JPS63126485A - 固定化酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は固定化酵素の製造法、詳しくは、架橋結合剤、
縮合剤、又は共有結合剤のいずれかを用いて、酵素に該
酵素以外の蛋白質、或はアミノ酸を結合させた物質を、
不溶性担体に吸着させる固定化酵素の製造法に関するも
のである。

（従来の技術） 従来の酵素固定化法は便宜上次の３つの方法に大別する
ことができる。即ち（１）担体結合法、（２）架橋法、
（３）包括法である。担体結合法は、酵素を水不溶性の
担体に結合させる方法で、固定化酵素の製法中量も古く
から行われているものであり、共有結合法、イオン結合
法、物理的吸着法に分けることができる。共有結合法は
水不溶性担体と酵素とを共有結合させるものであり、イ
オン結合法や、物理的吸着法に比べ、反応条件、反応操
作が煩雑で、比較的激しい処理をするので、強い力価の
固定化酵素はえにくいが、酵素が担体と強く結合してい
るので、高濃度の基質溶液や、塩類溶液などによって簡
単に脱離することがなく、安定で長時間使用できる利点
を有している。イオン結合法はイオン交換基を有する不
溶性担体に酵素をイオン結合させるもので、操作は簡単
で、比較的力価の高い不溶性酵素かえられるが、担体と
酵素の結合力がよりいため、酵素が担体から遊離する欠
点がある。物理的吸着法は、酵素を不溶性担体に物理的
に吸着させる方法であり、酵素に適合する担体を見出す
ことがむつかしく、又、担体との相互作用が弱いため、
簡単に酵素が脱離する。架橋法は２官能基を有する試薬
で、酵素蛋白を架橋することにより不溶化する方法であ
るが、前記の共有結合法と同様に、比較的激しい条件で
処理するため、強い力価の酵素かえられにくい。

このように、従来の酵素固定化法は、安定で長時間使用
できる固定化法は操作が煩雑である上、えられる固定化
酵素の力価が弱く、えられる固定化酵素の力価の高い固
定化方法は、操作は簡単であるが、えられる固定化酵素
は不安定で、使用に制限をうける。

（発明が解決しようとする問題点） 前記のように、従来の酵素固定化法は一長一短があった
。本発明は、比較的簡単な操作で、加えて、えられた固
定化酵素が比較的高力価を有し、安定で使用に際し、制
限の少ない固定化酵素をえるための酵素の固定化方法を
提供することである。

（問題を解決するための手段） 本発明は、酵素を、架橋結合剤、縮合剤、又は、共有結
合剤（これらを以下結合剤と記す）などを用いて該酵素
以外の蛋白質、又はアミノ酸に結合させ、その物質を不
溶性担体に吸着させるものである。

本発明に使用する酵素は、例えば、アルドラーゼ、ウレ
アーゼ、インベルターゼ、ウロキナーゼ、エラスターゼ
、タカラーゼ、キモトリプシン、グリコアミラーゼ、グ
ルタミナーゼ、グリコアミラ−ゼ、チトクロムＣ１ベプ
チターゼ、セルラーゼ、デキストラーゼ、トリプシン、
ペプシン、ラクターゼ、レニン、ムタナーゼ、その他い
かなる酵、素でも使用でき、不溶性担体はヒドロキシア
パタイト、フルオルアパタイト、リン酸２水素カルシウ
ム、リン酸３カルシウム、リン酸カルシウムゲルなどの
リン酸カルシウム化合物群、シリカゲル、活性炭、カオ
リナイト、多孔性ガラス、ベントナイト、漂白土、アル
ミナ、酸化チタン、チン化ケイ素などの無機成分、ポリ
アクリル酸ソーダ、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ
アクリルニトリル、ポリメチルメタアクリレートなどの
有機重合体を使用できる。

酵素との結合に使用する蛋白質又は、アミノ酸（以下こ
れらを中間担体と記す）は、アルブミン、リゾチーム、
千トクロムＣ，カゼイン、ロイシン、チロシン、バリン
、プロリン、レチン酸など不溶性担体に吸着するもので
あれば、いかなる蛋白質、アミノ酸でも使用可能である
が、酸性又は塩基性の蛋白質、又は、アミノ酸より選択
することが好ましい。結合剤としては臭化シアン、グル
タルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘ
キサメチレンジチオイソシアネート、ジシクロへキシル
カルボジイミド、Ｎ−メチル−５・フェニルイソオキサ
ゾリウム−３′−スルホネート、イソシアネート、ヘキ
サメチレンジアミンなどが使用でき、固定化酵素の使用
条件により、中間担体と結合剤とは適宜選択される。例
えば、アルカリ側で使用する場合には、中間担体として
酸性蛋白、又はアミノ酸のように酸性物質を、酸性側で
使用する場合は、塩基性物質を選択することが好ましい
。結合剤の量は生成する固定化酵素の力価に影響を及ぼ
す。酵素に対し過剰に使用すると力価の低下が著しいの
で、出来るだけ過剰にならぬ様使用し、」般に、結合剤
／酵素の重量比は約０．０５％から２０％、好ましくは
、０．１％から１％である。中間担体を飽和吸着させて
得られた中間担体を吸着した不溶性担体を緩衝溶液に懸
濁し、低温（約５℃）でおだやかに攪拌しながら結合剤
を添加し、更に数時間攪拌後酵素を添加するか、結合剤
と酵素とを同時に添加して数時間低温（５℃）で攪拌反
応させる。反応後遠心分離により固体を採取し、緩衝溶
液、次で冷水で充分に洗浄して付着する蛋白質を除去し
、凍結乾燥により目的物をえる。又、緩衝溶液に懸濁さ
れた不溶性担体懸濁液に、攪拌しながら中間担体、酵素
、結合剤を順次添加し低温（５℃）で数時間攪拌するこ
とによっても目的物をえることができる。この場合中間
担体と酵素の比は約１から１．５、不溶性担体は酵素量
に対し５０から３００倍の大過剰であることが好ましい
。

このようにして得られた固定化酵素は従来の方法によっ
てえられた固定化酵素に比し、活性が強く、温度、ｐＨ
に対し巾広い活性を示す。

（作用） 本願方法により得られた固定化酵素がいかなる機構によ
り生成されているのか正確には不明であるが、酵素の中
間担体への結合、中間担体と酵素との作用、不溶性担体
への中間担体の強力な吸着などが組合された結果、従来
の物理的吸着法、イオン結合法に比し、安定で、かつ高
力価の酵素かえられるものと推定される。

以下実施例で詳しく本発明を説明する。

例１　リゾチームの固定化 ハイドロキシアパタイト１０ｇを水冷１０ｍＭリン酸カ
ルシウム緩衝溶液ｐＨ５，５１００ｍ１に懸濁し、チト
クロムＣ３０ｍｇ、リゾチーム５０ｍｇを５℃で攪拌下
に添加し３時間攪拌後、その温度を保持したま−ｏ、ｏ
ｉ％グルタルアルデヒド緩衝溶液０．５ｍｊ２を徐々に
滴下し更に３時間攪拌を続ける。攪拌をやめ、遠心分離
で固型物を採取し、上澄液から蛋白質が検出されなくな
るまで、氷水で固型物を洗浄し、凍結乾燥により乾燥し
て乾燥品をえた。分析の結果えられた固型物１００ｍｇ
は蛋白１ｉ０．７ｍｇを含有し、そのリゾチーム活性は
０．９であった。（未反応リゾチーム活性を１として）
。尚本固定化酵素を水溶液中に３０℃、６０℃で３０日
、６０日放置してその活性を測定したところ夫々０．８
．０．７．０．７．０．５の比活性を示した。

例２　ペプシンの固定化 活性炭３００ｇを水冷クエン酸ナトリウム緩衝溶液ｐ　
Ｈ８，０に懸濁しチトクロム−０１ｍｇ、ペプシン５　
ｍｇを攪拌下８℃で添加し３時間攪拌後ジシクロへキシ
ルカルボジイミドｌ　ｍｇを含む１００ｍ１同緩衝溶液
ノ１ｌ１１１を添加ＬＩＯ時間攪拌下にその温度を保持
した。反応後側１と同様に処理して固定化酵素をえた。

えられた活性炭のペプシン活性は０．８５（未反応ペプ
シンを１として）を示し、３０℃、６０℃で夫々３０日
、１００日水溶液中に放置した結果活性は夫々０．８５
．０．８０．０．８５．０．７０を示した。

（発明の効果） 本発明により、酵素に適合する不溶性担体の選択がむつ
かしかった従来の固定化法に比し不溶性担体の選択が自
由であり、えられた酵素の力価が広く、ｐＨ１温度に対
し巾広（安定で使用容易な固定化酵素を簡単な方法でえ
ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 架橋結合剤、縮合剤、又は共有結合剤のいずれかを用い
   て酵素と該酵素以外の蛋白質或はアミノ酸とを結合させ
   た物質を不溶性担体に吸着させることを特徴とする固定
   化酵素の製造法。