JP3771284B2 - フイブリン密封組成物とその使用方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はフイブリン密封剤に関する。特に本発明はフイブリンモノマーを含有する組成物又は非架橋フイブリンを含有する組成物がフイブリン密封剤の構成成分となっているフイブリン密封剤及びその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物の止血、即ち血液の損失を防ぐ一つの機構は血塊の形成である。ヒトの場合の血塊の形成、即ち血液の凝固は、フイブリノゲンがトロンビンによってモノマーに変換し、カルシウムイオン、及び活性第ＸＩＩＩ因子によって最終的には架橋したフイブリンＩＩポリマー即ちフイブリン塊になる複雑な反応過程によって生じる。
【０００３】
架橋したフイブリンＩＩポリマーの形成は、フイブリノゲンがトロンビンによってフイブリンＩモノマーに変換しこれが自発的に重合してフイブリンＩポリマーになることにより進行する。フイブリンＩポリマーは適宜な化学的手段で再びフイブリンＩモノマーに再変換することが出来るので可溶性フイブリンＩとも呼ばれる。フイブリンＩポリマーはそれからトロンビンによってフイブリンＩＩポリマーに変換され、これは適宜な化学的手段でフイブリンＩＩポリマーをフイブリンＩＩモノマーに変換出来るので可溶性フイブリンＩＩとも呼ばれる。活性化された第ＸＩＩＩ因子として知られる第ＸＩＩＩの因子の作用によってフイブリンＩＩポリマーは架橋して架橋フイブリンＩＩとなりこのものがフイブリン塊である。第ＸＩＩＩ因子はカルシウムイオンの存在下トロンビンによって活性化される。架橋したフイブリンＩＩはフイブリンＩＩモノマーにはなり得ないのでときには不溶性フイブリンＩＩとも呼ばれる。
【０００４】
トロンビンはプロトロンビンより生成することに留意するべきである。プロトロンビンはカルシウムと他の補助物質の存在下第Ｘａ因子によってトロンビンに変換する。
【０００５】
フイブリノゲンは血漿タンパク１リットルにつき２〜４ｇ存在する。フイブリノゲンはモノマーであり、（Ａα）_２、（Ｂβ）_２、γ_２で表される３つのジスルフイド対を形成したポリペプチド鎖によって構成されている。“Ａ”及び“Ｂ”はそれぞれフイブリノペプチドＡ、フイブリノペプチドＢとして知られている２つの小さな、アミノ末端をもつペプチドである。トロンビンによるフイブリノゲンの分解の過程では、フイブリノゲンよりフイブリノペプチドＡが分離してフイブリンＩ化合物となり、続いてフイブリノペプチドＢが分離してフイブリンＩＩ化合物となる。このようにフイブリノペプチドＡ及びＢの分離によってフイブリノゲンの分子量は激減し、３４０，０００ダルトンが約６，０００ダルトンになるが重合部位は露出している。血液凝固の機構及びフイブリノゲンの構造については、Ｃ．Ｍ．ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：７６５−８１１（１９８０）、及びＢ．フリエ（Ｆｕｒｉｅ）及びＢ．Ｃ．フリエ（Ｆｕｒｉｅ）、Ｃｅｌｌ、５３：５０５−５１８（１９８８）を参照されたい。
【０００６】
フイブリン密封剤は生化学的な接着剤であり、その作用は血液凝固の最終の工程、その段階でフイブリン塊が生成する、を模したものである。通常のフイブリン密封剤は、濃縮されたヒトフイブリノゲン、ウシアプロチニン及び第ＸＩＩＩ因子を第１の成分とし、ウシトロンビン及び塩化カルシウムを第２の成分とすることにより構成されている。通常２重筒の注射器を使用し、フイブリン塊を形成させたい部位に両成分を同時に投与する方法によって使用される。アプロチニンはフイブリン分解阻害剤であり、フイブリン密封剤の安定性を増進させるために加えられる。
【０００７】
フイブリン密封剤のフイブリノゲン成分はプールされたヒト血漿から調製される。フイブリノゲンはヒト血漿から冷却沈澱法やいろいろの試薬、即ちポリエチレングリコール、エーテル、エタノール、硫酸アンモニウム、又はグリシンを使用して沈澱させることにより濃縮される。フイブリン密封剤についてのすぐれた概説としてＭ．ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５：２４０−２４４（１９９１）；Ｊ．Ｗ．ギブル（Ｇｉｂｂｌｅ）及びＰ．Ｍ．ネス（Ｎｅｓｓ）、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３０：７４１−７４７（１９９０）；Ｈ．マトラス（Ｍａｔｒａｓ），Ｊ．Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ．，４３：６０５−６１１（１９８５）、及びＲ．レルネル（Ｌｅｒｎｅｒ），及びＮ．ビヌル（Ｂｉｎｕｒ），Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８：１６５−１８１（１９９０）を参照されたい。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
最近自系のフイブリンを使用したフイブリン密封剤の調製について関心が持たれている。自系のフイブリン密封剤とはフイブリン密封剤のフイブリノゲン成分が患者自身の血液から抽出されたものであるフイブリン密封剤である。自系のフイブリン密封剤の使用は、プールされたヒト血漿から抽出されたフイブリノゲン成分中に存在するかも知れない病原菌による疾病、即ちＢ型肝炎、非Ａ、非Ｂ型肝炎及び後天性免疫不全症候群（エイズ）のような輸血によって感染する疾病の危険を回避出来ることから好ましいことである。Ｌ．Ｅ．シルバーステイン（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ）ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２８：３１９−３２１（１９８８）；Ｋ．レイタカリ（Ｌａｉｔａｋａｒｉ）及びＪ．ルオトネン（Ｌｕｏｔｏｎｅｎ）、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ，９９：９７４−９７６（１９８９），及びＡ．ドレスデール（Ｄｒｅｓｄａｌｅ）ら、Ｔｈｅ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ、４０：３８５−３８７（１９８５）を参照。
【０００９】
ある種の疾病はフイブリノゲンを使用したフイブリン密封剤のみならずウシアプロチニン及びウシトロンビンを使用した密封剤によっても感染する。ウシトロンビンはウシ海綿状脳炎、及び他のウイルス性病原を哺乳動物に感染することが知られている。更にウシトロンビンはヒトに対して免疫反応を起こす原因となる強力な抗原でもある。このようにウシトロンビンの使用は、ウシトロンビンを投与されたものにとってその危険を蒙る結果となる。Ｄ．Ｍ．テーラー（Ｔａｙｌｏｒ），Ｊ．Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１８（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ）：１４１−１４６（１９９１），Ｓ．Ｂ．プルシネル（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ）ら、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ，８１ Ｎｏ．２：８５−９６（１９９１），及びＤ．マッテウス（Ｍａｔｔｈｅｗｓ），Ｊ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｈｅａｌｔｈ，３−５（２月，１９９１）を参照。
【００１０】
したがってウイルス汚染の危険のない、即ち副作用の危険のないフイブリン密封剤を患者に供給する必要があるのである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（ａ）所望の部位をフイブリンモノマーを含有する組成物と接触させ；そして
（ｂ）該接触段階で接触すると同時に該フイブリンモノマーがフイブリンポリマーに変換し、それによってフイブリン塊を形成する
ことを特徴とするフイブリン密封剤とその使用法に関する。
【００１２】
本発明は又そのような組成物を調製する方法及びフイブリンモノマーを含有する組成物及びキットを提供する。
【００１３】
本発明の他の観点は、
（ａ）所望の部位を非架橋フイブリンを含有する組成物と接触させ；そして
（ｂ）接触と同時に非架橋フイブリンを架橋フイブリンに変換し、フイブリン塊を形成する
ことを特徴とするフイブリン密封剤とその使用法に関する。
【００１４】
本発明の主題は又そのような組成物を調製する方法及びそのような非架橋フイブリンを含有する組成物、及びキットを提供する。
【００１５】
本発明の目的のために以下の定義が使用されている：
フイブリン───いかなる型式のフイブリンをも意味する。これに限定するものではないがフイブリンの例としては、フイブリンＩ、フイブリンＩＩ、及びデスＢＢフイブリンを包含する。フイブリンはモノマー又はポリマーとして存在し、ポリマーは非架橋か架橋のいずれかである。
【００１６】
フィブリン・モノマー−フィブリン・モノマーはいかなるフィブリンの型式をも包含する、即ち、フィブリンＩ、フィブリンＩＩ、又はデスＢＢフィブリンであり、そのなかでフィブリンはモノマー型であり、それらはフィブリン・モノマーを含有する組成中で可溶化されるものであり、又フィブリン・モノマーはフィブリン・ポリマーに変換することが出来るものである。
【００１７】
フイブリンポリマー───フイブリンポリマーはいかなる型式のフイブリンをも包含する、即ちフイブリンＩ、フイブリンＩＩ又はデスＢＢフイブリンであってもよく、該フイブリンはポリマーであって非架橋、架橋のいずれであってもよい。
【００１８】
非架橋フイブリン───非架橋フイブリンはいかなる型式のフイブリンをも包含する、即ちフイブリンＩ、フイブリンＩＩ又はデスＢＢフイブリンであり、フイブリンは非架橋であり、架橋フイプリンに変換することが出来る。非架橋フイブリンはフイブリンモノマーであってもよいし、又非架橋フイブリンポリマーであってもよい。
【００１９】
架橋フイブリン───架橋フイブリンはいかなる型式のフイブリンをも包含する、即ちフイブリンＩ、フイブリンＩＩ又はデスＢＢフイブリンであってもよく、そのなかでフイブリンはフイブリンポリマーであり、架橋している。
【００２０】
本発明は、
（ａ）所望の部位をフイブリンモノマーを含有する組成物と接触させ；そして
（ｂ）接触と同時に該フイブリンモノマーをフイブリンポリマーに変換し、それによってフイブリン塊を形成する
ことを特徴とするフイブリン密封剤及びその使用法に関する。
【００２１】
本発明は又そのような組成物の調製法、及びフイブリンモノマーを含有する組成及びキットを提供する。
【００２２】
本発明の他の観点は、
（ａ）所望の部位を非架橋フイブリンを含有する組成物と接触させ；そして
（ｂ）接触と同時に非架橋フイブリンを架橋フイブリンに変換し、それによってフイブリン塊を形成する
ことを包含するフイブリン密封剤及びその使用法に関する。
【００２３】
本発明は又、そのような組成物の調製法及びそのような非架橋フイブリンを含有する組成及びキットをも提供する。
【００２４】
本発明のフイブリンモノマーを含有するフイブリン組成物は、フイブリンポリマーに変換することのできるいかなるフイブリンモノマーの型をも包含する組成物である。フイブリンモノマーの限定的でない例としては、フイブリンＩモノマー、フイブリンＩＩモノマー或いはデスＢＢフイブリンモノマーであり、好適にはフイブリンＩモノマーである。勿論フイブリンモノマーの混合物であってもよい。本発明の目的として、フイブリンポリマーはフイブリンモノマーの重合によって生じる如何なるポリマーをも包含する。例えばフイブリンＩモノマーのフイブリンポリマーへの変換は、変換工程の行われ方によって、架橋又は非架橋のフイブリンＩポリマー、及び／又は、架橋又は非架橋のフイブリンＩＩポリマーが生成する。
【００２５】
フイブリンＩモノマーはフイブリノゲンとは対照的にトロンビン又は第ＸＩＩ１因子を使用することなく容易にフイブリンポリマーに変換されるので好適である。事実フイブリンＩモノマーは自発的にフイブリンＩポリマーを形成し、フイブリンＩポリマーが架橋体であるか、非架橋体であるか又更に変換してフイブリンＩＩポリマーになっているかどうかに拘りなくフイブリン塊として作用することが出来る。このようにフイブリンＩモノマーよりフイブリンＩポリマーの形成が自発的であるのでフイブリンＩポリマーはトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子なくして形成されるのでウシトロンビンに関連した問題は回避出来る。（もしフイブリンＩモノマーが患者の血液と接触するように使用された場合、例えば傷口で接触した場合、患者のトロンヒン及び第ＸＩＩＩ因子がフイブリンＩポリマーを架橋フイブリンＩＩポリマーに変換するであろうことに留意すべきである）。
【００２６】
非架橋フイブリンを含む組成物はいかなる型の非架橋フイブリンを含む組成物であってもよい。非架橋フイブリンの限定的でない例は、非架橋フイブリンＩ、非架橋フイブリンＩＩ、及びデスＢＢフイブリンであり、非架橋フイブリンＩが好ましい。勿論非架橋フイブリンの混合物も包含される。本発明の“架橋フイブリン”は非架橋フイブリンから架橋フイブリンに変換することによるいかなる型のフイブリンをも包含する。例えば非架橋フイブリンＩより架橋フイブリンへの変換の結果生成した架橋フイブリンは、架橋フイブリンＩ及び／又は架橋フイブリンＩＩであり、これは変換の工程如何に依存している。
【００２７】
フイブリノゲンと比較してより容易に架橋フイブリンに変換出来ることにより非架橋フイブリンＩが好適である。事実フイブリンＩは架橋フイブリンＩを生成すると信じられており、この架橋フイブリンＩがフイブリン密封剤として作用する。このように非架橋フイブリンＩから架橋フイブリンＩの生成はトロンビンなしで進行し、このことにより、活性第ＸＩＩＩ因子は必要ではあるがウシトロンビンに関連した問題は回避できる。（もし、非架橋フイブリンＩが患者の血液と接触するように使用された場合、例えば傷口で接触した場合、患者のトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子がフイブリンＩを架橋フイブリンＩＩに変換するであろうことに留意すべきである）。
【００２８】
オリゴマー又はモノマー、即ちフイブリンモノマーは好適ではあるが非架橋フイブリンも又ポリマー、オリゴマー或いはモノマーであってもよい。これは重合体になった非架橋フイブリンは通常ゲル状となり、そのために所望の部位に分配することが困難となり、所望の部位の細胞と殆ど接触出来ない状態になるからである。これに反して得られたオリゴマー或いはモノマーである非架橋フイブリンは可溶体であり、それ故より容易に所望の部位に分配され、細胞とうまく接触する。勿論組成物は非架橋フイブリンのそのような型の混合物を含有するものであってもよい。
【００２９】
フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含有する組成物の供給源は、フイブリンモノマーがフイブリンポリマーに変換出来るもの、或いは非架橋フイブリンが架橋フイブリンに変換出来るものであれば周知のものであってもよいし又開発されるべきものであってもよい。これによって制限するものではないが、フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物の供給源の例としては、血液、好ましくは哺乳動物の血液、更に好ましくはヒト血液であり又フイブリノゲンを分泌する細胞培養、組換えフイブリンであり、中でも血液が好適である。血液はいかなる型のものであってもよく、例えば全血であってもよいし又は調製されたフイブリノゲン製品であってもよい。又血液は自系のフイブリン密封剤の調製にも使用することが出来る。
【００３０】
以下に記載したフイブリンＩモノマーか又はフイブリンＩポリマーのいずれかである全血から調製した非架橋フイブリンＩを含有する組成物は、トロンビンや第ＸＩＩＩ因子やその他の血液を凝固させるに必要な物質を添加することなく架橋フイブリンＩＩに変換することが出来ることが観察された。これは全血から調製された非架橋フイブリンＩを含む組成物は外部からトロンビンや第ＸＩＩＩ因子を添加しなくても非架橋フイブリンＩを架橋フイブリンＩＩに変換させるに十分な量のプロトロンビン、第ＸＩＩＩ因子及びその他の必要な物質を保持しているという事実によるものであると信じられる。この内在しているプロトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子は本発明のフイブリン密封剤中にフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含有する組成物の成分として使用することが出来る。
【００３１】
しかしながらこの内在しているトロンビンと第ＸＩＩＩ因子は、フイブリン密封剤にとって好ましい反応速度でフイブリノゲンを架橋フイブリンＩＩに変換するに十分な量ではないことに留意すべきである。当量反応で非架橋フイブリンＩを架橋フイブリンＩＩに変換する場合よりもフイブリノゲンを架橋フイブリンＩＩに変換する場合の方がより多くのトロンビンが必要であると考えられる。
【００３２】
３つのそれぞれの供給源は、フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンに変換されるフイブリノゲンを含んでいる。この変換工程に加えて、フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む得られた組成物は濃縮された状態になっていなければならない。フイブリンモノマーの濃度が１０ｍｇ／ｍｌよりも少なくないことが好ましく、更に好ましくは濃度が２０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである。
【００３３】
これに加えてフィブリンモノマー又は非架橋フィブリンが非動的であることが好ましい。本発明の目的である非架橋フィブリンを含有する非動的組成物とは、当該組成物中の非架橋フィブリンが当該組成物が調製されてから少なくとも１．５分間架橋されないことを意味する。当該非架橋フィブリンは、当該組成物が調製されてから好ましくは３分間、最も好ましくは少なくとも３０分間架橋されない。本発明の目的であるフィブリンモノマーを含む非動的組成物とは、当該組成物中のフィブリンモノマーが、当該組成物が調製されてから少なくとも１．５分間重合しないことを意味する。当該組成物中のフィブリンモノマーは、当該組成物が調製されてから好ましくは３分間、最も好ましくは少なくとも３０分間重合しない。事実フィブリンモノマーを含む組成は調製後少なくとも数日即ち約７２時間非動的であることに注目すべきである。
【００３４】
フイブリンモノマー或いは非架橋フイブリンを含む組成物は血液より調製することが出来る。この方法は非架橋フイブリン型である水素結合したフイブリンポリマーを生成する。このポリマーはフイブリン密封剤の成分として使用出来るか又は可溶化と称される工程によってフイブリンモノマーに変換することが出来、いずれも以下に述べられている。フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンは滅菌環境で調製されることが好ましい。
【００３５】
フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物は献血者より提供される血液の全血より調製することが出来、好ましくは抗凝血剤の存在下調製する。いかなる凝血剤も使用可能である。これによって制限されるものでない凝血剤の例としては、ヘパリン、ＥＤＴＡ、ヒルジン、クエン酸又は、直接的であれ、間接的であれトロンビンの生成を阻害するその他の試薬であって、なかでもクエン酸が好適である。
【００３６】
フイブリノゲンを含む血漿は、全血から分離される。いかなる分離技術も使用出来る。例えば沈降法、遠心分離法、或いは濾過法である。遠心分離法は３，０００ｇで約１０分で行うことが出来る。しかし、多血小板血漿を得たいのであれば遠心分離はより低いｇ．力例えば５００ｇ．で２０分行うのがよい。血漿を含む上澄液は慣用の技術で分離することが出来る。
【００３７】
濾過は全血を、血液細胞が血漿から分離出来る適宜なフィルターを通過させることによって行うことが出来る。フィルターはプロテインを良好に通過させるミクロポーラスな膜が好ましい。
【００３８】
得られた血漿はフイブリノゲンをフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンに変換する処理を行う。この変換は周知の技術又は開発されるべき技術によって行うことが出来る。
【００３９】
フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンの調製は、トロンビンを包含したトロンビン様酵素を使用することによって行う。トロンビン様酵素とはフイブリノゲンよりフイブリンを形成することに触媒できる酵素である。トロンビン様酵素の通常の供給源はヘビ毒である。好ましくはトロンビン様酵素はヘビ毒より精製する。トロンビン様酵素の選択によってフイブリノペプチドＡを切断───フイブリンＩを生成、フイブリノペプチドＢを切断───デスＢＢフイブリンを生成、フイブリノペプチドＡ及びＢを切断───フイブリンＩＩを生成することが出来る。フイブリノペプチドＡとＢを切り離すトロンビン様酵素は異なった速度で切り離すであろうことに留意すべきである。そのために生成する組成物は例えばフイブリンＩＩとフイブリンＩの混合物、或いはフイブリンＩＩとデスＢＢフイブリンの混合物が得られる可能性がある。
【００４０】
表Ｉは本発明に使用出来るヘビ毒に由来する制限的でない例のリストであり、トロンビン様酵素の名称、酵素によって切り離されるフイブリノペプチドが記されている。ヘビ毒由来の酵素の考察には、Ｈ．パークル（Ｐｉｒｋｌｅ）及びＫ．ストッカー（Ｓｔｏｃｋｅｒ）、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，６５（４）：４４４−４５０（１９９１）を参照されたい。
【００４１】
【表１】

【００４２】
好ましいトロンビン様酵素はバトロキソビン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）であり、特にＢ．ムウエニイ（Ｍｏｏｊｅｎｉ）、Ｂ．マランハオ（Ｍａｒａｎｈａｏ）及びＢ．アトロクス（ａｔｒｏｘ）及びアンクロド（Ａｎｃｒｏｄ）であり、特にＡ．ロドストマ（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）由来のものである。
【００４３】
フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンは血漿をトロンビン様酵素と接触させ、そこで血漿中のフイブリノゲンをフイブリンモノマーに変換させることによって得ることが出来る。しかし生成したフイブリンモノマーは自発的に重合してゲルを形成し、溶液である血清より分離する。そのゲルは非架橋フイブリンを含有する組成である。
【００４４】
この非架橋フイブリンゲルは例えば遠心分離（３，０００ｇ．，１０分）、血清から非架橋フイブリンの直接手法による分離、そのまま又は加圧による濾過、続いて遊離した血清を除くことによって収得することが出来る。（例えば、１−１００ミクロンのポアサイズのフィルターが使用できる、Ｐｏｒｅｘ社製の融結ポリプロピレン２０ミクロンポアサイズのフィルター、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ社製のテフロン製２０−７０ミクロンポアサイズのフィルター又はＣｏｓｔａｒ社製のナイロン６６製２２−４６ミクロンポアフィルターが使用出来る）。
【００４５】
この収得法によって溶液である血清より非架橋フイブリンゲルを分離し、これによって血漿と対応している非架橋フイブリンゲルを濃縮する。その非架橋フイブリンゲルは、外部からトロンビン又は第ＸＩＩＩ因子を添加しなくても非架橋フイブリンが架橋フイブリンに変換することが出来る少なくともある程度のプロトロンビン、第ＸＩＩＩ因子、及び血漿から得られる他の必要な物質を含有していることを理解すべきである。この内因性プロトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子は本発明のフイブリン密封剤中でフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物の成分として使用することが出来る。
【００４６】
調製時の遠心分離の速度、又は濾過の圧力は非架橋フイブリンゲルからどの程度血清を除去するかによって定められる、即ち遠心力が大きい程、又は濾過の圧力が大きければ大きい程非架橋フイブリンゲルは濃縮される。しかしそのような力又は圧力はトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子が非架橋フイブリンゲルより除去されてしまう程強くないことが好ましい。
【００４７】
非架橋フイブリンゲルはここに非架橋フイブリンを含む組成として非架橋フイブリンを含有する組成物であるフイブリン密封剤の成分として使用するように準備されたことになる。もしこのような組成物が全血より調製されると６０−９０％の全血中に存在したフイブリノゲンがその組成物中に存在することになる、勿論それは非架橋フイブリンとしてである。
【００４８】
非架橋フイブリンを含んだ組成物は調製されればすぐ使用可能である。事実その成分が自系である場合は調製後直ちに使用する方が特に好ましい。もしその組成物が調整後すぐに使用されない場合はその組成物は貯蔵することも出来る。その組成物の保存は例えば凍結、又は凍結乾燥するか又は４℃で保存することが必要である。凍結又は凍結乾燥した場合は数カ月間安定である。４℃で保存した場合は数日間安定であると考えられている。
【００４９】
もし組成物を凍結した場合、使用に際しては解凍しなければならない。
【００５０】
非架橋フイブリンゲルを形成することとなるこの技術は、フイブリノゲンを非架橋フイブリンゲルに変換し、そのゲルを基本的には１段階で濃縮する。他の方法として、あまり好ましくはないが、慣用の技術、例えばポリエチレングリコール、エーテル、エタノール、硫酸アンモニウム、又はグリシンのような種々の試薬を用いての結晶沈澱及び沈澱法によって濃縮することが出来る。濃縮されたフイブリノゲンは上記の技術により非架橋フイブリンゲルに変換することが出来る。好ましくは、フイブリノゲンはすでに濃縮されているので最初に非架橋フイブリンゲルを形成させることなくフイブリンモノマーを含む組成物に変換することが出来る。濃縮されたフイブリノゲンをカオトロピズム剤と接触させてフイブリノゲン溶液にすることが出来る。
【００５１】
カオトロピズム剤は、フイブリノゲンをトロンビン様酵素と接触することによって生じるフイブリンモノマーが自発的に重合することを阻害する。カオトロピズム剤はフイブリノゲン組成と混合し、１〜２分振盪してフイブリノゲン溶液とする。フイブリノゲンは上記のようなトロンビン様酵素又は以下に記す支持体に固定したトロンビン様酵素を用いてフイブリンモノマーに変換する。
【００５２】
適宜なカオトロピズム剤は、尿素、臭化ナトリウム、グアニジン塩酸塩、ＫＣＮＳ、沃化カリ及び臭化カリを包含する。カオトロピズム剤の好ましい濃度は０．２〜６．０モル濃度であり、最も好ましくは０．３〜２．０モル濃度である。フイブリンモノマーが自発的に重合しないように出来るだけ少量のカオトロピズム剤の使用が好ましい。
【００５３】
以下に示すようにフイブリンモノマーをフイブリンポリマーに変換することが望ましいときに至るまでカルシウムイオンを加えない方が得策であることに留意すべきである。このことはフイブリンモノマーが内因的血液凝固要素の活性化によって架橋することのないようにすることである。
【００５４】
好ましい実施態様としては、トロンビン様酵素を支持体に固定することである。そのような態様は固定した酵素を血漿から容易に分離することが出来、このことにより酵素による汚染がないよう非架橋フイブリンを含む組成を保護することが出来るので好適である。
【００５５】
本発明に於いては、支持体は、トロンビン様酵素が捕捉出来るものであればいずれでも有用である。制限的でない、好ましい支持体の例としては、セルローズ、ポリデキストラン、アガロース、ポリスチレン、シリカ、ポリアクリル酸、ポリビニールアルコール、ガラスビーズ及びポリテトラフルオロエチレンであり、シリカ及びアガロースが好ましく、最も好ましくはアガロースである。
【００５６】
他の好適な実施態様に於いては、トロンビン様酵素はフィルター又はフィルターの片面である支持体に固定されており、そして例えばビーズのような他の支持体に付着しているものである。さもなければトロンビン様酵素はフィルターを通過することになる。このようにフィルターのポアサイズは、固定化したトロンビン様酵素はフィルターを通過出来ないが非架橋フイブリンはフィルターを通過することが出来る、そのようなものでなければならない。非架橋フイブリンは血漿をフィルターの片面に固定したトロンビン様酵素に接触し、フイブリンモノマーを形成し、血漿の残部とともにフィルターを通過する。このようにして得られた非架橋フイブリンを含む組成物はトロンビン様酵素から分離することが必要である。そのフイブリンモノマーはフィルターを通過ののち自発的に重合して非架橋フイブリンポリマーとなる。
【００５７】
トロンビン様酵素を支持体に固定するために、支持体は活性化されなければならない。このことは適宜な技術で実施することが出来る。例えば支持体を誘導体化するのに利用出来るいろいろな活性化化学は：
ジアゾニウム基、イソシアネート基、酸クロリド基、酸無水物基、スルホニルクロリド基、ジニトロフルオロフエニル基、イソチオシアネート基、ヒドロキシ基、アミン基、ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド基、トリアジン基、ヒドラジノ基、カルボジイミド基、シラン基、及び臭化シアンである。（ａ）ペンタフアルム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）の特許ドイツ特許第２４４０２５４Ａ１号；（ｂ）Ｐ．Ｄ．Ｇ．ディーン（Ｄｅａｎ）、Ｗ．Ｓ．ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）及びＦ．Ａ．ミドル（Ｍｉｄｄｌｅ）（編者）（１９９１年）、ＩＲＬ出版社 オックスフォード───アフィニティクロマトグラフ法───実際的使用───第２章───活性化法を参照、これらは本明細書中参考文献として記載される。
【００５８】
好ましい活性化化学はヒドラジド基の使用である。ヒドラジド基で活性化された支持体の使用は、基本的に酵素の漏出がなくその活性を維持したトロンビン様酵素の最大限の率（少なくともＳ２２３８評価法──Ｇ．アクセルソン（Ａｘｅｌｓｓｏｎ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，３６：５１７（１９７６）参照───によって約３０％〜約５０％）でその活性を維持した結果となっている。又低いｐＨ値、即ちｐＨ４−６が酵素の分解を防ぐために酵素カップリングに利用出来る。
【００５９】
通常支持体は反応性の高い化合物で活性化され、続いて配位子の活性基、即ち−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯと反応して共有結合を形成する。本発明に使用される好ましい活性化化学は：
（ａ）トリアジン基、好ましくはハロゲン化トリアジン基による方法；
（ｂ）トレシルクロリド基による方法；
（ｃ）カルボニルジイミダゾール基による方法；
（ｄ）シアノゲンブロミドによる方法；及び
（ｅ）ヒドラジド又はアミノ基による方法
である。
【００６０】
（ａ）−（ｄ）に於いては、プロテインは−ＮＨ_２、−ＳＨ又は−ＯＨ基との反応を介して結合し、一方（ｅ）に於いてはプロテインは酸化された水酸化炭素基、即ち−ＣＨＯを介して結合する。これらの化学の使用は、活性をもったトロンビン様酵素の最大限の率（Ｓ２２３８評価法によって少なくとも約３０％〜約５０％）で、酵素漏出なく維持する結果になっている。
【００６１】
トリアジンによる活性化として２つの異なった方法が使用された。まず最初の方法は、トリアジンを直接表面の水酸基に結合させることである。これは表面の２個の水酸基とＣＮＢｒとを反応させるときに用いるＣＮＢｒ活性化法と良く似た方法である。トリアジンの活性化としてアガロースのＯＨ基はトリアジン（シアヌル酸クロリド）と反応させた。
【００６２】
【化１】

【００６３】
一般的には支持体は非常に活性の高い化合物で活性化され、続いて配位子の官能基、即ち−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＳＨ、−ＣＨＯと反応して共有結合を形成する。残ったトロンビン様酵素のついていない活性基は、基本的なことではないが、エタノールアミン、無水酢酸又はグリシンのような活性のない化合物でブロックすることが出来る。
【００６４】
本発明に於ける好ましい活性化学は：
（ａ）シアノゲンブロミドで活性化し、続いてプロテイン上の−ＮＨ_２基を介して酵素と直接結合する。
（ｂ）支持体をモノクロロトリアジンで活性化し、続いて−ＮＨ_２、−ＯＨ、又は−ＳＨ基を介して酵素と結合。
（ｃ）支持体をジクロロトリアジンで活性化し、続いて−ＮＨ_２、−ＯＨ、又は−ＳＨ基を介して酵素と結合。
（ｄ）支持体をトレシルクロリドで活性化し、続いて−ＮＨ_２、−ＯＨ、又は−ＳＨ基を介して酵素と結合。
（ｅ）支持体をアジピン酸ヒドラジド又はヒドラジンで活性化し、続いて−ＣＨＯ基を介して酸化された酵素と結合。
（ｆ）支持体をアミノ配位子で活性化し、続いて−ＣＨＯを介して酸化された酵素と結合する。
【００６５】
上記のすべてについて好ましい支持体はアガロースであるがシリカを使用することもできる。この支持体を使用する場合の好ましい活性化化学は：
（ａ）γ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランで活性化し、プロテインの−ＮＨ_２基を介してトロンビン様酵素と直接結合する。
（ｂ）シアノゲンブロミドで活性化し、続いてプロテインの−ＮＨ_２基を介して直接結合する。
（ｃ）γ−グリシドオキシトリメトキシシランで活性化し、続いてエポキシド環を開裂してジオールとし、このジオールをシアノゲンブロミドで活性化する。プロテイン上の−ＮＨ_２基を介して酵素と直接結合。
（ｄ）γ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランで活性化し、続いてアンモニア溶液で処理してアミン−シリカを生成させる。
このアミン−シリカ結合は続いてシアヌル酸クロリド（トリアジン）で活性化され、そして−ＮＨ_２、−ＯＨ又は−ＳＨ基を介して酵素と結合する。
【００６６】
酵素の活性化された支持体への結合は、効率よくカップリングさせるために適宜なｐＨで緩衝しなければならない。通常、例えばγ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランと臭化シアンがプロテインの活性基とカップリングする標準の活性化技法では酵素の一級又は二級アミンのｐＫａよりも１〜２単位高い所で緩衝することが必要である。しかし活性剤としてのシアヌル酸クロリドの使用はそれよりも低い所で行うことが出来る（最適なカップリング反応のｐＨは４〜６である）。バトロキソビンを不活性な支持体に結合する場合のようなグリコプロテインと結合させる他の方法は水酸化炭素を介する方法である。この方法は最初糖部分を酸化して−ＣＨＯ基とし、続いて酸性ｐＨ領域でヒドラジドのようなアミノ基と結合することを特徴とする。広い範囲のカップリング反応緩衝液を使用することが出来る。例えば表２を参照。
【００６７】
【表２】

【００６８】
活性化のあと、支持体は酵素結合に必要な数以上の活性部位が存在することになる。これらの過剰な部位をもし不活性化しなければ不必要なプロテインが共有結合することになり、これは固定化された酵素の生物学的な機能に影響を及ぼすことになる。
【００６９】
過剰の活性基はエタノールアミンのような小さい、障害にならないアミンで共有結合することによって不活性化することが出来る。
【００７０】
もしヒドラジド又はアミノ基で活性化した支持体が使用される場合、酵素との結合後の残余の活性基は無水酢酸で不活性化出来る。
【００７１】
固定化の方法や支持体によって固定工程中に酵素の不活性化が起こる。シリカ支持体に最も望ましい活性化剤（即ち臭化シアン）を用いると８０〜９０％以上の酵素の活性が失われる。しかしアガロースを支持体として使用し、塩化シアンで活性化した場合、酵素活性の損失はより少なくなる。
【００７２】
支持体上の固定された酵素の作用を評価するために２つの方法が支持体上に固定した活性酵素の量を評定するのに使用することが出来る；凝固時間による評定───Ａ．クラウス（Ｃｌａｕｓ），Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ，，１７：２３７（１９５７）及びＳ２２３８による評価───Ｇ．アクセルソン（Ａｘｅｌｓｓｏｎ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，３６：５１７（１９７６）参照。
【００７３】
支持体からの酵素の浸出を評価するには以下の方法が利用出来る。
【００７４】
酵素の浸出は放射性元素でラベルしたトロンビン様酵素、即ちＩ^１２５バトロキソビンによって評価することが出来る。しかし浸出評価をする前に結合していない放射性物質を除く必要がある、これは支持体を５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５ ５０ｍｌ、５０ｍＭグリシン／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ３．０ １００ｍｌ、５０ｍＭ炭酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ１０．０ １００ｍｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ７．０ １００ｍｌ、水１００ｍｌ、及び５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ７．０ １００ｍｌで順次洗滌することによって達成することが出来る。この洗滌工程の後は洗滌溶液中には放射能標識化合物は認められず、最初支持体に結合した放射能標識酵素の５０％以上が維持されている。
【００７５】
（ａ）必要な酵素の量
３０−５０ｍｌの血漿（全血６０−１００ｍｌより調製）を処理するに必要な酵素の量は、１０−１５分混合の後３０−２００単位である。
【００７６】
もしアガロースが支持体マトリックスとして採用された場合は、バトロキソビンの３０−２００単位で７−２０分で非架橋フイブリンを形成する結果となる。このシステムはヒドラジド活性化法を用い、０．２５ｇ−１．０ｇの乾燥アガロースを使用する。この場合残余の活性基をブロックする必要はない。
【００７７】
（ｂ）固定化した酵素と血漿フイブリノゲンとの反応
通常固定された酵素と血漿中のフイブリノゲンとの反応は以下のようにして実施される：
３０−７０ｍｌの血漿を、固定したトロンビン様酵素を保持した既知の量の乾燥した支持体に加える。懸濁液は穏やかに（スパイラルミキサーで回転するか、又は手動で混合）７−２０分混合する。この操作の間血漿中のフイブリノゲンは固定酵素によって分解し、フイブリノペプチドＡ及び／又はフイブリノペプチドＢを放出し、水素結合したフイブリンＩポリマー、水素結合したデスＢＢフイブリンポリマー又は水素結合したフイブリンＩＩポリマーを生成し、それぞれのポリマーはそこで固定酵素と会合する。
【００７８】
前述したように、水素結合したフイブリンポリマーはゲル状であり、例えば遠心分離（３，０００ｇ．，１０分）又は濾過（１−５０ミクロンの膜フィルター使用）によって収得される。このようにして収得したものは、血漿中から水素結合したフイブリンポリマーを分離することによってそのポリマーを濃縮する。
【００７９】
トロンビン様酵素を血漿中で使用すると第ＸＩＩＩ因子を活性化することになり、そこでトロンビン様酵素を使用する際、非架橋フイブリン、即ち非架橋フイブリンＩ又はＩＩが架橋したフイブリン即ち架橋フイブリンＩ又はＩＩに転換することを防止するために血漿組成物を修飾することが好ましいことに留意すべきである。勿論フイブリノゲンが非架橋フイブリンに変換した直後フイブリン密封剤として使用する場合は、血漿組成物は必ずしも修飾する必要はない。
【００８０】
血漿組成物は周知の又は開発されている技術で、非架橋フイブリンの架橋の生成を防ぐために修飾することが出来る。これはヒルジン又はトロンビン阻害剤のような第ＸＩＩＩ因子を活性化出来る内在のトロンビンをブロックすることによって、即ち重金属（Ｈｇ）、チオメルサール又は阻害抗体を使用することによって活性化した第ＸＩＩＩ因子の作用を阻害することによって行うことが出来る。
【００８１】
フイブリンＩ又はＩＩの架橋結合反応にはカルシウムイオンの存在が必要である。もしカルシウムイオンが血漿組成から除去されるとフイブリンＩ又はＩＩの架橋は阻害される。カール（Ｃａｒｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，，２３９：５１３（１９８６）；カミンスキー（Ｋａｍｉｎｓｋｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１０５３（１９８３）およびカネイド（Ｋａｎａｉｄｅ）ら、１３：２２９（１９８２）参照。フイブリンＩ又はＩＩの架橋反応を阻止するためにカルシウムキレート剤を加えることが出来る。そのようなキレート剤はカルシウムと結合し、それによって架橋を阻害する。どのようなカルシウムキレート剤でも使用出来る。カルシウムキレート剤の非限定的例としては、クエン酸、糖酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチレンジアミントリ酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミンジ〔ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸〕（ＥＤＤＨＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタン酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサンテトラ酢酸（ＤＣＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシン、Ｎ，Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシン、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及びＮ−ヒドロキシエチルイミノジ酢酸（ＨＩＭＤＡ）及びそれらの塩であり、クエン酸の塩が好ましい。
【００８２】
本発明に於いては、フイブリノゲンを分泌する細胞培養であればいかなるものも使用することが出来る。細胞培養中のフイブリノゲンは、血漿について述べた上記の技術と同様な技術によってフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンに変換することが出来る。しかしながらそのような変換の前に細胞の残骸を除去することが好ましい。
【００８３】
その工程は以下のようにして実施することが出来る：
ＨＥＰＧ２細胞を生育させ、哺乳動物の細胞培養についての標準テキストに記載されているようにして維持する。ルウ（Ｌｉｕ）ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１２９−１３９（１９９１）参照。１０％のウシ血清を含有し、５％ＣＯ_２で緩衝した最少基本培地に分裂速度が１：４〜１：８の間になるように細胞をフラスコに播く。
【００８４】
３７℃で２４〜３６時間生育させたのち培地を除去し適宜なプロテアーゼ阻害剤及び２ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含む血清を含まない培地に置き換える。培地は更に２４時間単位で継続して３回血清を含まない培地で交換する。
【００８５】
調製した培地は細胞の残骸を除くために３，０００ｇ．で１０分遠心分離を行い、フイブリノゲンを含む上澄液をトロンビン様酵素と４〜５時間ゆっくり混合する。トロンビン様酵素は固定されているのが好ましい。アガロース−トロンビン様酵素の量は５００ｍｌ培地中１．０ｍｌ〜５０ｍｌであるのが好適である。上に記したようにアガロース以外の支持体も使用することが出来る。生成したフイブリンモノマーは自発的に重合し固定支持体のまわりにからみつく。
【００８６】
フイブリノゲンを含まない上澄液は、支持体／フイブリンゲルより傾斜して分け、支持体／フイブリンゲルは最初設定した支持体の量１．０ｍｌにつきＮａＣｌ（０．１５Ｍ）１０ｍｌ〜１００ｍｌで４回洗滌する。洗滌したゲルはガラスロートを用いて減圧下半脱水する。
【００８７】
フイブリノゲンを分泌する細胞培地の使用は、フイブリンモノマーを含む組成物を用いる場合特に便宜である。それはフイブリンポリマーが最終的に架橋するかどうかに拘らずそのような組成物がフイブリン密封剤として有用となるフイブリンポリマーを形成するために用いることが出来ると信じられているからである。このようにそのような細胞培地が架橋するために必要欠くべからざるものである第ＸＩＩＩ因子を含有しないのでフイブリン密封剤を効果的にする外部の第ＸＩＩＩ因子を加える必要がない。
【００８８】
非架橋フイブリン組成は組み換えフイブリノゲンからも調製することが出来る。極最近フイブリノゲンは組み換えＤＮＡ技術で調製されるようになった。Ｓ．ロイ（Ｒｏｙ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅｍ．，２６６：４７５８−４７６３（１９９１）参照。この内容は参考文献として本明細書中に引用されている。ロイらはフイブリノゲンの三本の鎖を解明した最初のグループであり、又ＣＯＳ細胞がトロンビンによって誘導される塊を形成することが出来る形態で鎖を発現し、会合しそして分泌することを述べている。生成したフイブリノゲン組成物はフイブリノゲンを分泌する細胞培養に関して上記で述べたと同じ技術でフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物をつくるのに利用出来る。しかしフイブリンモノマー或いは非架橋フイブリンを含む組成物の形成前に、細胞培養に関して上記に述べたと同じ方法で細胞残骸をとり除くことが望ましい。細胞の残骸は遠心分離又は濾過で除くことが出来る。
【００８９】
組み換えフイブリノゲンの使用は、フイブリンモノマーを含む組成物を利用する場合は特に好適である。これはフイブリンポリマーが最終的に架橋するかどうかに拘らずそのような組成物がフイブリン密封剤として有用であるフイブリンポリマーの形成に利用することが出来ると考えられているからに外ならない。組み換えフイブリノゲン細胞培養は架橋に必須である第ＸＩＩＩ因子を含まないのでフイブリン密封剤を効果的にする外因性の第ＸＩＩＩ因子を加える必要がない。
【００９０】
フイブリノゲンを、例えばトロンビン様酵素による非架橋フイブリンへの変換はフイブリンが水素結合したポリマー型のフイブリンを形成する。しかし上で述べたように、非架橋フイブリンを含む組成物はフイブリンモノマーを含むことが基本的ではあるがオリゴメリック又はモノメリックであることが好ましい。これは非架橋フイブリンを含む組成を可溶化することによって達成することが出来る。
【００９１】
可溶化は支持体に固定されたトロンビン様酵素によって非架橋フイブリンが生成するときには特に好ましい。これは支持体上に固定されたトロンビン様酵素を使用すると通常そのような酵素と会合する非架橋フイブリン水素結合ポリマーを生成することになるからである。得られた組成物は支持体を含まないことが望ましいので可溶化によって非架橋フイブリンを含む組成物より酵素を固定した支持体を除くことが出来る。
【００９２】
可溶化はフイブリンモノマーを生成する周知の技術又は開発されるであろう技術によって行うことが出来る。可溶化は非架橋フイブリンを適宜な酸緩衝溶液、好ましくはｐＨが５以下、好ましくは１〜５のｐＨをもつ酸緩衝液と接触することによって進めることが出来る。これに限定するものではないが、酸緩衝剤の好ましい例としては、酢酸、コハク酸、グルクロン酸、システン酸、クロトン酸、イタコン酸、グルタミン酸、ギ酸、アスパラギン酸、アジビン酸及びそれらの塩であり、コハク酸、アスパラギン酸、アジビン酸及び酢酸の塩が好ましく、最も好ましくは酢酸のナトリウム塩である。今まで試験した酸緩衝剤よりももっと効果的に機能する好適な酸緩衝剤が探索されている。
【００９３】
酸緩衝液の好ましい濃度は、０．０２Ｍ〜１Ｍであり、最も好ましくは０．１Ｍ〜０．３Ｍ濃度である。そのような好ましい濃度は、その組成物のイオン強度が生物学的に適合したものである。
【００９４】
非架橋フイブリンをフイブリンモノマーを含む水溶液にする場合、最少量の酸緩衝液を使用して可溶化することが好ましい。それによってフイブリンモノマーが高濃度であるフイブリンモノマー水溶液が得られる。通常非架橋フイブリンを含む組成物の１ｍｌあたり酸緩衝液１ｍｌ〜４ｍｌが必要である。
【００９５】
酸緩衝液は非架橋フイブリンと混合し、１分〜２分激しく振盪し完全な溶液とする。
【００９６】
可溶化は中性ｐＨでカオトロピズム試薬を使用する方法でも達成できる。好ましいカオトロピズム剤は、尿素、臭化ナトリウム、グアニジン塩酸塩、ＫＣＮＳ、沃化カリ、及び臭化カリウムを包含する。カオトロピズム剤の好ましい濃度は、０．２〜０．６モル濃度であり、最も好適には３．５〜５．０モル濃度である。
【００９７】
酸緩衝液の場合と同様非架橋フイブリンを溶解する最少量のカオトロピズム試薬の使用が好ましい。通常非架橋フイブリンを含む組成物１ｍｌあたりカオトロピズム剤１．０ｍｌ〜１．５ｍｌが必要である。
【００９８】
カオトロピズム剤を非架橋フイブリン組成物と混合し、１〜２分激しく振盪し完全に溶液とする。
【００９９】
このような可溶化によりフイブリンモノマーを含む組成物、特にフイブリンモノマーを含む水溶液が得られる。水溶液中のフイブリンモノマーの濃度は１０ｍｇ／ｍｌより少なくないことが好ましく、より好ましくは２０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌであり、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである。
【０１００】
もし支持体に固定されたトロンビン様酵素が使用され、非架橋フイブリンを含む組成物中に混在する場合、可溶化した後に固定酵素はフイブリンモノマーを含む組成から除くことが出来る。この操作は例えば酵素を分離出来る適宜なフィルターを用いる濾過法によって行うことが出来る。適宜なフィルターとしては、Ｐｏｒｅｘ社製の融着したポリプロピレン２０ミクロンポアサイズのフィルター、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ社製のテフロン２０〜７０ミクロンポアサイズフィルター、或いはＣｏｓｔｅｒ社製ナイロン６６ ２２−４６ミクロンポアサイズフィルターが包含される。
【０１０１】
フイブリンモノマーを含む組成物の中にトロンビン様酵素ではない酵素、即ちバトロキソビンが存在する場合の別法としてその系では可溶性のトロンビン様酵素を用い、フイブリンの水素結合したポリマーを可溶化することによってその酵素を除くのがよい。酵素の除去はアフィニテイマトリックス、即ちトロンビン様酵素に対して特別な親和性をもった不活性な支持体に結合した配位子か又はイオン交換又は疎水性の相互作用をする支持体又は最も効果的であるアビジン−ビオチン系を用いて行うことが出来る。このビオチン−アビジン系の相互作用は自然界に存在するものの中で最も強い非共有結合性の結合定数（Ｋ_ＤＩＳ＝１０^−１５Ｍ）を示す。Ｅ．Ａ．バイヤー（Ｂａｙｅｒ）及びＭ．ウイルチェック（Ｗｉｌｃｈｅｋ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２６：１（１９８０）参照。
【０１０２】
この工程に於いてはビオチンは例えばバトロキソビンと共有的に結合し、そのビオチン−バトロキソビン複合体（これは可溶性である）は直接血漿と反応させる、即ち１０ＢＵ＋５０ｍｌ血漿と３７℃で１０分反応させる。生成したフイブリンＩポリマーは遠心分離又は濾過によって収得し、３０ｍＭの塩化カルシウムを含んだ０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ４．０ ４ｍｌ中に再溶解する。このフイブリンＩ溶液にアガロースのような不活性支持体に結合した１モル過剰のアビジンを加える。このアガロース：アビジン：ビオチン−バトロキソビン複合体は遠心分離又は濾過によってフイブリンＩから分離し、実質的にバトロキソビンを含まないフイブリンモノマーを含む組成を得、この組成は以下に述べるように再重合してフイブリン密封剤として役立つ。
【０１０３】
したがって本発明の態様の一つとして、フイブリンモノマーを含む組成物は、実質的にはトロンビン様酵素を含まない。実質的に含まないという意は、トロンビン様酵素が全く除去されているか又は組成物中に、不都合な薬理効果をもたらすような量のトロンビン様酵素が残存していないという意味である。このことより本発明による組成物の望ましい「実質的に含まない」状態は、トロンビン酵素が、フイブリンモノマーを含む組成物の調製に用いたもとの量の０〜１０％、好ましくは０〜２％を含んでいてもよい。
これらの態様は所望の可溶性フイブリンへの変換につづいてトロンビン様酵素の除去について開示しているが、トロンビン様酵素の大部分、又はすべてを保有している組成物は、本発明の一部としては有用なものであると考えられる。
【０１０４】
さてこれでフイブリンモノマーを含有した組成物がフイブリン密封剤として使用する用意が整った。このような組成物が全血より調製された場合もとのフイブリノゲン由来の６０〜９０％が存在する、勿論フイブリンモノマーとして存在する。
【０１０５】
フイブリンモノマーを含むこの組成物は調製された直後使用することが出来る。実際、この組成物が自系のものである場合は、調製後直ちに使用することが特に好ましい。調製後すぐに用いない場合は貯蔵することが出来る。組成物は、例えば凍結又は凍結乾燥、又は４℃に保つことによって保存される。凍結又は凍結乾燥した組成物は数ヶ月安定である。組成物を４℃に保った場合は少なくとも数日安定である。
【０１０６】
組成物を凍結した場合は使用時解凍しなければならない。組成を凍結乾燥した場合は、使用時には、可溶化工程で使用した酸緩衝溶液、例えば酢酸のような揮発酸であった場合、その酸緩衝溶液を加えて再構築するのが好ましく、カオトロピズム剤が用いられた場合は蒸留水を用いるのが好適である。可溶化の工程の場合と同様再構築の場合フイブリンモノマーを溶解するのに出来るだけ少量の酸緩衝液又は蒸留水を使用すべきである。事実フイブリンモノマーを含む凍結乾燥した組成物の再構築製剤はフイブリンモノマーの濃度を２００ｍｇ／ｍｌの濃度にすることが出来る。凍結乾燥する前に充填剤としてマンニトール又はラクトースを組成物に加えることが出来る。別法として凍結乾燥した組成物は凍結乾燥した状態で使用することが出来る。そのような形態は例えば抗生物質のような補助剤を加えたい場合には特に好ましい。
【０１０７】
フイブリンモノマーを含む組成物は実質的に如何なる形態であってもよい。例えば水剤、散剤、乳剤又は固型剤であってもよく、中でも水剤が好ましい。このように例えば製剤が液体、ゲル状、ペースト状又は軟膏状であってもよい。又凍結乾燥したフイブリンモノマーは“顆粒”であってもよく、使用する直前に水溶液、乳液又は懸濁液としてもよいし又そうしなくてもよい。
【０１０８】
溶液に出来る溶媒であればいづれでもよいが勿論その溶媒は無毒であることが好ましい。これに限定するものではないが溶媒の例としては、水、エチルアルコール、グリセロール、及びプロピレングリコールであり、水が好ましい。
【０１０９】
懸濁液の１つの例は、フイブリンモノマーを含有する組成物を有機溶媒、例えばエタノールと混合し、最終的にはその濃度を３．０Ｍ以上になるようにし、よく振り混ぜる。フイブリンモノマーは沈でんし、遠心分離によって回収することが出来る。沈でんは有機相で洗滌し、可溶化工程で用いた水性溶媒を除去する。フイブリンモノマーのエタノール懸濁液を直接包帯又はその他の担体に適用するか又はそのまま直接傷口に適用してもよい。有機溶媒相は蒸発させる。包帯又はその他の担体を用いた場合は適用の部位に接触するか又はその他の方法によって懸濁液は再水和しそしてフイブリンは重合する。
【０１１０】
別法として、例えばジエチルエーテルのような非常に揮発しやすい有機溶媒で調製した懸濁液は所望の部位に噴霧することも出来るし又スプレイ懸濁液として適用することが出来る。揮発性の溶媒は不燃性であることが好ましい。フイブリンモノマーの有機溶媒懸濁液は、耳、鼻、喉、又は肺に噴霧又は吸気によって適用することが出来、又出血した食道又は胃の病巣には、経口投与によって適用することも可能である。
【０１１１】
本発明によるフイブリン密封剤は、フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを所望の部位に接触させることにより、その接触と同時にフイブリンモノマーをフイブリンポリマーに変換させるか又は非架橋フイブリンを架橋フイブリンに変換し、それによって所望の部位でフイブリン塊を形成させることによって使用する。
【０１１２】
本発明での所望の部位とはフイブリン塊を形成させたい部位のことである。所望の部位が何であるか、又何処であるかと云うことは本発明のフイブリン密封剤の使用に依存している。又フイブリン密封剤はヒトばかりではなく他の哺乳動物にも適用出来るものであると信じられていることに注目すべきである。又、もしフイブリン密封剤の源が血液である場合は、その血液はフイブリンを使用する種と同じ種より得られた血液であることが好ましいが、決して基本的な事項であると云う訳ではない。
【０１１３】
本発明のフイブリン密封剤は周知の又はフイブリン密封剤の使用法として開発されうるいづれの方法でも使用することができる。本発明での使用方法、キット又はフイブリン密封剤は、組織又は器官の縫合、止血、傷の治療、手術部位の封鎖、血管手術に於ける末端冠状動脈吻合手術時の縫合口の出血の防止；左心室の縫合；大動脈の切開及びカニウレ挿入部；再手術時の上心筋の広汎性出血；及び血管部位例えば心房、大動脈又は左心室レベルの血管よりの出血の止血に使用することが出来る。本発明は又移植する前にテトロン製動脈管の密封、体外の組織の密封、細胞生長のためのフイブリン束の用意、損傷を受けた脾臓（臓器保存の場合）、肝臓、その他の臓器の止血；気管枝吻合及び空気の漏出又は肺の裂傷の密封、気管断端の密封、気管瘻孔及び食道瘻孔の密封；及び非縫合治療（ジッパー技術）、及び大脳内の血管腫（ＡＶＭ）、肝臓血管腫、大腸血管形成異常、食道静脈瘤、血管放射線治療時の閉鎖、消化管潰瘍の２次症状である“ポンプ作用をしている”胃腸の出血障害、などに対して本発明は又有用である。本発明は更に角膜移植時の止血、鼻血、扁桃摘出後、抜歯その他の手術時の止血に有用である。Ｇ．Ｆ．ゲストリング（Ｇｅｓｔｒｉｎｇ）及びＲ．レルマ（Ｌｅｒｍｅｒ）、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２９４−３０４，９月／１０月号、１９８３年を参照。又本発明によるフイブリン密封剤は血管凝固障害をもつものに対して特に適合している。
【０１１４】
フイブリンモノマーを含む組成又は非架橋フイブリンを含む組成物の用量は、フイブリン密封剤の特別な使用法に依存しているがその用量は意とする使用に充分応えられる量でなければならない。通常水溶液としてのフイブリンモノマー含有組成３ｍｌ〜５ｍｌで充分フイブリン密封剤としての効果を表わすものと信じられている。しかしながらその組成の使用によっては０．０５ｍｌ〜４０ｍｌになる場合もある。又もし非架橋フイブリンがポリマー型で使用される場合、又は組成物が固型の場合はその組成物は、水溶液中に含まれていた量に相当する量を含むものでなければならない。
【０１１５】
本発明の目的として該接触工程に於いてフイブリンモノマーをフイブリンポリマーに、又は非架橋フイブリンを架橋フイブリンに“同時に”変換すると云うことは、そのような変換工程及びそのような接触工程が所望の部位でそれぞれの工程の時間内でフイブリン塊が形成されるという意味である。であるから“同時に”なる語は接触工程の後フイブリンモノマーはフイブリンポリマーに、或いは非架橋フイブリンは架橋フイブリンに変換されることを意味する。これは該組成が所望の部位に適用された後にフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含有する組成物が、フイブリンモノマーがフイブリンポリマーに、非架橋フイブリンが架橋フイブリンに変換できる組成物と接触することによって実施される。この変換は通常接触後０．５分以内で行われなければならない。さもなければフイブリンモノマー或いは非架橋フイブリンを含有する組成は、特に非架橋フイブリンがフイブリンモノマーである場合は所望の部位より流失することになるかも知れない。
【０１１６】
同時になる語は又接触工程と変換工程が同時に起ることを意味している。これはフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含有する組成が、フイブリンモノマーをフイブリンポリマーに或いは非架橋フイブリンを架橋フイブリンに変換することが出来る組成物と接触すると同時に所望の部位に接触することによって行われる。
【０１１７】
最後に又好ましいことでもあるが、同時なる語は、すべてのフイブリンモノマーがフイブリンポリマーに又、すべての非架橋フイブリンが架橋フイブリンに変換して了う程そんなに前のことではないが、変換工程が接触工程の前に始まることを意味する。もしそうでなければ接触工程の前にすべてのフイブリンモノマーがフイブリンポリマーに、或いはすべての非架橋フイブリンが架橋フイブリンに変換することになり、フイブリン密封剤としては役に立たない結果となる。この具体例は、フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物がフイブリンモノマーをフイブリンポリマーに、又は非架橋フイブリンを架橋フイブリンに変換することが出来る組成物と接触工程の前に混合することによって示される。変換工程を完結させるためには約３０秒を必要とするので、変換工程は接触工程の３０秒よりも前好ましくは３秒前に始めてはならない。この具体例はフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含有する組成物の最大量が所望の部位に残り、有効なフイブリン塊を形成することが確かなので好ましい。
【０１１８】
フイブリンモノマーをフイブリンポリマーに、或いは非架橋フイブリンを架橋フイブリンへの変換は周知の技術又は開発されるであろう技術のいづれによっても実施することが出来る。しかしいかに変換工程を実施するかはフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含有する組成物の出所、例えば全血より得られたものか又は組み換えフイブリノゲンより得られたものかと云うことに依存しており、又フイブリンモノマーの型、非架橋フイブリンの型、例えばフイブリンＩであるのか、デスＢＢフイブリンであるのかと云うことに依存している。又いく分かは所望の部位はフイブリン密封剤を使用する際患者の血液を含んでいるかどうか、又は他の体液を含んでいるかどうかに係っている。
【０１１９】
又、もし別の組成物、例えばアルカリ緩衝液が変換工程で使用（後述）されている場合は、本発明による方法は、例えば２筒シリンジを用いて行うことが出来る。２筒シリンジはＹ字型であってもよく、これによってフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンと混合することが出来、変換工程で該組成を使用する場合、接触工程の直前に混合することが出来る。又Ｙ字型２筒シリンジではなく２つの注射口をもった２筒シリンジを使用することも出来る。これは同時に所望の部位で接触させることが出来、そしてフイブリンポリマー又は架橋フイブリンへの変換が起る。又２筒シリンジの組成物は所望の部位に噴霧することも出来る。Ｈ．Ｂ．クラム（Ｋｒａｍ）ら、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｕｒｇｅｏｎ，５７：３８１（１９９１）参照。
【０１２０】
フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物の供給源が血液である場合、前述したようにその組成はフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを架橋フイブリンに変換するに十分なプロトロンビン、第ＸＩＩＩ因子、及び他の必要な物質、即ちプロトロンビンを活性化する物質を保持しているであろうと考えられている。もし非架橋フイブリンがフイブリンポリマーである場合、即ち非架橋フイブリンが可溶化されていない場合、その非架橋フイブリンは、プロトロンビンの活性化及びその組成の第ＸＩＩＩ因子によって架橋フイブリンに変換することが出来る。このような活性化はその組成をカルシウムイオンの供給源と接触させることによって行うことが出来る。カルシウムイオンの供給源としては、これに限定する訳ではないが、塩化カルシウム、好ましくは３０ｍＭ濃度の塩化カルシウムを包含する。別法として、あまり好ましくはないが、カルシウムイオンは所望の部位に血液によって供給することが出来る。
【０１２１】
もし非架橋フイブリンが可溶化されている場合、即ちフイブリンモノマーである場合、該フイブリンモノマーをどのようにして架橋フイブリンに変換するかは、どのようにして可溶化が行われたかに係っている。もし非架橋フイブリンが酸緩衝液によって可溶化されている場合は、架橋フイブリンは、フイブリンモノマーを含む組成のｐＨを上げ、フイブリンモノマーを重合させることにより形成させることが出来る。
【０１２２】
これはその組成を適宜なアルカリ緩衝液に接触させることによって実施出来る。これに限定するものではないが適宜なアルカリ緩衝液の例としてはＨＥＰＥＳ、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、重炭酸ナトリウム及び重炭酸カリウムのような重炭酸緩衝液、クエン酸のトリメタル塩、酢酸の塩、及び硫酸の塩を包含する。
【０１２３】
好ましいアルカリ緩衝液は：０．５−０．７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムｐＨ１０−１０．５、０．５−０．７５Ｍ重炭酸ナトリウム／水酸化ナトリウムｐＨ１０．０、１．５Ｍグリシン／ＮａＯＨ ｐＨ１０．０、０．５−１．０Ｍビスヒドロキシエチルアミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）ｐＨ７．５、１Ｍヒドロキシエチルピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）ｐＨ８．５、０．５ＭトリシンｐＨ８．５、１Ｍモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ８．０、１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）ｐＨ８．０及び０．５Ｍシクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）ｐＨ１０．０；最も好ましいものとしては、０．５−０．７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムｐＨ１０−１０．５、０．５−１．０Ｍビスヒドロキシエチルアミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）ｐＨ７．５、１Ｍヒドロキシエチルピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）ｐＨ８．５及び１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）ｐＨ８．０である。
【０１２４】
使用するアルカリ緩衝液の量は非架橋フイブリンを重合するに十分な量でなければならない。フイブリンモノマーを含む組成約１０部から約１部とアルカリ緩衝液１部を混合するのが好適である。更に好ましくはそのような比率は９：１である。好ましい比率は選択した緩衝液によるものであり又フイブリンポリマーの望ましい“強度”に依存していることに注目すべきである。勿論フイブリンポリマーの所望の強度はフイブリン密封剤の最終の使用にかかわっていることは云うまでもない。もし可溶化がカオトロピズム試薬を用いて行ったものである場合は、フイブリンモノマーを含む組成を例えば蒸留水で稀釈することによって架橋フイブリンに変換することが出来る。稀釈は出来るだけ最少量の稀釈剤を用いて行われるべきである。通常稀釈した後のカオトロピズム試薬の濃度は、０．５〜０．１モル濃度であるべきである。
【０１２５】
ｐＨを上昇させること又はフイブリンモノマーを含む組成のカオトロピズム試薬の稀釈に加えてそのような組成のプロトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子を活性化して架橋フイブリンを形成することが好適である。このような活性化はその組成をカルシウム供給源と接触させることによって行われる。カルシウムイオン供給源は可溶化工程に用いられるアルカリ緩衝液の一部又は酸緩衝液の一部とすることが出来る。カルシウムイオン供給源として、これらに限定するものではないが、塩化カルシウムを包含し、好ましくは３０ｍＭの濃度である。別法として、あまり好ましくはないがカルシウムイオンの供給源は、所望の部位に血液によって供給することが出来る。
【０１２６】
もしアルカリ緩衝液が炭酸塩／重炭酸塩緩衝液である場合はカルシウムイオンの供給源を可溶化工程中に酸緩衝液に加えなければならないことに留意すべきである。これは塩化カルシウムは炭酸塩／重炭酸塩緩衝液には溶解しないためである。酸緩衝液中のカルシウムイオンの濃度は５ｍｍｏｌ濃度〜１５０ｍｍｏｌ濃度であることが好ましく更に好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭ濃度である。
【０１２７】
得られたフイブリン塊は、たとえ非架橋フイブリン即ちフイブリンモノマー又はフイブリンポリマーが存在していても架橋したフイブリンＩＩであろうと信じられている。しかしながら非架橋フイブリン形成がデスＢＢフイブリンである場合、そのときはデスＢＢフイブリンを架橋フイブリンに変換するためには更にトロンビンを加える必要があると信じられている。そのようなトロンビン供給源は例えば患者からの血漿であってもよく、その血漿は非架橋フイブリンの組成物に加えられる。
【０１２８】
もし所望の部位が血液を含み、フイブリンモノマーを含む組成を使用した場合、即ち非架橋フイブリンが可溶化された場合、その血液はカオトロピズム試薬の稀釈又はフイブリンモノマーを含有する組成物のｐＨを上げるのに役立つことが出来る。このように稀釈剤もアルカリ緩衝液も使用する必要がない。この態様の中では、カルシウムイオン供給源は可溶化工程で使用される酸緩衝液又はカオトロピズム試薬中に含まれているのが好適である。又本態様に於てはフイブリンモノマーを含む組成物は固形の支持体上に供することが出来る。例えば包帯、縫合糸、人工器官又はガーゼに供することが出来、これらは所望の部位と接触する。これらの支持体は、例えばフイブリン塊が形成するまで所望の部位に接触することになる。
【０１２９】
しかしながら、もしフイブリンモノマーを含む組成物が架橋フイブリンを形成するに充分なプロトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子を保持していない場合は、そのような組成物もフイブリン密封剤としてなお有用である。というのはフイブリンモノマーがそれ自体重合によってフイブリン塊を形成するのに有用であるからである。又そのような組成物はカルシウムイオン源及び活性化した第ＸＩＩＩ因子（又は活性化第ＸＩＩＩ因子の前駆体）及び任意にはトロンビンを加えることによって架橋フイブリンを形成させるためにまだ利用することが出来る。そのようなカルシウムイオン源、活性化した第ＸＩＩＩ因子及びトロンビンをフイブリンモノマーを含む組成物に加えることが出来る。活性化した第ＸＩＩＩ因子は、フイブリンモノマーを含む組成物に最終濃度非架橋フイブリンを含む組成物１ｍｌにつき第ＸＩＩＩ因子が１．０〜２０単位になるように加えることが出来る。別法として第ＸＩＩＩ因子は所望の部位の血液、又は体液によって供給することが出来、又自系の血漿をフイブリンモノマーを含む組成物に加えることによって第ＸＩＩＩ因子を供給することが出来る。
【０１３０】
限定するものではないがカルシウムイオン源は塩化カルシウムを包含し、好ましくは３０ｍＭ濃度である。別法として、あまり好ましいとは云えないがカルシウムイオンは所望の部位の血液又は体液によって供給出来る。フイブリンを含む組成物１ｍｌにつき４〜５００単位のトロンビンを加えることが出来るかもしくは、トロンビンを所望の部位で供給することが出来る。
【０１３１】
非架橋フイブリンを含む組成物の供給源がフイブリノゲンを分泌する細胞培養であるか又は組換えフイブリノゲンである場合は、非架橋フイブリンはフイブリンポリマーである。即ち非架橋フイブリンは可溶化されないのでカルシウムイオン源及び活性化された第ＸＩＩＩ因子（又は活性化された第ＸＩＩＩ因子の前駆体）は架橋フイブリンの形成に使用される。非架橋フイブリン源は第ＸＩＩＩ因子を含まないので第ＸＩＩＩ因子が使用されなければならない。活性化した第ＸＩＩＩ因子は非架橋フイブリンを含む組成物に最終濃度が非架橋フイブリンを含む組成物１ｍｌに対して第ＸＩＩＩ因子１．０〜２０単位になるように加えられる。別法として第ＸＩＩＩ因子は所望の部位で血液又は体液によって供給することが出来るか又は自系の血漿を組成に加えることによって供給することが出来る。これに限定されないが、カルシウムイオン源は塩化カルシウムを包含し、好適には３０ｍＭの濃度でである。別法としてはあまり好ましくはないがカルシウムイオンは所望の部位で血液又は体液で供給出来る。又随意、トロンビンが架橋フイブリンＩＩが形成するとの確信のもとにそのような組成物に加えることが出来る。非架橋フイブリンを含む組成物１ｍｌにつき４〜５００単位のトロンビンを加えることが出来るか又はトロンビンは所望の部位によって供給されることが出来る。
【０１３２】
もし非架橋フイブリンが可溶化された場合、即ちフイブリンモノマーである場合、いかにフイブリンモノマーがフイブリンポリマーに変換するかは、いかにして可溶化が行われたか即ち酸緩衝液を用いたか又はカオトロピズム試薬を用いたかに係っている。フイブリンポリマーの形成は上に記述した同じ方法によって行うことが出来る。このフイブリンポリマーはもし望むならば、カルシウムイオン源及び活性化第ＸＩＩＩ因子（又は活性化第ＸＩＩＩ因子の前駆体）を加えることによって及び随意にトロンビンを上に示したようにフイブリンモノマーを含む組成物に加えることによって、架橋フイブリンに変換することが出来る。
【０１３３】
活性化した第ＸＩＩＩ因子は最終の濃度が非架橋フイブリンを含む組成物１ｍｌに対して第ＸＩＩＩ因子が１．０〜２０単位になるように非架橋フイブリンを含む組成物に加えることが出来る。別法として、第ＸＩＩＩ因子は所望の部位にて血液又は体液によって供給することが出来るか又は自系の血漿非架橋フイブリンを含む組成物に加えることによって供給することが出来る。限定するものではないがカルシウムイオン源は塩化カルシウムを包含し、好ましくは３０ｍＭの濃度である。変法としてあまり好ましくはないが、カルシウムイオンは所望の部位で血液又は体液によって供給することが出来る。フイブリンモノマーを含む組成物１ｍｌに対してトロンビン４〜５００単位を加えてもよいし又、トロンビンを所望の部位で供給してもよい。
【０１３４】
本発明によるフイブリン密封剤は又補助剤、例えば抗生物質即ちゲンタマイシン、セフオタキシム、ネバセチン及びシソマイシン、ヒスタミンＨ_２−拮抗剤即ちラニチジン、及び抗癌剤即ちＯＫ−４３２を含むことが出来る。これは所望の抗生物質をフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物に加えることによって達成することが出来る。Ｍ．Ｃ．Ｈ．ゲルスドルフ（Ｇｅｒｓｄｏｒｆｆ）及びＴ．Ａ．Ｊ．ロビラード（Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ）ら、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ，９５：１２７８−８０（１９８５）；Ａ．エデルレ（Ｅｄｅｒｌｅ）ら、Ｉｔａｌ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２３：３５４−５６（１９９１）；Ｖ．ロンファルド（Ｒｏｎｆａｒｄ）ら、Ｂｕｒｎｓ，１７：１８１−８４（１９９１）；Ｔ．サクライ（Ｓａｋｕｒａｉ）ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１８：３９−４３（１９９２）；Ｔ．モンデン（Ｍｏｎｄｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ，６９：６３６−４２（１９９２）；Ｆ．グレコ（Ｇｒｅｃｏ）、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：３９−５１（１９９１）及びＨ．Ｂ．クラム（Ｋｒａｍ）ら、Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０：１７５−１７８（１９９１）参照。これらを明細書中参考文献として引用する。他の補助剤も又加えることが出来る。例えばフィブロネクチン、フイブリン溶解酵素阻害剤であるアプロチニン、α−２抗プラスミン、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、６−アミノヘキソン酸、４−アミノメチルシクロヘキソン酸、コラーゲン又はケラチン細胞である。このような補助剤の用量は慣用のフイブリン密封剤に使用されているものと同様であると確信する。
【０１３５】
本発明は、又フイブリン密封剤キットも提供する。そのキットは、最初の成分としてフイブリンモノマーを含む組成であり、第２の成分としてフイブリンモノマーを重合することが出来るアルカリ緩衝液であるか又は蒸留水であり、これらは可溶化工程がどのようになされたかに係っている。第２の成分は随意にカルシウムイオン源を含むことが出来る。別法として最初の成分は非架橋フイブリンを含む組成物であり又第２の成分はカルシウムイオン源であってもよい。もし非架橋フイブリンを含む組成物を調製するために使用したフイブリノゲン源が、フイブリノゲンを分泌する細胞培養からであるか又は組換えフイブリノゲンからのものである場合は、最初の成分は非架橋フイブリンを含む組成物であり、第２の成分はカルシウムイオン源であり、第３の成分は活性化された第ＸＩＩＩ因子である。
【０１３６】
【実施例】
〔実施例１〕
全血より血漿の調製：
全血（１００ｍｌ）をクエン酸塩／リン酸塩／デキストローズのような抗凝固剤の入った市販の標準血液バッグに集める。血液は遠心分離に適した容器に移し、室温にて１０分３，０００ｇで遠心分離を行う。澄明な血漿上澄液（５０ｍｌ）を傾斜して分けとり、細胞成分は捨てる。
【０１３７】
全血から血漿を調製する別法は濾過操作によるものである。クエン酸／リン酸塩／デキストローズのような適宜な抗凝固剤の入ったバッグに全血１００ｍｌを集める。血液は蠕動運動ポンプを用いてプロテインを効率よく濾去するフィルターを通して循環させる。メンブラン通過後の圧力の低下は、最循環血液中に残っている細胞成分によって血漿の無理な通過を強いられることになる。血漿（５０ｍｌ）は次の操作のために集める。
【０１３８】
〔実施例２〕
粒状アガロース上にバトロキソビンの固定：
粒状アガロース（フアルマシア社製）を固定化の研究に用いた。使用したアガロースは架橋度４％、４５−１６５μｍ（粒子の９０％）であった。このものは吸水した場合体積が５倍膨潤した。
【０１３９】
バトロキソビンは最初被覆したシンチレーションバイアル中過ヨウ素ナトリウムで室温で１時間酸化する。このバトロキソビンはセフアデクスＰＤ−１０ゲル透過カラムを通過させて精製する。酸化したバトロキソビンは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５＋１０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム（３０−２００Ｕ／１．７５ｇ吸湿ゲル）中一夜、室温でヒドラジドで活性化したアガロースゲルと結合させる。結合しなかった試薬は５０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５、１００ｍｌの５０ｍＭグリシン／１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ３．０、１００ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ１０．０、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍｌの水、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗滌することによって除去する。
【０１４０】
〔実施例３〕
非架橋フイブリンを含有する組成を形成するために、固定酵素と血漿フイブリノゲンとの反応：
固定酵素（３５０ｍｇ）を遠心分離した又は濾過した血漿に加え、非架橋フイブリンＩポリマー塊が出来るまで７−２０分ゆるやかに混合する。
【０１４１】
フイブリンＩポリマー及び結合した固定酵素は、ａ）３，０００ｇで１０分遠心分離して上澄血清を傾斜して除去するか又はｂ）適宜な低プロテイン結合フィルターを通過させて濾過し、続いて濾過された血清を捨て、フイブリンＩポリマーと固定酵素の混合物を次の操作のために維持する。このフイブリンＩポリマーは非架橋フイブリンを含む組成の一例である。
【０１４２】
〔実施例４〕
フイブリンモノマーを含有する組成を調製するためのフイブリンＩポリマーの可溶化：
フイブリンＩポリマーの可溶化は、収得したフイブリンＩポリマー＋固定酵素に３０ｍＭ塩化カルシウムを含んだ０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）１〜４ｍｌを加えることによって達成される。この試料は続いてボルテックスミキサー上で激しく２分間振盪する。固定酵素はフイブリンＩ溶液を１−２０μｍの低プロテイン結合したフィルターを通して濾過することにより除去することが出来る。アガロース酵素はフィルター上に残りこの系から除去される。フイブリンＩモノマーを含有する残った溶液は、他の血漿プロテインと結合し、濃縮された酸性フイブリンＩモノマー溶液より構成されている。通常１００ｍｌの全血より２５ｍｇ／ｍｌ〜３５ｍｇ／ｍｌのフイブリンモノマー濃度のフイブリンモノマーを含む組成４ｍｌ又は５ｍｌが得られる。さてこれで単独又はフイブリン密封剤を形成するために再重合緩衝液と同時投与するかのいづれかの方法で患者に供給する用意が出来たことになる。
【０１４３】
〔実施例５〕
フイブリンＩモノマーを含有する組成の再重合：
再重合はフイブリンＩモノマーを含む溶液９部と適宜な緩衝液、例えば０．７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．０ １部を混合することにより達成される。混合比はいろいろに変更することが出来るが９：１なる比は最終調製物でのフイブリンを高濃度に保つことが出来る。同時投与の場合にはフイブリンＩは自発的に重合し、フイブリンの架橋によって３０分でフイブリンＩＩに変換する。
【０１４４】
〔実施例６〕
アガロースのヒドラジドによる活性化及び酵素の水酸化炭素部位との結合：
バトロオキソビンの水酸化炭素部をヒドラジドで活性化した支持体と反応させるために、糖部を酸化して−ＣＨＯ基にしなければならない。これは以下のようにして達成される。
【０１４５】
バトロキソビン１〜７ｍｇを水２ｍｌ及び０．１Ｍ過ヨウ素酸０．２ｍｌ中に溶解する。混合物は室温で１時間インキュベートしその後セフアデクスＧ−２５ゲルカラムを通して脱塩する。酸化された活性バトロキソビンはカラムから０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウムで溶出する。
【０１４６】
市販の標準ヒドラジド活性化アガロース（Ｂｉｏｒａｄ研究所製、イギリス）又は末端にアミノ基をもつ試薬は直接アルデヒド基（−ＣＨＯ）と反応させるのに用いることが出来る。ヒドラジド−アガロースをカップリングに使用する場合は次のようにして行う。
【０１４７】
１〜５ｇのヒドラジド−アガロースゲルを５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５４ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液に１０ｍＭ水素ホウ素ナトリウム１ｍｌと所望の量の酸化したバトロキソビン（典型的には１００ー２００Ｂｕ／ｇ、吸湿ゲル）を加える。
【０１４８】
その試料は一夜室温で混合し、続いてガラスロート上で５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５ ５０ｍｌ、５０ｍＭグリシン／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ３．０ １００ｍｌ、５０ｍＭ炭酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ１０．０１００ｍｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ７．０ １００ｍｌ、水１００ｍｌ及び５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．０ １００ｍｌそして最後に５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．０
１００ｍｌで洗滌する。
【０１４９】
固定化されたバトロキソビンと血漿との反応は以下のようにして行う。
【０１５０】
血漿（５０ｍｌ）のｐＨは酢酸を加えてｐＨ５．５にする。バトロキソビンの１００−２００ＢＵの当量をアガロース １．７５ｇ（吸湿性ゲルの容量）に固定したものを血漿に加える。血漿は３７℃で１０〜１５分インキュベートし、その後ｐＨは水酸化ナトリウムを加えることによってｐＨ７．４とする。フイブリンＩの重合は即座に起こる。フイブリンＩポリマーは３，５００ｒｐｍで１０分遠心分離することによって収得し、そして３０ｍＭの塩化カルシウムを含んだ０．２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．０ ３〜４ｍｌ中に再溶解する。アガロース−酵素はそれから遠心分離か又は濾過によってフイブリンＩより分離する。フイブリンＩは続いて再重合し０．７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム ｐＨ１０．０ １部に対してフイブリンＩ溶液９部を加えることによってフイブリン密封剤を形成させる。
【０１５１】
〔実施例７〕
ビオチン−アヒジンを用いた酵素捕捉：
酵素の捕捉は最初バトロキソビンをビオチニル化し、そしてそのビオチン−酵素を固定化したアビジン（アビジンは６％架橋したアガロースに結合）で捕捉することによって行われる。
【０１５２】
プロテインのヒオチニル化は多くの試薬を用いて達成することが出来る。例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）−ビオチン（水に不溶）が用いられる（Ａｍｅｒｓｈａｍ社より市販）。ＮＨＳ−ビオチン（５０μｌ）を１ｍｇのバトロキソビンにｐＨ８．６で加え、そしてその溶液を室温で１時間インキュベートする。過剰のビオチニル化試薬はセフアデクスＧ−２５カラムを使用し、０．１Ｍリン酸カリウム ｐＨ７．５で溶出するゲル濾過法で除く。
【０１５３】
１０ＢＵ当量のビオチン−バトロキソビンを５０ｍｌの血漿に加え、３７℃、１０分インキュベートする。フイブリンＩポリマーは遠心分離（３，５００ｒｐｍ，１０分）によって収得し、そして３０ｍＭ塩化カルシウムを含有する０．２Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ４．０ ３〜４ｍｌ中に再溶解する。アビジン−アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社より市販）を０．２ｇ（吸湿ゲル）／ｍｌフイブリンＩの割合でフイブリンＩに加える。その試料は室温で１０分インキュベートし、２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離する。生成したフイブリンＩは実質的にバトロキソビンを含んでいない。フイブリン密封剤を形成するフイブリンの再重合は実施例６方法に従って収得する。
【０１５４】
本発明は、ここに記載した特別な実施態様によってその範囲を限定するものではなく、本発明の個々の態様をただ単に説明することを意としたものである。当然のことながら当業者にとっては本明細書に記載した内容に加えていろいろな変更、修正が出来ることは明らかなことである。そのような変更は、請求項に示した範囲内に入るものであると考えられる。

Claims (49)

1. 所望の部位において形成されるフィブリン密封剤用の非動的フィブリン・モノマーを含有する医薬組成物であって、当該非動的フィブリン・モノマーを含有する当該組成物は、当該所望の部位に接触され、そしてその後、当該非動的フィブリン・モノマーは、当該接触と同時にフィブリン・ポリマーに変換され、それにより、当該フィブリン密封剤が当該所望の部位において形成されることを特徴とする前記医薬組成物。
2. 前記非動的フィブリン・モノマーが、非架橋フィブリンＩ、非架橋デスＢＢフィブリン、及び、非架橋フィブリンＩＩから成る群から選ばれる、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記非動的フィブリン・モノマーが、フィブリンＩである、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記フィブリン・ポリマーが、フィブリンＩＩポリマーである、請求項１記載の医薬組成物。
5. 前記フィブリン・ポリマーが、架橋したものである、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前記組成物が、トロンビン様酵素を実質的に含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
7. 前記組成物が、血液、フィブリノーゲンを分泌する細胞培養物及び組換えフィブリノーゲンから成る群から選ばれる源から形成される、請求項１に記載の医薬組成物。
8. 前記源が血液である、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記組成物が、プロトロンビン、プロトロンビンのアクチベータ及び第ＸＩＩＩ因子を更に含む、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記血液が自己の血液である、請求項７に記載の医薬組成物。
11. 前記変換が、アルカリ緩衝液又は蒸留水により実施される、請求項１に記載の医薬組成物。
12. 前記アルカリ緩衝液又は蒸留水がカルシウム・イオン源を更に含有する、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 前記アルカリ緩衝液が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、重炭酸塩緩衝液、クエン酸三金属塩、酢酸の塩、及び硫酸の塩から成る群から選ばれる、請求項１１に記載の医薬組成物。
14. 前記アルカリ緩衝液が、０．５〜０．７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムｐＨ１０〜１０．５、０．５〜０．７５Ｍ重炭酸ナトリウム／ＮａＯＨ ｐＨ１０．０、１．５Ｍグリシン／ＮａＯＨ ｐＨ１０．０、０．５〜１．０Ｍビス・ヒドロキシエチルアミノエタン・スルホン酸（ＢＥＳ）ｐＨ７．５、１Ｍヒドロキシエチルピペラジン・プロパン・スルホン酸（ＥＰＰＳ）ｐＨ８．５、０．５Ｍトリシン ｐＨ８．５、１Ｍモルホリノ・プロパン・スルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ８．０、１Ｍトリスヒドロキシメチル・アミノエタン・スルホン酸（ＴＥＳ）ｐＨ８．０、及び０．５Ｍシクロヘキシルアミノエタン・スルホン酸（ＣＨＥＳ）ｐＨ１０．０から成る群から選ばれる、請求項１１に記載の医薬組成物。
15. 前記アルカリ緩衝液が、０．５〜０．７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム ｐＨ１０〜１０．５、０．５〜１．０Ｍビス・ヒドロキシエチルアミノエタン・スルホン酸（ＢＥＳ）ｐＨ７．５、１Ｍヒドロキシエチルピペラジン・プロパン・スルホン酸（ＥＰＰＳ）ｐＨ８．５、及び１Ｍトリスヒドロキシメチル・アミノエタン・スルホン酸（ＴＥＳ）ｐＨ８．０から成る群から選ばれる、請求項１１に記載の医薬組成物。
16. 前記接触が、１つの注射筒には当該組成物を、そしてもう一方の注射筒には当該アルカリ緩衝液又は蒸留水が充填されている２重注射筒シリンジにより実施される、請求項１１に記載の医薬組成物。
17. 前記組成物が、水性溶液であり、そしてｐＨ１〜ｐＨ５を示すものであるか又はカオトロピズム剤を含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
18. 前記組成物が、酢酸、コハク酸、グルクロン酸、システイン酸、クロトン酸、イタコン酸、グルタミン酸、ギ酸、アスパラギン酸、アジピン酸、及びそれらの塩から成る群から選ばれる酸緩衝剤をさらに含有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 前記酸緩衝剤が、コハク酸、アスパラギン酸、アジピン酸、及び酢酸の塩から成る群から選ばれる、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 前記酸緩衝剤が、酢酸ナトリウムである、請求項１９に記載の医薬組成物。
21. 前記酸緩衝剤の濃度が、０．０２Ｍ〜１Ｍである、請求項１８に記載の医薬組成物。
22. 前記酸緩衝剤の濃度が、０．１Ｍ〜０．３Ｍである、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 前記カオトロピズム剤が、尿素、臭化ナトリウム、グアニジン塩酸塩、ＫＣＮＳ（チオシアン酸カリウム）、ヨウ化カリウム、及び臭化カリウムから成る群から選ばれる、請求項１７に記載の医薬組成物。
24. 前記カオトロピズム剤の濃度が、０．２Ｍ〜６．０Ｍである、請求項２３に記載の医薬組成物。
25. 前記カオトロピズム剤の濃度が、３．５Ｍ〜５．０Ｍである、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. 前記非動的フィブリン・モノマーの水性溶液中の濃度が、１０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌである、請求項１７に記載の医薬組成物。
27. 前記濃度が、２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである、請求項２６に記載の医薬組成物。
28. 前記水性溶液が、カルシウム・イオン源を更に含有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
29. 前記所望の部位が、哺乳動物上に存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
30. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の医薬組成物。
31. 前記所望の部位が、皮膚、心臓血管系、リンパ系、呼吸器系、耳、鼻、咽喉、眼、肝臓、脾臓、頭蓋、脊髄、上顎顔面、骨、腱、膵臓、生殖泌尿器官、及び消化器官から成る群から選ばれる、請求項３０に記載の医薬組成物。
32. （ａ）フィブリノーゲンを含有する組成物をトロンビン様酵素と接触させて、当該フィブリノーゲンを非架橋フィブリン・ポリマーに変換し；
    （ｂ）フィブリノーゲンを含有する上記組成物から上記非架橋フィブリン・ポリマーを分離し；そして
    （ｃ）当該非架橋ブィブリン・ポリマーを可溶化して、非動的フィブリン・モノマーを含有する組成物を形成する；
    ステップを含む、フィブリノーゲンから非動的フィブリン・モノマーを含有する請求項１に記載の医薬組成物を製造する方法。
33. 前記トロンビン様酵素が、支持体に固定化されており、前記接触が、前記非架橋フィブリン・ポリマーと会合するトロンビン様酵素をもたらし、そして前記方法が、フィブリン・モノマーを含有する前記組成物から前記トロンビン様酵素を分離するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記支持体が、セルロース、ポリデキストラン、アガロース、ポリスチレン、シリカ、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ガラス・ビーズ、ポリ炭酸、コラーゲン、セルローズ誘導体、ポリテトラフルオロエチレン、及びそれらの複合体から成る群から選ばれる、請求項３３に記載の方法。
35. 前記支持体がアガロース及びシリカから成る群から選ばれる、請求項３４に記載の方法。
36. 前記トロンビン様酵素が、フィルター上に固定化されるか又は前記トロンビン様酵素が支持体上に固定化され、かつ、フィルターの片面にあり、そして前記接触ステップの後に、得られたフィブリン・モノマーを、当該フィルターに通過させる、請求項３２に記載の方法。
37. 前記可溶化ステップが、ｐＨ５未満の酸緩衝液及びカオトロピズム剤により実施される、請求項３２に記載の方法。
38. 前記酸緩衝液が、酢酸、コハク酸、グルクロン酸、システイン酸、クロトン酸、イタコン酸、グルタミン酸、ギ酸、アスパラギン酸、アジピン酸、及びそれらの塩から成る群から選ばれる、請求項３７に記載の方法。
39. 前記酸緩衝液又はカオトロピズム剤が、カルシウム・イオン源を更に含む、請求項３７に記載の方法。
40. 前記分離ステップが、濾過により実施される、請求項３２に記載の方法。
41. 前記トロンビン様酵素が、フィブリノゲンをフィブリンＩに変換することができる、請求項３２に記載の方法。
42. 前記トロンビン様酵素が、アンクロド（Ａｎｃｒｏｄ）及びバトロキソビン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）から成る群から選ばれる、請求項３２に記載の方法。
43. 前記トロンビン様酵素をビオチン化し、そして前記フィブリン・モノマーを含有する前記組成物を、固定化されたアビジンと接触させ、それにより当該トロンビン様酵素を、当該フィブリン・モノマーを含有する組成物から除去することによって、当該トロンビン様酵素をフィブリンモノマーを含む当該組成物から除去するステップを更に含む、請求項３２に記載の方法。
44. 所望の部位において形成されるフィブリン密封剤用の非動的非架橋フィブリンを含有する医薬組成物であって、当該非動的非架橋フィブリンを含有する当該組成物は、当該所望の部位に接触され、そしてその後、当該非動的非架橋フィブリンは、当該接触と同時に、架橋フィブリンに変換され、それにより、当該フィブリン密封剤が当該所望の部位において形成されることを特徴とする前記医薬組成物。
45. 前記非動的非架橋フィブリンが、非架橋フィブリンＩ、非架橋デスＢＢフィブリン、及び非架橋フィブリンＩＩから成る群から選ばれる、請求項４４に記載の医薬組成物。
46. 前記非動的非架橋フィブリンが、フィブリンＩである、請求項４５に記載の医薬組成物。
47. 前記組成物が、血液、フィブリノゲンを分泌する細胞培養物又は組換えフィブリノゲンから形成される、請求項４４に記載の医薬組成物。
48. 前記血液が、自己の血液である、請求項４７に記載の医薬組成物。
49. 前記変換が、前記組成物をカルシウム・イオン源と接触させることにより実施される、請求項４４に記載の医薬組成物。