PL176202B1 - Sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego - Google Patents

Sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego

Info

Publication number
PL176202B1
PL176202B1 PL93320659A PL32065993A PL176202B1 PL 176202 B1 PL176202 B1 PL 176202B1 PL 93320659 A PL93320659 A PL 93320659A PL 32065993 A PL32065993 A PL 32065993A PL 176202 B1 PL176202 B1 PL 176202B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fibrin
composition
monomer
noncrosslinked
acid
Prior art date
Application number
PL93320659A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter A.D. Edwardson
John E. Fairbrother
Ronald S. Gardner
Derek A. Hollingsbee
Stuart A. Cederholm-Williams
Original Assignee
Squibb & Sons Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Squibb & Sons Inc filed Critical Squibb & Sons Inc
Publication of PL176202B1 publication Critical patent/PL176202B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/363—Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4833—Thrombin (3.4.21.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/32—Proteins, polypeptides; Degradation products or derivatives thereof, e.g. albumin, collagen, fibrin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L17/00—Materials for surgical sutures or for ligaturing blood vessels ; Materials for prostheses or catheters
    • A61L17/005—Materials for surgical sutures or for ligaturing blood vessels ; Materials for prostheses or catheters containing a biologically active substance, e.g. a medicament or a biocide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0015—Medicaments; Biocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
    • A61L24/106—Fibrin; Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/225—Fibrin; Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A61L2300/254—Enzymes, proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/404—Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
    • A61L2300/406—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/416—Anti-neoplastic or anti-proliferative or anti-restenosis or anti-angiogenic agents, e.g. paclitaxel, sirolimus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/418—Agents promoting blood coagulation, blood-clotting agents, embolising agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/45—Mixtures of two or more drugs, e.g. synergistic mixtures

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego, znamienny tym, ze zadane miejsce, znajdujace sie poza zywym organizmem, doprowadza sie do zetkniecia z wodna kompozycja zawierajaca monomer fibryny o stezeniu równym 10 - 200 mg/ml, korzystnie 20 - 200 mg/ml, której pH równa sie 1 - 5 i przeprowadza sie konwersje monomeru fibryny do polimeru fibryny za pomoca kompozycji wybranej z grupy obejmujacej wode destylowana i bufor alkaliczny wybrany z grupy obejmujacej uklad 0,5 - 0,75M weglan/wodoroweglan sodu o pH 10 -10,5, 0,5 - 0,75M wodoroweglan sodu/NaOH o pH 10,0,1,5M glicyna/NaOH o pH 10,0,0,5 -1 ,0M kwas bis(hydroksyetyloaminoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5, 1 M kwas hydroksyetylopipera- zynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5,0,5 M trycyne o pH 8,5, 1 M kwas morfolinopropa- nosulfonowy (MOPS) o pH 8,0, 1M kwas trishydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0 i 0,5 M kwas cykloheksyloaminoetanosulfonowy (CHES). PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego poza żywym organizmem, np. na bandażu, szwie, protezie, opatrunku itp.
Jeden z mechanizmów homeostazy u ssaków, to jest zapobieganie ubytkom krwi, polega na tworzeniu skrzepu krwi. Tworzenie skrzepu u ludzi, to jest koagulacja krwi, przebiega na drodze złożonej kaskady reakcji, której etapem końcowym jest konwersja fibrynogenu - monomeru - przez trombinę, jony wapnia i aktywowany czynnik XIII do usieciowanego ostatecznie polimeru fibryny II, który jest skrzepem fibryny.
Tworzenie usieciowanego polimeru fibryny II przebiega na drodze konwersji fibrynogenu przez trombinę do monomeru fibryny I, która spontanicznie polimeryzuje z utworzeniem polimeru fibryny I, niekiedy określanego jako rozpuszczalna fibryna I ponieważ przez działanie odpowiednimi środkami chemicznymi polimer fibryny I może być ponownie przekształcony w monomer fibryny I. Polimer fibryny I jest następnie przekształcany przez trombinę do polimeru fibryny II, który jest czasami określany jako rozpuszczalna fibryna II, ponieważ przez działanie odpowiednimi środkami chemicznymi polimer fibryny II można ponownie przeprowadzić w monomer fibryny I. Polimer fibryny II pod wpływem czynnika XIIIa, znanego jako aktywowany czynnik XIII, jest następnie sieciowany z utworzeniem usieciowanej fibryny Π, która jest skrzepem fibryny. Czynnik XIII jest aktywowany przez trombinę w obecności jonów wapnia.
176 202
Usieciowana fibryna II jest niekiedy określana jako nierozpuszczalna fibryna II, ponieważ nie może być przekształcona w monomer fibryny II.
Należy zauważyć, że trombina tworzy się z protrombiny. Protrombina jest przekształcana w trombinę działaniem czynnika Xa w obecności wapnia i innych substancji pomocniczych.
Fibrynogen stanowi około 2 do 4 gramów/litr z białek osocza krwi. Fibrynogen jest monomerem, który składa się z trzech par łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami disiarczkowymi, oznaczonych (Aa )2, (Ββ)2, Y2, A i B oznaczają dwa małe peptydy terminalne, znane jako odpowiednio fibrynopeptyd A i fibrynopeptyd B. W wyniku odszczepienia fibrynopeptydu A od fibrynogenu podczas transformacji fibrynogenu pod wpływem trombiny powstaje związek fibryna I, zaś w wyniku późniejszego odszczepienia fibrynopeptydu B związek fibryna II. Takie odszczepienie fibrynopeptydów A i B powoduje bardzo niewielkie zmniejszenie ciężaru cząsteczkowego fibrynogenu około 6000 do 340000, ale odsłania miejsca polimeryzacji. Przegląd mechanizmów koagulacji krwi oraz struktura fibrynogenu przedstawione są przez C.M. Jackson. Ann. Rev. Biochem., 49:765-811 (1980) i B. Furie i B.C. Furie, Cell, 53:505-518(1988).
Spoiwo fibrynowe jest lepiszczem biologicznym, którego działanie imituje końcowe etapy koagulacji, przez co uzyskuje się skrzep fibrynowy. Typowe spoiwa fibrynowe składają się z zatężonego fibrynogenu ludzkiego, aprotyniny bydlęcej i czynnika XIII jako pierwszego składnika oraz trombiny bydlęcej i chlorku wapnia jako drugiego składnika. Nanoszenie odbywa się zwykle za pomocą dwucylindrowej strzykawki, która pozwala na jednoczesne nanoszenie obu składników na miejsce, w którym chce się utworzyć skrzep fibrynowy. Aprotynina jest inhibitorem fibrynolitycznym, dodawanym w celu nadania trwałości spoiwom fibrynowym.
Składnik fibrynogenowy spoiwa fibrynowego otrzymuje się ze zbieranego ludzkiego osocza krwi. Fibrynogen może być zatężony z osocza ludzkiego za pomocą krioprecypitacji oraz precypitacji przy użyciu różnych reagentów, na przykład glikolu polietylenowego, eteru, etanolu, siarczanu amonu lub glicyny. Doskonały przegląd spoiw fibrynowych przedstawili M. Brennan, Blood Reviews, 5:240-244 (1991); J. W. Gibble i P.M. Ness, Transfusion, 30:741-747 (1990); H. Matras, J. Oral Maxillofac Surg., 43:605-611 (1985) oraz R. Lerner i N. Binur, J. of Surgical Research, 48:165-181 (1990).
Ostatnio obserwuje się również zainteresowanie otrzymywaniem spoiw fibrynowych przy użyciu fibryny autologicznej. Autologiczne spoiwo fibrynowe jest to takie spoiwo fibrynowe, którego składnik fibrynogenowy jest wyekstrahowany z własnej krwi pacjenta. Stosowanie autologicznego spoiwa fibrynowego jest korzystne, ponieważ eliminuje ono ryzyko przeniesienia chorób przenoszonych przez krew, na przykład zapalenia wątroby typu B, typu A i typu nie-A nie-B oraz zespołu nabytego niedoboru odpornościowego (AIDS), które w przeciwnym razie mogłyby być obecne w komponencie fibrynogenowym, wyodrębnionym ze zbieranego osocza ludzkiego. Patrz L.E. Silberstein et al., Transfusion, 28:319-321 (1988); K. Laitakari i J. Luotonen, Laryngoscope, 99:974-976 (1989) i A. Dresdale et al., The Annals of Thoracic Surgery, 40:385-387 (1985).
Spoiwo fibrynowe może przenosić infekcje nie tylko za pośrednictwem fibryogenu, ale również za pośrednictwem aprotyniny bydlęcej i trombiny bydlęcej. Wiadomo jest, że trombina bydlęca przenosi czynnik zakaźny bydlęcego gąbczastego zapalenia mózgu (BSE) i inne wirusy patogenne dla ssaków. Ponadto trombina bydlęca jest silnym antygenem, który może powodować reakcje immunologiczne u ludzi. Zatem zastosowanie trombiny bydlęcej może spowodować działania uboczne u biorcy. Patrz D.M. Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (Supplement A): 1-41-146 (1991), S.B. Prusiner et al., Cornell Vet. 81 Nr 2: 85-96 (1991) i D. Matthews, J. roy. Soc. Health, 3-5 (February 1991).
W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na spoiwo fibrynowe, które może być stosowane u pacjenta bez ryzyka zakażenia wirusowego lub innych działań niepożądanych.
Sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego, według wynalazku polega na tym, że żądane miejsce, znajdujące się poza żywym organizmem, doprowadza się do zetknięcia z wodną kompozycją zawierającą monomer fibryny o stężeniu równym 10 - 200 mg/ml, korzystnie 20 200 mg/ml, której pH równa się 1 - 5 i przeprowadza się konwersję monomeru fibryny do polimeru fibryny za pomocą kompozycji wybranej z grupy obejmującej wodę destylowaną i
176 202 bufor alkaliczny wybrany z grupy obejmującej układ 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 - 10,5,0,5 - 0,75 M wodorowęglan sodiENaOH o pH 10,0, 1,,5 M gllcyniONaOH opH 10,0, 0,5 - 1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5, IM kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5, 0,5 M trycynę N-[2-hydroksy1,1-bis(hydroksymetylo)etylo]gllcynao pH 8,5, 1M kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS) o pH 8,0, 1M kwas trishydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0 i 0,5 M kwas cykloheksyloaminoetanosulfonowy (CHES).
W sposobie według wynalazku, korzystnie, jako bufor alkaliczny stosuje się bufor wybrany z grupy obejmującej układ 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 -10,5, 0,5 -1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5, 1M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5 i 1M kwas trishydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, stosuje się bufor alkaliczny lub wodę destylowaną dodatkowo zawierającą źródło jonów wapnia.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, stosuje się źródło jonów wapnia o stężeniu równym 5 - 200 mM, a zwłaszcza równym 30 mM.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, żądane miejsce doprowadza się do zetknięcia z wodną kompozycją fibryny i buforem alkalicznym lub wodą destylowaną za pomocą strzykawki dwucylindrycznej, przy czym jeden cylinder zawiera kompozycję fibryny, a drugi zawiera bufor alkaliczny lub wodę destylowaną.
Dla celów wynalazku stosuje się następujące definicje:
Fibryna - Fibryna oznacza dowolną postać fibryny. Do nieograniczających przykładów fibryny należą fibryna I, fibryna II i fibryna des BB. Fibryna może mieć postać monomeryczną lub polimeryczną, przy czym w postaci polimerycznej jest usieciowana albo nieusieciowana.
Monomer fibryny - Monomer fibryny obejmuje dowolną postać fibryny, na przykład fibrynę I, fibrynę II lub fibrynę des BB, przy czym fibryna jest w postaci monomerycznej lub oligomerycznej, która może być solubilizowana w kompozycji zawierającej monomer fibryny, a monomer fibryny może być przekształcony w polimer fibryny.
Polimer fibryny - Polimer fibryny obejmuje dowolną formę fibryny, na przykład fibrynę
I, fibrynę II lub fibrynę des BB, przy czym wspomniana fibryna jest w postaci polimerycznej, albo nieusieciowanej albo usieciowanej.
Fibryna nieusieciowana - Fibryna nieusieciowana obejmuje dowolną postać fibryny, na przykład fibrynę I, fibrynę II lub fibrynę des BB, przy czym wspomniana fibryna jest nieusieciowana i może być przekształcona w fibrynę usieciowaną. Fibryna nieusieciowana może być monomerem fibryny lub nieusieciowanym polimerem fibryny.
Fibryna usieciowana - Fibryna usieciowana obejmuje dowolną postać fibryny, na przykład fibrynę I, fibrynę II lub fibrynę des BB, przy czym wspomniana fibryna jest polimerem fibryny, który jest usieciowany.
Wodna kompozycja fibryny stosowana w sposobie według wynalazku, zawierająca monomer fibryny, może zawierać dowolną postać monomeru fibryny, która może być przekształcona w polimer fibryny. Do nieograniczających przykładów należą monomer fibryny I, monomer fibryny II lub monomer fibryny des Bb przy czym preferowany jest monomer fibryny I. Oczywiście kompozycja może zawierać mieszaniny monomerów fibryny. Dlacelów niniejszego wynalazku określenie polimer fibryny obejmuje dowolny polimer otrzymany przez polimeryzację monomeru fibryny. Zatem na przykład w wyniku konwersji monomeru fibryny I do polimeru fibryny może powstać polimer fibryny I nieusieciowany albo usieciowany i/lub polimer fibryny
II, usieciowany lub nieusieciowany, zależnie od tego, jak jest przeprowadzany etap konwersji.
Preferowany jest monomer fibryny I, ponieważ może on być, w przeciwieństwie do fibrynogenu, łatwo poddany konwersji do polimeru fibryny bez stosowania trombiny lub czynnika XIII. W istocie, monomer fibryny I może spontanicznie tworzyć polimer fibryny I, który może działać jako skrzep fibryny, niezależnie od tego, czy polimer fibryny I jest usieciowany czy nieusieciowany, lub dalej ulec konwersji do polimeru fibryny II. Zatem, ponieważ tworzenie polimeru fibryny I z monomeru fibryny I jest spontaniczne, polimer fibryny I może być utworzony bez trombiny i czynnika XIII, przez co unika się problemów związanych z
176 202 trombiną bydlęcą. (Należy zauważyć, że jeśli monomer fibryny Ijest stosowany tak, że wchodzi on w kontakt z krwią pacjenta, na przykład na ranie, trombiną i czynnik ΧΠΙ pacjenta mogą spowodować konwersję polimeru fibryny I do usieciowanego polimeru fibryny Π).
Jako fibrynę nieusieciowaną kompozycja zawiera dowolną postać fibryny. Do nieograniczających przykładów nieusieciowanej fibryny należą nieusieciowana fibryna I, nieusieciowana fibryna Π i fibryna des BB, przy czym preferowana jest nieusieciowana fibryna I. Oczywiście kompozycja może zawierać mieszaniny nieusieciowanej fibryny. Dla celów niniejszego wynalazku określenie fibryna usieciowana obejmuje również dowolną formę fibryny, otrzymaną przez konwersję nieusieciowanej fibryny w fibrynę usieciowaną. Zatem jako usieciowana fibryna, otrzymana na przykład w wyniku konwersji nieusieciowanej fibryny I w fibrynę usieciowaną, może być stosowana usieciowana fibryna I i/lub usieciowana fibryna Π, zależnie od tego, jak jest przeprowadzany etap konwersji.
Nieusieciowana fibryna I jest preferowana, ponieważ w porównaniu z fibrynogenem jej konwersja do fibryny usieciowanej jest łatwiejsza. W istocie, uważa się, że fibryna I może tworzyć usieciowaną fibrynę I, która może działać jako spoiwo fibrynowe. Zatem tworzenie usieciowanej fibryny I z nieusieciowanej fibryny I może być przeprowadzone bez trombiny, dzięki czemu unika się problemów związanych z trombiną bydlęcą, jakkolwiek może być niezbędny aktywowany czynnik ΧΠΙ. (Należy zauważyć, że jeśli nieusieciowana fibryna I jest stosowana tak, że wchodzi ona w kontakt z krwią pacjenta, na przykład na ranie, trombiną i czynnik ΧΙΠ pacjenta mogą przekształcić fibrynę I w usieciowaną fibrynę Π).
Nieusieciowana fibryna może być polimerem, oligomerem lub monomerem, jakkolwiek preferowany jest oligomer lub monomer, to jest monomer fibryny. Jest to związane z faktem, że nieusieciowana fibryna w postaci polimerycznej jest na ogół żelem, a zatem bardzo trudne jest dostarczenie jej do żądanego miejsca i daje ona mniej bliski kontakt z komórkami w żądanym miejscu. W przeciwieństwie do tego uzyskana fibryna nieusieciowana w postaci oligomerycznej lub monomerycznej jest rozpuszczalna i może być zatem łatwiej dostarczana do żądanego miejsca i zapewnia bliższy kontakt z komórkami. Oczywiście kompozycja może zawierać mieszaninę takich form nieusieciowanej fibryny.
Źródłem kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę może być dowolne znane źródło jeśli tylko monomer fibryny może być przekształcony w polimer fibryny lub nieusieciowana fibryna może być przekształcona w fibrynę usieciowaną. Do nieograniczających przykładów kompozycji zawierających monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę należą krew, korzystnie krew ssaków a jeszcze bardziej korzystnie krew ludzka, hodowle komórkowe wydzielające fibrynogen oraz fibrynogen rekombinacyjny, przy czym korzystna jest krew. Krew może mieć dowolną postać, na przykład może być to krew pełna lub preparowane preparaty fibrynogenu. Krew może być również zastosowana do wytwarzania autologicznych spoiw fibrynowych.
Zaobserwowano, że kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę I w postaci monomeru fibryny I albo polimeru fibryny I, przygotowana z krwi pełnej w sposób opisany poniżej, może być przekształcona w usieciowaną fibrynę Π bez dodawania trombiny, czynnika ΧΠΙ ani innych substancji niezbędnych do koagulacji krwi!. Uważa się, że jest to związane z faktem, że kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę I, przygotowana z krwi pełnej zatrzymuje wystarczające ilości protrombiny, czynnika ΧΙΠ i takich innych substancji niezbędnych z osocza, że nieusieciowana fibryna I może być przekształcona w usieciowaną fibrynę Π bez dodawania egzogennej trombiny i czynnika XHI. Ta endogenna protrombina i czynnik ΧΙΠ mogą być wykorzystane w spoiwie fibrynowym jako komponenty kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę.
Jednakże należy zauważyć, że endogenna trombiną i czynnik ΧΠΙ nie są zatrzymywane w ilościach wystarczających do konwersji fibrynogenu w usieciowaną fibrynę Π z szybkością reakcji odpowiednią dla spoiwa fibrynowego. Uważa się, że do konwersji fibrynogenu w usieciowaną fibryną Π potrzeba jest więcej trombiny niż do przekształcenia nieusieciowanej fibryny I w usieciowaną fibrynę Π przy równoważnej szybkości reakcji.
Każde z tych trzech źródeł zawiera fibrynogen, który może być przekształcony w monomer fibryny lub w fibrynę nieusieciowaną. Poza takim etapem konwersji uzyskana kompozycja
176 202 zawierająca monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę musi być w formie zagęszczonej. Korzystnie stężenie monomeru fibryny jest nie niższe niż około 10 mg/ml, bardziej korzystnie wynosi od około 20 mg/ml do około 200 mg/ml, jeszcze bardziej korzystnie od około 20 mg/ml do około 100 mg/ml, a najbardziej korzystnie od około 25 mg/ml do około 50 mg/ml.
Ponadto korzystnie monomer fibryny lub nieusieciowana fibryna są niedynamiczne. Dla celów niniejszego wynalazku określenie niedynamiczna kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę oznacza, że nieusieciowana fibryna w takiej kompozycji nie sieciuje się przez co najmniej około 1,5 minuty, korzystnie przez co najmniej około 3 minuty, a najbardziej korzystnie przez co najmniej około 30 minut po przygotowaniu takiej kompozycji. Dla celów niniejszego wynalazku określenie niedynamiczna kompozycja zawierająca monomer fibryny oznacza, że monomer fibryny w takiej kompozycji nie polimeryzuje przez co najmniej około 1,5 minuty, korzystnie przez co najmniej około 3 minuty, bardziej korzystnie przez co najmniej około 30 minut, a jeszcze bardziej korzystnie przez co najmniej około 2 godziny po przygotowaniu takiej kompozycji. W istocie, należy zauważyć, że kompozycja zawierająca monomer fibryny może być niedynamiczna przez co najmniej kilka dni, to jest około 72 godziny po jej przygotowaniu!
Kompozycja zawierająca monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę może być otrzymana z krwi. W wyniku tej metody uzyskuje się polimer fibryny połączony wiązaniami wodorowymi, który jest formą nieusieciowanej fibryny. Taki polimer może być następnie wykorzystany jako komponent spoiwa fibrynowego lub przekształcony w monomer fibryny metodą określaną jako solubilizacja, tak jak to opisano poniżej. Korzystne jest również przygotowywanie kompozycj i zawieraj ącej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w j ałowym środowisku.
Kompozycje zawierające monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę mogą być otrzymane z krwi pełnej przez pobranie krwi od dawcy, korzystnie w obecności antykoagulanta. Może być zastosowany dowolny antykoagulant. Nieograniczającymi przykładami antykoagulantów są heparyna, EDTA, hirudyna, cytrynian lub dowolny inny czynnik, który może bezpośrednio lub pośrednio zapobiegać tworzeniu trombiny, przy czym korzystny jest cytrynian.
Następnie z krwi pełnej wydziela się osocze, które zawiera fibrynogen. Może być zastosowana dowolna technika separacji, na przykład sedymentacja, wirowanie lub filtracja. Wirowanie może być przeprowadzone przy około 3000 g przez około 10 minut. Jednakże jeśli pożądane jest otrzymywanie osocza bogatego w płytki, wirowanie może być prowadzone przy niższej sile g, na przykład 500 g przez około 20 minut. Supematant, który zawiera osocze, może być wydzielony zwykłymi technikami.
Filtracja może być prowadzona przez przepuszczenie krwi pełnej przez odpowiedni filtr, który rozdziela krwinki od osocza. Korzystnie jako filtrat stosuje się membranę mikroporowatą, charakteryzującą się dobrą przepuszczalnością białka.
Następnie na uzyskane osocze działa się tak, aby przeprowadzić konwersję fibrynogenu w monomer fibryny lub w nieusieciowaną fibrynę. Konwersja ta może być prowadzona dowolną znaną techniką.
Korzystnie monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę wytwarza się za pomocą enzymu trombino-podobnego, co obejmuje trombinę. Enzymem trombino-podobnym jest każdy enzym, który może katalizować tworzenie fibryny z fibrynogenu. Typowym źródłem enzymów trombino-podobnych są jady węży. Korzystnie enzym trombino-podobny oczyszcza się z jadu węża. Zależnie od doboru enzymu trombino-podobnego taki enzym trombino-podobny może uwalniać fibrynopeptyd A, który tworzy fibrynę I, fibrynopeptyd B, który tworzy fibrynę des BB lub zarówno fibrynopeptyd A jak i B, które tworzą fibrynę II. Należy zauważyć, że te enzymy trombino-podobne, które uwalniają fibrynopeptyd A i B mogą robić to z różnymi szybkościami. Zatem uzyskana kompozycja może być na przykład mieszaniną fibryny II i fibryny I lub mieszaniną fibryny II i fibryny des BB.
Tabela I przedstawia nieograniczającą listę źródeł jadów węży, które mogą być wykorzystane do wytwarzania kompozycji nazwę enzymu trombino-podobnego oraz fibrynopeptyd(y), uwalniane przez działanie enzymem.
176 202
Tabela I
Źródło Nazwa Uwalniany fibrynopeptyd
AgUstiOdon acutus Acutin A
A.contOTtrix contortrk Venzyme B, (A)*
A. halys Pallas B, (A)*
A. (Calloselasma) rhodostoma Ancrod, Arvin A
Botorops asper (B.atrox) Asperase A
B Atrox Batroxobin, Reptilase-Reagent A
B. insularis A, B
B. jararaca Botropase A
B. Moojeni (B.Atrox) Batroxobin, Defibrase A
Lachesis muta muta A, B
Crotalus adamanteus Crotalase A
C. durissus terrificus A
Trimeresurus flavovindis Flavoxobin A
T. gramineus A
Bitis gabonica Gabonase A, B
* () oznacza niską aktywność
Przegląd enzymów trombino-podobnych z jadów węży przedstawili H. Pirkle i K. Stocker w Thrombosis and Haemostasis, 65(4):444-450 (1991).
Korzystnymi enzymami trombino-podobnymi są Batroksobin, zwłaszcza z B. Moojeni, B. Maranhao i B. atrox oraz Ancrod, zwłaszcza z A. rhodostoma.
Monomer fibryny lub nieusieciowana fibryna mogą być otrzymane przez kontaktowanie osocza z enzymem trombino-podobnym, przez co umożliwia się przekształcenie fibrynogenu z osocza w monomer fibryny. Jednakże uzyskany monomer fibryny spontanicznie polimeryzuje, tworząc polimer związany wiązaniami wodorowymi w postaci żelu, który oddziela się od pozostałego osocza, które jest roztworem. Żel jest formą kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.
Ten żel nieusieciowanej fibryny może być zebrany na przykład przez wirowanie (3000 g przez 10 minut), bezpośrednie ręczne oddzielenie od nieusieciowanej fibryny z osocza, filtrację bezpośrednio lub pod ciśnieniem, a następnie usunięcie oddzielonego osocza. (Może być wykorzystany filtr o wielkości porów 1-100 pm, na przykład filtr ze spiekanego polipropylenu o wielkości porów 20 pm z Porex Inc., filtr teflonowy o wielkości porów 20 - 70 pm z Fluorotechniąues Inc. lub filtr z nylonu 66 o wielkości porów 22 - 46 pm z Costar Inc.).
W wyniku tego zebrania oddziela się żel nieusieciowanej fibryny od osocza, które jest roztworem, zatęża żel nieusieciowanej fibryny w stosunku do osocza. Należy zauważyć, że żel nieusieciowanej fibryny zatrzymuje co najmniej część protrombiny, czynnika XIII i takie inne niezbędne substancje z osocza, że nieusieciowana fibryna I może być przekształcona w usieciowaną fibrynę II bez dodawania egzogennej trombiny lub czynnika XnI. Ta endogenna protrombina i czynnik XIII mogą być wykorzystane w spoiwie fibrynowym jako komponenty kompozycji monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę.
Od siły wirowania lub ciśnienia filtracji podczas zbierania zależy, jak dużo osocza zostanie usunięte z żelu nieusieciowanej fibryny, zaś im wyższa taka siła lub ciśnienie, tym bardziej zatężony jest uzyskany żel nieusieciowanej fibryny. Jednakże korzystne jest, aby taka siła lub ciśnienie nie były tak wysokie, aby spowodować usunięcie protrombiny lub czynnika XIII z żelu nieusieciowanej fibryny.
Żel nieusieciowanej fibryny jest obecnie gotowy do użycia jako komponent spoiwa fibrynowego jako forma kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Zaobserwowano, że gdy taką kompozycję otrzymuje się z krwi pełnej, to w kompozycji obecne jest od około 60% do około 90% pierwotnego fibrynogenu, ale oczywiście w formie nieusieciowanej fibryny.
176 202
Kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę może być wykorzystana bezpośrednio po jej przygotowaniu. W istocie szczególnie korzystne jest wykorzystanie takiej kompozycji bezpośrednio po jej przygotowaniu gdy kompozycja jest autologiczna. Jeśli kompozycja nie zostanie wykorzystana bezpośrednio po jej przygotowaniu, może być przechowywana. Przechowywanie kompozycji wymaga, aby kompozycja była konserwowana przez na przykład zamrożenie lub liofilizację kompozycja lub przechowywanie kompozycji w 4°C. Kompozycja w postaci zamrożonej lub liofilizowanej będzie trwała przez miesiące. Jeśli kompozycja będzie przechowywana 4°C, będzie trwała przez okres co najmniej dni.
Jeśli kompozycja zostanie zamrożona, przed użyciem musi zostać rozmrożona.
Technika ta, której skutkiem jest utworzenie żelu nieusieciowanej fibryny, powoduje konwersję fibrynogenu w żel nieusieciowanej fibryny i zatężenie takiego żelu w jednym etapie. Alternatywnie, ale mniej korzystnie, można zatężyć fibrynogen za pomocą zwykłych technik, na przykład przez krioprecypitację i precypitację przy użyciu różnych reagentów, na przykład glikolu polietylenowego, eteru, etanolu, siarczanu amonu lub glicyny. Zatężony fibrynogen może być następnie przekształcony w żel nieusieciowanej fibryny za pomocą technik opisanych powyżej, lub korzystnie, ponieważ fibrynogen jest już zatężony, fibrynogen może być następnie przekształcony w kompozycję zawierającą monomer fibryny bez potrzeby tworzenia najpierw żelu nieusieciowanej fibryny. Może to być przeprowadzone przez kontaktowanie zatężonego fibrynogenu z czynnikiem chaotropowym z utworzeniem roztworu fibrynogenu.
Czynnik chaotropowy jest niezbędny dla zapobieżenia spontanicznej polimeryzacji monomeru fibryny, który tworzy się w wyniku kontaktu fibrynogenu z enzymem trombino-podobnym. Czynnik chaotropowy miesza się z kompozycją fibrynogenu, a następnie miesza przez około 1 do 2 minut, otrzymując roztwór fibrynogenu. Następnie fibrynogen może być poddany konwersji do monomeru fibryny za pomocą na przykład enzymu trombino-podobnego jak opisano powyżej lub za pomocą enzymu trombino-podobnego immobilizowanego na podłożu, jak opisano poniżej.
Do odpowiednich czynników chaotropowych należą mocznik, bromek sodu, chlorowodorek guanidyny, KCNS, jodek potasu i bromek potasu. Korzystne stężenie molowe czynnika chaotropowego wynosi od około 0,2 do około 6,0 a najbardziej korzystnie od około 0,3 do około 2,0. Korzystnie czynnik. się w naamniejszee mt^^żLiwiej ilości, zapobiegającej jeszcze spontanicznej polimeryzacji monomeru fibryny.
Należy zauważyć, że korzystnie do czynnika chaotropowego nie dodaje się źródła jonów wapnia dopóki nie jest potrzebna konwersja monomeru fibryny w polimer fibryny, jak opisano poniżej. Zapewnia to, że monomer fibryny nie będzie sieciowany w związku z aktywacją jakiegokolwiek z endogennych czynników koagulacji krwi.
W korzystnej postaci enzym trombino-podobny jest immobilizowany na nośniku. Taka postać jest korzystna, ponieważ można łatwo oddzielić immobilizowany enzym od osocza, zapobiegając przez to zanieczyszczeniu enzymem kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.
W niniejszym wynalazku może być wykorzystany każdy nośnik, do którego może być przyłączony enzym trombino-podobny. Do nieograniczających przykładów odpowiednich nośników należą celuloza, polidekstrany, agaroza, polistyreny, krzemionka, kwasy poliakrylowe, poliakryloamidy, alkohole poliwinylowe, perełki szklane, policzterofluoroetylen, poliwęglany, kolagen, pochodne celulozy i ich kompozyty, przy czym korzystne są krzemionka, polistyren i agaroza, a najbardziej korzystna jest agaroza.
W innej korzystnej postaci enzym trombino-podobny jest przyłączony do nośnika, który jest filtrem lub na jednej stronie filtra i przyłączony do innego nośnika, na przykład perełek. W przeciwnym razie enzym trombino-podobny przejdzie przez filtr. Zatem wielkość porów filtra powinna być taka, aby immobilizowany enzym trombino-podobny nie mógł przejść przez filtr, ale nieusieciowana fibryna mogła przejść przez filtr. Nieusieciowaną fibrynę otrzymuje się przez kontaktowanie osocza z enzymem trombino-podobnym na jednej stronie filtra z utworzeniem monomeru fibryny, który razem z resztą osocza przechodzi przez filtr. Zatem konieczne jest, aby uzyskana kompozycja, zawierająca nieusieciowana fibrynę, była oddzielana od enzymu trombi176 202 no-podobnego. Monomer fibryny po przejściu przez filtr spontanicznie polimeryzuje z utworzeniem polimeru nieusieciowanej fibryny.
W celu immobilizowania enzymu trombino-podobnego na nośniku nośnik musi być aktywowany. Można tego dokonać dowolną z odpowiednich technik. Na przykład różnymi dostępnymi grupami aktywującymi do derywatyzacji nośników są: grupy diazoniowe, grupy izocyjannianowe, grupy chlorków kwasowych, grupy bezwodników kwasowych, grupy chlorków sulfonylowych, grupy dinitrofluorofenylowe, grupy izotiocyjanianowe, grupy hydroksylowe, grupy aminowe, grupy N-hydroksysukcynoimidowe, grupy triazynowe, grupy hydrazynowe, grupy karbodiimidowe, grupy silanowe i bromek cyjanogenu. Techniki te są opisane na przykład w opisie patentowym niemieckim nr 2440254 firmy Pentapharm oraz w P.D.G. Dean, W.S. Johnson i F.A. Middle (edytorzy) Affinity Chromatography - A Practical Approach, rozdział 2, Activation Procedures, 1991, IRL Press Offord.
Korzystnie jako grupy aktywujące stosuje się grupy hydrazydowe. W wyniku zastosowania nośników aktywowanych hydrazydem uzyskuje się najwyższe procentowo utrzymanie aktywności enzymu trombino-podobnego przy w zasadzie braku wypłukiwania enzymu (co najmniej około 30% do około 50%, zmierzone za pomocą techniki S2238, patrz Axelsson G. et al., Thromb. Haemost., 36:517 (1976). W celu zapobieżenia degradacji enzymu mogą być również wykorzystane niskie wartości pH, na przykład pH 4-6.
Generalnie nośnik aktywuje się związkiem silnie reaktywnym, który następnie reaguje z grupą funkcyjną ligandu, na przykład -OH, -NH2, -SH, -COOH, -CHO, z utworzeniem wiązania kowalencyjnego. Korzystnymi technikami aktywacji do stosowania w wynalazku są techniki:
(a) z wykorzystaniem grup triazynowych, a korzystnie grup triazynohalogenkowych;
(b) z wykorzystaniem grupy chlorku tresylu;
(c) z wykorzystaniem grupy karbonylodiimidazolu;
(d) z wykorzystaniem grupy bromku cyjanogenu; i (e) z wykorzystaniem grupy hydrazydowej lub aminowej. W technikach (a)-(d) białko sprzęga się za pomocą reakcji z grupami -NH2, -SH lub -OH, natomiast w technice (e) białko sprzęga się poprzez utlenioną grupę węglowodanową, to jest -CHO. Przy użyciu tych technik uzyskuje się maksymalne procentowe zatrzymanie aktywności enzymu trombino-podobnego (co najmniej około 30% do około 50%, mierzone techniką S2238) przy prawie całkowitym braku wypłukiwania.
Do aktywacji triazyną stosuje się dwie różne metody. Pierwsza metoda polega na połączeniu pierścienia triazynowego bezpośrednio z powierzchniowymi grupami OH. Jest to metoda podobna do metody aktywacji CNBr, gdzie powierzchniowe grupy diolowe reagują z CNBr. Przy aktywacji triazynowej grupy OH z agarozy reagują z triazyną (chlorkiem cyjanurowym).
Generalnie nośnik aktywuje się silnie reaktywnym związkiem, który następnie reaguje z grupą funkcyjną ligandu, na przykład -OH, -NH2, -SH, -CHO, tworząc wiązanie kowalencyjne. Pozostałe grupy reaktywne, które nie mają przyłączonego enzymu trombino-podobnego mogą być zablokowane związkami niereaktywnymi, takimi jak etanoloamina, bezwodnik octowy lub glicyna, ale nie jest to konieczne.
Korzystnymi technikami aktywacji do wykorzystania w niniejszym wynalazku są:
(a) Aktywacja bromkiem cyjanogenu, a następnie bezpośrednie sprzężenie enzymu poprzez grupy NH2 białka.
(b) Aktywacja nośnika za pomocą monochlorotriazyny, a następnie sprzężenie enzymu poprzez grupy -NH2, -OH lub -SH.
(c) Aktywacja nośnika dichlorotriazyną, a następnie sprzężenie enzymu poprzez grupy -NH2, -OH lub -SH.
(d) Aktywacja nośnika chlorkiem trezylu, a następnie sprzężenie enzymu poprzez grupy -NH2, -OH lub -SH.
(e) Aktywacja nośnika hydrazydem kwasu adypinowego lub hydrazyną, a następnie sprzężenie utlenionego enzymu poprzez grupy -CHO.
(f) Aktywacja nośnika ligandem aminowym, a następnie sprzężenie utlenionego enzymu poprzez grupy -CHO.
17(5202
We wszystkich powyższych korzystnych metodologiach jako nośnik stosuje się agarozę, jednakże możliwejest stosowanie krzemionki. Przy użyciu tego nośnika korzystnymi technikami aktywacji są:
(a) Aktywacja gamma-glicydoksypropylotrimetoksysilanem z bezpośrednim sprzężeniem enzymu trombino-podobnego poprzez grupy -NH2 białka.
(b) Aktywacja bromkiem cyjanogenu, a następnie bezpośrednie sprzężenie enzymu poprzez grupy -NH2 na białka.
(c) Aktywacja gamma-glicydoksytrimetoksysilanem, a następnie otwarcie pierścienia epoksydowego z utworzeniem grupy diolowej, która może być następnie aktywowana za pomocą bromku cyjanogenu. Bezpośrednie sprzężenie enzymu można przeprowadzić poprzez grupy -NH2 białku.
(d) Aktywacja gamma-glicydoksypropylotrimetoksysilanem, a następnie otrzymanie aminokrzemionki przez działanie roztworem amoniaku.
Amino-krzemionka może być następnie aktywowana chlorkiem cyjanurowym (triazyna) a enzym sprzężony poprzez grupy -NH2, -OH lub -SH.
Sprzęganie enzymu z aktywowanym nośnikiem musi być prowadzone przy odpowiednim pH w celu uzyskania optymalnego wiązania enzymu. Generalnie przy standardowych technikach aktywacji, takich jak sprzęganie enzymu z aktywowanym nośnikiem przy użyciu gammaglicydoksypropylotrimetoksysilanu i sprzęganie dowolnego białka z grupami aktywnymi przy użyciu bromku cyjanogenu wymaga buforowania na pH o 1 -2 jednostki wyższym niż pKa amin pierwszorzędowych i drugorzędowych enzymu. Jednakże zastosowanie chlorku cyjanurowego jako optymalnego aktywatora umożliwia stosowanie buforów o znacznie niższym pH (optymalne pH sprzęgania wynosi 4-6). Inna metoda sprzęgania glikoprotein, takich jak batroxobin, z obojętnym nośnikiem polega na wykorzystaniu ich grup węglowodanowych. Polega to na najpierw utlenieniu grup cukrowych do grup -CHO, a następnie bezpośrednim sprzężeniu przy pH kwasowym z grupą aminową, taką jak w hydrazydzie. Można stosować szeroki zakres buforów do sprzęgania. Przykłady takich buforów są przedstawione w tabeli 2.
Tabela 2
Przykłady buforów do sprzęgania stosowanych do immobilizacji enzymu z nośnikiem krzemionkowym i agarozowym
Nośnik Metoda aktywacji Bufor do sprzęgania
Krzemionka gamma-glicydoksypropylotrimetoksysilan 0,1M wodorowęglan sodu pH 8-9,10 mM HEPES pH 7,0
Krzemionka gamma-glicydoksypropylotrimetoksysilan + bromek cyjanogenu 0,1M wodorowęglan sodu pH 8-9,10 mM HEPES pH 7,0
Krzemionka bromek cyjanogenu Woda pH 7,0 0,1M wodorowęglan sodu pH 79,10 mM HEPES pH7,0
Agaroza monochlorotriazyna 50 mM octan sodu/ 1M NaCl, pH 4,0
Agaroza dichlorotriazyna 0,1 M fosforan potasu/ 1M NaCl, pH 8,0-9,0
Agaroza chlorek trezylu 50 mM fosforan potasu/ 0,5 M NaCl, pH 7,7
Agaroza hydrazyd 50 mM octan sodu pH 5,5 10 mM NaBH4
Agaroza amina 50 mM octan sodu pH 5,5 10 mM NaBH4
Po aktywacji nośnika będzie posiadał więcej miejsc aktywnych niż jest wymagane do sprzęgania z enzymem. Miejsca te, jeśli nie zostaną zdezaktywowane, mogą wiązać kowalencyjnie zanieczyszczające białka, które mogą wpływać nafunkcję biologiczną immobilizowanego enzymu.
176 202
Nadmiar grup można zdezaktywować poprzez kowalencyjne związanie małych, nieinterferujących amin, takich jak etanoloamina.
Jeśli stosuje się nośniki aktywowane hydrazydem lub aminą, zablokowanie resztkowych grup reaktywnych po sprzęganiu z enzymem można przeprowadzić przy użyciu bezwodnika octowego. .... .
Zależnie od metody immobilizacji oraz nośnika, podczas procesu immobilizacji zachodzi inaktywacja enzymu. Przy użyciu nośnika krzemionkowego i najbardziej korzystnej techniki aktywacji (to jest bromku cyjanogenu) traci się do 80-90% aktywności enzymatycznej. Jednakże przy zastosowaniu jako nośnika agarozy straty aktywności enzymatycznej są mniejsze.
W celu scharakteryzowania efektywności enzymu immobilizowanego na nośniku mogą być wykorzystane dwie metody oceny: Oznaczenie czasu tworzenia skrzepu (Ciot Time Assay) Clauss A., Acta Haematologica., 17:237 (1957) oraz oznaczenie S2238 - patrz Axelsson G. et al., Thromb. Haemost., 36:517 (1976).
W celu oszacowania wypłukiwanie enzymu z nośnika może być zastosowane oznaczenie opisane poniżej.
Wypłukiwanie enzymu można oznaczyć przez radioznakowanie enzymu trombino-podobnego na przykład za pomocą I25 batroxobinu. Jednakże przed przeprowadzeniem oznaczenia wypłukiwania niezbędne jest usunięcie całego niezwiązanego radioznacznika. Można to przeprowadzić przez kolejne przemywanie nośnika następującymi roztworami: 50 ml 50 mM octan sodu o pH 5,5,100 ml 50 mM glicynaOM chlorek sodu o pH 3,0,100 ml 50 mM węglan sodu/lM chlorek sodu o pH H0,<^, 100 ml 50 mM fosforan sodu/l M chlorek sodu o pH 7,0,100 ml wody i 100 ml 50 mM fosforan sodu/lM chlorek sodu o pH 7,0. Po takiej procedurze przemywania w przemywkach nie wykrywa się radioznacznika, zaś > 50% początkowo użytego radioznacznika jest sprzężone z nośnikiem.
Wymagana ilość enzymu
Ilość enzymu wymagana do obróbki 30-70 ml osocza (uzyskanego z 60-150 ml krwi pełnej) wynosi 30-200 jednostek po mieszaniu przez około 10-15 minut.
Jeśli jako matrycę nośnika stosuje się agarozę, przy użyciu 30-200jednostek batroxobinu nieusieciowana fibryna tworzy się po około 7-20 minutach. W tym systemie stosuje się aktywację hydrazydem i 0,25 g -1,0 g suchej agarozy. W tym przypadku nie jest wymagane blokowanie pozostających grup aktywnych.
Reakcja immobilizowanego enzymu zjibrynogenem. osocza
Generalnie reakcję immobilizowanego enzymu z fibrynogenem z osocza przeprowadza się w sposób następujący: do znanej ilości wysuszonego nośnika, zawierającego immobilizowany enzym trombino-podobny dodaje się 30-70 ml osocza. Zawiesinę miesza się delikatnie (wirowanie w mikserze spiralnym lub mieszanie ręczne) przez około 7-20 minut. Przez ten czas fibrynogen z osocza ulega rozszczepieniu przez immobilizowany enzym, uwalniając fibrynopeptyd A i/lub fibrynopeptyd B, z utworzeniem związanego wiązaniami wodorowymi polimeru fibryny I, związanego wiązaniami wodorowymi polimeru fibryny des BB lub związanego wiązaniami wodorowymi polimeru fibryny II, przy czym każdy z polimerów jest połączony z immobilizowanym enzymem.
Jak opisano powyżej, związany wiązaniami wodorowymi polimer fibryny ma postać żelu i może być zebrany na przykład przez wirowanie (3000 g przez 10 minut) lub filtrację (przez filtr membranowy 1 - 50 jxm). Takie zebranie powoduje oddzielenie związanego wiązaniami wodorowymi polimeru fibryny od osocza i w związku z tym zagęszczenie polimeru.
Należy zauważyć, żejeśli stosuje się enzym trombino-podobny, w wyniku czego następuje aktywacja czynnika Xni, to korzystne jest modyfikowanie kompozycji osocza w czasie stosowania enzymu trombino-podobnego w celu zapobieżenia tworzeniu się usieciowanej fibryny, na przykład usieciowanej fibryny I lub II z nieusieciowanej fibryny, na przykład nieusieciowanej fibryny I lub II. Oczywiście może być niezbędne modyfikowanie kompozycji osocza jeśli kompozycja ta jest wykorzystywana jako spoiwo fibrynowe bezpośrednio po przekształceniu fibrynogenu w nieusieciowaną fibrynę.
Kompozycja osocza może być modyfikowana w celu zapobieżenia sieciowania nieusieciowanej fibryny za pomocą dowolnej znanej techniki. Można to przeprowadzić przez blokowa12
176 202 nie endogennej trombiny, która może aktywować czynnik XIII, na przykład za pomocą hirudyny lub inhibitorów trombiny, lub przez blokowanie działania aktywowanego czynnika XIII, na przykład za pomocą metali ciężkich (Hg), tiomerosalu lub przeciwciał hamujących. Sieciowanie fibryny I lub II wymaga obecności jonów wapnia. Zatem jeśli z kompozycji osocza usunie się wapń, sieciowanie fibryny I lub II może być zahamowane. Patrz Carretal., J. Biochem., 239:513 (1986); Kamiński etal., J. Biol. Chem. 258:10530 (1983) oraz Kanaide etal., 13:229 (1982). W celu zapobieżenia sieciowaniu fibryny I lub II do kompozycji mogą być dodane chelatory wapnia. Takie chelatory wiążą się z wapniem, zapobiegając w ten sposób sieciowaniu. Może być zastosowany każdy chelator wapnia. Do nieograniczających przykładów chelatorów wapnia należą kwas cytrynowy, kwas scharynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), kwas nitrylotri-octowy (NTA), kwas hydrokjyetylenodiaminotriostowy (HEEDTA), kwas etylenodiαminf-[o-hydroksyfenyloostowy] (EDDHA), kwas etylenoglikolobis-(2-aminoetyloetero)tetraoctowy (EGTA), kwas dictylenotriaminopentaostowy (DTPA) kwas 1,2-diamino cykloheksanotetraoctowy (DCTA), N,N-bishydroksyetyloglicyna, kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) i kwas N-hydroksyetyloiminodioctowy (HIMDA) i ich sole, przy czym korzystne są sole kwasu cytrynowego.
W niniejszym wynalazku może być wykorzystana każda hodowla komórkowa, wydzielająca fibrynogen. Fibrynogen w hodowli komórkowej może być przekształcony w monomer fibryny lub w nieusieciowaną fibrynę za pomocą takich samych technik jak opisane powyżej w odniesieniu do osocza. Jednakże przed taką konwersją korzystne jest usunięcie resztek ścian komórkowych.
Proces może być prowadzony w sposób następujący: komórki HEPG2 namnaża się i utrzymuje w sposób opisany w standardowych tekstach dotyczących hodowli komórek ssaków. Patrz również Liu et al, Cytoteshnology, 5:129-139 (1991). Komórki posiewa się w kolbach w minimalnej pożywce podstawowej zawierającej 10% surowicy cielęcej i buforowanej 5% CO2 przy stosunku rozszczepienia między 1:4 a 1:8.
Po 24-36 godzinach wzrostu w 37°C pożywkę usuwa się i zastępuje pożywką pozbawioną surowicy, zawierającą odpowiedni inhibitor proteazy i 2 j.m./ml heparyny. Hodowlę kontynuuje się przez następne okresy 24-godzinne z kolejnymi trzema zmianami pożywki pozbawionej surowicy.
Kondycjonowaną pożywkę wiruje się przy 3000 g przez 10 minut w celu usunięcia wszelkich resztek komórkowych, a sklarowany supernatant zawierający fibrynogen miesza się następnie delikatnie z enzymem trombino-podobnym przez 4-5 godzin. Korzystnie enzym trombino-podobny immobilizuje się. Odpowiedni stosunek ustalonej objętości agarozy-enzym trombino-podobny na 500 ml pożywki wynosi od około 1,0 ml do około 50 ml. Jak opisano powyżej, można stosować nośniki inne niż agaroza. Uzyskany monomer fibryny spontanicznie polimeryzuje i jest oplątywany wokół nieruchomego nośnika.
Supernatant, który teraz nie zawiera fibrynogenu, dekantuje się od koniugatu nośnik/żel fibryny, który następnie przemywa się kolejno czterokrotnie zmienianym 0,15M NaCl przy stosunku od około 10 ml do około 100 ml na 1,0 ml początkowo ustalonej objętości nośnika. Przemyty żel następnie odwadnia do połowy objętości, stosując lejek ze spiekanego szkła pod próżnią.
Zastosowanie hodowli komórkowych, które wydzielają fibrynogen jest szczególnie korzystne gdy stosuje się kompozycję zawierającą monomer fibryny. Jest to spowodowane tym, że uważa się, iż taka kompozycja może być zastosowana z utworzeniem polimeru fibryny, mającego zastosowanie jako spoiwo fibrynowe niezależnie od tego, czy polimer fibryny ulega ostatecznie sieciowaniu. Zatem, ponieważ takie hodowle komórkowe nie zawierają czynnika XIH, który ma znaczenie podstawowe dla sieciowania, do wytworzenia efektywnego spoiwa fibrynowego nie będzie potrzebny egzogenny czynnik XIII.
Kompozycja nieusiesiowanej fibryny może być również otrzymana z fibrynogenu rekombinacyjnego. Ostatnio fibrynogen wytworzono technikami rekombinacyjnymi. Patrz 5. Roy et al., The joumal of Biological Chemistry, 266:4758-4763 (1991). Roy i współpr. wydają się być pierwszą grupą, której udało się uzyskać ekspresję wszystkich trzech łańcuchów fibrynogenu oraz nauczyć komórki COS ekspresji, łączenia i wydzielania łańcuchów w formie, która posiada
176 202 zdolność tworzenia skrzepu indukowanego przez trombinę. Uzyskana kompozycja fibrynogenowa może być następnie wykorzystana do wytworzenia kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę przy użyciu technik opisanych powyżej w odniesieniu do hodowli komórkowych wydzielających fibrynogen. Jednakże korzystnie przed utworzeniem kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę resztki komórkowe usuwa się za pomocą technik opisanych powyżej w odniesieniu do hodowli komórkowych. Resztki komórkowe mogą być usunięte przez wirowanie lub filtrację.
Zastosowanie fibrynogenu rekombinacyjnego jest szczególnie korzystne gdy stosuje się kompozycję zawierającą monomer fibryny. Jest to spowodowane tym, że uważa się, że taka kompozycja jest przydatna jako spoiwo fibrynowe niezależnie od tego czy polimer fibryny ostatecznie ulega sieciowaniu. Ponieważ hodowla komórkowa fibrynogenu rekombinacyjnego nie zawiera czynnika XIII, który ma znaczenie podstawowe dla sieciowania, do wytworzenia efektywnego spoiwa fibrynowego nie będzie potrzebny egzogenny czynnik XIII.
W wyniku konwersji fibrynogenu do nieusieciowanej fibryny za pomocą na przykład enzymu trombino-podobnego tworzy się fibryna w postaci polimeru związanego wiązaniami wodorowymi. Jednakże jak omówiono powyżej, korzystne jest aby kompozycja zawierała nieusieciowaną fibrynę i dla kompozycji zawierającej monomer fibryny znaczenie podstawowe ma, aby miała ona formę oligomeryczną lub monomeryczną. Można to przeprowadzić przez solubilizację kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.
Solubilizacja jest szczególnie korzystna gdy nieusieciowaną fibrynę otrzymuje się przy udziale enzymu trombino-podobnego immobilizowanego na nośniku. Jest to spowodowane tym, że w wyniku użycia enzymu trombino-podobnego immobilizowanego na nośniku generalnie otrzymuje się związany wiązaniami wodorowymi polimer nieusieciowanej fibryny zasocjowany z takim immobilizowanym nośnikiem. A zatem, ponieważ korzystne jest aby otrzymywana kompozycja nie zawierała nośnika, solubilizacja umożliwia również usunięcie z kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę nośnika razem z immobilizowanym enzymem.
Solubilizacja może być prowadzona za pomocą dowolnej znanej techniki, w wyniku której otrzymuje się monomer fibryny. Solubilizacja może być prowadzona przez kontaktowanie kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę z odpowiednim roztworem bufora kwasowego, korzystnie bufora kwasowego mającego pH poniżej około 5, a korzystnie od około 1 do około 5. Do nieograniczających przykładów odpowiednich roztworów buforów kwasowych należą kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas glukuronowy, kwas cysteinowy, kwas krotonowy, kwas itakonowy, kwas glutaminowy, kwas mrówkowy, kwas asparaginowy, kwas adypiowy i ich sole, przy czym korzystne są kwas bursztynowy, kwas asparaginowy, kwas adypinowy i sole kwasu octowego, a najbardziej korzystny octan sodu. Zaobserwowano, że korzystne bufory kwasowe funkcjonują znacznie bardziej efektywnie niż pozostałe testowane bufory kwasowe.
Korzystnie stężenie bufora kwasowego wynosi od około 0,02M do około IM, a najbardziej korzystnie od około 0,1 M do około 0,3 M. Takie korzystne stężenie czyni siłę jonową kompozycji bardziej przydatną biologicznie.
Korzystnie stosuje się najmniejszą objętość bufora kwasowego, która ciągle jeszcze solubilizuje nieusieciowaną fibrynę z utworzeniem roztworu wodnego zawierającego monomer fibryny. W wyniku tego tworzy się roztwór wodny zawierający monomer fibryny o wysokim stężeniu monomeru fibryny. Generalnie wymagane jest od około lml do około 4ml bufora kwasowego naokoło 1 ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.
Bufor kwasowy miesza się z nieusieciowaną fibryną i następnie miesza energicznie przez około 1 do 2 minut dla zapewnienia zakończenia solubilizacji.
Solubilizacja może być również prowadzona przy pH obojętnym przy użyciu czynnika chaotropowego. Do odpowiednich czynników chaotropowych należą mocznik, bromek sodu, chlorowodorek guanidyny, KCNS, jodek potasu i bromek potasu. Korzystne stężenie molowe czynnika chaotropowego wynosi od około 0,2 do około 6,0, a najbardziej korzystnie od około
3,5 do około 5,0.
Tak jak w przypadku bufora kwasowego, korzystnie stosuje się najmniejszą objętość czynnika chaotropowego, która ciągle jeszcze solubilizuje nieusieciowaną fibrynę. Generalnie
176 202 wymagane jest od około 1,0 ml do około 1,5 ml czynnika chaotropowego na około 1 ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.
Czynnik chaotropowy miesza się z taką kompozycją i następnie miesza energicznie przez około 1 do 2 minut dla zapewnienia zakończenia solubilizacji.
Zgodnie z tym w wyniku solubilizacji otrzymuje się kompozycję zawierającą monomer fibryny, a w szczególności roztwór wodny zawierający monomer fibryny. Korzystnie stężenie monomeru fibryny w roztworze wodnym jest nie niższe niż około 10 mg/ml, bardziej korzystnie wynosi od około 20 mg/ml do około 200 mg/ml, jeszcze bardziej korzystnie od około 20 mg/ml do około 100 mg/ml, a najbardziej korzystnie od około 25 mg/ml do około 50 mg/ml.
Jeśli stosuje się enzym trombino-podobny immobilizowany na nośniku, w wyniku czego taki enzym jest obecny w kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę, to po solubilizacji immobilizowany enzym może być usunięty z kompozycj i zawieraj ącej monomer fibryny .Można to przeprowadzić na przykład przez filtrację przez każdy odpowiedni filtr, który może oddzielić enzym. Do odpowiednich filtrów należą filtr ze spiekanego polipropylenu o wielkości porów 20 μιη z Porex Inc., filtr teflonowy o wielkości porów 20-70 |im z Fluorotechniąues Inc. oraz filtr z nylonu 66 o wielkości porów 22-46 fim z Costar Inc.
Alternatywny sposób zapewnienia, że w kompozycji zawierającej monomer fibryny nie jest obecny enzym trombino-podobny, na przykład baxotrobin, polega na tym, że w układzie stosuje się rozpuszczalny enzym trombino-podobny i usuwa enzym po solubilizacji polimeru fibryny związanego wiązaniami wodorowymi. Usunięcie enzymu można przeprowadzić poprzez użycie matrycy powinowactwa, na przykład w postaci ligandu związanego z obojętnym nośnikiem, który posiada specyficzne powinowactwo do enzymu trombino-podobnego lub za pomocą nośnika wymiany jonowej lub hydrofobowego lub najbardziej efektywnie przy użyciu układu biotyna-awidyna. Interakcja biotyna-awidyna charakteryzuje się jedną z najsilniejszych stałych wiązania niekowalencyjnego (Kdis =10'15 M) spotykanych w przyrodzie. Patrz E.A. Bayer i M. Wilchek, Methods in Biochemical Analysis 26:1 (1980).
W procesie tym biotynę wiąże się kowalencyjnie na przykład z batroxobinem, a koniugat biotyna-batroxobin (który jest rozpuszczalny) poddaje się bezpośrednio reakcji z osoczem, na przykład 10 jednostek enzymatycznych batroxobinu BU plus 50 ml osocza poddaje się reakcji w 37°C przez 10 minut. Wytworzony polimer fibryny Ijest zbierany przez wirowanie lub filtrację i solubilizowany ponownie w około 4 ml 0,2M octanu sodu o pH 4,0, zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Do roztworu fibryny I dodaje się nadmiar molowy awidyny sprzężonej z obojętnym nośnikiem, takim jak agaroza. Następnie kompleks agaroza:awidyna:biotynabatroxobin oddziela się od fibryny I przez wirowanie lub filtrację, otrzymując kompozycję zawierającą monomer fibryny pozbawiony w znacznym stopniu batroxobinu, który może być poddany repolimeryzacji jak opisano poniżej z utworzeniem spoiwa fibrynowego.
Wjednym wykonaniu wynalazku, kompozycja zawierająca monomer fibryny w znacznym stopniu jest pozbawiona enzymu trombino-podobnego. Przez określenie w znacznym stopniu pozbawiona uważa się, że cały trombino-podobny enzym został usunięty względnie, że jakiekolwiek trombino-podobne enzymy jakie pozostały w kompozycji stanowią niewystarczające ilości do wywołania niepożądanego efektu farmakologicznego. Tak więc pozbawione w znacznym stopniu pożądane kompozycje mogą, zawierać enzym trombino-podobny w ilości około 0-10% pierwotnego enzymu, a korzystnie około 0-2% trombino-podobnego enzymu stosowanego do wytwarzania kompozycji monomeru fibryny.
Chociaż opisy te przedstawiają kompozycje w których został usunięty enzym trombinopodobny, po czym następuje pożądana konwersja do rozpuszczalnej fibryny, to kompozycje zachowujące wiele lub całość trombino-podobnych enzymów uważane są także za użyteczne.
Tak otrzymana kompozycja zawierająca monomer fibryny jest gotowa do wykorzystania jako komponent spoiwa fibrynowego. Zaobserwowano, że gdy kompozycję taką otrzymuje się z pełnej krwi, to zawiera ona od około 60% do około 90% pierwotnego fibrynogenu, ale oczywiście w postaci monomeru fibryny.
Kompozycja zawierająca monomer fibryny może być wykorzystana bezpośrednio po jej otrzymaniu. W istocie jest szczególnie korzystne wykorzystanie takiej kompozycji po jej otrzymaniu w przypadku gdy kompozycja jest autologiczna. Jeśli kompozycja nie zostanie
176 202 wykorzystana bezpośrednio po jej otrzymaniu, może być przechowywana. Przechowywanie kompozycji wymaga, aby została ona zakonserwowana na przykład przez zamrożenie lub liofilizację lub też przechowywanie kompozycji w 4°C. Uważa się, że kompozycja w postaci zamrożonej lub liofilizowanej będzie trwała przez miesiące. Przy przechowywaniu kompozycji w 4°C uważa się, że będzie ona trwała przez okres co najmniej dni.
Jeśli kompozycja zostanie zamrożona, to podczas jej stosowania musi zostać rozmrożona. Jeśli kompozycja jest liofilizowana, to korzystnie podczas stosowania powinna zostać roztworzona przez dodanie tego samego bufora kwasowego, który został użyty w etapie solubilizacji, jeśli ten kwas jest lotny, na przykład kwasu octowego, lub jeśli zastosowano czynniki chaotropowe, to przez dodanie wody destylowanej. Tak jak w etapie solubilizacji, przy roztwarzaniu należy stosować najmniejszą ilość roztworu bufora kwasowego lub wody destylowanej, przy której jeszcze otrzymuje się rozpuszczalny monomer fibryny. Roztwarzanie liofilizowanej kompozycji zawierającej monomer fibryny może spowodować utworzenie roztworu wodnego zawierającego monomer fibryny, w którym stężenie takiego monomeru wynosi do 200 mg/ml. Przed liofilizacją do kompozycji może być dodany środek zwiększający objętość, na przykład mannitol lub laktoza.
Alternatywnie, kompozycja liofilizowana może być wykorzystana w postaci liofilizowanej. Taka postać jest szczególnie korzystna gdy potrzeba do kompozycji dodać adiuwanty, na przykład antybiotyki.
Kompozycja zawierająca monomer fibryny może mieć dowolną postać, na przykład roztworu, zawiesiny, emulsji lub substancji stałej, przy czym roztwór jest postacią korzystną. Zatem taka kompozycja może na przykład mieć postać cieczy, żelu, pasty lub balsamu. Oczywiście kompozycja może mieć również postać granulek, na przykład liofilizowanego monomeru fibryny, które mogą być przetworzone na roztwór, emulsję lub zawiesinę bezpośrednio przed użyciem.
Do utworzenia roztworu może być użyty dowolny odpowiedni rozpuszczalnik, ale oczywiście korzystny jest rozpuszczalnik nietoksyczny. Do nieograniczających przykładów rozpuszczalników należą woda, alkohol etylowy, gliceryna i glikol propylenowy, przy czym korzystnym rozpuszczalnikiem jest woda.
Przykładem zawiesiny jest zawiesina otrzymana przez zmieszanie kompozycji zawierającej monomer fibryny z rozpuszczalnikami organicznymi, na przykład etanolem, do końcowego stężenia etanolu ponad 3,OM i wytrząśnięcie. Monomer fibryny wytrąci się i może być wyodrębniony przez odwirowanie. Precypitat powinien być przemyty fazą organiczną w celu usunięcia roztworu wodnego stosowanego w etapie solubilizacji. Etanolowa zawiesina monomeru fibryny może być następnie nałożona bezpośrednio na bandaż lub inny nośnik lub nawet nałożona bezpośrednio na ranę. Fazie organicznej pozwala się odparować. W przypadku bandażu lub innego podłoża zawiesina może być ponownie uwodniona przez skontaktowanie z miejscem nałożenia lub w inny sposób, a fibrynie pozwala się spolimeryzować.
Alternatywnie organiczna zawiesina monomeru fibryny fazie silnie lotnej, na przykład w eterze dietylowym, może być zatomizowana i dostarczona do żądanego miejsca w postaci zawiesiny w spray'u. Korzystnie faza lotna jest niepalna. Możliwe jest dostarczanie organicznej zawiesiny fibryny do żądanego miejsca poza żywym organizmem przez rozpylanie.
Spoiwo fibrynowe stosuje się przez skontaktowanie żądanego miejsca poza żywym organizmem z kompozycją zawierającą monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę i konwersję monomeru fibryny do polimeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny do usieciowanej fibryny jednocześnie ze wspomnianym etapem kontaktowania i utworzenie przez to skrzepu fibrynowego.
Dla celów niniejszego wynalazku określenie żądane miejsce oznacza miejsce, poza żywym organizmem gdzie chce się utworzyć skrzep fibryny. Czym jest żądane miejsce i gdzie się znajduje zależy od zastosowania spoiwa.
Wynalazek znajduje zastosowanie do spajania dakronowych przeszczepów tętnic przed przeszczepieniem, spajania tkanek poza żywym organizmem, wytwarzania masy fibryny do namnażania komórek.
Dawka kompozycji zawierającej monomer fibryny lub kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę zależy od konkretnego zastosowania spoiwa fibrynowego, ale powinna to być
176 202 dawka zapewniająca przeprowadzenie zamierzonego wykorzystania kompozycji. Generalnie dla kompozycji zawierającej monomer fibryny będącej roztworem wodnym uważa się, że dawka takiej kompozycji równa od około 3 ml do około 5 ml jest wystarczająca do tego, aby była o na skutecznym spoiwem. Jednakże zależnie od zastosowania kompozycji dawka może być zawarta w zakresie od około 0,05 ml do około 40 ml. Również jeśli stosowana jest kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę w formie polimeru lub kompozycja ma postać stałą, to powinna ona zawierać taką ilość fibryny, jak jest w takim roztworze wodnym.
Dla celów niniejszego wynalazku określenie, że konwersja monomeru fibryny do polimeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny do usieciowanej fibryny jednocześnie ze wspomnianym etapem kontaktowania oznacza, że taki etap konwersji i taki etap kontaktowania zachodzi w okresie czasu każdego z etapów tak, aby wytworzyć skrzep fibryny w żądanym miejscu. Zatem określenie jednocześnie może oznaczać, że po etapie kontaktowania monomer fibryny jest przekształcany w polimer fibryny lub że nieusieciowana fibryna jest przekształcana w usieciowaną fibrynę. Przeprowadza się to przez kontaktowanie kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę, po nałożeniu takiej kompozycji na żądane miejsce, z kompozycją która może przekształcić monomer fibryny w polimer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w usieciowaną fibrynę. Etap konwersji powinien generalnie zachodzić w ciągu około 0,5 minuty po etapie kontaktowania. W przeciwnym razie kompozycja zawierająca monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę, zwłaszcza jeśli nieusieciowaną fibryną jest monomer fibryny, może spływać z żądanego miejsca.
Jednocześnie może również oznaczać, że etap kontaktowania i etap konwersji mają miejsce jednocześnie. Przeprowadza się to przez kontaktowanie żądanego miejsca z kompozycją zawierającą monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w tym samym czasie, w którym taka kompozycja jest kontaktowana z kompozycją, która może przekształcić monomer fibryny w polimer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w usieciowaną fibrynę.
Ostatecznie i korzystnie jednocześnie może oznaczać również, że etap konwersji może zaczynać się przed etapem kontaktowania, chociaż nie tak daleko przed etapem kontaktowania, aby cały monomer fibryny uległ konwersji do polimeru fibryny lub cała nieusieciowana fibryna uległa konwersji do usieciowanej fibryny. W przeciwnym razie cały monomer fibryny uległby konwersji do polimeru fibryny lub cała nieusieciowana fibryna uległaby konwersji do usieciowanej fibryny przed etapem kontaktowania, w wyniku czego powstałoby bardzo złe spoiwo fibrynowe. Ten problem rozwiązuje się przez zmieszanie kompozycji zawierającej monomer fibryny z kompozycją, która może przekształcić monomer fibryny w polimer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w usieciowaną fibrynę, przed etapem kontaktowania. Ponieważ doprowadzenie do końca etapu konwersji trwa około 30 sekund, etap konwersji nie powinien rozpoczynać się na więcej niż 30 sekund i korzystnie nie więcej niż 3 sekundy przed etapem kontaktowania. Ta postać jest korzystna, ponieważ zapewnia ona, że maksymalna ilość kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę pozostanie w żądanym miejscu i jeszcze utworzy doskonały skrzep fibrynowy.
Konwersję monomeru fibryny do polimeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny do usieciowanej fibryny można prowadzić dowolną znaną techniką. Jednakże to, jak prowadzony jest etap konwersji zależy od tego, jest źródło kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę, na przykład pełna krew lub fibrynogen rekombinacyjny, od postaci monomeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny, na przykład fibryny I lub fibryny des BB oraz w mniejszym stopniu od tego, czy żądane miejsce będzie w czasie stosowania spoiwa fibrynowego zawierać krew pacjenta lub inne płyny ustrojowe.
Jeśli do etapu konwersji stosuje się oddzielną kompozycję, taką jak bufor alkaliczny (jak omówiono poniżej), to sposób według wynalazku może być prowadzony na przykład za pomocą strzykawki dwucylindrowej. Strzykawka dwucylindrowa może mieć kształt litery Y, dzięki czemu możliwe jest zmieszanie kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę oraz kompozycji stosowanej w etapie konwersji bezpośrednio przed etapem kontaktowania. Również zamiast strzykawki dwucylindrowej w kształcie litery Y można stosować strzykawkę dwucylindrową z dwoma otworami. Umożliwia to jednoczesne zachodzenie kontaktowania żądanego miejsca i konwersji do polimeru fibryny lub usieciowanej fibryny. Kompo176 202 zycje w strzykawkach dwucylindrowych mogą byli również rozpylane na żądane miejsce. Patrz H.B. Kram etal., The American Surgeon, 57:381 (1991).
Jeśli źródłem kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibryną jest krew, to wtedy tak jak omówiono powyżej, uważa się, że kompozycja zatrzyma wystarczającą ilość protrombiny, czynnika XIII i innych substancji niezbędnych do konwersji takiego monomeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny do usieciowanej fibryny, na przykład aktywatorów protrombiny. Jeśli nieusieciowaną fibryną jest polimer fibryny, to jest nieusieciowana fibryna nie została solubilizowana, to nieusieciowana fibryna może być poddana konwersji do usieciowanej fibryny poprzez aktywację protrombiny i czynnika XIII w takiej kompozycji z utworzeniem usieciowanej fibryny. Taka aktywacja może być prowadzona przez kontaktowanie kompozycj i ze źródłem jonów wapnia. Do nieograniczających źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie o stężeniu 30 mM. Alternatywnie, ale mniej korzystnie jony wapnia mogą być dostarczane poprzez krew do żądanego miejsca.
Jeśli nieusieciowana fibryna jest solubilizowana, to znaczy jest to monomer fibryny, to sposób konwersji monomeru fibryny do usieciowanej fibryny zależy od sposobu przeprowadzenia solubilizacji. Jeśli nieusieciowaną fibrynę solubilizowano za pomocą bufora kwasowego, to usieciowana fibryna może być utworzona przez podniesienie pH kompozycji zawierającej monomer fibryny tak, że monomer fibryny może polimeryzować. Można to przeprowadzić przez skontaktowanie takiej kompozycji z dowolnym odpowiednim buforem alkalicznym. Do nieograniczających przykładów buforów alkalicznych należą te, które zawierają HEPES, wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek wapnia, bufory wodorowęglanowe takie jak wodorowęglan sodu, trimetaliczne sole kwasu cytrynowego, sole kwasu octowego i sole kwasu siarkowego. Do korzystnych buforów alkalicznych należą: 0,5-0,75M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10-10,5,0,5-0,75 M wodorowęglan sodu/glicyna o pH 10,0,1,5M glicyna/NaOH o pH 10,0, 0,5-1,0M kwas bis(hydroksyetyloaminoetanosulfonowy) (BES) o pH 7,5, 1M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5, 0,5m tricyna o pH 8,5, 1M kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS) o pH 8, 0,1M kwas trihydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0 i 0,5 M kwas cykloheksyloaminoetanosulfonowy (CHES) o pH 10,0; przy czym najbardziej korzystne są bufory 0,5-0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10-10,5, 0,5-1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetanosulfonowy) (BES) o pH 7,5, 1 M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5, i kwas trihydroksymetyloaminoettonosulfonowy (TES) o pH 8,0.
Ilość użytego bufora alkalicznego powinna być wystarczająca do spolimeryzowania nieusieciowanej fibryny. Korzystnie od około 10 części do około 1 części kompozycji zawierającej monomer fibryny miesza się z 1 częścią bufora alkalicznego. Jeszcze bardziej korzystnie stosunek ten wynosi około 9:1. Należy zauważyć, że korzystny stosunek zależy od wyboru bufora i pożądanej mocy polimeru fibryny. Oczywiście żądana moc polimeru fibryny zależy od końcowego zastosowania spoiwa fibrynowego.
Jeśli solubilizację prowadzi się za pomocą czynnika chaotropowego, to monomer fibryny może być poddany konwersji do usieciowanej fibryny przez rozcieńczenie kompozycji zawierającej monomer fibryny na przykład wodą destylowaną. Rozcieńczenie powinno być prowadzone przy użyciu minimalnej ilości rozcieńczalnika. Generalnie stężenie molowe czynnika chaotropowego uzyskane po rozcieńczeniu powinno wynosić od około 0,5 do około 0,1.
Oprócz zwiększania pH lub rozcieńczania czynnika chaotropowego kompozycji zawierającej monomer fibryny korzystnie protrombinę i czynnik XIII z takiej kompozycji aktywuje się z utworzeniem usieciowanej fibryny; Taką aktywację można przeprowadzić przez kontaktowanie kompozycji ze źródłem wapnia. Źródło jonów wapnia może być częścią bufora alkalicznego lub częścią bufora kwasowego stosowanego w etapie solubilizacji. Do nieograniczających przykładów źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie o stężeniu 30 mM. Alternatywnie, ale mniej korzystnie źródło jonów wapnia może być dostarczane przez krew do żądanego miejsca.
Należy zauważyć, że jeśli jako bufor alkaliczny stosuje się bufor węglan/ wodorowęglan, to źródło jonów wapnia musi być dodane do bufora kwasowego podczas etapu solubilizacji. Jest to spowodowane tym, że chlorek wapniajest nierozpuszczalny w buforze węglan/wodorowęglan.
176 202
Korzystnie stosuje się stężenie jonów wapnia w roztworze bufora kwasowego od około 5 milimołowego do około 150 milimołowego, a bardziej korzystnie od około 5 mM do około 50 mM.
Uważa się, że uzyskany skrzep fibrynowy będzie usieciowaną fibryną II niezależnie od tego, która postać nieusieciowanej fibryny, to jest monomer fibryny lub polimer fibryny jest obecna. Jednakże jeśli nieusieciowana fibryna ma postać fibryny des Bb, to uważa się, że w celu przeprowadzenia konwersji fibryny des bB do usieciowanej fibryny może być niezbędne źródło dodatkowej trombiny. Takim źródłem trombiny może być na przykład osocze pacjenta, przy czym takie osocze dodaje się do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.
Kompozycję zawierającą monomer fibryny umieszcza się na stałym podłożu, na przykład bandażu, szwie, protezie lub opatrunku, a następnie kontaktuje z żądanym miejscem. Taki nośnik umieszcza się następnie w kontakcie z żądanym miejscem aż do utworzenia skrzepu fibryny.
Jednakże należy zauważyć, że jeśli kompozycja zawierająca monomer fibryny nie zatrzyma dosyć protrombiny i czynnika XIII do utworzenia usieciowanej fibryny, to taka kompozycja jest mimo to przydatna jako spoiwo fibrynowe, ponieważ polimeryzacja monomeru fibryny per se może być wykorzystana do tworzenia skrzepu fibrynowego. Taka kompozycja może również być jeszcze wykorzystana do utworzenia usieciowanej fibryny przez dodanie źródła jonów wapnia i aktywowanego czynnika XIII (lub prekursorów aktywowanego czynnika XIII) i ewentualnie trombiny. Takie źródło jonów wapnia, aktywowanego czynnika XIII i trombiny może być dodane do kompozycji zawierających monomer fibryny.
Aktywowany czynnik XIII może być dodany do kompozycji zawierającej monomer fibryny w stężeniu końcowym od około 1,0 do około 20 jednostek czynnika XIII na ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Alternatywnie czynnik XIII może być dostarczany do żądanego miejsca przez krew lub płyny ustrojowe lub przez dodanie osocza autologicznego do kompozycji zawierającej monomer fibryny. Do nieograniczających źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie w stężeniu 30 mM. Alternatywnie, ale mniej korzystnie jony wapnia mogą być dostarczane w żądane miejsce przez krew lub płyny ustrojowe. Można dodać od około 4 jednostek do około 500 jednostek trombiny na ml kompozycji zawierającej monomer fibryny lub trombina może być dostarczana przez żądane miejsce.
Jeśli źródłem kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę są hodowle komórkowe wydzielające fibrynogen lub fibrynogen rekombinacyjny, a nieusieciowaną fibryną jest polimer fibryny, tojest nieusieciowana fibryna niejest solubilizowana, to w celu utworzenia usieciowanej fibryny musi być zastosowane źródło jonów wapnia i aktywowanego czynnika XIII (lub prekursorów aktywowanego czynnika Xńl). Czynnika XIII musi być zastosowany, ponieważ te źródła nieusieciowanej fibryny nie zawierają wcale czynnika XIII. Aktywowany czynnik XIII może być dodany do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę w stężeniu końcowym od około 1,0 do około 20 jednostek czynnika XIII na ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.
Alternatywnie czynnik XIII może być dostarczany przez krew lub płyny ustrojowe w żądane miejsce lub przez dodanie do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę autologicznego osocza. Do nieograniczających źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie w stężeniu 30 mM. Alternatywnie ale mniej korzystnie jony wapnia mogą być dostarczane przez krew lub płyny ustrojowe w żądane miejsce. Również ewentualnie do takiej kompozycji może być dodawana trombina w celu zapewnienia tworzenia się usieciowanej fibryny II. Można dodać od około 4 jednostek do około 500 jednostek trombiny na ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę lub do trombina może być dostarczona do żądanego miejsca.
Jeśli nieusieciowana fibryna jest solubilizowana, to znaczy jest monomerem fibryny, to sposób przeprowadzenia konwersji monomeru fibryny do polimeru fibryny zależy od sposobu przeprowadzenia solubilizacji, na przykład za pomocą bufora kwasowego lub czynnika chaotropowego. Tworzenie polimeru fibryny można przeprowadzić tymi samymi metodami jak opisano powyżej. Ten polimer fibryny w razie potrzeby może być poddany konwersji do usieciowanej fibryny przez dodanie do kompozycji zawierającej monomer fibryny źródła jonów wapnia i aktywowanego czynnika XIII (lub prekursorów aktywowanego czynnika XIII) i ewentualnie trombiny, jak opisano powyżej.
176 202
Aktywowany czynnik XIII może być dodany do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę w stężeniu końcowym od około 1,0 do około 20 jednostek czynnika XIII na ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Alternatywnie czynnik XIII może być dostarczany przez krew lub płyny ustrojowe w żądane miejsce lub przez dodanie osocza autologicznego do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Do nieograniczających źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie w stężeniu 30 mM. Alternatywnie ale mniej korzystnie jony wapnia mogą być dostarczane przez krew lub płyny ustrojowe w żądane miejsce. Można dodać od około 4 jednostek do około 500jednostek trombiny na ml kompozycji zawierającej monomer fibryny lub trombina może być dostarczona w żądane miejsce.
Spoiwo fibrynowe może ponadto zawierać adiuwanty, na przykład antybiotyki, takie jak gentamycyna, cefotaksym, nebacetin i sisomicin, antagoniści histaminy H2, na przykład ranitydyna oraz leki przeciwnowotworowe, na przykład OK-432. Może to przeprowadzić przez dodanie żądanego antybiotyku do kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę. Patrz M.C. Gersdorffi T.A.J. Robillard, Laryngoscope, 95:1278-80 (1985); A. Ederle etal., Ital. J. Gastroenterol., 23:354-56 (1991); V. Ronfard et al., Burns, 17: 181 -84(1991); T. Sakurai et al., J. Control. Release, 18:39-43 (1992); T. Monden et al., Cancer, 69:636-42 (1992); F. Greco, J. of Biomedical Materials Research, 25:39-51 (1991) orazH.B. Kram etal, Journal of Surgical Research, 50:175-178 (1991). Mogą być również dodane inne adiuwanty, na przykład fibronectin, inhibitory fibrynolityczne takie jak aprotinin, alfa-2 antiplasmin, PAI-1, PAI-2, kwas 6-aminoheksanowy, kwas 4-aminometylocykloheksanowy, kolagen lub keratynocyty. Dawka takiego adiuwanta jest taka sama jak dawka stosowana w znanych spoiwach fibrynowych.
Zestaw spoiwa fibrynowego może zawierać jako pierwszy komponent kompozycję zawierającą monomer fibryny, a jako drugi komponent bufor alkaliczny, który jest zdolny do polimeryzowania monomeru fibryny lub wodę destylowaną, zależnie od tego jak przeprowadza się etap solubilizacji. Drugi komponent może ewentualnie zawierać źródło jonów wapnia. Alternatywnie zestaw może jako pierwszy komponent zawierać kompozycję zawierającą nieusieciowaną fibrynę, a jako drugi komponent źródło jonów wapnia. Jeśli źródłem fibrynogenu stosowanego do otrzymania kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę są hodowle komórkowe wydzielaj ące fibrynogen lub rekombinacyjny fibrynogen, to pierwszym komponentem może być kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę, drugim komponentem może być źródło jonów wapnia a trzecim komponentem jest aktywowany czynnik XIII.
Przykłady
Przykład I. Otrzymywanie osocza z pełnej krwi
Pełną krew (100 ml) zbiera się do standardowych, dostępnych w handlu torebek na krew zawierających antykoagulant taki jak układ cytrynian/fosforan/dekstroza. Następnie krew przenosi się do pojemnika odpowiedniego do wirowania i wiruje w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 3000 g. Klarowne osocze z supernatanta (około 50 ml) dekantuje się, a składniki komórek odrzuca.
Alternatywną metodą otrzymywania osocza z pełnej krwi jest filtracja. 100 ml pełnej krwi zbiera się do standardowych, dostępnych w handlu torebek na krew zawierających antykoagulant taki jak układ cytrynian/fosforan/dekstroza. Następnie krew recyrkuluje się za pomocą pompy perystaltycznej poprzez filtr charakteryzujący się dobrą transmisją białek. Spadek ciśnienia poprzez membranę powoduje przepychanie osocza wraz ze składnikami komórkowymi pozostającymi w recyrkulującej krwi. Osocze (50 ml) zbiera się do dalszej przeróbki.
Przykład II. Immobilizacja batroxobinu na agarozie
W badaniach immobilizacji zastosowano perełki agarozowe (Pharmacia). Użyto usieciowaną w 4% agarozę o średnicy 45-165 pm (90% cząstek). Materiał ten po uwodnieniu 5-krotnie zwiększa swoją objętość. Baxotrobin najpierw utlenia się przez 1 godzinę 0,1 M nadjodanem sodu w temperaturze pokojowej w zakrytym naczynku scyntylacyjnym. Batroxobin oczyszcza się przez przepuszczenie przez kolumnę z żelem sephadex Pd 10. Następnie utleniony batroxobin sprzęga się przez noc z aktywowanym hydrazydem żelem agarozowym w temperaturze pokojowej w 50 mM octanie sodu o pH 5,5 plus 10 mM borowodorek sodu (30-200 U na 1,75 g wilgotnego żelu). Niezwiązane reagenty usuwa się z żelu przez przemycie: 50 ml octanu sodu o
176 202 pH 5,5,100 ml układu 50 mM glicyna/l M chlorek sodu o pH 3,0,100 ml układu 50 mM węglan sodu/lM chlorek sodu o pH 10,0, 100 ml układu 50 mM fosforan sodiVlM chlorek sodu o pH 7,0, 100 ml wody, 100 ml 50 mM fosforanu sodu/lM chlorek sodu o pH 7,0, 100 ml 50 mM fosforanu sodu o pH 7,0.
Przykład III. Reakcja immobilizowanego enzymu z fibrynogenem z osocza z wytworzeniem kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę
Immobilizowany enzym (350 mg) dodaje się do około 50 ml odwirowanego lub przefiltrowanego osocza i miesza delikatnie przez 7 do 20 minut aż do utworzenia skrzepu polimeru nieusieciowanej fibryny II.
Polimer fibryny I plus zasocjowany immobilizowany enzym zbiera się następnie przez: a) wirowanie przy 3000 g przez 10 minut a następnie usunięcie supematanta surowicy przez dekantację, albo przez b) filtrację przez odpowiedni filtr wiążący białka niskocząsteczkowe, a następnie odrzucenie przefiltrowanej surowicy i zatrzymanie polimeru fibryny I wraz z immobilizowanym enzymem do dalszej obróbki. Ten polimer fibryny I jest przykładem kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.
Przykład IV. Solubilizacja polimeru fibryny I z wytworzeniem kompozycji zawierającej monomer fibryny I
Solubilizację polimeru fibryny I przeprowadza się przez dodanie do zebranego polimeru fibryny I wraz z immobilizowanym enzymem około 1-4 ml 0,2M octanu sodu o pH 4,0, zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Następnie próbkę miesza się energicznie przez 2 minuty, na przykład w mikserze wirowym. Następnie przeprowadza się usunięcie immobilizowanego enzymu przez filtrację roztworu fibryny I przez filtr wiążący białka niskocząsteczkowe 1 do 20 pm. Enzym immobilizowany na agarozie pozostanie na filtrze, co umożliwi usunięcie go z układu. Pozostały roztwór, kompozycja zawierająca monomer fibryny I, składa się z zatężonego kwasowego roztworu monomeru fibryny I wraz z innymi białkami osocza. Generalnie z około 100 ml pełnej krwi otrzymuje się około 4 ml lub 5 ml kompozycji zawierającej monomer fibryny, w której stężenie monomeru fibryny wynosi od około 25 mg/ml do około 35 mg/ml. Jest ona gotowa do podawania pacjentowi pojedynczo lub wytłaczania razem z buforem do repolimeryzacji, z utworzeniem spoiwa fibrynowego.
Przykład V. Repolimeryzacja kompozycji zawierającej monomer fibryny I.
Repolimeryzację przeprowadza się przez jednoczesne mieszanie 9 części roztworu zawierającego monomer fibryny I z 1 częścią odpowiedniego buforu do repolimeryzacji, na przykład buforu 0,75M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10,0. Stosunek ten może być zmieniony, jednakże stosunek 9:1 pozwala na utrzymanie wysokiego stężenia fibryny I w produkcie końcowym. Przy łącznym wytłaczaniu fibryna I spontanicznie repolimeryzuje i przechodzi konwersję do fibryny II a następnie ulega sieciowaniu w ciągu okresu około 30 minut.
Przykład VI. Aktywowanie agarozy hydrazydem i sprzęganie węglowodanowej grupy enzymu.
W celu przereagowania grupy węglowodanowej batroxobinu z nośnikiem aktywowanym hydrazydem cukier musi być najpierw utleniony z utworzeniem wolnych grup -CHO. Przeprowadza się to poniższym sposobem.
1-7 mg batroxobinu rozpuszcza się w 2 ml wody i 0,2 ml 0, IM nadjodanu sodu. Mieszaninę inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym odsala na kolumnie filtracyjnej z żelem Sephadex G-25. Utleniony aktywny batroxobin eluuje się z kolumny 0,9% w/v chlorkiem sodu.
Do bezpośredniego sprzężenia wolnych grup aldehydowych (-CHO) można zastosować standardowe, dostępne w handlu agarozy aktywowane hydrazydem (Bio-Rad Laboratories Ltd, Wielka Brytania) lub dowolną grupę z wolnymi terminalnymi grupami aminowymi. Jeśli stosuje się hydrazydo-agarozę, to procedura sprzęgania jest następująca.
1-5 g żelu hydrazydo-agarozowego zawiesza się w 4 ml 50 mM octanu sodu o pH 5,5. Do zawiesiny dodaje się 1 ml 10 mM borowodorku sodu razem z żądaną ilością utlenionego batroxobinu (zwykle 100-200 BU na gram wilgotnego żelu).
Próbkę miesza się przez noc w temperaturze pokojowej a następnie przemywa na lejku ze spiekanego szkła następującymi buforami: 50 ml 50 mM octanu sodu o pH 5,5, 100 ml układu
176 202 mM glicyna/IM chlorek sodu o pH 3,0,100 ml układu 50 mM węglan sodu/lM chlorek sodu o pH 10,0, 100 ml układu 50 mM fosforan sodu/lM chlorek sodu o pH 7,0, 100 ml wody i 100 ml układu 50 mM fosforan sodu/l M chlorek sodu o pH 7,0 i na końcu 100 ml 50 mM fosforanu sodu o pH 7,0.
Reakcję immobilizowanego batroxobinu z osoczem przeprowadza się w następujący sposób.
pH osocza zmniejsza się do 5,5 przez dodanie kwasu octowego. Do osocza dodaje się równoważnik 100-200 BU batroxobinu immobilizowanego na około 1,75 g (ciężar wilgotnego żelu) agarozy. Osocze inkubuje się w 37°C przez 10-15 minut, po czym pH zwiększa się do 7,4 przez dodanie wodorotlenku sodu. Polimeryzacja fibryny I zachodzi niemal jednocześnie. Polimer fibryny I zbiera się przez wirowanie przez 10 minut przy 3500 rpm i rozpuszcza ponownie w 3-4 ml 0,2M octanu sodu o pH 4,0, zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Enzym sprzężony z agarozą oddziela się następnie od fibryny I przez wirowanie lub filtrację. Fibrynę I repolimeryzuje się następnie z utworzeniem spoiwa fibrynowego przez dodanie 9 części roztworu fibryny I do 1 części buforu 0,75M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10,0.
Przykład VII. Wychwycenie enzymu za pomocą układu biotynaawidyna
Wychwycenie enzymu przeprowadza się przez najpierw biotynylowanie batroxobinu i wychwycenie koniugatu biotynaenzym za pomocą immobilizowanej awidyny (awidyna sprzężona z 6% usieciowaną agarozą).
Biotynylowanie białek można przeprowadzić stosując wiele reagentów. W tym przypadku stosuje się N-hydrokjyjukcynoimido-biotynę (nierozpuszczalną w wodzie, dostępną w handlu z firmy Amershem). NHS-biotynę (50 (il) dodaje się do 1 mg batroxobinu przy pH 8,6 i inkubuje roztwór w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Nadmiar reagenta biotynylującego usuwa się przez filtrację żelową na kolumnie Sephadex G-25, stosując jako eluent 0, IM fosforan potasu o pH 7,5.
Równoważnik 10 BU biotyno-batroxobinu dodaje się do 50 ml osocza i inkubuje w 37°C przez 10 minut. Polimer fibryny I zbiera się przez wirowanie (3500 rpm przez 10 minut) i ponownie rozpuszcza w 3-4 ml 0,2M octanu sodu o pH 4,0, zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Do fibryny I dodaje się awidyno-agarozę (dostępna w handlu z firmy Sigma Chemical Co.) w ilości 0,2 g (wilgotny żel) na ml fibryny I. Próbkę inkubuje się przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wiruje przez 10 minut przy 2000 rpm. Otrzymana fibryna I jest pozbawiona w wysokim stopniu batroxobinu. Repolimeryzację fibryny z utworzeniem spoiwa fibrynowego przeprowadza się w sposób opisany powyżej w przykładzie V.
Przykład VHI
a) Otrzymywanie osocza z pełnej krwi
Pełną krew (100 ml) zbiera się do standardowych, dostępnych w handlu torebek na krew zawierających antykoagulant (cytrynian/fosforan/dekstroza). Następnie krew przenosi się do pojemnika odpowiedniego do wirowania i wiruje w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 3000 g. Klarowne osocze z supematanta (około 50 ml) dekantuje się, a składniki komórek odrzuca.
b) Wychwycenie enzymu za pomocą układu biotyna-awidyna
N-Hydroksyjukcynoimido-biotynę (nierozpuszczalną w wodzie, dostępną w handlu z firmy Amersham) (50 p,1) dodaje się do 1 mg batroxobinu przy pH 8,6 i inkubuje roztwór w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Nadmiar reagenta biotynyluj ącego usuwa się przez filtrację żelową na kolumnie Sephadex G-25, stosując jako eluent 0,1 M fosforan potasu o pH 7,5.
Równoważnik 10 BU biotyno-batroxobinu dodaje się do 50 ml osocza i inkubuje w 37°C przez 10 minut. Polimer fibryny I zbiera się przez wirowanie (3500 rpm przez 10 minut) i ponownie rozpuszcza się w 3-4 ml 0,2 M octanu sodu o pH 4,0 zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Do fibryny I dodaje się awidyno-agarozę (dostępna w handlu z firmy Sigma Chemical Co.) w ilości 0,2 g (wilgotny żel) na ml fibryny I. Próbkę inkubuje się przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wiruje przez 10 minut przy 200 rpm. Otrzymana fibryna I jest pozbawiona w wysokim stopniu batroxobinu.
176 202
Przykład IX. Wytwarzanie spoiwa fibrynowego
Wytwarzanie spoiwa fibrynowego przeprowadza się przez jednoczesne mieszanie 9 części roztworu zawierającego monomer fibryny I z 1 częścią 0,75 M węglanu/wodorowęglanu sodu o pH 10,0. Przy łącznym stosowaniu, fibryna I spontanicznie repolimeryzuje i przechodzi konwersję do fibryny II, po czym fibryna ulega sieciowaniu i tworzy się spoiwo fibrynowe.
Cl
Cl
N-\
OH
Cl immobilizacja
H
s-©
CE>-nh2 <E>-sh ®~OH N=<
N-s..
-©
0-®
FIG. Γ
X oznacza OH lub Cl oznacza proteinę
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (6)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego, znamienny tym, że żądane miejsce, znajdujące się poza żywym organizmem, doprowadza się do zetknięcia z wodną kompozycją zawierającą monomer fibryny o stężeniu równym 10 - 200 mg/ml, korzystnie 20 - 200 mg/ml, której pH równa się 1- 5 i przeprowadza się konwersję monomeru fibryny do polimeru fibryny za pomocą kompozycji wybranej z grupy obejmującej wodę destylowaną i bufor alkaliczny wybrany z grupy obejmującej układ 0,5 - 0,75M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 - 10,5, 0,5 - 0,75M wodorowęglan sodu/NaOH o pH 10,0, 1,5M glicyna/NaOH o pH 10,0, 0,5 - 1,0M kwas bis(hydroksyetyloaminoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5, 1M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5,0,5 M trycynę o pH 8,5,1 M kwas moffoiinopropanosulfonowy (MOPS) o pH 8,0, 1M kwas trishydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0 i 0,5 M kwas cykloheksyloaminoetanosulfonowy (CHES).
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako bufor alkaliczny stosuje się bufor wybrany z grupy obejmującej układ 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 - 10,5, 0,5 -1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminfetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5,1M kwas hydroksyetylopiperyzynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5 i 1 Mkwas trisl^;^dn^lss;yn^eityo^i^mn^(^^tn^osulfonowy (TeS) o pH 8,0.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się bufor alkaliczny lub wodę destylowaną dodatkowo zawierającą źródło jonów wapnia.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się źródło jonów wapnia o stężeniu równym 5 - 200 mM.
  5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się źródło jonów wapnia o stężeniu równym 30 mM.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że żądane miejsce doprowadza się do zetknięcia z wodną kompozycją fibryny i buforem alkalicznym lub wodą destylowaną za pomocą strzykawki dwucylindrycznej, przy czym jeden cylinder zawiera kompozycję fibryny, a drugi zawiera bufor alkaliczny lub wodę destylowaną.
PL93320659A 1992-10-08 1993-10-08 Sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego PL176202B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95821292A 1992-10-08 1992-10-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL176202B1 true PL176202B1 (pl) 1999-04-30

Family

ID=25500729

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93320659A PL176202B1 (pl) 1992-10-08 1993-10-08 Sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego
PL93320660A PL175443B1 (pl) 1992-10-08 1993-10-08 Zestaw spoiwa fibrynowego
PL93300647A PL173858B1 (pl) 1992-10-08 1993-10-08 Sposób wytwarzania kompozycji zawierającej monomer fibryny i kompozycja wodna zawierająca monomer fibryny

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93320660A PL175443B1 (pl) 1992-10-08 1993-10-08 Zestaw spoiwa fibrynowego
PL93300647A PL173858B1 (pl) 1992-10-08 1993-10-08 Sposób wytwarzania kompozycji zawierającej monomer fibryny i kompozycja wodna zawierająca monomer fibryny

Country Status (24)

Country Link
US (12) US5750657A (pl)
EP (2) EP1266666A3 (pl)
JP (1) JP3771284B2 (pl)
KR (1) KR940008697A (pl)
CN (1) CN1091315A (pl)
AT (1) ATE244581T1 (pl)
AU (1) AU676201B2 (pl)
BR (1) BR9304185A (pl)
CA (3) CA2108104C (pl)
CZ (1) CZ211793A3 (pl)
DE (1) DE69333080T2 (pl)
DK (1) DK0592242T3 (pl)
ES (2) ES2065294B1 (pl)
FI (1) FI110616B (pl)
HU (1) HU218898B (pl)
IL (1) IL107211A (pl)
MX (1) MX9306272A (pl)
NO (1) NO314412B1 (pl)
NZ (3) NZ280264A (pl)
PL (3) PL176202B1 (pl)
PT (1) PT592242E (pl)
RU (1) RU2143924C1 (pl)
SG (1) SG49640A1 (pl)
SK (1) SK109393A3 (pl)

Families Citing this family (251)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6117425A (en) 1990-11-27 2000-09-12 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, method of their production and use
US7196054B1 (en) * 1990-11-27 2007-03-27 The American National Red Cross Methods for treating wound tissue and forming a supplemented fibrin matrix
US6054122A (en) 1990-11-27 2000-04-25 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
US6197325B1 (en) 1990-11-27 2001-03-06 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
CN1091315A (zh) * 1992-10-08 1994-08-31 E·R·斯奎布父子公司 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法
US8795332B2 (en) 2002-09-30 2014-08-05 Ethicon, Inc. Barbed sutures
US6241747B1 (en) 1993-05-03 2001-06-05 Quill Medical, Inc. Barbed Bodily tissue connector
ZA948564B (en) * 1993-11-19 1995-07-26 Bristol Myers Squibb Co Liquid separation apparatus and method
CA2188647A1 (en) * 1994-05-02 1995-11-09 Stewart Anthony Cederholm-Williams Recombinant fibrin chains, fibrin and fibrin-homologs
ATE405335T1 (de) * 1994-12-02 2008-09-15 Vivolution As Methode und vorrichtung zum abtrennen von fibrinmonomer aus blutplasma
US5733446A (en) * 1994-12-02 1998-03-31 Bristol-Myers Squibb Company Centrifuge with annular filter
CZ164697A3 (cs) 1994-12-02 1998-03-18 Bristol-Myers Sguibb Company Způsob oddělování složky z plazmy a zařízení k provádění tohoto způsobu
US6946079B1 (en) * 1994-12-02 2005-09-20 Bristol-Myers Squibb Company Centrifugal filtration method for separating fibrin monomer from blood
US5585007A (en) * 1994-12-07 1996-12-17 Plasmaseal Corporation Plasma concentrate and tissue sealant methods and apparatuses for making concentrated plasma and/or tissue sealant
US5605541A (en) * 1994-12-07 1997-02-25 E. R. Squibb And Sons, Inc. Fibrin sealant applicatoor
JPH11502431A (ja) * 1995-01-16 1999-03-02 バクスター インターナショナル インコーポレイテッド 手術後の癒着を防止するための架橋化フィブリンの自己支持シート様材料
US5733545A (en) * 1995-03-03 1998-03-31 Quantic Biomedical Partners Platelet glue wound sealant
US5691152A (en) * 1995-11-09 1997-11-25 E. R. Squibb & Sons, Inc. Stable avidin composition
US6551794B1 (en) * 1995-11-09 2003-04-22 E. R. Squibb & Sons, Inc. Stable biotinylated biomolecule composition
PT865300E (pt) 1995-12-07 2004-12-31 Bristol Myers Squibb Co Dispositivo para a aplicacao de uma mistura de dois componentes liquidos
WO2000062828A1 (en) 1996-04-30 2000-10-26 Medtronic, Inc. Autologous fibrin sealant and method for making the same
DE19781869T1 (de) * 1996-04-30 2000-03-16 Medtronic Inc Verfahren zur Herstellung eines autologen Fibrin-Blutstillungsmittels
EP0917444A1 (en) 1996-07-12 1999-05-26 Baxter Travenol Laboratories, Inc. A fibrin delivery device and method for forming fibrin on a surface
DE19634313A1 (de) * 1996-08-24 1998-02-26 Behringwerke Ag Methode zur Stabilisierung von Plättchen
US5844087A (en) * 1996-11-05 1998-12-01 Bayer Corporation Method and device for delivering fibrin glue
CA2271738C (en) 1996-11-15 2008-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Devices and methods for applying a mixture of two or more liquid components to form a biomaterial
US6613020B1 (en) 1996-12-06 2003-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Method of applying a mixture of two liquid components as well as a device for carrying out the method
FR2757770B1 (fr) * 1996-12-30 1999-02-26 Inoteb Procede de preparation d'une colle biologique capable de coaguler par simple addition d'ions calcium
CA2277860C (en) * 1997-01-08 2005-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Centrifuge apparatus for separating blood
US6132598A (en) * 1997-01-08 2000-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Centrifuge apparatus with temperature control means
IL130729A0 (en) * 1997-01-08 2000-06-01 Bristol Myers Squibb Co Apparatus and methods for preparing blood or plasma component solutions of known concentration
US6228051B1 (en) 1997-03-27 2001-05-08 Bristol-Myers Squibb Company Laparoscopic sealant applicator
US6331172B1 (en) 1997-04-14 2001-12-18 Baxter International Inc. Applicator for dispensing measured quantities with use of controlled suction
US5971956A (en) * 1997-04-15 1999-10-26 Biosurgical Corporation Medical suctioning apparatus and methods of use
US5931855A (en) 1997-05-21 1999-08-03 Frank Hoffman Surgical methods using one-way suture
GB9711927D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Bristol Myers Squibb Co Compositions useful as fibrin sealants
US7745106B2 (en) 1997-06-24 2010-06-29 Cascade Medical Enterprises, Llc Methods and devices for separating liquid components
IT1292410B1 (it) * 1997-06-24 1999-02-08 Roberto Beretta Contenitore di pronto impiego per ottenere colla di fibrina autologa
US6979307B2 (en) 1997-06-24 2005-12-27 Cascade Medical Enterprises Llc Systems and methods for preparing autologous fibrin glue
ZA987019B (en) * 1997-08-06 1999-06-04 Focal Inc Hemostatic tissue sealants
AT407484B (de) * 1997-11-12 2001-03-26 Bio Prod & Bio Eng Ag Arzneimittel zur förderung der wundheilung
US6492494B1 (en) 1997-12-09 2002-12-10 Bristol-Myers Squibb Company Method of making a fibrin sealant comprising alpha-2-antiplasmin
EP1037969A4 (en) * 1997-12-09 2003-05-21 Bristol Myers Squibb Co FIBRINOGEN CONVERSING ENZYME HYBRID
US6478808B2 (en) * 1997-12-17 2002-11-12 Closys Corporation Clotting cascade initiating apparatus and methods of use and methods of closing wounds
US6159232A (en) 1997-12-16 2000-12-12 Closys Corporation Clotting cascade initiating apparatus and methods of use and methods of closing wounds
US6762336B1 (en) 1998-01-19 2004-07-13 The American National Red Cross Hemostatic sandwich bandage
AU744373B2 (en) * 1998-05-06 2002-02-21 Vivolution A/S Directional endoscopic delivery of material
US20020022588A1 (en) * 1998-06-23 2002-02-21 James Wilkie Methods and compositions for sealing tissue leaks
US6083383A (en) * 1998-06-25 2000-07-04 Huang; Xun Yang Apparatus for production of fibrin ogen or fibrin glue
US6274090B1 (en) 1998-08-05 2001-08-14 Thermogenesis Corp. Apparatus and method of preparation of stable, long term thrombin from plasma and thrombin formed thereby
JP2000070241A (ja) * 1998-08-31 2000-03-07 Nissho Corp 急速凝固用真空採血管
BE1012536A3 (fr) 1998-11-04 2000-12-05 Baxter Int Element muni d'une couche de fibrine sa preparation et son utilisation.
EP1731175B1 (en) 1998-11-12 2009-09-30 International Manufacturing Group, Inc. Hemostatic cross-linked dextran beads useful for rapid blood coagulation and hemostatis
DE10025001A1 (de) * 2000-05-22 2001-11-29 Aventis Behring Gmbh Gewebekleber mit verbesserten anti-adhäsiven Eigenschaften
KR100858830B1 (ko) * 1998-11-18 2008-09-17 체에스엘 베링 게엠베하 조직 접합제용의 안정화된 단백질 제제
US7276235B2 (en) * 1998-11-18 2007-10-02 Zlb Behring Gmbh Tissue glue with improved antiadhesive properties
DE19853033A1 (de) * 1998-11-18 2000-05-25 Centeon Pharma Gmbh Stabilisierte Proteinzubereitung für einen Gewebekleber
US6479052B1 (en) * 1998-12-02 2002-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Spray delivery of cells
DE19858463A1 (de) * 1998-12-18 2000-06-21 Centeon Pharma Gmbh Verwendung eines Fibrinklebers zur Regeneration des Lebergewebes
US6310036B1 (en) 1999-01-09 2001-10-30 Last Chance Tissue Adhesives Corporation High strength, Bio-compatible tissue adhesive and methods for treating vigorously bleeding surfaces
US7015198B1 (en) 1999-05-11 2006-03-21 Orentreich Foundation For The Advancement Of Science, Inc. Materials for soft tissue augmentation and methods of making and using same
US6921412B1 (en) 1999-05-18 2005-07-26 Cryolife, Inc. Self-supporting, shaped, three-dimensional biopolymeric materials and methods
AT500670A1 (de) * 1999-05-19 2006-02-15 Bio & Bio Licensing Sa Arzneimittel zur lokalen anwendung
EP1223955A1 (en) * 1999-06-01 2002-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Fibrin sealants providing less inflammatory response and methods using same
WO2000072857A1 (en) * 1999-06-01 2000-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Fibrin polymer structure
EP1187623A1 (en) * 1999-06-01 2002-03-20 Bristol-Myers Squibb Company Prevention of post surgical adhesions using a fibrin monomer sealant
US6472162B1 (en) 1999-06-04 2002-10-29 Thermogenesis Corp. Method for preparing thrombin for use in a biological glue
CA2375346A1 (en) * 1999-06-16 2000-12-21 Bristol-Myers Squibb Company Fibrin sealant as a transfection/transformation vehicle for gene therapy
US7654998B1 (en) * 1999-08-23 2010-02-02 Aeris Therapeutics, Inc. Tissue volume reduction
US6610043B1 (en) * 1999-08-23 2003-08-26 Bistech, Inc. Tissue volume reduction
CA2316554C (en) 1999-08-25 2007-10-23 Bristol-Myers Squibb Company Applicator and electro-mechanical applicator drive system
US6463335B1 (en) 1999-10-04 2002-10-08 Medtronic, Inc. Temporary medical electrical lead having electrode mounting pad with biodegradable adhesive
EP1242157B1 (en) * 1999-10-29 2005-01-12 Bristol-Myers Squibb Company Methods for preparing blood or plasma component solutions with improved concentrations
DE60141567D1 (de) 2000-01-25 2010-04-29 Edwards Lifesciences Corp Freisetzungssysteme zur behandlung von restenose und anastomotischer intimaler hyperplasie
US6187347B1 (en) 2000-02-09 2001-02-13 Ecosafe, Llc. Composition for arresting the flow of blood and method
JP3576063B2 (ja) * 2000-02-22 2004-10-13 株式会社ホギメディカル 凝固蛋白質を含む可溶性創傷治癒止血セルロース繊維とその製造方法
EP1155706A1 (en) * 2000-05-19 2001-11-21 Xun Yang Huang Apparatus for production of fibrin glue and its medical application
US6921532B1 (en) * 2000-06-22 2005-07-26 Spinal Restoration, Inc. Biological Bioadhesive composition and methods of preparation and use
WO2001097872A1 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 Austin Sam L Bioadhesive compositions and methods of preparation and use
US20020147462A1 (en) * 2000-09-11 2002-10-10 Closure Medical Corporation Bronchial occlusion method and apparatus
JP4199004B2 (ja) * 2000-11-07 2008-12-17 クライオライフ、インコーポレイテッド 起泡性泡沫様生体材料および方法
US6942880B1 (en) * 2001-04-09 2005-09-13 Medtronic, Inc. Autologous platelet gel having beneficial geometric shapes and methods of making the same
US7795218B2 (en) 2001-04-12 2010-09-14 Bioaxone Therapeutique Inc. ADP-ribosyl transferase fusion variant proteins
ATE420670T1 (de) * 2001-04-25 2009-01-15 Eidgenoess Tech Hochschule Arzneimittel freisetzende matrizen zur förderung der wundheilung
US7056331B2 (en) 2001-06-29 2006-06-06 Quill Medical, Inc. Suture method
US6994722B2 (en) 2001-07-03 2006-02-07 Scimed Life Systems, Inc. Implant having improved fixation to a body lumen and method for implanting the same
US6848152B2 (en) 2001-08-31 2005-02-01 Quill Medical, Inc. Method of forming barbs on a suture and apparatus for performing same
US6692515B2 (en) * 2001-11-07 2004-02-17 Frank H. Boehm, Jr. Surgical kit for repairing leaks in fluid carrying vessels and organs and method thereof
AU2002361902A1 (en) 2001-12-31 2003-07-24 Ares Medical, Inc. Hemostatic compositions and methods for controlling bleeding
AU2003225543A1 (en) * 2002-02-04 2003-09-02 Damage Control Surgical Technologies, Inc. Method and apparatus for improved hemostasis and damage control operations
DE10204405A1 (de) * 2002-02-04 2003-08-21 Surface Care Gmbh Plasmagel
US7832566B2 (en) 2002-05-24 2010-11-16 Biomet Biologics, Llc Method and apparatus for separating and concentrating a component from a multi-component material including macroparticles
US20030205538A1 (en) 2002-05-03 2003-11-06 Randel Dorian Methods and apparatus for isolating platelets from blood
US7992725B2 (en) 2002-05-03 2011-08-09 Biomet Biologics, Llc Buoy suspension fractionation system
DE10392686T5 (de) 2002-05-24 2005-07-07 Biomet Mfg. Corp., Warsaw Vorrichtung und Verfahren zum Trennen und Konzentrieren von Flüssigkeiten, welche mehrere Komponenten enthalten
US7845499B2 (en) 2002-05-24 2010-12-07 Biomet Biologics, Llc Apparatus and method for separating and concentrating fluids containing multiple components
US20060278588A1 (en) 2002-05-24 2006-12-14 Woodell-May Jennifer E Apparatus and method for separating and concentrating fluids containing multiple components
US6773450B2 (en) 2002-08-09 2004-08-10 Quill Medical, Inc. Suture anchor and method
AU2003270401B2 (en) 2002-09-10 2008-03-13 American National Red Cross Hemostatic dressing
US20040088003A1 (en) 2002-09-30 2004-05-06 Leung Jeffrey C. Barbed suture in combination with surgical needle
US8100940B2 (en) 2002-09-30 2012-01-24 Quill Medical, Inc. Barb configurations for barbed sutures
JP3640655B2 (ja) * 2002-10-23 2005-04-20 一知 井上 血管新生誘導剤
US20050004599A1 (en) * 2003-06-30 2005-01-06 Mcnally-Heintzelman Karen M. Non-light activated adhesive composite, system, and methods of use thereof
US7943810B2 (en) 2003-02-04 2011-05-17 Buckman Robert F Method and apparatus for hemostasis
JP4585743B2 (ja) * 2003-02-13 2010-11-24 独立行政法人物質・材料研究機構 生体内分解吸収性粘着性医用材料
JP5346148B2 (ja) * 2003-03-28 2013-11-20 エー・デー・ガイストリヒ・ゾーネ・アクチェンゲゼルシャフト・フュール・ヒェーミシェ・インダストリー 抗新生物性組成物および治療方法
US20040224006A1 (en) * 2003-04-21 2004-11-11 Samn Raffaniello Ancrod irradiated, impregnated or coated sutures and other first aid or wound management bandaging materials for minimizing scarring and/or preventing excessive scar formation
US7624487B2 (en) 2003-05-13 2009-12-01 Quill Medical, Inc. Apparatus and method for forming barbs on a suture
WO2005023333A2 (en) * 2003-09-04 2005-03-17 Roy Raghunandan Supercutaneous method and device for promoting hemostasis in cannulated patient
AU2004273867B2 (en) * 2003-09-12 2011-01-27 Marine Polymer Technologies, Inc. Vascular access preservation in hemodialysis patients
US20050075712A1 (en) 2003-10-06 2005-04-07 Brian Biancucci Minimally invasive valve replacement system
WO2005046528A1 (en) 2003-10-06 2005-05-26 3F Therapeutics, Inc. Minimally invasive valve replacement system
ES2396689T3 (es) 2003-12-11 2013-02-25 Isto Technologies Inc. Sistema de cartílago particulado
NZ598970A (en) 2004-05-14 2013-07-26 Ethicon Llc Suture device using an enlongated body with barbs and a needle at one end and an anchor to prevent pull-through at the other end
CA2567297A1 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Tissue sealant
JP4767252B2 (ja) 2004-06-14 2011-09-07 ヌームアールエックス・インコーポレーテッド 肺のアクセス装置
US7678767B2 (en) 2004-06-16 2010-03-16 Pneumrx, Inc. Glue compositions for lung volume reduction
US20050281739A1 (en) * 2004-06-16 2005-12-22 Glen Gong Imaging damaged lung tissue using compositions
US7553810B2 (en) * 2004-06-16 2009-06-30 Pneumrx, Inc. Lung volume reduction using glue composition
US20050281798A1 (en) * 2004-06-16 2005-12-22 Glen Gong Targeting sites of damaged lung tissue using composition
US20050288702A1 (en) 2004-06-16 2005-12-29 Mcgurk Erin Intra-bronchial lung volume reduction system
US20050281740A1 (en) * 2004-06-16 2005-12-22 Glen Gong Imaging damaged lung tissue
US7608579B2 (en) * 2004-06-16 2009-10-27 Pneumrx, Inc. Lung volume reduction using glue compositions
US20050281799A1 (en) 2004-06-16 2005-12-22 Glen Gong Targeting damaged lung tissue using compositions
US7766891B2 (en) 2004-07-08 2010-08-03 Pneumrx, Inc. Lung device with sealing features
EP1781182B1 (en) * 2004-07-08 2019-11-13 PneumRx, Inc. Pleural effusion treatment device
US8419722B2 (en) * 2004-10-29 2013-04-16 Spinal Restoration, Inc. Apparatus and method for injection of fibrin sealant in spinal applications
US8124075B2 (en) * 2004-07-16 2012-02-28 Spinal Restoration, Inc. Enhanced biological autologous tissue adhesive composition and methods of preparation and use
US7597687B2 (en) * 2004-10-29 2009-10-06 Spinal Restoration, Inc. Injection of fibrin sealant including an anesthetic in spinal applications
US8403923B2 (en) * 2004-10-29 2013-03-26 Spinal Restoration, Inc. Injection of fibrin sealant in the absence of corticosteroids in spinal applications
US8206448B2 (en) 2004-10-29 2012-06-26 Spinal Restoration, Inc. Injection of fibrin sealant using reconstituted components in spinal applications
EP1804843B1 (en) * 2004-10-18 2014-12-03 Covidien LP Adhesive suture structure
AU2005299672A1 (en) * 2004-10-22 2006-05-04 Benitec, Inc. Therapeutic RNAi agents for treating psoriasis
US20110213464A1 (en) * 2004-10-29 2011-09-01 Whitlock Steven I Injection of fibrin sealant in the absence of corticosteroids in spinal applications
EP1816945B1 (en) 2004-11-23 2019-08-21 PneumRx, Inc. Steerable device for accessing a target site
ATE419019T1 (de) * 2005-01-14 2009-01-15 Eska Implants Gmbh & Co Verfahren zur herstellung einer osteoinduktiv- antiseptischen implantatbeschichtung
US7866485B2 (en) 2005-02-07 2011-01-11 Hanuman, Llc Apparatus and method for preparing platelet rich plasma and concentrates thereof
EP2666494B1 (en) 2005-02-07 2018-01-17 Hanuman LLC Platelet rich plasma concentrate apparatus and method
EP1848474B1 (en) 2005-02-07 2013-06-12 Hanuman LLC Platelet rich plasma concentrate apparatus and method
US7766900B2 (en) 2005-02-21 2010-08-03 Biomet Manufacturing Corp. Method and apparatus for application of a fluid
WO2007025290A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 Isto Technologies, Inc. Implants and methods for repair, replacement and treatment of joint disease
US20070110788A1 (en) * 2005-11-14 2007-05-17 Hissong James B Injectable formulation capable of forming a drug-releasing device
RU2308287C2 (ru) * 2005-12-26 2007-10-20 Владимир Александрович Макаров Гемостатическое средство
US8157837B2 (en) 2006-03-13 2012-04-17 Pneumrx, Inc. Minimally invasive lung volume reduction device and method
US9402633B2 (en) 2006-03-13 2016-08-02 Pneumrx, Inc. Torque alleviating intra-airway lung volume reduction compressive implant structures
US8888800B2 (en) 2006-03-13 2014-11-18 Pneumrx, Inc. Lung volume reduction devices, methods, and systems
US20070248653A1 (en) * 2006-04-20 2007-10-25 Cochrum Kent C Hemostatic compositions and methods for controlling bleeding
US9096839B2 (en) 2006-04-26 2015-08-04 Arteriocyte Medical Systems, Inc. Compositions and methods of preparation thereof
WO2007127390A2 (en) * 2006-04-28 2007-11-08 Biolife, L.L.C. Materials and methods for wound treatment
US20070264296A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-15 Myntti Matthew F Biofilm extracellular polysachharide solvating system
US7993675B2 (en) * 2006-05-10 2011-08-09 Medtronic Xomed, Inc. Solvating system and sealant for medical use in the sinuses and nasal passages
US7976873B2 (en) 2006-05-10 2011-07-12 Medtronic Xomed, Inc. Extracellular polysaccharide solvating system for treatment of bacterial ear conditions
US7959943B2 (en) * 2006-05-10 2011-06-14 Medtronics Xomed, Inc. Solvating system and sealant for medical use in the middle or inner ear
US8567609B2 (en) 2006-05-25 2013-10-29 Biomet Biologics, Llc Apparatus and method for separating and concentrating fluids containing multiple components
NZ574653A (en) * 2006-08-04 2012-11-30 Stb Lifesaving Technologies Inc Solid dressing for treating wounded tissue
EP3028705A1 (en) * 2006-09-07 2016-06-08 Ed. Geistlich Söhne Ag Für Chemische Industrie Treating bone cancer
WO2008036763A2 (en) * 2006-09-20 2008-03-27 Pneumrx, Inc. Tissue adhesive compositions and methods thereof
US7968682B2 (en) * 2006-12-12 2011-06-28 Oregon Health & Science University Degradation-resistant fibrinogen sealants
US8163549B2 (en) 2006-12-20 2012-04-24 Zimmer Orthobiologics, Inc. Method of obtaining viable small tissue particles and use for tissue repair
US20080154233A1 (en) * 2006-12-20 2008-06-26 Zimmer Orthobiologics, Inc. Apparatus for delivering a biocompatible material to a surgical site and method of using same
EP2106263B1 (en) * 2007-01-04 2016-12-21 Hepacore Ltd. Water soluble reactive derivatives of carboxy polysaccharides and fibrinogen conjugates thereof
US8088095B2 (en) * 2007-02-08 2012-01-03 Medtronic Xomed, Inc. Polymeric sealant for medical use
GB2447012B (en) * 2007-02-21 2011-03-16 Pharmacure Health Care Ab Composition for combating epistaxis
WO2008128075A1 (en) 2007-04-12 2008-10-23 Isto Technologies, Inc. Compositions and methods for tissue repair
JP5479319B2 (ja) 2007-04-12 2014-04-23 バイオメット・バイオロジックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー ブイ式懸濁液分画システム
US8328024B2 (en) 2007-04-12 2012-12-11 Hanuman, Llc Buoy suspension fractionation system
US20080255612A1 (en) 2007-04-13 2008-10-16 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Self-retaining systems for surgical procedures
WO2009020612A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 Stb Lifesaving Technologies, Inc. Methods and dressing for sealing internal injuries
ES2488406T3 (es) 2007-09-27 2014-08-27 Ethicon Llc Suturas de auto-retención que incluyen elementos de retención a tejido con resistencia mejorada
US8771313B2 (en) 2007-12-19 2014-07-08 Ethicon, Inc. Self-retaining sutures with heat-contact mediated retainers
US8916077B1 (en) 2007-12-19 2014-12-23 Ethicon, Inc. Self-retaining sutures with retainers formed from molten material
US8118834B1 (en) 2007-12-20 2012-02-21 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Composite self-retaining sutures and method
CA2710798A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Kuros Biosurgery Ag Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
US8615856B1 (en) 2008-01-30 2013-12-31 Ethicon, Inc. Apparatus and method for forming self-retaining sutures
WO2009097556A2 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Appartaus and method for forming self-retaining sutures
US9125647B2 (en) 2008-02-21 2015-09-08 Ethicon, Inc. Method and apparatus for elevating retainers on self-retaining sutures
US8216273B1 (en) 2008-02-25 2012-07-10 Ethicon, Inc. Self-retainers with supporting structures on a suture
US8641732B1 (en) 2008-02-26 2014-02-04 Ethicon, Inc. Self-retaining suture with variable dimension filament and method
EP2259774B1 (en) 2008-02-27 2012-12-12 Biomet Biologics, LLC Methods and compositions for delivering interleukin-1 receptor antagonist
WO2009111338A1 (en) 2008-02-29 2009-09-11 Biomet Manufacturing Corp. A system and process for separating a material
US8518272B2 (en) 2008-04-04 2013-08-27 Biomet Biologics, Llc Sterile blood separating system
US20090259263A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Biomet Microfixation, Inc. Apparatus and methods of fixating bone
BRPI0911132B8 (pt) 2008-04-15 2021-06-22 Angiotech Pharm Inc sutura para ser usada em um procedimento aplicado ao tecido
US8961560B2 (en) 2008-05-16 2015-02-24 Ethicon, Inc. Bidirectional self-retaining sutures with laser-marked and/or non-laser marked indicia and methods
US8012077B2 (en) 2008-05-23 2011-09-06 Biomet Biologics, Llc Blood separating device
AU2009257390B2 (en) 2008-06-12 2014-09-04 Medtronic Xomed, Inc. Method for treating chronic wounds with an extracellular polymeric substance solvating system
US8632605B2 (en) 2008-09-12 2014-01-21 Pneumrx, Inc. Elongated lung volume reduction devices, methods, and systems
WO2010042427A2 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Microbial Defense Systems, Llc Antimicrobial composition and methods of making and using same
BRPI0921810B8 (pt) 2008-11-03 2021-06-22 Angiotech Pharm Inc montagem para inserir um comprimento de sutura no interior do corpo de um mamífero
US8187475B2 (en) 2009-03-06 2012-05-29 Biomet Biologics, Llc Method and apparatus for producing autologous thrombin
US8110208B1 (en) 2009-03-30 2012-02-07 Biolife, L.L.C. Hemostatic compositions for arresting blood flow from an open wound or surgical site
US8313954B2 (en) 2009-04-03 2012-11-20 Biomet Biologics, Llc All-in-one means of separating blood components
US20100256671A1 (en) * 2009-04-07 2010-10-07 Biomedica Management Corporation Tissue sealant for use in noncompressible hemorrhage
WO2010129258A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Mallinckrodt Inc. Tissue sealant compositions, vascular closure devices, and uses thereof
JP5809621B2 (ja) 2009-05-18 2015-11-11 ヌームアールエックス・インコーポレーテッド 患者の肺を治療するインプラント
US8367802B2 (en) * 2009-06-18 2013-02-05 Biomedica Management Corporation Method to produce fibrin monomer in acid media for use as tissue sealant
US9011800B2 (en) 2009-07-16 2015-04-21 Biomet Biologics, Llc Method and apparatus for separating biological materials
WO2011040888A1 (en) * 2009-10-01 2011-04-07 Singapore Health Services Pte Ltd A biodegradable composition or combination and uses thereof
US20110171285A1 (en) * 2009-10-28 2011-07-14 The Texas A&M University System Design of Fibrinogen and Fibrinogen Derived Products with Reduced Bacterial Binding by Using Modified Sequences of Fibrinogen Chains
US8591391B2 (en) 2010-04-12 2013-11-26 Biomet Biologics, Llc Method and apparatus for separating a material
WO2011140283A2 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Self-retaining systems having laser-cut retainers
AU2011265232B2 (en) 2010-06-11 2015-01-22 Ethicon Llc Suture delivery tools for endoscopic and robot-assisted surgery and methods
US10231721B2 (en) 2010-06-24 2019-03-19 St. Croix Surgical Systems, Llc Failsafe percutaneous wound barrier
JP2014504894A (ja) 2010-11-03 2014-02-27 アンジオテック ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 薬剤を溶出する留置縫合材及びこれに関する方法
US9675341B2 (en) 2010-11-09 2017-06-13 Ethicon Inc. Emergency self-retaining sutures and packaging
JP6125488B2 (ja) 2011-03-23 2017-05-10 エシコン・エルエルシーＥｔｈｉｃｏｎ ＬＬＣ 自己保持可変ループ縫合材
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
CA2835211C (en) 2011-05-10 2019-09-24 Next Science, Llc Antimicrobial solid and methods of making and using same
US20130172931A1 (en) 2011-06-06 2013-07-04 Jeffrey M. Gross Methods and devices for soft palate tissue elevation procedures
DE102011122227A1 (de) 2011-12-23 2013-06-27 Medizinische Hochschule Hannover Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines bioartifiziellen Gewebekonstrukts
US8999376B2 (en) 2012-02-03 2015-04-07 Xcede Technologies, Inc. Tissue patch
US9642956B2 (en) 2012-08-27 2017-05-09 Biomet Biologics, Llc Apparatus and method for separating and concentrating fluids containing multiple components
AU2013323621B2 (en) 2012-09-25 2016-04-14 Stem Cell Partners Llc Method and apparatus for preparing single donor thrombin serum
US10016527B2 (en) 2012-10-23 2018-07-10 Orthovita, Inc. Materials and methods for repair of cartilage defects
US20140178343A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Jian Q. Yao Supports and methods for promoting integration of cartilage tissue explants
US8906856B2 (en) * 2012-12-31 2014-12-09 Biomedica Mangement Corporation Single component fibrin hemostat
JP2016507279A (ja) * 2012-12-31 2016-03-10 ファルス，ジョージ，デイヴィッド 大量出血に対する凍結乾燥したフィブリンシーラント
US20140222067A1 (en) * 2013-02-01 2014-08-07 Xcede Technologies, Inc. Minimally invasive surgery, including vascular closure, and associated sealants
EP3461886A1 (en) 2013-02-12 2019-04-03 Replicel Life Sciences Inc. Methods for isolating non-bulbar dermal sheath cells and compositions
US10208095B2 (en) 2013-03-15 2019-02-19 Biomet Manufacturing, Llc Methods for making cytokine compositions from tissues using non-centrifugal methods
US20140271589A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biomet Biologics, Llc Treatment of collagen defects using protein solutions
US9950035B2 (en) 2013-03-15 2018-04-24 Biomet Biologics, Llc Methods and non-immunogenic compositions for treating inflammatory disorders
US10143725B2 (en) 2013-03-15 2018-12-04 Biomet Biologics, Llc Treatment of pain using protein solutions
US9895418B2 (en) 2013-03-15 2018-02-20 Biomet Biologics, Llc Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions
RU2522879C1 (ru) * 2013-04-23 2014-07-20 ОАО "Научно-исследовательский институт текстильных материалов" (ОАО "НИИТМ") Биодеградируемое гемостатическое лекарственное средство для остановки капиллярных и паренхиматозных кровотечений
IL230151A0 (en) * 2013-12-24 2014-09-30 Omrix Biopharmaceuticals Ltd One-component fibrin glue containing a polymerization inhibitor
IL230150A0 (en) 2013-12-24 2014-09-30 Omrix Biopharmaceuticals Ltd One-component fibrin glue containing zymogens
US10500233B2 (en) 2014-02-12 2019-12-10 Replicel Life Sciences Inc. Compositions and methods for treating bone, joints and cartilage
IL231230A0 (en) * 2014-02-27 2014-08-31 Omrix Biopharmaceuticals Ltd Fibrinogen preparation
IL231792A0 (en) 2014-03-27 2014-08-31 Omrix Biopharmaceuticals Ltd Device and method for the preparation and administration of one-component fibrin glue
BR102014011436A8 (pt) * 2014-05-12 2018-01-09 Univ Estadual Paulista Julio De Mesquita Filho selante de fibrina para uso tópico, método de formação do mesmo e seu uso
US10390838B1 (en) 2014-08-20 2019-08-27 Pneumrx, Inc. Tuned strength chronic obstructive pulmonary disease treatment
US9932388B2 (en) 2014-11-13 2018-04-03 Hemarus Therapeutics Limited Chromatographic process for producing high purity fibrinogen and thrombin
US9713810B2 (en) 2015-03-30 2017-07-25 Biomet Biologics, Llc Cell washing plunger using centrifugal force
US9757721B2 (en) 2015-05-11 2017-09-12 Biomet Biologics, Llc Cell washing plunger using centrifugal force
US10588998B2 (en) 2015-08-07 2020-03-17 Xcede Technologies, Inc. Adhesive compositions and related methods
US9540548B1 (en) 2015-08-07 2017-01-10 Xcede Technologies, Inc. Adhesive compositions and related methods
US9833538B2 (en) 2015-08-07 2017-12-05 Xcede Technologies, Inc. Adhesive compositions and related methods
US10501715B1 (en) 2015-09-11 2019-12-10 Mark H. Widick System for the formation of fibrin foam
RU2628809C1 (ru) * 2016-06-30 2017-08-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ ГНЦ Минздрава России) Гемостатическая губка и способ ее получения
FR3055805B1 (fr) 2016-09-09 2020-05-15 Assistance Publique - Hopitaux De Paris (Ap-Hp) Biomateriau a usage therapeutique
CN108220233B (zh) * 2016-12-21 2021-07-09 上海透景诊断科技有限公司 细胞分离器具表面处理方法、相关器具、外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞快速高效分离方法
CN107589246B (zh) * 2017-03-07 2019-10-01 上海原科实业发展有限公司 一种纤维蛋白激活剂、其制备方法，包括该激活剂的试剂盒及采用该试剂盒的检测方法
RU179063U1 (ru) * 2017-07-03 2018-04-25 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Амурская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации Салфетка с фибрином
US10793327B2 (en) 2017-10-09 2020-10-06 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization container and method of using same
US11154637B2 (en) 2018-11-07 2021-10-26 Industrial Technology Research Institute Biodegradable sealant and use of a biodegradable sealant in manufacture of an agent for biological tissue adhesion or repair
CN109679946B (zh) * 2019-01-04 2020-11-13 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 一种血液病毒rna保护剂及采血管
CA3130700A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization container fill fixture, system and method of use
RU2749983C1 (ru) * 2020-11-09 2021-06-21 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ герметизации панкреато-кишечного анастомоза с применением фибринового композита
EP4274625A1 (en) * 2021-01-07 2023-11-15 Baxter International Inc. Thrombin-free hemostatic materials, methods of manufacture, and uses thereof
WO2023222770A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg Novel recombinant fibrinogen variants for fibrin sealants for surgical wound care

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2533004A (en) * 1943-10-27 1950-12-05 John D Ferry Fibrin clots and methods for preparing the same
CH586233A5 (pl) * 1971-01-18 1977-03-31 Pentapharm Ag
GB1417003A (en) * 1972-06-22 1975-12-10 Radiochemical Centre Ltd Stabilisation of fibrinogen
US3915640A (en) * 1974-08-06 1975-10-28 Warner Lambert Co Method and composition for detecting fibrin monomers and fibrin degradation products
SU663404A1 (ru) * 1976-12-30 1979-05-25 Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им. М.В.Ломоносова Способ получени фибрин-мономера
US4442650A (en) * 1977-12-15 1984-04-17 Sivachenko Eugene W Girder construction
US4167823A (en) * 1978-06-21 1979-09-18 Kumming Deborah G Coagulation puzzle for teaching coagulation theory
JPS5598196A (en) * 1979-01-16 1980-07-25 Meito Sangyo Kk Fractionation of fibrinogen or its constituents and their use
SE417342B (sv) * 1979-02-05 1981-03-09 Nya Asfalt Ab Forfarande och anordning for grundleggning av for tillverkade anleggningar i land
AT359653B (de) * 1979-02-15 1980-11-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes
DE3017707A1 (de) * 1980-05-08 1981-11-12 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagens zum nachweis von fibrinmonomer
US4488198A (en) * 1981-01-15 1984-12-11 Sundstrand Corporation Protective circuit for clutchless parallel generating system
US4455290A (en) * 1981-04-02 1984-06-19 Research Corporation Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1
US4495278A (en) * 1981-04-27 1985-01-22 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Process for making novel blood clotting enzyme compositions
US4480029A (en) * 1981-04-27 1984-10-30 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Biological indicators and their use
EP0068149A3 (de) * 1981-06-25 1983-07-20 Serapharm GmbH &amp; Co. KG Fibrinogen-haltiges Trockenpräparat, dessen Herstellung und Verwendung
US4442655A (en) * 1981-06-25 1984-04-17 Serapharm Michael Stroetmann Fibrinogen-containing dry preparation, manufacture and use thereof
ATE13810T1 (de) * 1981-06-25 1985-07-15 Serapharm Gmbh & Co Kg Angereichertes plasmaderivat zur unterstuetzung von wundverschluss und wundabdeckung.
ATE20824T1 (de) * 1981-06-25 1986-08-15 Serapharm Gmbh & Co Kg Angereichertes plasmaderivat zur unterstuetzung von wundverschluss und wundheilung.
US4438198A (en) * 1981-09-30 1984-03-20 Trimedyne, Inc. Biochemically active matrix for use in a bio-artificial organ
DE3203775A1 (de) * 1982-02-04 1983-08-11 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Fibrinogenzubereitung, verfahen zu ihrer herstellungund ihre verwendung
DE3230849A1 (de) * 1982-08-19 1984-02-23 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Pasteurisiertes human-fibrinogen (hf) und verfahren zu dessen herstellung
US5357042A (en) * 1984-04-23 1994-10-18 The General Hospital Corporation Synthetic peptides capable of eliciting fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity
US4927916A (en) * 1984-04-23 1990-05-22 The General Hospital Corporation Method of producing fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity using fibrin-specific peptides
DE3430906A1 (de) * 1984-08-22 1986-02-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung von fibrinmonomer in plasma
US4928603A (en) * 1984-09-07 1990-05-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of preparing a cryoprecipitated suspension and use thereof
US4627879A (en) * 1984-09-07 1986-12-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fibrin adhesive prepared as a concentrate from single donor fresh frozen plasma
US5223420A (en) * 1985-03-01 1993-06-29 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Elastin-based product, a procedure for its preparation and its biological applications; in particular as biomaterials and artificial supports
SE447579B (sv) * 1985-04-01 1986-11-24 Biopool Ab Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrar
DE3622642A1 (de) * 1986-07-05 1988-01-14 Behringwerke Ag Einkomponenten-gewebekleber sowie verfahren zu seiner herstellung
DD261844A1 (de) * 1986-07-09 1988-11-09 Adw Ddr Verfahren zur praezipitation von fibrinmonomeren
US4714457A (en) * 1986-09-15 1987-12-22 Robert Alterbaum Method and apparatus for use in preparation of fibrinogen from a patient's blood
DK475386D0 (da) * 1986-10-03 1986-10-03 Weis Fogh Ulla Sivertsen Fremgangsmaade og apparat til fremstilling af biologiske stoffer
US4915847A (en) * 1987-08-04 1990-04-10 Baxter International Inc. Cryoglobulin separation
GB8628398D0 (en) * 1986-11-27 1986-12-31 Central Blood Lab Authority Pharmaceutically-active conjugates
US4709037A (en) * 1987-02-17 1987-11-24 Hoechst Celanese Corporation Biotinylating agents
US5175087A (en) * 1987-07-06 1992-12-29 Biopool International, Inc. Method of performing tissue plasminogen activator assay
DE3808048A1 (de) * 1988-03-11 1989-09-21 Behringwerke Ag Verfahren zum affinitaetschromatografischen reinigen von faktor xiii
US5290552A (en) * 1988-05-02 1994-03-01 Matrix Pharmaceutical, Inc./Project Hear Surgical adhesive material
AT397203B (de) * 1988-05-31 1994-02-25 Immuno Ag Gewebeklebstoff
DE3819923A1 (de) * 1988-06-11 1989-12-21 Behringwerke Ag Fibrin(ogen)derivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
WO1990004786A1 (en) * 1988-10-17 1990-05-03 Molecular Devices Corporation Hapten derivatized capture membrane and diagnostic assays using such membrane
JPH02129234A (ja) * 1988-11-09 1990-05-17 Kanebo Ltd 難燃性フェノール系樹脂プリプレグ
JPH02129224A (ja) * 1988-11-10 1990-05-17 Terumo Corp フィブリンの製造法
DE3900493A1 (de) * 1989-01-10 1990-07-12 Thomae Gmbh Dr K Verfahren zur bestimmung der fibrinolytischen gesamtaktivitaet im plasma
US5026785A (en) * 1989-05-12 1991-06-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Avidin and streptavidin modified water-soluble polymers such as polyacrylamide, and the use thereof in the construction of soluble multivalent macromolecular conjugates
CA1335361C (en) * 1989-05-24 1995-04-25 Andrei Z. Budzynski Thrombus-targeted complexes of plasminogen activator and fibrin fragments
US5226877A (en) * 1989-06-23 1993-07-13 Epstein Gordon H Method and apparatus for preparing fibrinogen adhesive from whole blood
FR2649982B1 (fr) * 1989-07-20 1991-09-27 Inst Nat Sante Rech Med Membrane biologique artificielle
EP0423938B1 (en) * 1989-09-29 1994-03-02 Rohm And Haas Company Ligand-containing medium for chromatographic separation, process for preparing the medium, and use of the medium for isolating synthetic or natural molecules from a fluid mixture
US5252743A (en) * 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
US5030215A (en) * 1990-01-03 1991-07-09 Cryolife, Inc. Preparation of fibrinogen/factor XIII precipitate
US5219328A (en) * 1990-01-03 1993-06-15 Cryolife, Inc. Fibrin sealant delivery method
US5318524A (en) * 1990-01-03 1994-06-07 Cryolife, Inc. Fibrin sealant delivery kit
US5185001A (en) * 1990-01-18 1993-02-09 The Research Foundation Of State University Of New York Method of preparing autologous plasma fibrin and application apparatus therefor
US5180828A (en) * 1990-02-09 1993-01-19 Molecular Devices Corporation Chromophoric reagents for incorporation of biotin or other haptens into macromolecules
US5420250A (en) * 1990-08-06 1995-05-30 Fibrin Corporation Phase transfer process for producing native plasma protein concentrates
AU644205B2 (en) * 1990-08-23 1993-12-02 New York Blood Center, Inc., The Assays using a soluble fibrin-like monomer
EP0485904B1 (en) * 1990-11-13 1997-08-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Mitomycin derivatives
US5206023A (en) * 1991-01-31 1993-04-27 Robert F. Shaw Method and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage
CH681693A5 (pl) * 1991-02-28 1993-05-14 Pentapharm Ag
EP0534178B1 (en) * 1991-09-27 2001-04-18 Omrix Biopharmaceuticals S.A. Improved tissue glue prepared by using cryoprecipitate
US5527692A (en) * 1991-12-31 1996-06-18 Zymogenetics, Inc. Methods for producing thrombin
US5272074A (en) * 1992-04-23 1993-12-21 Mcmaster University Fibrin coated polymer surfaces
US5443959A (en) * 1992-09-09 1995-08-22 Tokuyama Corporation Method of assaying fibrinogen, dry reagent therefor, and process for the preparation thereof
CN1091315A (zh) 1992-10-08 1994-08-31 E·R·斯奎布父子公司 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法
US5292416A (en) * 1992-11-13 1994-03-08 Indiana University Foundation Pulsed-field separation of polysaccharides in capillaries
US5520885A (en) * 1993-01-19 1996-05-28 Thermogenesis Corporation Fibrinogen processing apparatus, method and container
US5330974A (en) * 1993-03-01 1994-07-19 Fibratek, Inc. Therapeutic fibrinogen compositions
AU696691C (en) * 1993-03-12 2003-09-18 American National Red Cross, The Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
US5464471A (en) * 1994-11-10 1995-11-07 Whalen Biomedical Inc. Fibrin monomer based tissue adhesive
US5510102A (en) * 1995-01-23 1996-04-23 The Regents Of The University Of California Plasma and polymer containing surgical hemostatic adhesives
EP0841108A1 (en) * 1996-11-06 1998-05-13 Norsk Hydro ASA Process for connecting metal members

Also Published As

Publication number Publication date
HUT66587A (en) 1994-12-28
CZ211793A3 (en) 1996-04-17
KR940008697A (ko) 1994-05-16
AU4887893A (en) 1994-04-21
IL107211A (en) 1997-09-30
CA2510981A1 (en) 1994-04-09
CA2566574A1 (en) 1994-04-09
JPH06199685A (ja) 1994-07-19
SG49640A1 (en) 1998-06-15
CA2108104A1 (en) 1994-04-09
NZ328064A (en) 2000-08-25
NZ280264A (en) 1997-08-22
NO933624L (no) 1994-04-11
PT592242E (pt) 2003-11-28
ES2065294A1 (es) 1995-02-01
JP3771284B2 (ja) 2006-04-26
ATE244581T1 (de) 2003-07-15
PL173858B1 (pl) 1998-05-29
AU676201B2 (en) 1997-03-06
CA2510981C (en) 2007-02-13
EP1266666A2 (en) 2002-12-18
MX9306272A (es) 1994-07-29
US5770194A (en) 1998-06-23
US6077507A (en) 2000-06-20
US5962026A (en) 1999-10-05
US6048966A (en) 2000-04-11
SK109393A3 (en) 1994-06-08
FI110616B (fi) 2003-02-28
HU218898B (hu) 2000-12-28
CN1091315A (zh) 1994-08-31
US5739288A (en) 1998-04-14
US5763410A (en) 1998-06-09
EP0592242A1 (en) 1994-04-13
HU9302839D0 (en) 1994-01-28
US5962420A (en) 1999-10-05
ES2202306T3 (es) 2004-04-01
NZ248897A (en) 1996-08-27
CA2108104C (en) 2005-09-27
IL107211A0 (en) 1994-01-25
US5763411A (en) 1998-06-09
ES2065294B1 (es) 1995-11-01
US6262236B1 (en) 2001-07-17
EP0592242B1 (en) 2003-07-09
PL175443B1 (pl) 1998-12-31
NO314412B1 (no) 2003-03-17
RU2143924C1 (ru) 2000-01-10
EP1266666A3 (en) 2003-01-22
BR9304185A (pt) 1994-05-03
NO933624D0 (no) 1993-10-08
US5804428A (en) 1998-09-08
US5773418A (en) 1998-06-30
DE69333080T2 (de) 2004-04-15
DE69333080D1 (de) 2003-08-14
FI934440A (fi) 1994-04-09
US5750657A (en) 1998-05-12
FI934440A0 (fi) 1993-10-08
DK0592242T3 (da) 2003-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL176202B1 (pl) Sposób wytwarzania spoiwa fibrynowego
US5330974A (en) Therapeutic fibrinogen compositions
US20120156284A1 (en) Enhanced biological autologous tissue adhesive composition and methods of preparation and use
FR2510408A1 (fr) Colle pour tissus
WO1992013495A1 (en) Fibrinogen based adhesive
US6492494B1 (en) Method of making a fibrin sealant comprising alpha-2-antiplasmin
JPH0757760B2 (ja) 生体由来物質の固定化方法
JPH04364200A (ja) 細胞接着性アルブミン