使うことを可能にするも
のであり、化学反応を行わせるのに貴重な物質で
ある。それらは当技術分野で公知であり、通常、
リパーゼの水性溶液からリパーゼを適当なキヤリ
ヤー物質上に吸着させ、その後乾燥することによ
つて調製されている。 このような物質が有する欠点の１つは、リパー
ゼのキヤリヤー上への通常の吸着技術によつては
リパーゼの活性のかなりのパーセンテージが失わ
れるということである。 この現象に対する幾つかの仮定が提案されてお
り、その１つは、例えば、キヤリヤーへの吸着に
よつて酵素のコンホーメーシヨンが変化し、これ
が酵素の活性の部分的損失につながる、というも
のである。 より詳細に述べると、担持物質上の酵素、特に
リパーゼは、欧州特許公開公報第322213号（ユニ
リーバー）から公知であり、この引用例は、特
に、疎水性、多孔質、固体、担持物質上に吸着に
よつて直接物理的に付着しているリパーゼを使用
する脂肪酸エステルの調製を開示している。 米国特許第4798793号及び第4818695号［ノボ
（Novo）］には、弱いアニオン交換樹脂上へのリ
パーゼの不動化が記載されている。 本発明は、キヤリヤー物質上に担持されたリパ
ーゼであつて、キヤリヤー物質にかなりの割合の
非リパーゼタンパク質の被覆（coating）と少な
くとも１部のリパーゼの被覆とが設けられている
ことを特徴とするものを提供する。 このキヤリヤー物質上に担持されたリパーゼ
は、等量のリパーゼが担持されているが非リパー
ゼタンパク質で被覆されていないものよりも、か
なり高い活性を有しており、従つてリパーゼのも
ともとの活性がより多く保持されている。 キヤリヤー物質は、疎水性物質及びイオン交換
樹脂から選択されるのが好ましい。微粒状キヤリ
ヤー物質が好ましく、特に100乃至2000μmの粒度
（particle size）を有するものが好ましい。キヤ
リヤー物質は膜の形態でもよい。 キヤリヤー物質は多孔質であり、50ナノメータ
ーより大きい平均細孔直径（average
porediameter）を有しているのが好ましい。キ
ヤリヤー物質が疎水性物質から選択される場合、
これはポリプロピレン、ポリオレフイン、ポリス
チレン、ポリアクリレート（エステル）、シリケ
ート、シリカ、ガラス、その他のような無機物
質、又はそれらの組み合わせから選択できる。こ
の実施態様に関して、通常親水性であるシリカな
どの物質は、シランなどの適当な化合物で処理し
て疎水性にしなければならない。 キヤリヤー物質がイオン交換樹脂から選択され
る場合、これはポリスチレン、ポリアクリレー
ト、フエノール−ホルムアルデヒド樹脂、及びシ
リカを主材料とするイオン交換樹脂から選択でき
る。イオン交換樹脂がアニオン交換樹脂であるの
が理想的であり、マクロ多孔質（macroporous）
の弱いアニオン交換樹脂であるのが特に理想的で
ある。適する例には、フエノール−ホルムアルデ
ヒド樹脂、ポリスチレン性樹脂、及びスチレン−
DVB樹脂が含まれ、例えば、デユオライト
（DUOLITE）ES568及びアンバーリスト
（AMBERLYST）A21の商標で市販されている
ようなものがある。 担持物質は微粒状形態であるのが好ましい。粒
子サイズは、0.1乃至2.0mmの範囲内で変えること
ができる。 キヤリヤー微粒子を被覆するために使用する非
リパーゼタンパク質は、卵白アルブミン、ゼラチ
ン、ウシ血清アルブミン、及び／又はカゼインナ
トリウムのような水溶性タンパク質であるのが好
ましい。タンパク質物質によるこの被覆は、キヤ
リヤーの表面が、単分子層までの非リパーゼタン
パク質で実質的に被覆されるように塗布する。被
覆プロセスにおいて、担持物質の細孔容積及び非
リパーゼタンパク質水溶液の量と濃度は、担持物
質の表面が実質的に完全に被覆されるように選択
する。実質的に完全な被覆とは、利用可能な表面
積の少なくとも50％、好ましくは85％より多くが
被覆されることを意味する。同時に、或いはその
後、キヤリヤー物質は少なくとも部分的にリパー
ゼで被覆される。 本発明を実施するのに使用するリパーゼは、適
当な微生物を培養し、その後酵素を単離すること
によつて得ることができる。この目的のために適
する微生物は、ムコル（Mucor）、アスペルギル
ス（Aspergillus）、リゾプス（Rhizopus）、シユ
ードモナス（Pseudomonas）、カンジダ
（Candida）、フミコラ（Humicola）、テルモミセ
ス（Thermomyces）、及びペニシリウム
（Penicillium）に属する。 さらに、本発明によつて提供されるキヤリヤー
上に担持されたリパーゼは、非リパーゼタンパク
質の0.5乃至75重量％の量で存在するのが好まし
い。リパーゼが非リパーゼタンパク質の１乃至50
重量％の量で存在するのがより好ましい。リパー
ゼを吸着させた後、キヤリヤーの利用可能表面積
を２分子層（bilayer）までのタンパク質物質で
被覆する。 本発明によつて提供されるキヤリヤー上に担持
されたリパーゼは、疎水性キヤリヤー物質を非リ
パーゼタンパク質の溶液で、キヤリヤー粒子の利
用可能な表面が単分子層までの非リパーゼタンパ
ク質で実質的に覆われるように処理し、この被覆
されたキヤリヤーの上にリパーゼの被覆を部分的
に付着させることによつて簡便に調製できる。 本発明によつて提供されるキヤリヤー物質上に
担持されたリパーゼは、本発明によつて提供され
るキヤリヤー上に担持されたリパーゼの存在下
に、カルボン酸とエステルとを加熱し反応させる
ことによつて行われるエステル交換によつてエス
テルを調製する方法において有利に使用すること
ができる。キヤリヤー物質上のリパーゼを使用す
ることを含む製造技術は、例えば、固定床又はパ
イプ反応器のような連続式法、或いは攪拌タンク
反応器のような回分式方法において、リパーゼ物
質を繰り返し使用できるようにする。 本発明によるキヤリヤー物質上のリパーゼは、
本発明によつて提供されるキヤリヤー上に担持さ
れたリパーゼの存在下に、アルコールとカルボン
酸を反応させることによつて行われるエステル化
によつてエステルを調製する方法においても使用
できる。本発明を以下の実施例によつて説明す
る。本明細書において使用した分析は以下のよう
にして行つた。 分 析 Ａ エステル化 触媒（投入量に応じて５〜20mg）をバイアルの
中にいれ、5.88ｇのオレイン酸（92％、BDH製）
及び2.70ｇのオクタン−１−オール（GPRグレー
ド、BDH製）を含有する水飽和混合物を添加し
た。バイアルを密封し、50℃の水浴中の振盪機に
入れ、200ストローク／分で30分間振盪した。一
定量（0.1ml）を取り出し、即座に、小さいアル
ミナカラム（塩基性、活性２）にジエチルエーテ
ルを用いて、内部標準としてステアリン酸メチル
（2.5mg）の溶液とともに溶出させた。その後、ジ
エチルエーテルを蒸発によつて除去し、石油エー
テル（4.0ml、沸点60〜80℃）で置換した。次ぎ
に、オレイン酸オクチルのステアリン酸メチルに
対する比率をGLC（気液クロマトグラフイー）に
よつて測定した。この比からエステル形成の速度
を計算し、この速度を理論リパーゼ装填量
（loading）で割つたものとして効率を表わした。 Ｂ エステル交換 直径15mmのガラス製カラム中に、触媒（0.5〜
1.0ｇ）を、プレカラム（pre−column）として
の、3.2ｇの水を含有する4.0ｇの湿潤IDシリカゲ
ル［英国、ウオーリングトンのジヨセフ・クロス
フイールズ・アンド・サンズ（Joseph
Crosfields ＆ Sons）社製］とともに充填し
た。１重量部の高オレエートヒマワリ油、0.7重
量部のラウリン酸（98％、ユニケマ社製）、及び
４重量部の石油エーテル（沸点100〜120℃）を含
む水飽和供給物を、25ml／時の流速でカラムにポ
ンプ送入した。水ジヤケツトを用いて、カラム温
度を50℃に保持した。トリグリセリド中に組み入
れたラウリン酸の量をFAME（脂肪酸メチルエス
テル）／GC（ガスクロマトグラフイー）分析によ
つて測定した。このカラムを連続的に５日間運転
し、２日めに得られた活性を実施例において使用
した。 活性は、以下の式を使用して計算した。 活性＝（−ln（１−DC）×流量）／触媒重量
（ｇ） （ｇトリグリセリド／時／ｇ触媒） 流量＝ｇトリグリセリド／時 DC＝％（組み入れられたラウリン−初期含
量）／ ％（平衡含量−初期含量） DC＝転化度 以下の実施例において、初期ラウリン含量は０
％であり、平衡含量は31.3％であつた。 効率は、得られた活性を理論リパーゼ装填量で
割ることによつて計算した。これは、mgトリグリ
セリド／時／1000リパーゼ単位（mgTg／時／
KLU）の単位で表される。 実施例 １ 2.0ｇのマクロ多孔質ポリプロピレン粒子（平
均細孔直径139ナノメーター、粒度0.2〜0.4mm）
に、6.0mlのエタノールを全ポリマー粒子が確実
に濡れるように振盪しながら添加した。このスラ
リーに、54mlの0.01Mの燐酸ナトリウム緩衝剤
（PH７）を完全に混合するように攪拌しながら添
加した。予備処理タンパク質（下記の表を参照の
こと）を516mgを含有する前述と同じ緩衝剤を200
mlの量でさらに添加し、この混合物を20℃で24時
間ゆつくりと攪拌した。その後、処理された担持
体を濾過によつて溶液から分離し、同じ緩衝剤
（各100ml）で４回洗浄した。この物質の１ｇを40
mlの同じ燐酸塩緩衝剤中に懸濁させた。 この懸濁された予備処理担持体に、下記の表で
説明するある量のムコル・ミエヘイ
（Mucormiehei）リパーゼ（10000LU／ｇ、
11000LU／ml）を含有する同じ燐酸塩緩衝剤の
100mlを添加した。この混合物を20℃で24時間ゆ
つくりと攪拌した。達成された酵素装填量を、グ
リセリルトリブチレートの加水分解速度によつて
測定した溶液から失われた酵素活性から計算し
た。得られたキヤリヤー上のリパーゼを濾過によ
つて分離し、同じ燐酸塩緩衝剤（200ml）で２回
洗浄し、蒸留水（100ml）で１回洗浄し、そして
減圧下20℃で乾燥した。
【表】
実施例 ２
実施例１の手順を繰り返したが、使用したリパ
ーゼ溶液はフミコラ・スプ（Humicola sp.）［デ
ンマークのノボ・インダストリーズ（Novo
Industries）社製、１ml当たり63900リパーゼ単
位］からのものを使用した。結果を以下の表に示
す。
ーゼ溶液はフミコラ・スプ（Humicola sp.）［デ
ンマークのノボ・インダストリーズ（Novo
Industries）社製、１ml当たり63900リパーゼ単
位］からのものを使用した。結果を以下の表に示
す。
【表】
実施例 ３
実施例１の手順を繰り返したが、使用したリパ
ーゼ溶液はリゾプス・ニベウス
（Rhizopusniveus）［アマノＮ、日本の天野製薬
製、１ｇ当たり4500リパーゼ単位］からのものを
使用した。リパーゼを100mlの燐酸塩緩衝剤に溶
解して、その後処理された担持体に添加した。
ーゼ溶液はリゾプス・ニベウス
（Rhizopusniveus）［アマノＮ、日本の天野製薬
製、１ｇ当たり4500リパーゼ単位］からのものを
使用した。リパーゼを100mlの燐酸塩緩衝剤に溶
解して、その後処理された担持体に添加した。
【表】
実施例 ４
5.0ｇの調節された多孔質ガラスビーズ（英国、
プールのシグマ・ケミカル・リミテツド社製、平
均細孔直径187ナノメーター、表面積11m2／ｇ）
をオーブン中105℃で15分間乾燥させた。五酸化
燐上で冷却した後、ジクロロメチルシラン（16
ml）の１，１，１−トリクロロエタン（64ml）溶
液を添加し、ビーズを攪拌した。1.5時間後、ビ
ーズを濾過し、１，１，１−トリクロロエタンで
洗浄し、減圧下20℃で乾燥した。 実施例１の手順を繰り返したが、2.0ｇの疎水
性ガラスビーズを100mlのエタノールで濡らした
後、予備処理タンパク質溶液を添加した。この予
備処理したガラスビーズの１ｇを50mlの緩衝剤：
エタノール（９：１）混合物中で懸濁させて、そ
の後リパーゼを添加した。
プールのシグマ・ケミカル・リミテツド社製、平
均細孔直径187ナノメーター、表面積11m2／ｇ）
をオーブン中105℃で15分間乾燥させた。五酸化
燐上で冷却した後、ジクロロメチルシラン（16
ml）の１，１，１−トリクロロエタン（64ml）溶
液を添加し、ビーズを攪拌した。1.5時間後、ビ
ーズを濾過し、１，１，１−トリクロロエタンで
洗浄し、減圧下20℃で乾燥した。 実施例１の手順を繰り返したが、2.0ｇの疎水
性ガラスビーズを100mlのエタノールで濡らした
後、予備処理タンパク質溶液を添加した。この予
備処理したガラスビーズの１ｇを50mlの緩衝剤：
エタノール（９：１）混合物中で懸濁させて、そ
の後リパーゼを添加した。
【表】
実施例 ５
実施例１の手順を繰り返したが、使用した担持
体は、疎水性マクロ多孔質ポリスチレン粒子［米
国、ブリツジウオーターのナシヨナル・スター
チ・アンド・ケミカル・コーポレーシヨン
（National Starch ＆ Chemical Corp.）製、
平均細孔直径1660ナノメーター、表面積11m2／
ｇ］であつた。2.0ｇの担持体に10mlのエタノー
ルを加えることによつて初めに濡れを生じさせ、
その後50mlの燐酸塩緩衝剤を添加した。
体は、疎水性マクロ多孔質ポリスチレン粒子［米
国、ブリツジウオーターのナシヨナル・スター
チ・アンド・ケミカル・コーポレーシヨン
（National Starch ＆ Chemical Corp.）製、
平均細孔直径1660ナノメーター、表面積11m2／
ｇ］であつた。2.0ｇの担持体に10mlのエタノー
ルを加えることによつて初めに濡れを生じさせ、
その後50mlの燐酸塩緩衝剤を添加した。
【表】
実施例 ６
2.0ｇの湿つたデユオライト ES568弱アニオ
ン交換樹脂（水分29％）に、6.0mlのエタノール
を全樹脂粒子が確実に濡れるように振盪しながら
添加した。このスラリーに、54mlの0.01Mの燐酸
ナトリウム緩衝剤（PH７）を完全に混合するよう
に攪拌しながら添加した。予備処理タンパク質を
516mg含有する前述と同じ燐酸塩緩衝剤を140mlの
量でさらに添加し、この混合物を20℃で16時間ゆ
つくりと攪拌した。樹脂を沈降させ、上澄液をデ
カンテーシヨンによつて除去した。この処理され
た樹脂を100mlの燐酸塩緩衝剤で３回洗浄し、濾
過によつて分離した。この処理され洗浄された樹
脂に、下記の表で説明するある量のムコル・ミエ
ヘイ（Mucor miehei）リパーゼ（10000LU／
ｇ、11000LU／ml）を含有する70mlの燐酸塩緩衝
剤を添加した。この混合物を20℃で16時間ゆつく
りと攪拌した。達成された酵素装填量を、トリブ
チリンの加水分解速度によつて測定した溶液から
失われた酵素活性から計算した。得られた不動化
されたリパーゼを濾過によつて回収し、燐酸塩緩
衝剤（200ml）で２回洗浄し、蒸留水（100ml）で
１回洗浄し、そして減圧下20℃で乾燥した。
ン交換樹脂（水分29％）に、6.0mlのエタノール
を全樹脂粒子が確実に濡れるように振盪しながら
添加した。このスラリーに、54mlの0.01Mの燐酸
ナトリウム緩衝剤（PH７）を完全に混合するよう
に攪拌しながら添加した。予備処理タンパク質を
516mg含有する前述と同じ燐酸塩緩衝剤を140mlの
量でさらに添加し、この混合物を20℃で16時間ゆ
つくりと攪拌した。樹脂を沈降させ、上澄液をデ
カンテーシヨンによつて除去した。この処理され
た樹脂を100mlの燐酸塩緩衝剤で３回洗浄し、濾
過によつて分離した。この処理され洗浄された樹
脂に、下記の表で説明するある量のムコル・ミエ
ヘイ（Mucor miehei）リパーゼ（10000LU／
ｇ、11000LU／ml）を含有する70mlの燐酸塩緩衝
剤を添加した。この混合物を20℃で16時間ゆつく
りと攪拌した。達成された酵素装填量を、トリブ
チリンの加水分解速度によつて測定した溶液から
失われた酵素活性から計算した。得られた不動化
されたリパーゼを濾過によつて回収し、燐酸塩緩
衝剤（200ml）で２回洗浄し、蒸留水（100ml）で
１回洗浄し、そして減圧下20℃で乾燥した。
【表】
【表】
実施例 ７
実施例６の手順を繰り返したが、使用したリパ
ーゼ溶液はフミコラ・スプ（Humicola sp.）［ノ
ボ−ノルデイスク（Novo Nordisk）社製、１ml
当たり50000リパーゼ単位］からのものを使用し
た。
ーゼ溶液はフミコラ・スプ（Humicola sp.）［ノ
ボ−ノルデイスク（Novo Nordisk）社製、１ml
当たり50000リパーゼ単位］からのものを使用し
た。
【表】
１：エステル化、マイクロモル／時／
LU。
実施例 ８ 湿つた弱アニオン交換樹脂（デユオライト
ES568）（水分29％）の15ｇのサンプルを抽出用
筒（extraction thimble）に入れ、プロパン−２
−オールを使用するソツクスレー抽出
（Soxhletextraction）によつて16時間洗浄した。
その後、これを200mlのエタノールで２回洗浄し、
減圧下20℃で乾燥した。別の弱アニオン交換樹脂
であるアンバーリスト Ａ−21の15ｇのサンプル
を用いて、この手順を繰り返した。 その後、実施例６の手順を繰り返したが、出発
物質は上述のようにして調製し、洗浄し、乾燥し
た樹脂であつた。使用した予備処理タンパク質は
卵白アルブミンであり、ムコル・ミエヘイ
（Mucor miehei）リパーゼ溶液を0.8mlの体積で
使用した。
LU。
実施例 ８ 湿つた弱アニオン交換樹脂（デユオライト
ES568）（水分29％）の15ｇのサンプルを抽出用
筒（extraction thimble）に入れ、プロパン−２
−オールを使用するソツクスレー抽出
（Soxhletextraction）によつて16時間洗浄した。
その後、これを200mlのエタノールで２回洗浄し、
減圧下20℃で乾燥した。別の弱アニオン交換樹脂
であるアンバーリスト Ａ−21の15ｇのサンプル
を用いて、この手順を繰り返した。 その後、実施例６の手順を繰り返したが、出発
物質は上述のようにして調製し、洗浄し、乾燥し
た樹脂であつた。使用した予備処理タンパク質は
卵白アルブミンであり、ムコル・ミエヘイ
（Mucor miehei）リパーゼ溶液を0.8mlの体積で
使用した。
【表】
実施例 ９
実施例６の手順を繰り返したが、使用した担持
体は、強アニオン交換シリカであるスフエロシル
（Spherosil）QAMと弱アニオン交換シリカであ
るスフエロシル DEAであつた。卵白アルブミ
ン予備処理タンパク質の添加の前に、これらのア
ニオン交換シリカを濡らすためのエタノールの使
用は行わなかつた。添加したムコル・ミエヘイ
（Mucor miehei）リパーゼ溶液の体積は、200ml
の燐酸塩緩衝剤中の0.8mlであつた。
体は、強アニオン交換シリカであるスフエロシル
（Spherosil）QAMと弱アニオン交換シリカであ
るスフエロシル DEAであつた。卵白アルブミ
ン予備処理タンパク質の添加の前に、これらのア
ニオン交換シリカを濡らすためのエタノールの使
用は行わなかつた。添加したムコル・ミエヘイ
（Mucor miehei）リパーゼ溶液の体積は、200ml
の燐酸塩緩衝剤中の0.8mlであつた。
【表】
実施例 10
デユオライト ES568を担持体として使用し
て、実施例８の手順を繰り返したが、予備処理タ
ンパク質はカゼインナトリウムであつた。添加し
たムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）リパーゼ
溶液の体積は、1.0mlであつた。
て、実施例８の手順を繰り返したが、予備処理タ
ンパク質はカゼインナトリウムであつた。添加し
たムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）リパーゼ
溶液の体積は、1.0mlであつた。
【表】
実施例 11
アンバーリスト Ａ−21を担持体として使用し
て、実施例８の手順を繰り返したが、使用したリ
パーゼ溶液はフミコラ・スプ（Humicola sp.）
からのものであり、使用した体積は、0.8mlであ
つた。
て、実施例８の手順を繰り返したが、使用したリ
パーゼ溶液はフミコラ・スプ（Humicola sp.）
からのものであり、使用した体積は、0.8mlであ
つた。
【表】
実施例 12
疎水性マクロ多孔質ポリプロピレン粒子［2.0
ｇ、アキユレル（Accurel）EP100、エンカ
（ENKA）］に、20mlの無水エタノールを全ポリ
マー粒子が確実に濡れるように攪拌しながら添加
した。このスラリーに、200mlの0.01Mの燐酸ナ
トリウム緩衝剤溶液（PH７）を完全に混合するよ
うに攪拌しながら添加した。過剰の溶液、約190
mlをデカンテーシヨンにより除去し、リパーゼと
非リパーゼタンパク質の混合物を含有する緩衝剤
の100mlのアリコートをさらに添加した。混合物
を室温でゆつくりと攪拌した。リパーゼの多孔質
担持体への吸着を溶液から失われる活性によりモ
ニターした。達成された理論酵素装填量と得られ
た効率とを以下の表に示す。 ａ リパーゼ＝ムコル・ミエヘイ、10000LU／
ｇ、11000LU／mlノボ・インダストリーズ社
製。
ｇ、アキユレル（Accurel）EP100、エンカ
（ENKA）］に、20mlの無水エタノールを全ポリ
マー粒子が確実に濡れるように攪拌しながら添加
した。このスラリーに、200mlの0.01Mの燐酸ナ
トリウム緩衝剤溶液（PH７）を完全に混合するよ
うに攪拌しながら添加した。過剰の溶液、約190
mlをデカンテーシヨンにより除去し、リパーゼと
非リパーゼタンパク質の混合物を含有する緩衝剤
の100mlのアリコートをさらに添加した。混合物
を室温でゆつくりと攪拌した。リパーゼの多孔質
担持体への吸着を溶液から失われる活性によりモ
ニターした。達成された理論酵素装填量と得られ
た効率とを以下の表に示す。 ａ リパーゼ＝ムコル・ミエヘイ、10000LU／
ｇ、11000LU／mlノボ・インダストリーズ社
製。
【表】
ナトリウ
ム
ム
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ キヤリヤー物質上に担持されたリパーゼから
成る生体触媒物質であつて、キヤリヤー物質にか
なりの割合の非リパーゼタンパク質の被覆と少な
くとも１部のリパーゼの被覆とが設けられてお
り、非リパーゼタンパク質とリパーゼのいずれも
がキヤリヤー物質に物理的吸着により結合してい
ることを特徴とする、生体触媒物質。 ２ キヤリヤー物質が疎水性である、請求項第１
項に記載の生体触媒物質。 ３ キヤリヤー物質がイオン交換樹脂である、請
求項第１項に記載の生体触媒物質。 ４ キヤリヤー物質が50ナノメーターより大きい
平均細孔直径を有する、請求項第２項又は第３項
に記載の生体触媒物質。 ５ タンパク質が、卵白アルブミン、ゼラチン、
ウシ血清アルブミン、及び／又はカゼインナトリ
ウムを含む、請求項第２項又は第３項に記載の生
体触媒物質。 ６ リパーゼが、非リパーゼタンパク質の0.5乃
至75重量％、好ましくは１乃至50重量％の量で存
在する、請求項第２項又は第３項に記載の生体触
媒物質。 ７ 疎水性キヤリヤー物質が、ポリオレフイン、
ポリスチレン、ポリアクリレート、シリケート、
シリカ、又はガラスである、請求項第２項に記載
の生体触媒物質。 ８ イオン交換樹脂が、ポリスチレン、ポリアク
リレート、フエノール−ホルムアルデヒド樹脂、
及びシリカに基づくイオン交換樹脂から選択され
る、請求項第３項に記載の生体触媒物質。 ９ イオン交換樹脂が、アニオン性イオン交換樹
脂である、請求項第８項に記載の生体触媒物質。 １０ キヤリヤー物質上に担持されたリパーゼか
ら成る生体触媒物質の製造方法であつて、キヤリ
ヤー物質を非リパーゼタンパク質で物理的吸着に
よつて実質的に被覆し、それと同時か又はその
後、リパーゼでキヤリヤー物質を物理的吸着によ
つて少なくとも部分的に被覆することを特徴とす
る、方法。 １１ キヤリヤー物質が非リパーゼタンパク質で
実質的に覆われるように、非リパーゼタンパク質
の溶液でキヤリヤー物質を処理する、請求項第１
０項に記載の方法。 １２ 請求項第１項乃至第９項のいずれか１請求
項に記載のキヤリヤー物質上に担持されたリパー
ゼから成る生体触媒物質の存在下に、カルボン酸
及びエステルを加熱し反応させるエステル交換に
よつてエステルを製造する方法。 １３ 請求項第１項乃至第９項のいずれか１請求
項に記載のキヤリヤー物質上に担持されたリパー
ゼから成る生体触媒物質の存在下に、カルボン酸
及びアルコールを加熱し反応させるエステル化に
よつてエステルを製造する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89202659 | 1989-10-20 | ||
| EP89202659.2 | 1989-10-20 | ||
| GB909019437A GB9019437D0 (en) | 1990-09-06 | 1990-09-06 | Supported enzyme |
| GB9019437.4 | 1990-09-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03155785A JPH03155785A (ja) | 1991-07-03 |
| JPH0585157B2 true JPH0585157B2 (ja) | 1993-12-06 |
Family
ID=26121335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2279544A Granted JPH03155785A (ja) | 1989-10-20 | 1990-10-19 | 担持酵素 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0424130B1 (ja) |
| JP (1) | JPH03155785A (ja) |
| AT (1) | ATE118034T1 (ja) |
| AU (1) | AU635572B2 (ja) |
| BR (1) | BR9005292A (ja) |
| CA (1) | CA2027649C (ja) |
| DE (1) | DE69016570T2 (ja) |
| DK (1) | DK0424130T3 (ja) |
| ES (1) | ES2067694T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015059T3 (ja) |
| MY (1) | MY154458A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5846604A (en) * | 1988-03-14 | 1998-12-08 | Nextec Applications, Inc. | Controlling the porosity and permeation of a web |
| CA2027649C (en) * | 1989-10-20 | 1996-01-16 | John Anthony Bosley | Supported enzyme |
| JP2001511354A (ja) | 1997-07-25 | 2001-08-14 | アクゾ ノーベル ナムローゼ フェンノートシャップ | 第三級パーエステルの製造法 |
| EP0937776A3 (en) * | 1998-02-18 | 2002-06-12 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | Immobilized enzymes |
| ES2143940B1 (es) * | 1998-02-26 | 2000-12-16 | Consejo Superior Investigacion | Procedimiento de preparacion selectiva de derivados de alfa-hidroxiacidos. |
| GB0226270D0 (en) | 2002-11-11 | 2002-12-18 | Unilever Plc | Method of producing retinyl esters |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5860987A (ja) * | 1981-10-06 | 1983-04-11 | Sumitomo Chem Co Ltd | 酵素もしくは微生物菌体の固定化方法 |
| JPS62134090A (ja) * | 1985-12-07 | 1987-06-17 | Fuji Oil Co Ltd | 酵素剤の製造法 |
| JPS63126485A (ja) * | 1986-11-18 | 1988-05-30 | Dentaru Kagaku Kk | 固定化酵素の製造法 |
| JPH02138986A (ja) * | 1987-12-22 | 1990-05-28 | Unilever Nv | 脂肪酸エステルの製造方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2543972B1 (fr) * | 1983-04-06 | 1985-12-27 | Immunotech Sa | Procede de fixation de macromolecules biologiques sur des supports |
| DK402583D0 (da) * | 1983-09-05 | 1983-09-05 | Novo Industri As | Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf |
| EP0320132B1 (en) * | 1987-12-09 | 1995-06-21 | Kao Corporation | Immobilized enzyme and esterification and interesterification therewith |
| DK687387D0 (da) * | 1987-12-28 | 1987-12-28 | Novo Industri As | Immobiliseret lipase |
| CA2027649C (en) * | 1989-10-20 | 1996-01-16 | John Anthony Bosley | Supported enzyme |
-
1990
- 1990-10-15 CA CA002027649A patent/CA2027649C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-18 AT AT90311416T patent/ATE118034T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-18 AU AU64759/90A patent/AU635572B2/en not_active Expired
- 1990-10-18 DE DE69016570T patent/DE69016570T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-18 DK DK90311416.3T patent/DK0424130T3/da active
- 1990-10-18 MY MYPI90001824A patent/MY154458A/en unknown
- 1990-10-18 EP EP90311416A patent/EP0424130B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-18 ES ES90311416T patent/ES2067694T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-19 BR BR909005292A patent/BR9005292A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-10-19 JP JP2279544A patent/JPH03155785A/ja active Granted
-
1995
- 1995-02-15 GR GR950400300T patent/GR3015059T3/el unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5860987A (ja) * | 1981-10-06 | 1983-04-11 | Sumitomo Chem Co Ltd | 酵素もしくは微生物菌体の固定化方法 |
| JPS62134090A (ja) * | 1985-12-07 | 1987-06-17 | Fuji Oil Co Ltd | 酵素剤の製造法 |
| JPS63126485A (ja) * | 1986-11-18 | 1988-05-30 | Dentaru Kagaku Kk | 固定化酵素の製造法 |
| JPH02138986A (ja) * | 1987-12-22 | 1990-05-28 | Unilever Nv | 脂肪酸エステルの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR3015059T3 (en) | 1995-05-31 |
| BR9005292A (pt) | 1991-09-17 |
| CA2027649C (en) | 1996-01-16 |
| DE69016570T2 (de) | 1995-06-01 |
| DE69016570D1 (de) | 1995-03-16 |
| ATE118034T1 (de) | 1995-02-15 |
| ES2067694T3 (es) | 1995-04-01 |
| MY154458A (en) | 2015-06-30 |
| AU635572B2 (en) | 1993-03-25 |
| JPH03155785A (ja) | 1991-07-03 |
| DK0424130T3 (da) | 1995-06-26 |
| CA2027649A1 (en) | 1991-04-21 |
| EP0424130B1 (en) | 1995-02-01 |
| EP0424130A1 (en) | 1991-04-24 |
| AU6475990A (en) | 1991-04-26 |
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