FI110616B - Menetelmä fibriinimonomeerikoostumuksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

! 110616

Menetelmä fibriinimonomeerikoostumuksen valmistamiseksi Tämän keksinnön kohteena on menetelmä koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää ei-dynaamista fibriinimo-5 nomeeriä, fibrinogeenistä. Lisäksi tässä kuvatun fibrii-nipeiteaineen käyttö, jossa koostumusta, joka sisältää fibriinimonomeeriä, tai koostumusta, joka sisältää sil-loittumatonta fibriiniä, käytetään fibriinipeiteaineen aineosana.

10 Eräs hemostasiksen, ts. verenvuodon estymisen me kanismi nisäkkäissä on verihyytymän muodostuminen. Veri-hyytymän muodostuminen ihmisissä, ts. veren koaguloitumi-nen, aiheutuu monista monimutkaisista reaktioista, joiden loppuvaiheina on fibrinogeenin, joka on monomeeri, konver-15 sio trombiinilla, kalsiumioneilla ja aktivoidulla tekijällä XIII muodostamaan kokonaan silloittunut fibriini II -polymeeri, joka on fibriinihyytymä.

Silloittuneen fibriini II -polymeerin muodostuminen etenee niin, että fibrinogeeni muuttuu trombiinin toi-,···. 20 mesta fibriini I -monomeeriksi, joka spontaanisti polyme- roituu muodostaen fibriini I -polymeerin, johon joskus viitataan liukoisena fibriininä I, koska käsittelemällä tarkoituksenmukaisella kemikaalilla fibriini I -polymeeri ··.'· voidaan muuttaa takaisin fibriini I -monomeeriksi. Fib- : '.· 25 riini I -polymeeri muuttuu sitten trombiinin toimesta fib- ·' riini II -polymeeriksi, johon joskus viitataan liukoisena fibriininä II, koska käsittely tarkoituksenmukaisella kemikaalilla muuttaa fibriini II -polymeerin fibriini II -monomeeriksi. Fibriini II -polymeeri, tekijän XHIa vai-; 30 kutuksesta, joka tunnetaan aktivointitekijänä XIII, sil- loittuu sitten muodostamaan silloittuneen fibriinin II, . joka on fibriinihyytymä. Tekijä XIII aktivoituu trombiinin · toimesta kalsiumionien läsnä ollessa. Silloittuneeseen ·;··: fibriiniin II viitataan joskus liukenemattomana fibriininä . V 35 II, koska se ei voi muuttua fibriini II -monomeeriksi.

110616 2

On ymmärrettävä, että trombiini on muodostunut protrombiinista. Protrombiini muuttuu trombiiniksi tekijällä Xa kalsiumin ja muiden avustavien aineiden läsnä ollessa.

5 Fibrinogeeniä on läsnä n. 2 - 4 g/1 veriplasmapro- teiinia. Fibrinogeeni on monomeeri, joka koostuu kolmesta disulfidi-sitoutuneesta polypeptidiketjujen parista, jotka on merkitty (Aa) 2, (Ββ)2, Y2- "A" ja "B" kuvaavat kahta pientä aminopäätteistä peptidiä, jotka tunnetaan fibrino-10 peptidinä A ja fibrinopeptidinä B, vastaavasti. Fibrino-peptidien A lohkaisu fibrinogeenistä fibrinogeenin transformaatiossa trombiinin toimesta johtaa fibriini I -yhdisteeseen ja myöhempi fibrinopeptidien B lohkaisu johtaa fibriini II -yhdisteeseen. Tällainen fibrinopeptidien A ja 15 B lohkaisu alentaa fibrinogeenin molekyylipainoa hyvin vähän, n. 6 000 - n. 340 000 daltonia, mutta altistaa po-lymerointikohdat. Katsauksen fibrinogeenin rakenteesta ja veren hyytymisen mekanismeista löytämiseksi katso C. M. Jackson, Ann. Ref. Biochem., 49: 765 - 811 (1980) ja B.

.···. 20 Furie ja B.C. Furie, Cell, 53: 505 - 518 (1988).

*'! Fibriinipeiteaine on biologinen tartunta-aine, jo- ka vaikutuksiltaan jäljittelee koagulaation loppuvaiheita, ···’ aikaansaaden täten fibriinihyytymän. Tavalliset fibriini- ···· peiteaineet koostuvat väkevöidystä ihmisen fibrinogeenis- : ’.· 25 tä, naudan aprotiniinista ja tekijästä XIII ensimmäisenä · aineosana ja naudan trombiinista ja kalsiumkloridista toi sena aineosana. Sovellutus toteutetaan tavallisesti kaksiosaisella käsipumpulla, joka mahdollistaa molempien aineosien samanaikaisen käytön kohdalle, johon halutaan fib-.·. · 30 riinihyytymän muodostuvan. Aprotiniini on fibrinolyyttinen inhibiitti, jota lisätään fibriinipeiteaineiden stabiili-'! . suuden edistämiseksi.

Fibriinipeiteaineen fibrinogeeniaineosa valmiste-'.··’ taan yhdistetystä ihmisplasmasta. Fibrinogeeni voidaan . V 35 väkevöidä ihmisplasmasta kryosaostamalla ja saostamalla 110616 3 käyttäen eri reagensseja, esim. polyetyleeniglykolia, eetteriä, etanolia, ammoniumsulfaattia tai glysiiniä. Erinomainen kuvaus fibriinipeiteaineista löytyy julkaisuista M. Brennan, Blood Reviews, 5: 240 - 244 (1991); J. W.

5 Gibble ja P. M. Ness, Transfusion, 30: 741 - 747 (1990); H. Matras, J. Oral. Maxillofac Surg., 43: 605 - 611 (1985) ja R. Lerner ja N. Binur, J. of Surgical Research, 48: 165 - 181 (1990).

Viime aikoina on myös osoitettu kiinnostusta fib-10 riinipeiteaineiden valmistusta kohtaan, joissa voidaan käyttää autologista fibriiniä. Autologinen fibriinipeite-aine on fibriinipeiteaine, jossa fibriinipeiteaineen fib-rinogeeniaineosa on uutettu potilaiden omasta verestä. Autologisen fibriinipeiteaineen käyttö on edullista, koska 15 se poistaa verensiirtoinfektioiden, esim. hepatitis B:n, ei-A-, ei-B-hepatitiksen ja immuunikadon (AIDS), tarttu-misriskin, mikä muutoin olisi mahdollista fibrinogeeniai-neosan, joka on uutettu yhdistetystä ihmisplasmasta, tapauksessa. Katso L.E. Silberstein et ai., Transfusion, 28: ,···. 20 319 - 321 (1988); K. Laitakari ja J. Luotonen, Laryn- goscope, 99: 974 - 976 (1989) ja A. Dreslade et ai., The Annals of Thoracic Surgery, 40: 385 - 387 (1985).

• · · ·'·; Infektio voi tarttua fibriinipeiteaineesta ei ai- ··· noastaan fibrinogeenistä vaan myös naudan aprotiniinista : . 25 ja naudan trombiinista. Naudan trombiinin tiedetään sisäl- V · tävän tarttuvaa naudan aivokalvontulehdusta (bovine spongiform encephalitis) (BSE) ja muita nisäkkäille patogeenisiä viruksia. Lisäksi naudan trombiini on tehokas antigeeni, joka voi aiheuttaa immunologisia reaktioita 30 ihmisissä. Täten naudan trombiinin käyttö voi aikaansaada haitallisia vaikutuksia vastaanottajassa. Katso D. M.

‘. Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (Supplement A): 141 - 146 (1991), S.B. Prusiner et al., Cornell Vet, 81 nro 2: 85 - 96 (1991) ja D. Matthews, J. Roy. Soc. Health, 3-5 : ,·’ 35 (helmikuu 1991) .

4 110616 Tämän mukaisesti on olemassa tarve fibriinipeite-aineelle, joka voidaan kuljettaa potilaaseen ilman virus-kontaminaation tai muiden haitallisten vaikutusten riskiä.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä ei-dynaa-5 mistä fibriinimonomeeriä sisältävän koostumuksen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnön mukaan valmistetaan myös pakkauksia, jotka sisältävät tällaista fibriinimonomeeriä.

Tässä keksinnössä käytetään seuraavia määritelmiä: 10 Fibriini - fibriini tarkoittaa mitä tahansa fib- riinin muotoa. Ei-rajoittavia esimerkkejä fibriinistä ovat fibriini I, fibriini II ja des BB -fibriini. Fibriini voi olla monomeerisessä tai polymeerisessä muodossa, jolloin polymeerinen muoto on joko silloittumaton tai silloittu-15 nut.

Fibriinimonomeeri - fibriinimonomeeri on mikä tahansa fibriinin muoto, esim. fibriini I, fibriini II tai des BB -fibriini, jossa fibriini on monomeerisessä tai oligomeerisessä muodossa, joka voidaan liuottaa koostumuk-,···. 20 seen, joka sisältää f ibriinimonomeeriä ja jossa fibriini- monomeeri voidaan muuttaa fibriinipolymeeriksi.

'"I Fibriinipolymeeri - fibriinipolymeeri on mikä ta- ···; hansa fibriinin muoto, esim. fibriini I, fibriini II tai • •d des BB -fibriini, jossa mainittu fibriini on polymeerises- : V 25 sä muodossa, joko silloittuneena tai silloittumattomana.

Silloittumaton fibriini - silloittumaton fibriini on mikä tahansa fibriinin muoto, esim. fibriini I, fibriini II tai des BB -fibriini, jossa mainittu fibriini on silloittumaton ja voidaan muuttaa silloittuneeksi fibrii-·, 30 niksi. Silloittumaton fibriini voi olla fibriinimonomeeri -·. tai silloittumaton fibriinipolymeeri.

‘. Silloittunut fibriini - silloittunut fibriini on mikä tahansa fibriinin muoto, esim. fibriini I, fibriini II tai des BB, jossa fibriini on fibriinipolymeeri, joka ; ;.· 35 on silloittunut.

• I

11)1 5 110616 Tässä kuvataan edelleen menetelmä fibriinipeiteai-neen käyttämiseksi, jossa menetelmässä: (a) saatetaan haluttu kohta kosketukseen koostumuksen kanssa, joka sisältää fibriinimonomeeriä; ja 5 (b) muutetaan mainittu fibriinimonomeeri fibriini- polymeeriksi rinnakkaisesti mainitun kontaktivaiheen kanssa aikaansaaden täten fibriinihyytymän.

Lisäksi tässä kuvataan menetelmä fibriinipeite-aineen käyttämiseksi, jossa menetelmässä: 10 (a) saatetaan haluttu kohta kosketukseen koostu muksen kanssa, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä; ja (b) muutetaan mainittu silloittumaton fibriini silloittuneeksi fibriiniksi rinnakkaisesti mainitun 15 kontaktivaiheen kanssa muodostamaan täten fibriinihyytymä.

Esitetään myös menetelmät tällaisen koostumuksen ja koostumusten ja pakkausten valmistamiseksi, jotka sisältävät tällaista silloittumatonta fibriiniä.

4.1. Koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä ,··· 20 Keksinnön mukaan fibriinikoostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä, on koostumus, joka sisältää mitä ”’· tahansa fibriinimonomeerimuotoa, joka voidaan muuttaa ···' fibriinipolymeeriksi. Ei-rajoittavia esimerkkejä fibriini- monomeeristä ovat fibriini I monomeeri, fibriini II mono-i ’. 25 meeri tai des BB -fibriinimonomeeri, fibriini I monomeerin ·/ ollessa edullinen. Tietenkin nämä voivat olla fibriinimo- nomeeriseoksia. Tämän keksinnön tarkoituksia varten fib-riinipolymeeri on myös mikä tahansa polymeeri, joka on saatu fibriinimonomeerin polymeroinnista. Täten esimerkik-30 si fibriini I monomeerin konversio fibriinipolymeeriksi voi muodostaa fibriini I polymeerin, silloittuneena tai . silloittumattomana, ja/tai fibriini II -polymeerin, sil loittuneena tai silloittumattomana, riippuen siitä, miten ':· konversiovaihe toteutetaan.

: !·’ 35 » * » · 6 110616

Fibriini I monomeeri on edullinen, koska se voidaan, poiketen fibrinogeenistä, helposti muuttaa fibriini-polymeeriksi käyttämättä trombiinia tai tekijää XIII. Tosiaan fibriini I monomeeri voi spontaanisti muodostaa fib-5 riini I polymeerin, joka voi toimia fibriinihyytymänä, riippumatta siitä, onko fibriini I polymeeri silloittunut vai silloittumaton, tai muuttua edelleen fibriini II -polymeeriksi. Täten, koska fibriini I polymeerin muodostuminen fibriini I monomeeristä on spontaani, fibriini I poly-10 meeri voidaan muodostaa ilman trombiinia tai tekijää XIII, välttäen täten ongelmat, jotka liittyvät naudan trombii-niin. (On huomattava, että mikäli fibriini I monomeeriä käytetään niin, että fibriini I monomeeri joutuu kosketukseen potilaan veren, esimerkiksi haavassa, kanssa, poti-15 laan trombiini ja tekijä XIII voivat muuttaa fibriini I

polymeerin silloittuneeksi fibriini II -polymeeriksi).

Koostumus, joka sisältää silloittumatonta fibrii-niä, on koostumus, joka sisältää mitä tahansa silloittu-mattoman fibriinin muotoa. Ei-rajoittavia esimerkkejä sil- ,··· 20 loittumattomasta fibriinistä ovat silloittumaton fibriini I, silloittumaton fibriini II ja des BB -fibriini, sil-loittumattoman fibriini I:n ollessa edullinen. Tietenkin • * •**j nämä voivat ola myös silloittumattoman fibriinin seoksia.

• ••1 Tämän keksinnön tarkoituksia varten "silloittunut fibrii- .’ 25 ni" on myös mikä tahansa fibriinin muoto, joka on saatu * · :,· silloittumattoman fibriinin konversiosta silloittuneeksi fibriiniksi. Täten silloittunut fibriini, esimerkiksi sellainen, joka on saatu silloittumattumattoman fibriinin I konversiosta silloittuneeksi fibriiniksi, voi olla sil-30 loittunut fibriini I ja/tai silloittunut fibriini II, riippuen siitä, kuinka konversiovaihe toteutetaan.

Silloittumaton fibriini I on edullinen, koska se voidaan helpommin, verrattuna fibrinogeeniin, muuttaa silloittuneeksi fibriiniksi. Tosiaan uskotaan, että fibriini ; V 35 I voi muodostaa silloittuneen fibriinin I, joka voi toimia

Mil 7 110616 fibriinipeiteaineena. Täten silloittuneen fibriinin I muodostaminen silloittumattomasta fibriinistä I voidaan toteuttaa ilman trombiinia, välttäen täten ongelmat, jotka liittyvät naudan trombiiniin, vaikka aktivointitekijää 5 XIII voidaan tarvita. (On huomattava, että mikäli silloit-tumatonta fibriiniä I käytetään niin, että silloittunut fibriini I joutuu kosketukseen ihmisen veren kanssa, esimerkiksi haavassa, potilaan trombiini ja tekijä XIII voivat muuttaa fibriinin I silloittuneeksi fibriiniksi II).

10 Silloittumaton fibriini voi olla myös polymeeri, oligomeeri tai monomeeri, joskin oligomeeri tai monomeeri on edullinen, ts. fibriinimonomeeri. Tämä johtuu siitä tosiasiasta, että silloittumaton fibriini polymeerimuodos-sa on tavallisesti geeli ja täten hyvin vaikeasti kulje-15 tettavissa haluttuun kohtaan eikä ole yhtä läheisessä kosketuksessa solujen kanssa halutussa kohdassa. Tästä poiketen saatu silloittumaton fibriini oligomeerisessä tai mo-nomeerisessä muodossa on liukoinen ja täten helpommin kuljetettavissa haluttuun kohtaan ja sillä on läheisempi kos-,"· 20 ketus solujen kanssa. Koostumus voi sisältää tietenkin tällaisten silloittumattomien fibriinimuotojen seosta.

Koostumuksen lähde, joka sisältää fibriinimonomee- i · · ···; riä tai silloittumatonta fibriiniä, voi olla mikä tahansa

I I

···: tunnettu lähde tai on kehitettävissä niin kauan kun fib- » » · ; . 25 riinimonomeeri voidaan muuttaa fibriinipolymeeriksi tai > · v silloittumaton fibriini voidaan muuttaa silloittuneeksi fibriiniksi. Ei-rajoittavia lähteitä fibriinimonomeerille tai silloittumattomalle fibriinille koostumuksissa ovat veri, edullisesti nisäkkään veri ja jopa edullisemmin ih-.·. 30 misen veri, soluviljelmät, jotka erittävät fibrinogeeniä ... ja rekombinanttifibrinogeeniä, joista veri on edullinen.

'!. Veri voi olla mikä tahansa veren muoto, mukaanlukien esi merkiksi kokoveri tai valmistetut fibrinogeenipreparaatit. Verta voidaan käyttää myös autologisen fibriinipeiteaineen . V 35 valmistamiseksi.

tllt 8 110616

On havaittu, että koostumuksessa, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä I, joko fibriini I monomeerinä tai fibriini I polymeerinä, valmistettuna kokoverestä, kuten edellä on kuvattu, silloittumaton fibriini I voidaan 5 muuttaa silloittuneeksi fibriiniksi II ilman trombiinin lisäämistä, tekijää XIII tai muita tarpeellisia aineita veren koaguloimiseksi. Uskotaan, että tämä johtuu siitä tosiasiasta, että koostumus, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä I, joka on valmistettu kokoverestä, sisältää 10 riittäviä määriä protrombiinia, tekijää XIII ja tällaisia muita tarpeellisia aineita plasmasta, niin että silloittumaton fibriini I voidaan muuttaa silloittuneeksi fibriiniksi II lisäämättä eksogeenistä trombiinia ja tekijää XIII. Tätä endogeenistä protrombiinia ja tekijää XIII voi-15 daan käyttää fibriinipeiteaineen aineosina koostumuksessa, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fibriiniä.

Kuitenkin tulisi ottaa huomioon, että riittäviä määriä tätä endogeenistä trombiinia ja tekijää XIII ei ,*·· 20 saada fibrinogeenin muuttamiseksi silloittuneeksi fibrii- ’‘,’ niksi II reaktionopeudella, joka on sopiva fibriinipeite- *’*) aineelle. Uskotaan, että tarvitaan enemmän trombiinia

fibrinogeenin muuttamiseksi silloittuneeksi fibriiniksi II

· ..d kuin silloittumattoman fibriinin I muuttamiseksi silloit- • · · i *, 25 tumattomaksi fibriiniksi II samalla reaktionopeudella.

* I

Jokainen näistä kolmesta lähteestä sisältää fibri-nogeeniä, joka voidaan muuttaa fibriinimonomeeriksi tai silloittumattomaksi fibriiniksi. Tällaisen reaktiovaiheen lisäksi saadun koostumuksen, joka sisältää fibriinimono-30 meerin tai silloittumatonta fibriiniä, on oltava väkevöi-dyssä muodossa. On edullista, että fibriinimonomeerin pi-‘. toisuus on alueelta 10 mg/ml, edullisemmin n. 20 mg/ml - n. 200 mg/ml, edullisemmin jopa n. 20 mg/ml - n. 100 mg/ml ja edullisimmin n. 25 mg/ml - n. 50 mg/ml.

: V 35 f i * ‘(at i 9 110616

Keksinnön mukaisessa menetelmässä fibriinimono-meeri tai silloittumaton fibriini on ei-dynaaminen. Tämän keksinnön tarkoituksia varten ei-dynaaminen koostumus, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä, tarkoittaa, että 5 silloittumaton fibriini tällaisessa koostumuksessa ei sil-loitu ainakaan n. 1,5 minuuttia, edullisesti ei ainakaan n. 3 minuuttia ja edullisemmin ei ainakaan n. 30 minuuttia tällaisen koostumuksen valmistamisen jälkeen. Tämän keksinnön tarkoitusta varten ei-dynaaminen koostumus, joka 10 sisältää fibriinimonomeeriä, tarkoittaa, että fibriini- monomeeri tällaisessa koostumuksessa ei polymeroidu ainakaan n. 1,5 minuuttia, edullisesti ei ainakaan n. 3 minuuttia, edullisemmin ei ainakaan n. 30 minuuttia ja jopa edullisemmin ei ainakaan n. 2 tuntia koostumuksen valmis-15 tamisen jälkeen. Tosiasiaan tulisi ottaa huomioon, että koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä, voi olla ei-dynaaminen useita päiviä, ts. n. 72 tuntia sen valmistamisen jälkeen.

Koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai 20 silloittumatonta fibriiniä, voidaan valmistaa verestä.

Menetelmä voi johtaa vetysitoutuneeseen f ibriinipolymee-riin, joka on silloittumattoman fibriinin muoto. Tällaista /1' polymeeriä voidaan sitten käyttää fibriinipeiteaineen ai- neosana tai muuttaa fibriinimonomeeriksi menetelmällä, *·'; 25 johon viitataan liuottamisena, kuten seuraavassa on esi- tetty. On myös edullista, että koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fibriiniä, valmistetaan steriilissä ympäristössä.

Koostumukset, jotka sisältävät fibriinimonomeeriä 30 tai silloittumatonta fibriiniä, voidaan valmistaa koko- * *. verestä poistamalla veri luovuttajasta ja edullisesti an- ·.. tikoagulantin läsnä ollessa. Mitä tahansa antikoagulanttia ··. : voidaan käyttää. Ei-rajoittavia esimerkkejä antikoagulan- ____: teista ovat hepariini, EDTA, hirudiini, sitraatti tai mikä 35 ίο 110616 tahansa muu aine, joka voi suoraan tai epäsuorasti estää trombiinin muodostumisen ja joista sitraatti on edullinen.

Plasma, joka sisältää fibrinogeeniä, erotetaan sitten kokoverestä. Mitä tahansa erotusmenetelmää voidaan 5 käyttää, esimerkiksi sedimentaatiota, sentrifugointia tai suodattamista. Sentrifugointi voidaan toteuttaa n.

3 000 g:ssa n. 10 minuutin aikana. Kuitenkin, mikäli halutaan saada plasma hiutalerikkaana, sentrifugointi voidaan toteuttaa alemmassa g-voimassa, esim. 500 g:ssa n. 20 mi-10 nuutin aikana. Ylin kirkas kerros, joka sisältää plasmaa, voidaan poistaa standardimenetelmien avulla.

Suodattaminen voidaan toteuttaa antamalla kokoveren kulkea sopivan suodattimen läpi, joka erottaa verisolut plasmasta. On edullista, että suodatin on mikrohuokoi-15 nen kalvo, jolla on hyvä proteiinin läpäisevyys.

Saatua plasmaa käsitellään sitten fibrinogeenin muuttamiseksi fibriinimonomeeriksi tai silloittumattomaksi fibriiniksi. Tämä konversio voidaan toteuttaa millä tahansa tunnetulla tai kehitteillä olevalla menetelmällä.

20 Edullinen menetelmä fibriinimonomeerin tai sil- loittumattoman fibriinin valmistamiseksi tapahtuu trombii-nin tapaisen entsyymin avulla, mukaanlukien trombiini. Trombiinin kaltainen entsyymi on mikä tahansa entsyymi, ;· joka katalysoi fibriinin muodostumista fibrinogeenistä.

25 Tavallinen trombiinin tapaisten entsyymien lähde ovat käärmemyrkyt. Edullisesti trombiinin tapainen entsyymi puhdistetaan käärmeen myrkystä. Riippuen trombiinin tapaisen entsyymin valinnasta tällainen trombiinin tapainen entsyymi voi vapauttaa fibrinopeptidiä A, joka muodostaa 30 fibriiniä I, fibrinopeptidiä B, joka muodostaa des BB "* ' -fibriiniä tai sekä fibrinopeptidiä A että B, jotka muodostavat fibriiniä II. Tulisi huomata, että ne trom- ‘ biinin kaltaiset entsyymit, jotka vapauttavat fibrino peptidiä A ja B, voivat tehdä tämän eri nopeuksilla. Täten • 35 saatu koostumus voi olla esimerkiksi fibriinin II ja n 110616 fibriinin I seos tai fibriinin II ja des BB -fibriinin seos.

Taulukko I on ei-rajoittava taulukko käärme-myrkyistä, joita voidaan käyttää tässä keksinnössä, trom-5 biinin tapaisen entsyymin nimi ja fibrinopeptidin ja fibrinopeptidien nimet, joita vapautuu entsyymikäsit-telyllä, on annettu.

Taulukko I

1° ^SS==S=====X-—SSSSIS==^S===SSSS=S=^^ (Vapautunut Lähde Nimi fibrinopeptidi

Agkistrodon seutua__Acutin__A_ A. contortrix contortrix__Venzyroe__B, (A)*_ A. halys Pallas___B, (A)*_

A. (Calloselasma) Ancrod, Arvin A

rhodoatoma_____

Bothrops aapar (B. atrox)__Asperaae__A _

B. Atrox Batroxobin, A

Reptiiase- reagenssi 20--- : ”· B♦ insular ia____A, B_ • j B. jararaoa_______Botropase__A_

B. Moojeni (B. Atrox) Batroxobin', A

...i _·___Def ibraee___

Lachesis auta auta___A, B_

‘ ' 25 Crotalua adaaanteus Crotalase A

> · ; C. durissua terrifjcua____A_

Trlmereaurua flavoviridis__Flavoxobin__A_ T. gramineua___A_

Bltia gabonica Gabonaee A, B

3Q “ ’· ’ * ( ) tarkoittaa alhaista aktiivisuutta.

Kuvausta trombiinin tapaisista entsyymeistä käärmemyrkyistä katso H. Pirklen ja K. Stockerin julkaisua 35 Thrombosis and Haemostasis, 65 (4) : 444 - 450 (1991).

12 110616

Edullisia trombiinin kaltaisia entsyymejä ovat batroksobiini, erityisesti B. Moojenistä, B. Maranhaosta ja B. atroxista ja Ancrodista, erityisesti A. rhodosto-masta.

5 Fibriinimonomeeri tai silloittumaton fibriini voi daan valmistaa saattamalla plasma kosketukseen trombiinin tapaisen entsyymin kanssa mahdollistaen täten fibrinogee-nin konvertoitumisen fibriinimonomeeriksi plasmassa. Kuitenkin saatu fibriinimonomeeri polymeroituu spontaanisti 10 muodostaen vetysidospolymeerin geelin muodossa, joka erottuu jäljelle jääneestä seerumista, joka on liuos. Geeli on koostumuksen muodossa, joka sisältää silloittumatonta fib-riiniä.

Tämä silloittumaton fibriinigeeli voidaan ottaa 15 talteen esimerkiksi sentrifugoimalla (3000 g:ssa 10 minuuttia) , silloittumattoman fibriinin suoralla manuaalisella erottamisella seerumista, suodattamalla, suoraan tai alennetussa paineessa, mitä seuraa erotetun seerumin poistaminen. (Voidaan käyttää 1 - 100 mikronin huokoskoon suo-20 datinta, esimerkiksi sintrattua polypropyleenin 20 mikro-nin huokoskoon suodatinta Porex Incrstä, teflon 20 - 70 mikronin huokoskoon suodatinta Fluorotechniques Incrstä tai nailon 66 22 - 46 mikronin huokoskoon suodatinta Cos-i tar Incrstä) .

·*·’ 25 Tämä talteenotto erottaa silloittumattoman fibrii- * · .*.* nigeelin seerumista, joka on liuos, ja väkevöi täten sil

loittumattoman fibriinigeelin plasmasta. Tulisi huomata, että silloittumaton fibriinigeeli sisältää ainakin vähän protrombiinia, tekijää XIII ja muita tällaisia tarpeelli-30 siä aineita plasmasta niin, että silloittumaton fibriini I

• · *. ’ voidaan muuttaa silloittuneeksi fibriiniksi II lisäämättä ·., eksogeenistä trombiinia tai tekijää XIII. Tätä endogeenis- tä protrombiinia ja tekijää XIII voidaan käyt-,,,· tää fibriinipeiteaineen aineosina koostumuksessa, joka 35 13 110616 sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fib-riiniä.

Sentrifugointivoima tai suodatuspaine talteenoton aikana määrittää, kuinka paljon seerumia poistuu silloit-5 tumattomasta fibriinigeelistä, niin että mitä suurempi voima tai paine on, sitä väkevämpi on saatu silloittumaton fibriinigeeli. Kuitenkin on edullista, että tällainen voima tai paine ei ole niin suuri, että protrombiini ja tekijä XIII poistuvat silloittumattomasta fibriinigeelistä.

10 Silloittumaton fibriinigeeli on nyt valmis käytet täväksi fibriinipeiteaineen aineosana koostumusmuotona, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä. On havaittu, että kun koostumus valmistetaan kokoverestä, n. 60 % - n. 90 % alkuperäisestä fibrinogeenistä on läsnä koostumukses-15 sa, mutta tietenkin silloittumattoman fibriinin muodossa.

Koostumusta, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä, voidaan käyttää välittömästi sen valmistuksen jälkeen. Todella on erityisen edullista käyttää tällaista koostumusta välittömästi sen valmistumisen jälkeen, kun 20 koostumus on autologinen. Mikäli koostumusta ei käytetä *·· välittömästi sen valmistumisen jälkeen, koostumus voidaan • · varastoida. Koostumuksen varastointi vaatii, että koostu- mus suojataan esimerkiksi jäädyttämällä tai kylmäkuivaa- ^j maila koostumus tai pitämällä koostumus 4 °C:ssa. Koostu- ·’·' 25 mus jäädytetyssä tai lyofilisoidussa muodossa on stabiili * « kuukausien ajan. Kun koostumus pidetään 4 °C:ssa, usko-taan, että koostumus on stabiili ainakin päivien ajan.

Mikäli koostumus on jäädytetty, koostumus on sulatettava ennen käyttöä.

30 Tämä menetelmä johtaa silloittumattoman fibriini- » ’ geelin muodostumiseen, joka muuttaa fibrinogeenin silloit- tumattomaksi fibriinigeeliksi ja väkevöi tällaisen geelin i * pääosin yhdessä vaiheessa. Vaihtoehtoisesti, eikä yhtä edullisesti, fibrinogeeni voidaan väkevöidä tavallisilla 35 menetelmillä, esim. kryosaostamalla ja saostamalla käyt- 14 110616 täen eri reagensseja, esim. polyetyleeniglykolia, eetteriä, etanolia, ammoniumsulfaattia tai glysiiniä. Väkevöity fibrinogeeni voidaan sitten muuttaa silloittumattomaksi fibriinigeeliksi edellä kuvatuilla menetelmillä, tai edul-5 lisesti, koska fibrinogeeni on jo väkevöity, fibrinogeeni voidaan muuttaa koostumukseksi, joka sisältää fibriinimo-nomeeriä, ilman tarvetta muodostaa ensin silloittumaton fibriinigeeli. Tämä voidaan toteuttaa saattamalla väkevöity fibrinogeeni kosketukseen kaotrooppisen aineen kanssa 10 antamaan fibrinogeeniliuos.

Kaotrooppinen aine on tarpeellinen estämään fib-riinimonomeerin, jota muodostuu kun fibrinogeeni on kosketuksessa trombiinin kaltaisen entsyymin kanssa, spontaani polymeroituminen. Kaotrooppinen aine sekoitetaan tällaisen 15 fibrinogeenikoostumuksen kanssa ja sitten sitä sekoitetaan n. 1-2 minuuttia fibrinogeeniliuoksen muodostamiseksi. Fibrinogeeni voidaan sitten muuttaa fibriinimonomeeriksi, esimerkiksi trombiinin kaltaiseksi entsyymiksi, kuten edellä on kuvattu, tai trombiinin kaltaiseksi entsyymiksi, .20 immobilisoituneena kantoaineelle, kuten seuraavassa on kuvattu.

"’1 Sopivia kaotrooppisia aineita ovat urea, natrium- bromidi, guanidiini hydrokloridi, KCNS, kaliumjodidi ja kaliumbromidi. Kaotrooppisen aineen edullinen pitoisuus on ·' ·' 25 n. 0,2 - n. 6,0 M ja edullisimmin n. 0,3 - n. 2,0 M. On ·.* · edullista käyttää pienintä mahdollista määrää kaotrooppis- ta ainetta, joka määrä vielä estää fibriinimonomeerin spontaanin polymeroitumisen.

Tulisi huomata, että on edullista, että kalsium-.·. : 30 ionien lähdettä ei lisätä kaotrooppiseen aineeseen ennen .··· kuin halutaan muuttaa fibriinimonomeeri fibriinipolymee- ’· · riksi, kuten seuraavassa on kuvattu. Tämä varmistaa sen, että fibriinimonomeeri ei silloitu, johtuen endogeenisten veren hyytymistekijöiden aktivoinista.

: V 35 is 110616

Edullisessa suoritusmuodossa trombiinin kaltainen entsyymi immobilisoidaan kantoaineelle. Tällainen suoritusmuoto on edullinen, koska on helppoa erottaa immobili-soitu entsyymi plasmasta, estäen täten koostumuksen, joka 5 sisältää silloittumatonta fibriiniä, entsyymikontaminaa-tio.

Mitä tahansa kantoainetta, johon trombiinin kaltainen entsyymi voi liittyä, voidaan käyttää tässä keksinnössä. Ei-rajoittavia esimerkkejä sopivista kantoai-10 neista ovat selluloosa, polydekstraanit, agaroosi, poly-styreenit, piidioksidi, polyakryylihapot, polyakryyli-amidit, polyvinyylialkoholit, lasihelmet, polytetrafluori-etyleeni, polykarbonaatti, kollageeni, selluloosajohdan-naiset, tefloni ja niiden koostumukset, joista piipoly-15 styreeni ja agaroosi ovat edullisia ja agaroosi on edullisin.

Toisessa edullisessa suoritusmuodossa trombiinin kaltainen entsyymi kiinnittyy kantoaineeseen, siis suodat-timeen tai suodattimen toiselle puolelle ja kiinnittyy 20 toiseen kantoaineeseen, esim. helmeen. Muutoin trombiinin kaltainen entsyymi kulkeutuu suodattimen läpi. Täten suo-"! dattimen huokoskoon on oltava sellainen, että immobilisoi- tu trombiinin kaltainen entsyymi ei voi läpäistä suodatin-ta, mutta silloittumaton fibriini voi läpäistä suodatti-: ·' 25 men. Silloittumaton fibriini valmistetaan saattamalla ’.· · plasma kosketukseen trombiinin kaltaisen entsyymin kanssa suodattimen toisella puolella muodostamaan fibriinimono-meeri, joka yhdessä muun plasman kanssa läpäisee suodattimen. Täten saatu koostumus, joka sisältää silloittumatonta .: 30 fibriiniä, erottuu välttämättä trombiinin kaltaisesta ent- .··· syymistä. Fibriinimonomeeri, kuljettuaan suodattimen läpi, '· · polymeroituu spontaanisti muodostaen silloittumattoman fibriinipolymeerin.

"· Trombiinin kaltaisen entsyymin immobilisoimiseksi ; ,· 35 kantoaineelle, kantoaineen on oltava aktivoitu. Tämä voi- 16 110616 daan toteuttaa millä tahansa tekniikalla. Esimerkiksi eri aktivointiaineita, joita on saatavissa kantoaineiden johtamiseksi, ovat: diatsoniumryhmät, isosyanaattiryhmät, happokloridiryhmät, happoanhydridiryhmät, sulfonyyliklori-5 diryhmät, dinitrofluorifenyyliryhmät, isotiosyanaattiryh- mät, hydroksyyliryhmät, aminoryhmät, n-hydroksisukkiini-imidiryhmät, triatsiiniryhmät, hydratsinoryhmät, karbodi-imidiryhmät, silaaniryhmät ja syaanibromidi. Katso (a) Pentapharm Patent DT 2440 254 Ai; (b) P. D. G. Dean, W. S. 10 Johnson ja F. A. Middle (julkaisijat) (1991) IRL Press

Oxford - Affinity Chromatography - A practical approach -luku 2 - Activation Procedures, jotka julkaisut on liitetty tähän viitteinä.

Edullinen aktivointimenetelmä tapahtuu hydratsidi-15 ryhmän avulla. Hydratsidilla aktivoidun kantoaineen käyttö aikaansaa maksimaalisen trombiinin kaltaisen entsyymin prosentuaalisen aktiivisuuden säilymisen pääosin ilman entsyymi vuotoa (vähintäin n. 30 % - n. 50 % mitattuna S2238-kokeella - katso Axelsson G. et ai., Thromb. .*··. 20 Haemost., 36: 517 (1976)). Voidaan käyttää myös alhaisia pH-arvoja esim. arvoa 4-6, entsyymin liittämisessä ent-syymin hajoamisen estämiseksi.

Yleensä kantoaine aktivoidaan hyvin reaktiivisella ···· yhdisteellä, joka kantoaine tämän jälkeen saatetaan rea- • · . 25 goimaan ligandin funktionaalisen ryhmän, esim. ryhmän -OH, ’.· -NH2, -SH, -COOH, -CHO kanssa, muodostamaan kovalenttinen sidos. Edullisia aktivointimenetelmiä käytettäviksi tässä keksinnössä ovat: (a) triatsiiniryhmän avulla ja edullisesti triat-.·. 30 siinihalogenidiryhmillä; .··· (b) tresyylikloridiryhmän avulla; . (c) karbonyylidi-imidatsoliryhmän avulla; (d) syaanibromidiryhmän avulla; ja (e) hydratsidi- tai aminoryhmän avulla.

: 35 17 110616

Kohdissa (a) - (d) proteiini liitetään reaktiolla NH2, -SH tai -OH-ryhmien kanssa, kun taas kohdassa (e) proteiini liitetään hapetetulla hiilihydraattiryhmällä, ts. -CHO:lla. Näiden aineiden käyttö johtaa maksimaaliseen 5 prosentuaaliseen trombiinin kaltaisen entsyymin aktiivisuuden säilymiseen pääosin ilman entsyymivuotoa (vähintäin n. 30 % - n. 50 % mitattuna S2238-kokeella).

Triatsiiniaktivoinnissa käytettiin kahta erilaista menetelmää. Ensimmäisessä menetelmässä triatsiinirengas 10 sidotaan suoraan OH-ryhmien pinnalle. Tämä vastaa käytettyä CNBr-aktivointimenetelmää, jossa pintadioliryhmät saatetaan reagoimaan CNBr:n kanssa. Triatsiiniaktivoinnissa agaroosin OH-ryhmät saatetaan reagoimaan triatsiinin (syaanivirtsahappokloridi) kanssa.

15 Yleensä kantoaine, joka aktivoidaan hyvin reaktii visella yhdisteellä, reagoi tämän jälkeen ligandin funktionaalisen ryhmän, esim. ryhmän -OH, -NH2, -SH, -CHO kanssa, muodostaen kovalenttisen sidoksen. Jäljelle jääneet aktivoidut ryhmät, joilla ei ole trombiinin kaltaista 20 entsyymiä liittyneenä, voidaan, mutta se ei ole välttämä-töntä, suojata ei-reaktiivisilla yhdisteillä, kuten etano-I liamiinilla, etikkahappoanhydridillä tai glysiinillä.

**” Edullisia aktivointimenetelmiä käytettäviksi tässä keksinnössä ovat: : · 25 (a) syaanibromidiaktivointi, mitä seuraa entsyymin • · *.· välitön kytkentä -NH2~ryhmien kautta proteiiniin.

(b) kantoaineen aktivointi monoklooritriatsii-nilla, mitä seuraa entsyymin liittäminen -NH2-, -OH- tai -SH-ryhmien kautta.

30 (c) kantoaineen aktivointi diklooritriatsiinilla, .··· mitä seuraa entsyymin liittäminen -NH2-, -OH- tai -SH-ryh- • · mien kautta.

(d) kantoaineen aktivointi tresyylikloridilla, ’·” mitä seuraa entsyymin liittäminen -NH2-, -OH- tai -SH- : ,* 35 ryhmien kautta.

« 110616 (e) kantoaineen aktivointi adipiinihappohydratsii-nilla tai hydratsiinilla, mitä seuraa hapetetun entsyymin liittäminen -CHO-ryhmien kautta.

(f) kantoaineen aktivointi aminoligandilla, mitä 5 seuraa hapetetun entsyymin liittäminen -CHO-ryhmien kautta .

Kaikissa edeltävissä edullisissa menetelmissä käytetään agaroosia kantoaineena, kuitenkin on mahdollista käyttää piidioksidia. Kun käytetään tätä kantoainetta, 10 edullisia aktivointimenetelmiä ovat: (a) gamma-glysidoksipropyylitrimetoksisilaani aktivointi trombiinin kaltaisen entsyymin välittömällä liittämisellä -NH2-ryhmien kautta proteiiniin.

(b) syaanibromidiaktivointi, mitä seuraa entsyymin 15 välitön liittäminen -NH2-ryhmien kautta proteiiniin.

(c) gamma-glysidoksitrimetoksisilaaniaktivointi, mitä seuraa epoksidirenkaan avaaminen muodostamaan dioli-ryhmä, joka voidaan tämän jälkeen aktivoida syaanibromi-dilla. Entsyymin välitön liittäminen voidaan toteuttaa ’*· 20 -NH2-ryhmien kautta proteiiniin.

(d) gammaglysidoksipropyylitrimetoksisilaaniakti- *'*; vointi, mitä seuraa amino-piidioksidin valmistus käsit- telemällä ammoniakkiliuoksella.

« ·

Amino-piidioksidi voidaan tämän jälkeen aktivoida : . 25 syaanivirtsahappokloridilla (triatsiini) ja entsyymi lii- • · ·,· tetään -NH2-, -OH- tai -SH-ryhmien kautta.

Entsyymin liittämisen aktivoituun kantoaineeseen on oltava puskuroitu tiettyyn pH:hon optimaalisen entsyy- misitoutumisen aikaansaamiseksi. Tavallisesti standardiak- .·. 30 tivointimenetelmissä, kuten entsyymin gamma-glysidoksipro- t··· pyylitrimetoksisilaani-liittämisessä aktivoituun kantoai- $ '! . neeseen ja minkä tahansa proteiinin syaanibromidiliittä- misessä aktivoituihin ryhmiin, vaaditaan puskurointia pHrssa, joka on 1 - 2 yksikköä korkeampi kuin entsyymin ; , 35 primaaristen ja sekundaaristen amiinien pKa. Kuitenkin » « i9 110616 syaanivirtsahappokloridin käyttö aktivaattorina mahdollistaa huomattavasti alhaisempien pH-puskurien käytön (optimaalinen kytkentä-pH on 4 - 6). Toinen glykoproteiinien, kuten batroksobiinin, liitäntämenetelmä inerttiin kantoai-5 neeseen tapahtuu niiden hiilihydraattiosien kautta. Tämä käsittää ensin sokeriryhmän hapettamisen -CHO-ryhmiksi, mitä seuraa välitön kytkentä happamassa pH:ssa aminoryh-mään, kuten hydratsidiin. Voidaan käyttää monia kytkentä-puskureita. Katso esimerkiksi taulukko 2.

10

Taulukko 2

Esimerkkejä kytkentäpuskureista, joita käytetään entsyymin immobilisoinnissa silika- ja agaroosikantoaineisiin Kantoaine Aktivointimenetelmä Kytkentäpuskuri 15 silika y-glysidoksipropyy- 0,1 M natriumbikarbonaat-

litrimetoksisilaani ti, pH 8 - 9, 10 mM

HEPES, pH 7,0 silika y-glysidoksipropyy- 0,1 M natriumbikarbonaat- litrimetoksisilaani ti, pH 8 - 9, 10 mM 20 + syaanibromidi HEPES, pH 7,0 _· silika syaanibromidi vesi, pH 7,0, 0,1 M nat- t riumbikarbonaatti, pH 7 - 9 * · 10 mM HEPES, pH 7,0 • · agaroosi monoklooritriatsiini 50 mM natriumasetaat- : 25 ti/1 M NaCl, pH 4,0 * · ·.· agaroosi diklooritriatsiini 0,1 M kaliumfosfaat- ti/1 M NaCl, pH 8,0 - 9,0 agaroosi tresyylikloridi 50 mM kaliumfosfaat- ti/0,5 M NaCl pH 7,7 .·. 30 agaroosi hydratsidi 50 mM natriumasetaatti ,·.· pH 5,5 10 mM NaBH<i . agaroosi amiini 50 mM natriumasetaatti pH 5,5 10 mM NaBH4 » » • f 20 Ί10616

Aktivoinnin jälkeen kantoaineella on enemmän aktiivisia kohtia kuin entsyymin liittämiselle vaaditaan. Nämä kohdat, mikäli ne eivät ole deaktivoituja, voivat kovalen-tisesti sitoa kontaminoivia proteiineja, jotka voivat vai-5 kuttaa immobilisoidun entsyymin biologiseen toimintaan.

Ylimäärä ryhmiä voidaan deaktivoida sitomalla kovalenttisesti pienet, ei-häiritsevät amiinit, kuten etanoliamiinit.

Mikäli hydratsidi- tai aminoaktivoituja kantoai-10 neita käytetään, jäljelle jääneiden reaktiivisten ryhmien suojaus entsyymikytkennän jälkeen voidaan saavuttaa käyttäen etikkahappoanhydridiä.

Riippuen immobilisointimenetelmästä ja kantoai-neesta, entsyymin inaktivointi tapahtuu immobilisointi-15 menetelmän aikana. Käyttäen piidioksidikantoainetta halutta vimman aktivointimenetelmän (esim. syaanibromidi) kanssa jopa 80 - 90 % entsyymin aktiivisuudesta häviää. Kuitenkin agaroosin käyttö kantoaineena syaanivirtsahappoklori-diaktivoinnissa johtaa pienempään entsyymiaktiivisuus-·· 20 häviöön.

Immobilisoidun entsyymin kantoaineella tehokkuuden kuvaamiseksi voidaan käyttää kahta menetelmää aktiivisen » 1 1· · entsyymin määrän arvioimiseksi immobilisoituneena kantoai- ·. · ·1··’ neelle; Clot Time Assay - Clauss A., Acta Haematol., 17: * · 1 : . 25 237 (1957) ja S2238 koe - katso Axelsson G. et ai., V Thromb. Haemost., 3_6: 517 (1976).

Entsyymivuodon määrittämiseksi kantoaineesta voidaan tehdä seuraava koe.

Vuoto voidaan määrittää merkitsemällä radioaktii-p, 30 visesti trombiinin kaltainen entsyymi, esim. I125 batrokso- ... biinillä. Kuitenkin ennen vuotokokeen aloittamista on tar- ♦ C , peen poistaa kaikki sitoutumaton radioaktiivinen merkkiai ne. Tämä voidaan saavuttaa pesemällä kantoaine peräkkäi-‘ sesti: 50 ml :11a 50 mM natriumasetaattia, pH 5,5, 100 . V 35 ml: 11a 50 mM glysiini/1 M natriumkloridia, pH 3,0, 100 21 110616

ml :11a 50 mM natriumkarbonaatti/1 M natriumkloridia, pH

10,0, 100 ml:11a 50 mM natriumfosfaatti/1 M natriumkloridia, pH 7,0, 100 ml :11a vettä ja 100 ml :11a 50 mM natrium-fosfaatti/1 M natriumkloridia, pH 7,0. Tällaisen pesemisen 5 jälkeen ei ollut havaittavissa radioaktiivisuutta pesuissa, ja > 50 % alkuperäisestä radioaktiivisesta entsyymistä oli liittynyt kantoaineeseen.

(a) Tarvittava entsyymimäärä

Tarvittava entsyymimäärä 30 - 70 ml plasman käsit-10 telemiseksi (saatu 60 - 150 ml:sta kokoverta) on 30 - 200 yksikköä n. 10 - 15 minuutin sekoittamisen jälkeen.

Mikäli käytetään agaroosia kantoainesideaineena, 30 - 200 U batroksobiinia aikaansaa silloittumattoman fib-riinin muodostumisen n. 7-20 minuutissa. Tässä menetel-15 mässä käytetään hydratsiiniaktivointia ja 0,25 - 1,0 g kuivaa agaroosia. Tässä tapauksessa ei vaadita jäljelle jääneiden vaikuttavien ryhmien suojaamista.

(b) Immobilisoidun entsyymin reaktio plasmafibri-nogeenin kanssa 20 Tavallisesti immobilisoidun entsyymin reaktio fib- '···' rinogeenin kanssa plasmassa toteutetaan seuraavasti: n.

...t 30 - 70 ml plasmaa lisätään tunnettuun määrään haluttua kantoainetta, joka sisältää immobilisoitua trombiinin kal-täistä entsyymiä. Suspensiota sekoitetaan varovasti (pyö-25 rösekoittimessa tai sekoittamalla käsin) n. 7-20 minuut-tia. Tänä aikana fibrinogeeni plasmassa on lohkaistu immobilisoidun entsyymin toimesta vapauttamaan fibrinopeptidi A ja/tai fibrinopeptidi B, mikä johtaa vetysitoutuneen fibriini I -polymeerin, vetysitoutuneen des BB -fibriini-. . 30 polymeerin tai vetysitoutuneen fibriini II -polymeerin ; ’· muodostumiseen, joista jokainen polymeeri on liittynyt immobilisoidun entsyymin kanssa.

• ' Kuten edellä on kuvattu, vetyyn sitoutunut fibrii- —: nipolymeeri on geelin muodossa ja voidaan ottaa talteen, 35 esimerkiksi sentrifugoimalla (3000 g:ssa 10 minuuttia) tai 22 1 106 1 6 suodattamalla (1 - 50 mikronin kalvosuodattimen läpi).

Tällainen talteenotto erottaa vetyyn sitoutuneen fibriini-polymeerin seerumista ja täten polymeeri väkevöityy.

Olisi otettava huomioon, että mikäli käytetään 5 trombiinin kaltaista entsyymiä plasmassa, mikä johtaa tekijän XIII aktivoitumiseen, on edullista, että plasmakoos-tumusta modifioidaan hetkellä, jolloin trombiinin kaltaista entsyymiä käytetään, niin että estetään silloittumaton fibriini, esim. silloittumaton fibriini I tai II muodos-10 tamasta silloittunutta fibriiniä, esim. silloittunutta fibriiniä I tai II. Tietenkin voi olla tarpeellista modifioida plasmakoostumusta, mikäli tällaista koostumusta käytetään fibriinipeiteaineena, välittömästi sen jälkeen kun fibrinogeeni on muuttunut silloittumattomaksi fibrii-15 niksi.

Plasmakoostumus voidaan modifioida silloittumatto-man fibriinin silloittumisen estämiseksi millä tahansa tunnetulla tai kehitteillä olevalla menetelmällä. Tämä voidaan toteuttaa suojaamalla endogeeninen trombiini, joka ... 20 voi aktivoida tekijän XIII, esim. hirudiini- tai trombii-

’···’ ni-inhibiiteillä, tai estämällä aktivoidun tekijän XIII

··.: toimintaa, esim. raskasmetallien (Hg) , tiomerosaalin tai inhiboivien vasta-aineiden avulla. Fibriinin I tai II silli loittuminen kalsiumionien läsnäoloa. Täten, mikäli kalsium 25 poistetaan plasmakoostumuksesta, fibriinin I tai II sil- loittuminen voidaan estää. Katso Carr et ai., J. Biochem., 239: 513 (1986); Kaminski et ai., J. Biol. Chem. 258: 10530 (1983) ja Kanaide et ai. 13: 229 (1982). Kalsium- kelaattoreita voidaan lisätä koostumukseen fibriinin I tai 30 II silloittumisen estämiseksi. Tällaiset kelaattorit si- “· * toutuvat kalsiumiin estäen täten silloittumisen. Mitä ta- hansa kalsiumkelaattoria voidaan käyttää. Ei-rajoittavia . ’ esimerkkejä kalsiumkelaattoreista ovat sitruunahappo, sak- kariinihappo, etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA), · 35 nitrilotrietikkahappo (NTA), hydroksietyleenidiamiini-tri- • t > ( 23 110616 etikkahappo (HEEDTA), etyleenidiamiinidi-[o-hydroksifenyy-lietikkahappo] (EDDHA), etyleeniglykolibis(2-aminoetyyli-eetteri)tetra-etikkahappo (EGTA), dietyleenitriamiinipen-ta-etikkahappo (DTPA), 1, 2-diaminosykloheksaanitetraetik- 5 kahappo (DCTA), Ν,Ν-bishydroksietyyliglysiini, 4-(2-hyd-roksietyyli)-1-piperatsiinietaani-sulfonihappo (HEPES) ja N-hydroksietyyli-imino-dietikkahappo (HIMDA) ja niiden suolat, joista suolat sitruunahapon kanssa ovat edullisia.

Mitä tahansa soluviljelmää, joka pystyy erittämään 10 fibrinogeeniä, voidaan käyttää tässä keksinnössä. Fibrino-geeni soluviljelmässä voidaan muuttaa fibriinimonomeeriksi tai silloittumattomaksi fibriiniksi samoilla menetelmillä, kuten edellä on kuvattu suhteessa plasmaan. Kuitenkin, ennen tällaista konversiota, on edullista, että solujään-15 nös poistetaan.

Menetelmä voidaan toteuttaa seuraavasti: HEPG2-so-luja kasvatetaan ja pidetään kuten nisäkkään soluviljelmä standardikirjoituksissa on kuvattu. Katso myös Liu et ai., Cytotechnology, 5: 129 - 139 (1991). Solut istutetaan pul-20 loihin puoliintumissuhteella 1:4 - 1:8 pienimmässä tarvittavassa vähimmäismäärässä elatusnestettä (minimal essential medium) , jossa on 10 % vasikan seerumia ja joka puskuroidaan 5-%:isella CC>2:lla.

ti‘j 24 - 36 tunnin kasvun jälkeen 37 °C:ssa väliaine 25 poistetaan ja korvataan seerumi vapaalla väliaineella, joka » · sisältää sopivaa proteaasi-inhibiittiä ja 2 IU/ml hepa-riinia. Viljelyä jatketaan vielä 24 tuntia, mitä seuraa kolme peräkkäistä seerumivapaan väliaineen vaihdosta.

Väliainetta sentrifugoidaan 3000 g:ssa 10 minuut-30 tia kaiken solujäännöksen poistamiseksi ja kirkastunutta ‘ ylintä kerrosta, joka sisältää fibrinogeeniä, sekoitetaan varovasti trombiinin tapaisen entsyymin kanssa 4 - 5 tuntia. Edullisesti trombiinin tapainen entsyymi immobi-:.· lisoidaan. Suhde n. 1,0 ml - n. 50 ml kiinnitettyä ( * 35 agaroosi-trombiinin kaltaista entsyymiä/500 ml väliainetta 24 1 10616 on sopiva. Kuten edellä on kuvattu, kantoaineita, muita kuin agaroosia, voidaan käyttää. Saatu fibriinimonomeeri polymeroituu spontaanisti ja ympäröi immobiilisen kantoaineen.

5 Ylin keros, joka nyt ei sisällä fibrinogeeniä, de- kantoidaan kantoaine/fibriinigeelistä, joka sitten pestään peräkkäisesti neljällä vaihdolla NaCl-0,15 M, suhteessa n. 10 ml - n. 100 ml/1,0 ml alkuperäisen kiinnitetyn kanto-aineen tilavuutta. Sitten pesty geeli semi-dehydrataan 10 käyttäen sintrattua lasisuppiloa tyhjössä.

Soluviljelmien käyttö, jotka voivat erittää fibri-nogeeniä, on erityisen edullista, kun käytetään koostumusta, jossa on fibriinimonomeeriä. Tämä siksi, että uskotaan, että tällaista koostumusta voidaan käyttää fibriini-15 polymeerin muodostamiseksi, joka on hyödyllinen fibriini-peiteaineena, riippumatta siitä, onko fibriinipolymeeri täysin silloittunut. Täten, koska tällainen soluviljelmä ei sisällä tekijää XIII, joka on olennainen silloittumi-selle, ei mitään eksogeenistä tekijää XIII tarvitse lisätä 20 tehokkaan fibriinipeiteaineen aikaansaamiseksi.

“··· Silloittumaton fibriinikoostumus voidaan valmistaa myös rekombinanttifibrinogeenistä. Vasta viime aikoina fibrinogeeniä on valmistettu rekombinantti-DNA-tekniikoil-"l\‘ la. Katso S. Roy et ai., The Journal of Biological 25 Chemistry, 266: 4758 - 4763 (1991), jonka sisältö on lii-tetty tähän viitteenä. Roy et ai. vaikuttaa olevan ensimmäinen ryhmä ilmaisemaan kaikki kolme fibrinogeeniketjua ja he esittävät, että COS-solut ilmaisevat, järjestävät ja erittävät ketjut muodossa, joka pystyy muodostamaan trom-. 30 biini-indusoidun hyytymän. Saatua fibrinogeenikoostumusta * voidaan sitten käyttää koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fibrii-niä, samoilla menetelmillä, kuten tässä edellä on kuvattu suhteessa soluviljelmiin, jotka erittävät fibrinogeeniä.

• 35 Kuitenkin on edullista, että ennen koostumuksen muodosta- 25 1106 1 6 mistä, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittuma-tonta fibriiniä, solujäännös poistetaan samoilla menetelmillä, kuten edellä on kuvattu suhteessa soluviljelmiin. Solujäännös voidaan poistaa sentrifugoimalla tai suodat-5 tamalla.

Rekombinanttifibrinogeenin käyttö on erityisen edullista, kun käytetään koostumusta, joka sisältää fib-riinimonomeeriä. Tämä siksi, että uskotaan, että tällaista koostumusta voidaan käyttää fibriinipolymeerin muodostami-10 seksi, joka on hyödyllinen fibriinipeiteaineena, riippumatta siitä, onko fibriinipolymeeri kokonaan silloittunut. Koska rekombinanttifibrinogeenisoluviljelmä ei sisällä tekijää XIII, joka on olennainen silloittumiselle, ekso-geenistä tekijää XIII ei tarvitse lisätä tehokkaan fibrii-15 nipeiteaineen aikaansaamiseksi.

Fibrinogeenin konversio silloittumattomaksi fib-riiniksi, esimerkiksi trombiinin tapaisen entsyymin toimesta, johtaa fibriinin muodostumiseen fibriinin vety-sitoutuneen polymeerin muodossa. Kuitenkin, kuten edellä on 20 käsitelty, on edullista, että koostumus, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä, mikä on olennaista koostumuk-selle, joka sisältää fibriinimonomeeriä, on oligomeerises-sä tai monomeerisessä muodossa. Tämä voidaan toteuttaa liuottamalla koostumus, joka sisältää silloittumatonta : · 25 fibriiniä.

• t

Liuottaminen on erityisen edullista, kun silloit- « tumaton fibriini muodostuu trombiinin tapaisen entsyymin toimesta, joka on immobilisoitu kantoaineelle. Tämä johtuu siitä tosiasiasta, että trombiinin tapaisen entsyymin . 30 käyttö immobilisoituna kantoaineelle tavallisesti johtaa ’· ’ silloittumattomaan vety-sitoutuneeseen fibriinipolymee- riin, joka liittyy tällaiseen immobilisoituun entsyymiin.

» t Tämä siksi, koska on edullista, että kantoainetta ei ole aikaansaadussa koostumuksessa, liuottaminen mahdollistaa • * 35 myös koostumuksesta, joka sisältää silloittumatonta f ib- 26 1 10616 riiniä, kantoaineen poistamisen yhdessä immobilisoidun entsyymin kanssa.

Liuottaminen voidaan toteuttaa millä tahansa tunnetulla tai kehitteillä olevalla menetelmällä, jolla 5 aikaansaadaan fibriinimonomeeri. Liuottaminen voidaan toteuttaa saattamalla koostumus, joka sisältää silloit-tumatonta fibriiniä, kosketukseen sopivan happopusku-riliuoksen kanssa, edullisesti happopuskurin kanssa, jonka pH on alle n. 5 ja edullisesti n. 1 - n. 5. Ei-rajoittavia 10 esimerkkejä sopivista happopuskuriliuoksista ovat etikka-happo, meripihkahappo, glukoronihappo, kysteiinihappo, krotonihappo, itakonihappo, glutamiinihappo, muurahaishappo, asparagiinihappo, adipiinihappo ja niiden suolat, joista suolat meripihkahapon, asparagiinihapon, adipii-15 nihapon ja etikkahapon kanssa ovat edullisia ja edullisin on natriumasetaatti. On havaittu, että edulliset happo-puskurit toimivat huomattavasti tehokkaammin kuin muut testatut happopuskurit.

Edullinen happopuskuripitoisuus on n. 0,02 M - n. 20 1 M ja edullisimmin n. 0,1 M - n. 0,3 M. Tällainen edul- linen pitoisuus tekee koostumuksen ionivoimakkuuden biolo-gisesti kilpailukykyisemmäksi.

« ttt’| On edullista käyttää pienintä mahdollista happo- ·;' puskuritilavuutta, joka vielä liuottaa silloittumattoman » * « t 25 fibriinin vesipitoisen liuoksen muodostamiseksi, joka si- > · sältää fibriinimonomeeriä. Tämä johtaa vesipitoiseen liuokseen, joka sisältää fibriinimonomeeriä, joka on hyvin väkevöitynyt fibriinimonomeerin suhteen. Tavallisesti tarvitaan n. 1 ml - n. 4 ml happopuskuria/n. 1 ml koostumus-30 ta, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä.

*> ’ Happopuskuri sekoitetaan silloittumattoman fibrii- nin kanssa ja sekoitetaan sitten voimakkaasti n. 1 - 2 * » minuuttia täydellisen liukenemisen varmistamiseksi. Liuottaminen voidaan myös toteuttaa neutraalissa pHtssa kao-, . 35 trooppisen aineen avulla. Sopivia kaotrooppisia aineita 27 1 106 1 6 ovat urea, natriumbromidi, guanidiini hydrokloridi, KCNS, kaliumjodidi ja kaliumbromidi. Edullinen pitoisuus kao-trooppista ainetta on n. 0,2 - n. 6,0 molaaria ja edullisimmin n. 3,5 - n. 5,0 molaaria.

5 Kuten happopuskurin tapauksessa, on edullista käyttää mahdollisimman pientä määrää kaotrooppista ainetta, joka vielä liuottaa silloittumattoman fibriinin. Tavallisesti n. 1,0 ml - n. 1,5 ml kaotrooppista ainetta/n. 1 ml koostumusta, joka sisältää silloittumatonta fibrii-10 niä, tarvitaan.

Kaotrooppinen aine sekoitetaan tällaisen koostumuksen kanssa ja sitä sekoitetaan sitten voimakkaasti n. 1-2 minuuttia täydellisen liukenemisen varmistamiseksi.

Tämän mukaisesti liuottaminen johtaa koostumuk-15 seen, joka sisältää fibriinimonomeeriä, ja erityisesti vesipitoiseen liuokseen, joka sisältää fibriinimonomeeriä. On edullista, että fibriinimonomeeripitoisuus vesipitoisessa liuoksessa ei ole pienempi kuin n. 10 mg/ml, edullisemmin n. 20 mg/ml - n. 200 mg/ml, vielä edullisemmin n. 20 20 mg/ml - n. 100 mg/ml ja edullisimmin n. 25 mg/ml - n.

·“" 50 mg/ml.

····' Mikäli käytetään trombiinin kaltaista entsyymiä immobilisoituneena kantoaineelle, tämä johtaa siihen, että tällaista entsyymiä on läsnä koostumuksessa, joka sisältää : · : 25 silloittumatonta fibriiniä, liuottamisen jälkeen immobili- ;Y; soitu entsyymi voidaan poistaa koostumuksesta, joka sisäl tää fibriinimonomeeriä. Tämä voidaan toteuttaa esimerkiksi suodattamalla minkä tahansa sopivan suodattimen läpi, joka voi erottaa entsyymin. Sopivia suodattimia ovat sintrattu . , 30 polypropyleeni 20 mikronin huokoskoon suodatin Porex · Incrstä, teflon 20 - 70 mikrohuokoskoon suodatin Fluoro- techniques Incrstä tai nailon 66 22 - 46 mikronin huokos-"· : koon suodatin Costar Incrstä.

Vaihtoehtoinen menetelmä sen varmistamiseksi, että 35 trombiinin kaltaista entsyymiä, esim. batroksobiinia, ei 2β 110616 ole läsnä koostumuksessa, joka sisältää fibriinimonomee-riä, on käyttää liukoista trombiinin kaltaista entsyymiä järjestelmässä ja poistaa entsyymi, mitä seuraa fibriini vetyyn sitoutuneen polymeerin liuottaminen. Entsyymin 5 poistaminen voidaan toteuttaa käyttäen affiniteettiside- ainetta, esim. ligandia, joka on sitoutunut inerttiin kan-toaineeseen, jolla on spesifinen affiniteetti trombiinin kaltaiselle entsyymille, tai ioninvaihtoa tai hydrofobista vuorovaikutuskantoainetta tai tehokkaimmin käyttäen avi-10 diini-biotiinijärjestelmää. Biotiini-avidiini-vuorovai- kutuksella on eräs voimakkaimmista ei-kovalenttisista sitoutumisvakioista (Kdis = 10"15M) havaittuna luonnossa.

Katso E. A. Bayer ja M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, 26: 1 (1980).

15 Tässä menetelmässä biotiini on kovalenttisesti si toutunut esimerkiksi batroksobiiniin ja biotiini-batrokso-biinikonjugaatti (joka on liukoinen) saatetaan välittömästi reagoimaan plasman kanssa, esim. 10 BU plus 50 ml plasmaa saatetaan reagoimaan 37 °C:ssa 10 minuuttia. Muodostu-20 nut fibriini I polymeeri otetaan talteen sentrifugoimalla ’··* tai suodattamalla ja liuotetaan uudestaan n. 4 ml: aan ···· 0,2 M natriumasetaattia, pH 4,0, joka sisältää 30 mM kal- siumkloridia. Fibriini I -liuokseen lisätään sitten mooli-ylimäärä avidiinia liitettynä inerttiin kantoaineeseen, j * : 25 kuten agaroosiin. Sitten agaroosi:avidiini:biotiini-bat- ;Y; roksobiinikompleksi erotetaan fibriini I:stä sentrifugoi malla tai suodattamalla aikaansaaden koostumuksen, joka sisältää fibriinimonomeeriä, joka on pääosin vapaa batrok-sobiinista ja joka voidaan uudelleenpolymeroida, kuten . . 30 edellä on kuvattu, muodostamaan fibriinipeiteaine.

; Tämän mukaisesti tämän keksinnön eräässä toteutus- muodossa fibriinimonomeeriä sisältävä koostumus on oleel-” ‘ lisesti vapaa trombiinin kaltaisesti entsyymistä. Oleelli- sesti vapaalla tarkoitetaan joko sitä, että kaikki trom-35 biinin kaltainen entsyymi on poistettu, tai sitä, että 29 1 10616 koostumuksessa mahdollisesti jäljellä olevaa trombiinin kaltaista entsyymiä on pitoisuuksina, jotka ovat riittämättömiä aiheuttamaan haitallista farmakologista vaikutusta. Siten tämän keksinnön mukaan koostumukset, joiden 5 halutaan olevan "oleellisesti vapaita", voivat sisältää trombiinin kaltaista entsyymiä määrinä, jotka ovat noin 0 - 10 % alkuperäisestä entsyymistä ja edullisesti noin 0 - 2 % fibriinimonomeerikoostumuksen valmistukseen käytetystä trombiinin kaltaisesta entsyymistä.

10 Vaikka nämä toteutusmuodot kuvaavat koostumuksia, joissa trombiinin kaltainen entsyymi on poistettu sen jälkeen, kun on saavutettu haluttu konversio liukoiseksi fib-riiniksi, uskotaan, että myös koostumukset, joissa on jäljellä kaikki trombiinin kaltainen entsyymi tai suurin osa 15 siitä, ovat käyttökelpoisia ja ne ovat siten osa tätä keksintöä .

Koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä, on nyt valmis käytettäväksi aineosana fibriinipeiteaineessa. On havaittu, että kun tällainen koostumus valmistetaan 20 kokoverestä, n. 60 - n. 90 % alkuperäisestä fibrinogee- '*·· nistä on läsnä koostumuksessa, mutta tietenkin fibriini- ···.' monomeerin muodossa.

Koostumusta, joka sisältää f ibriinimonomeeriä, voidaan välittömästi käyttää sen valmistuksen jälkeen.

:’·*· 25 Tosiasiassa on erityisen edullista käyttää tällaista koos- * « tumusta välittömästi sen valmistuksen jälkeen, kun koostumus on autologinen. Mikäli koostumusta ei käytetä välittömästi sen valmistuksen jälkeen, koostumus voidaan varastoida. Koostumuksen varastointi vaatii, että koostumus on . 30 suojattu, esimerkiksi jäädyttämällä tai lyofilisoimalla * koostumus, tai pitämällä koostumus 4 °C:ssa. Uskotaan, että jäädytetty tai lyofilisoitu koostumusmuoto on stabiili kuukausia. Kun koostumusta pidetään 4 °C:ssa, uskotaan, että koostumus on stabiili ainakin päivien ajan.

35

* I

30 1 10616

Mikäli koostumus on jäädytetty, koostumus on sulatettava käyttöäjankohtana. Mikäli koostumus on lyofilisoi-tu, on edullista, että käyttöäjankohtana koostumus muodostetaan uudestaan lisäämällä samaa happopuskuria, jota käy-5 tettiin liuottamisvaiheessa, mikäli happo oli haihtuva, esim. etikkahappoa, tai mikäli kaotrooppista ainetta käytettiin, lisäämällä tislattua vettä. Kuten liuottamisvaiheessa, uudelleenmuodostamisessa tulisi käyttää mahdollisimman pientä määrää happopuskuriliuosta tai tislattua 10 vettä, johon monomeeri vielä liukenee. Tosiasiassa lyofi-lisoidun koostumuksen, joka sisältää fibriinimonomeeriä, uudelleenmuodostaminen voi johtaa fibriinimonomeeriä sisältävään vesipitoiseen liuokseen, jossa tällaisen mono-meerin pitoisuus on jopa 200 mg/ml. Ennen lyofilisointia 15 voidaan bulkkiainetta, esim. mannitolia tai laktoosia, lisätä koostumukseen. Vaihtoehtoisesti lyofilisoitua koostumusta voidaan käyttää lyofilisoidussa muodossa. Tällainen muoto on erityisen edullinen, kun apuaineita, esim. antibiootteja, halutaan lisätä koostumukseen.

... 20 Koostumus, joka sisältää f ibriinimonomeeriä, voi ’··; käytännössä olla missä tahansa muodossa, esimerkiksi ••d liuoksena, suspensiona, emulsiona tai kiinteänä aineena, joista liuos on edullinen. Täten tällainen koostumus voi olla esimerkiksi neste, geeli, tahna tai voide. Tietenkin : * : 25 koostumus voi olla myös granulaatin muodossa, esimerkiksi jV lyofilisoitu fibriinimonomeeri, jota voidaan, mutta ei i välttämättä, käsitellä liuoksen, emulsion tai suspension muodostamiseksi välittömästi ennen käyttöä.

Mitä tahansa liuotinta voidaan käyttää liuoksen . 30 mudostamiseksi, mutta on tietenkin edullista, että liuotin on ei-myrkyllinen. Ei-rajoittavia esimerkkejä liuottimista ovat vesi, etyylialkoholi, glyseroli ja propyleeniglykoli, joista vesi on edullinen.

Esimerkki suspensiosta on koostumus, joka sisältää , ·/ 35 fibriinimonomeeriä, joka voidaan sekoittaa orgaanisten * * » • M » 3i 110616 liuottimien, esim. etanolin kanssa, muodostamaan etanolin loppupitoisuus, joka on yli 3,0 M, ja ravistellaan. Fib-riinimonomeeri saostuu ja voidaan ottaa talteen sentrifu-goimalla. Sakka tulisi pestä orgaanisella faasilla vesip-5 itoisen liuoksen poistamiseksi, jota käytettiin liuot-tamisvaiheessa. Etanolipitoinen suspensio monomeeristä fibriiniä voidaan sitten levittää suoraan siteelle tai muulle kantoaineelle tai käyttää jopa suoraan haavakohdassa. Orgaanisen faasin annetaan haihtua. Siteen tai muun 10 kantoaineen tapauksessa suspensio voidaan hydrata uudestaan saattamalla kosketukseen levityskohdan kanssa tai jollakin muulla tavalla ja fibriinin annetaan polymeroi-tua.

Vaihtoehtoisesti orgaaninen suspensio, joka sisäl-15 tää fibriinimonomeeriä, valmistettuna hyvin haihtuvaan faasiin, esim. dietyylieetteriin, voidaan sumuttaa ja kuljettaa suihkesuspensiona haluttuun kohtaan. On edullista, että haihtuva faasi on syttymätön. On mahdollista, että orgaaninen suspensio, joka sisältää fibriinimonomeeriä, 20 voidaan kuljettaa korvaan, nenään, nieluun tai keuhkoihin '·; suihkeena tai hengittämällä, tai kuljettaa vertavuotavaan . · ····' ruokatorveen tai mahalaukun vammaan nauttimalla.

Tässä kuvattua fibriinipeiteainetta käytetään saattamalla haluttu kohta kosketukseen koostumuksen kans- • · » | ' 25 sa, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta :V fibriiniä, ja muutetaan fibriinimonomeeri fibriinipolymee- » riksi tai silloittumaton fibriini silloittuneeksi fibrii-niksi rinnakkaisesti mainitun kontaktivaiheen kanssa, muodostaen täten fibriinipeiteaineen.

. 30 Tässä yhteydessä käytettynä "haluttu kohta" tar- i · |f> koittaa kohtaa, johon halutaan muodostaa fibriinipeite- ’·· ( aine. Mikä, tai missä haluttu kohta on, riippuu f ibriini peiteaineen käytöstä. Tulisi myös huomata, että uskotaan, että fibriinipeiteainetta voidaan käyttää ei pelkästään , 35 ihmisissä vaan myös muissa nisäkkäissä. Myös, mikäli fib- i t ! I » * 32 1 106 1 6 riinipeiteaineen lähde on veri, on edullista, mutta ei olennaista, että veri saadaan samasta lajista, jossa fibriinipeiteainetta käytetään.

Mainittua fibriinipeiteainetta voidaan käyttää 5 mitä tahansa käyttöä varten, joka on tunnettu tai kehitteillä fibriinipeitteaineille. Tässä esitettyjä menetelmiä, pakkauksia tai fibriinipeiteainetta voidaan käyttää kudosten tai elinten yhdistämisessä, veren vuodon pysäyttämisessä, haavojen parantamisessa, leikkaushaavan sulke-10 misessa, käytössä verisuonileikauksessa, mukaanlukien verenvuodon tyrehdyttäminen distaalisen sydänvaltimon yhdistämisen ompeleista; pistohaavaverenvuodot; sydämen vasemman kammion ompeleet; aortan avaamis- ja kanyylikohdat; tihkuvat sydänlihaksen leikkausvuodot ja tihkuminen veri-15 suonista, esim. eteiseen, onttolaskimoon tai oikeaan kammioon. Keksinnöstä on myös hyötyä suljettaessa dakronilla valtimokudokset ennen kudoksen siirtoa, sulkemaan kudoksia kehon ulkopuolella, muodostamaan fibriinisiirteitä solukasvulle, pysäyttämään verenvuotoa vaurioituneesta 20 pernasta (täten pelastaen elimen), maksasta ja muista '·; peruskudokseen liittyvistä elimistä; sulkemaan henkitorven ja keuhkoputken liitoskohdat ja keuhkojen ilmavuodot tai ...: repeämät, keuhkoputken typistykset, keuhkoputken avanteet ..(· ja ruokatorven avanteet; parantamaan ompelemattomat saumat | 25 ("zipper"-menetelmä) ja käytettäväksi aivojen sisäisessä AVMrn, maksan AVM:n verisuoniradiologiassa, paksusuolen angiodysplasiassa, ruokatorven suonikohjuissa, mahalaukun ja ohutsuolen veren vuodon, joka johtuu mahahaavasta, pumppauksessa jne. Tämä keksintö on lisäksi hyödyllinen . . 30 verenvuodon pysäyttämisessä sarveiskalvon siirteissä, nenäverenvuodossa, nielurisojen poistossa, hampaiden pois-'·· _ tossa ja muissa sovellutuksissa. Katso G. F. Gestrin ja R.

'·· · Lermer, Vascular Surgery, 294 - 304, syyskuu/lokakuu, 1983. Tässä kuvattu fibriinipeiteaine on myös erityisen . V 35 sopiva yksilöille, joilla on koagulaatiohäiriöitä.

33 1 106 1 6

Koostumuksen, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai koostumuksen, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä, annos riippuu fibriinipeiteaineen erityisestä käytöstä, mutta annoksen tulisi olla vaikuttava määrä sen tarkoi-5 tetun suorituksen aikaansaamiseksi. Yleensä koostumukselle, joka sisältää fibriinimonomeeriä vesipitoisessa liuoksessa, uskotaan, että n. 3 ml - n. 5 ml tällaista koostumusta on riittävä ollakseen tehokas fibriinipeiteaine. Kuitenkin, riippuen koostumuksen käytöstä, annosalue voi 10 vaihdella alueella n. 0,05 ml - n. 40 ml. Mikäli käytetään koostumusta, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä po-lymeerimuodossa tai koostumus on kiinteässä muodossa, silloin koostumuksen tulisi sisältää fibriiniä se määrä, joka on tällaisessa vesipitoisessa liuoksessa.

15 Tässä yhteydessä fibriinimonomeerin muuttaminen fibriinipolymeeriksi tai silloittumattoman fibriinin muuttaminen silloittuneeksi fibriiniksi "rinnakkaisesti" mainitun kontaktivaiheen kanssa tarkoittaa, että tällainen konversiovaihe ja tällainen kontaktivaihe tapahtuvat 20 jokaisen vaiheen ajanjakson sisällä, niin että muodostuu ·*;’ f ibriinihyytymä haluttuun kohtaan. Täten rinnakkaisesti ····' voi tarkoittaa, että kontaktivaiheen jälkeen, fibriini- ...: monomeeri muutetaan f ibriinipolymeeriksi tai silloit- tumaton fibriini muutetaan silloittuneeksi fibriiniksi. j ‘ : 25 Tämä toteutetaan saattamalla koostumus, joka sisältää :V; fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fibriiniä, sen jälkeen kun tällainen koostumus on levitetty haluttuun kohtaan, kosketukseen koostumuksen kanssa, joka voi muuttaa fibriinimonomeerin fibriinipolymeeriksi tai . . 30 silloittumattoman fibriinin silloittuneeksi fibriiniksi.

Konversiovaiheen tulisi yleensä tapahtua n. 0,5 minuutin kuluttua kontaktivaiheesta. Muuten koostumus, joka sisäl-· ’ tää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fibriiniä, erityisesti mikäli silloittumaton fibriini on fibriinimo-35 nomeeri, voi valua pois halutusta kohdasta.

• » 3< 110616

Rinnakkaisesti voi myös tarkoittaa, että kontakti-vaihe ja muuttamisvaihe tapahtuvat samanaikaisesti. Tämä toteutetaan saattamalla haluttu kohta kosketukseen koostumuksen kanssa, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai sil-5 loittumatonta fibriiniä, samaan aikaan kun tällainen koostumus on kosketuksessa koostumuksen kanssa, joka voi muuttaa fibriinimonomeerin fibriinipolymeeriksi tai silloit-tumattoman fibriinin silloittuneeksi fibriiniksi.

Lopuksi ja edullisesti rinnakkainen voi myös tar-10 koittaa, että konversiovaihe voi alkaa ennen kontaktivai-hetta, vaikkakaan ei niin paljon ennen kontaktivaihetta, että kaikki fibriinimonomeeri on muuttunut fibriinipolymeeriksi tai kaikki silloittumaton fibriini on muuttunut silloittuneeksi fibriiniksi. Muuten kaikki fibriinimono-15 meeristä muuttuu fibriinipolymeeriksi tai kaikki silloit-tumattomasta fibriinistä muuttuu silloittuneeksi fibriiniksi ennen kontaktivaihetta, mikä johtaa hyvin huonoon fibriinipeiteaineeseen. Tämä suoritusmuoto toteutetaan sekoittamalla koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä 20 tai silloittumatonta fibriiniä, koostumuksen kanssa, joka '** voi muuttaa fibriinimonomeerin fibriinipolymeeriksi tai silloittumattoman fibriinin silloittuneeksi fibriiniksi, ennen kontaktivaihetta. Koska konversiovaiheen loppuun-vieminen kestää n. 30 sekuntia, konversiovaihe ei saisi ] \ 25 alkaa enempää kuin n. 30 sekuntia, ja edullisesti ei enem- pää kuin n. 3 sekuntia ennen kontaktivaihetta. Tämä suoritusmuoto on edullinen, koska se varmistaa, että maksimimäärä koostumuksessa olevaa fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fibriiniä pysyy halutussa kohdassa ja muo-. 30 dostaa myös erinomaisen fibriinipeiteaineen.

Fibriinimonomeerin konversio fibriinipolymeeriksi *·; _ tai silloittumattoman fibriinin konversio silloittuneeksi '*· fibriiniksi voidaan toteuttaa millä tahansa tunnetulla tai ;··,’ kehitteillä olevalla menetelmällä. Kuitenkin se miten kon- , V 35 versiovaihe toteutetaan, riippuu koostumuksen lähteestä,

* * I I

35 1 106 1 6 joka sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fib-riiniä, esim. kokoverestä tai rekombinanttifibrinogeenis-tä, fibriinimonomeerin tai silloittumattoman fibriinin, esim. fibriinin I tai des BB -fibriinin muodosta ja vähem-5 mässä määrin siitä, sisältääkö haluttu kohta potilaiden verta tai muita kehon nesteitä fibriinipeiteaineen käyttö-ajankohtana .

Myös, mikäli erillistä koostumusta, kuten emäksistä puskuria, käytetään (käsitelty seuraavassa) konver-10 siovaiheelle, silloin tässä kuvattu menetelmä voidaan toteuttaa esimerkiksi kahden säiliön käsipumpulla. Kak-soissäiliökäsipumppu voi olla Y-muotoinen mahdollistaen täten koostumuksen, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fibriiniä, ja koostumuksen, jota käyte-15 tään konversiovaiheessa, sekoittumisen seokseksi välittömästi ennen kontaktivaihetta. Myös, mieluummin kuin Y-muotoista kaksoissäiliökäsipumppua, voidaan käyttää kaksoissäiliökäsipumppua, jossa on kaksi aukkoa. Tämä mahdollistaa sen, että kosketukseen saattaminen haluttuun 20 kohtaan ja konversio fibriinipolymeeriksi tai silloit- ") tuneeksi fibriiniksi tapahtuvat samanaikaisesti. Koostu- ····’ mukset kahden säiliön käsipumpusta voidaan myös suihkuttaa » · · haluttuun kohtaan. Katso H.B. Kram et ai., The American ..,‘1 Surgeon, 57: 381 (1991).

• · · | ' · 25 Mikäli koostumuksen lähde, joka sisältää fibriini- monomeeriä tai silloittumatonta fibriiniä, on veri, kuten edellä on esitetty, uskotaan, että koostumuksessa pysyy tarpeeksi protrombiinia, tekijää XIII ja muita tarpeellisia aineita tällaisen fibriinimonomeerin tai silloittumat- . 30 toman fibriinin muuttamiseksi silloittuneeksi fibriiniksi, « * esim. protrombiinin aktivaattoreita. Mikäli silloittuma-( ton fibriini on fibriinipolymeeri, ts. silloittumaton fib- riini ei ole liuennut, silloittumaton fibriini voidaan ;· muuttaa silloittuneeksi fibriiniksi aktivoimalla protrom- , ·,’ 35 biini ja tekijä XIII tällaisessa koostumuksessa muodosta-

»III

36 1 10616 maan silloittunut fibriini. Tällainen aktivointi voidaan toteuttaa saattamalla koostumus kosketukseen kalsiumionien lähteen kanssa. Ei-rajoittavia kalsiumionien lähteitä ovat kalsiumkloridi, edullisesti pitoisuutena 30 mM. Vaihtoeh-5 toisesti ja vähemmän edullisesti kalsiumioneja voidaan lisätä veren mukana haluttuun kohtaan.

Mikäli silloittumaton fibriini on liuennut, ts. on fibriinimonomeeri, se miten fibriinimonomeeri muuttuu sil-loittuneeksi fibriiniksi riippuu siitä, kuinka liuottami-10 nen toteutettiin. Mikäli silloittumaton fibriini liuotettiin happopuskurilla, silloittunut fibriini voi muodostua nostamalla koostumuksen, joka sisältää fibriinimonomeeriä, pH:ta niin, että tällainen fibriinimonomeeri voidaan poly-meroida. Tämä voidaan toteuttaa saattamalla koostumus kos-15 ketukseen minkä tahansa emäksisen puskurin kanssa. Ei-ra-joittavia esimerkkejä sopivista emäspuskureista ovat HEPES, natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi, kalsiumhydrok-sidi, bikarbonaattipuskurit, kuten natriumbikarbonaatti ja kaliumbikarbonaatti, sitruunahapon tri-metallisuolat, ... 20 etikkahapon suolat ja rikkihapon suolat. Edullisia emäs- puskureita ovat: 0,5 - 0,75 M natriumkarbonaatti/bikarbo- ···· naatti, pH 10 - 10,5, 0,5 - 0,75 M natriumbikarbonaat- » ...: ti/NaOH, pH 10,0, 1,5 M glysiini/NaOH, pH 10,0, 0,5 -

1,0 M bishydroksietyyliaminoetaani sulfonihappo (BES) , pH

25 7,5, IM hydroksietyylipiperatsiinipropaani sulfonihappo (EPPS) , pH 8,5, 0,5 M trisiini, pH 8,5, IM morfolinopro- paani sulfonihappo (MOPS), pH 8,0, IM trishydroksimetyy- liaminoetaani sulfonihappo (TES), pH 8,0 ja 0,5 M syklo- heksyyliaminoetaani sulfonihappo (CHES), pH 10,0; joista . 30 0, 5 - 0, 75 M natriumkarbonaatti/bikarbonaatti, pH 10 - « · 10,5, 0,5 - 1,0 M bishydroksietyyliaminoetaani sulfonihap-'·; po (BES), pH 7,5, IM hydroksietyylipiperatsiinipropaani ··* sulfonihappo (EPPS), pH 8,5 ja 1 M trishydroksimetyyli- ·;· aminoetaani sulfonihappo (TES), pH 8,0, ovat edullisimpia.

: :· 35 I I ♦ * 37 1 106 1 6 Käytetyn emäspuskurin määrän tulisi olla riittävä silloittumattoman fibriinin polymeroimiseen. On edullista, että n. 10 osaa - n. 1 osa koostumusta, joka sisältää fib-riinimonomeeriä, sekoitetaan n. 1 osan kanssa emäspusku-5 ria. On jopa edullisempaa, että tämä suhde on n. 9:1. Tu lisi huomata, että edullinen suhde riippuu puskurin valinnasta ja fibriinipolymeerin halutusta "voimakkuudesta". Tietenkin fibriinipolymeerin haluttu voimakkuus riippuu fibriinipeiteaineen lopullisesta käytöstä.

10 Mikäli liuottaminen toteutetaan ilman kaotroop- pista ainetta, fibriinimonomeeri voidaan muuttaa silloit-tuneeksi fibriiniksi laimentamalla koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä, esimerkiksi tislatulla vedellä. Laimennus tulisi toteuttaa niin, että käytetään pienintä 15 mahdollista määrää laimenninta. Tavallisesti saadun kaotrooppisen pitoisuuuden laimennuksen jälkeen tulisi olla n. 0,5 - n. 0,1 molaaria.

Koostumuksen, joka sisältää fibriinimonomeeriä, kaotrooppisen aineen laimentamisen tai pH: n nostamisen 20 lisäksi on edullista, että tällaisen koostumuksen protrom-biini ja tekijä XIII aktivoidaan muodostamaan silloittunut • * fibriini. Tällainen aktivointi voidaan toteuttaa saatta- i · maila koostumus kosketukseen kalsiumionien lähteen kanssa.

,.i| Kalsiumionien lähde voi muodostaa osan emäspuskurista tai 1 > · 25 osan happopuskurista, joita käytetään liuottamisvaiheessa. Ei-rajoittavia kalsiumionien lähteitä on kalsiumkloridi, edullisesti pitoisuutena 30 mM. Vaihtoehtoisesti, eikä yhtä edullisesti, kalsiumionien lähde voidaan saada veren mukana halutussa kohdassa.

. 30 Tulisi huomata, että mikäli emäspuskuri on karbo- naatti/bikarbonaattipuskuri, kalsiumionien lähdettä on li-’·; _ sättävä happopuskuriin liuottamisvaiheen aikana. Tämä joh tuu siitä tosiasiasta, että kalsiumkloridi ei ole liukoi-;·· nen karbonaatti/bikarbonaattipuskuriin. On edullista, että 35 I · » » 38 110616 kalsiumionien pitoisuus happopuskuriliuoksessa on 5 mM -n. 150 mM ja edullisemmin n. 5 mM - n. 50 mM.

Uskotaan, että saatu fibriinipeiteaine on silloit-tunut fibriini II, riippumatta siitä mitä muotoa silloit-5 tumatonta fibriiniä, ts. fibriinimonomeeriä tai fibriini-polymeeriä on läsnä. Kuitenkin, mikäli silloittumattoman fibriinin muoto on des BB -fibriini, uskotaan, että lisäksi tarvitaan lisälähde trombiinia des BB -fibriinin muuttamiseksi silloittuneeksi fibriiniksi. Tällainen trombii-10 nilähde voi olla esimerkiksi potilaan plasma, jolloin tällaista plasmaa lisätään koostumukseen, joka sisältää sil-loittumatonta fibriiniä.

Mikäli haluttu kohta sisältää verta ja käytetään koostumusta, joka sisältää fibriinimonomeeriä, ts. sil-15 loittumaton fibriini on liuennut, silloin tätä verta voidaan käyttää kaotrooppisen aineen laimentimena koostumuksen, joka sisältää fibriinimonomeeriä, pH:n nostamiseksi. Täten ei tarvitse käyttää laimenninta tai emäspuskuria. Tässä suoritusmuodossa on edullista, että kalsiumionien .. 20 lähde sisältyy happopuskuriin tai kaotrooppiseen ainee- ,i' seen, jota käytetään liuottamisvaiheessa. Tässä suoritus- ··! muodossa koostumus, joka sisältää f ibriinimonomeeriä, voi- » daan panna kiinteälle kantoaineelle, esim. siteelle, ompe- t ,,U leelle tai proteesille, jotka ovat kosketuksessa halutun ·’ 25 kohdan kanssa. Tällainen kantoaine pidetään sitten koske- tuksessa halutun kohdan kanssa niin kauan, että esimerkiksi muodostuu fibriinipeiteaine.

Kuitenkin tulisi huomata, että mikäli koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä, ei sisällä riittävästi , 30 protrombiinia ja tekijää XIII silloittuneen fibriinin muo- dostamiseksi, tällainen koostumus on kuitenkin hyödyllinen fibriinipeiteaineena, koska fibriinimonomeerin polymeri- • · sointi on sinänsä hyödyllistä fibriinipeiteaineen muodos-tamiseksi. Tällaista koostumusta voidaan myös käyttää sil-•y 35 loittuneen fibriinin muodostamiseksi lisäämällä kalsium-

‘ » i I I I I

39 110616 ionien lähdettä ja aktivointitekijää XIII (tai aktivoidun tekijän XIII prekursoreita) ja valinnaisesti trombiinia. Tällaisten kalsiumionien lähdettä, aktivoitua tekijää XIII ja trombiinia voidaan lisätä koostumuksiin, jotka sisältä-5 vät fibriinimonomeeriä. Aktivointitekijää XIII voidaan lisätä koostumukseen, joka sisältää fibriinimonomeeriä, loppupitoisuudeksi n. 1,0 - n. 20 yksikköä tekijää XIII/ml koostumusta, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä. Vaihtoehtoisesti tekijää XIII voidaan lisätä veren tai 10 kehon nesteiden mukana haluttuun kohtaan tai lisäämällä autologista plasmaa koostumukseen, joka sisältää fibriinimonomeeriä. Ei-rajoittavia esimerkkejä kalsiumioneista ovat kalsiumkloridi, edullisesti pitoisuutena 30 mM. Vaihtoehtoisesti, eikä yhtä edullisesti, kalsiumioneja voidaan 15 lisätä veren tai kehon nesteiden mukana haluttuun kohtaan. N. 4 yksikköä - n. 500 yksikköä trombiinia/ml koostumusta, joka sisältää fibriinimonomeeriä, voidaan lisätä, tai trombiinia voi muodostua halutussa kohdassa.

Mikäli koostumuksen, joka sisältää silloittuma-20 tonta fibriiniä, lähde on soluviljelmät, jotka erittävät fibrinogeeniä tai rekombinanttifibrinogeeniä, ja silloit-····’ tumaton fibriini on fibriinipolymeeri, ts. silloittumaton fibriini ei ole liuennut, silloin on käytettävä kalsium-ionien lähdettä ja aktivointiteki jää XIII (tai aktivoidun j 25 tekijän XIII prekursoreita) silloittuneen fibriinin muo- ;Y: dostamiseksi. Tekijää XIII on käytettävä, koska nämä sil- loittumattoman fibriinin lähteet eivät sisällä lainkaan tekijää XIII. Aktivoitua tekijää XIII voidaan lisätä koostumukseen, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä, lop-. . 30 pupitoisuudeksi n. 1,0 - n. 20 yksikköä tekijää XIII/ml koostumusta, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä. Vaihtoehtoisesti tekijää XIII voidaan lisätä veren tai ’ · kehon nesteiden mukana haluttuun kohtaan tai lisäämällä · autologista plasmaa koostumukseen, joka sisältää , 35 silloittumatonta fibriiniä. Ei-rajoittavia kalsiumionien 40 1 10616 lähteitä ovat kalsiumkloridi, edullisesti pitoisuutena 30 mM. Vaihtoehtoisesti, eikä yhtä edullisesti, kalsiumioneja voidaan lisätä veren tai kehon nesteiden mukana haluttuun kohtaan. Myös, vaihtoehtoisesti, trombiinia voidaan lisätä 5 tällaiseen koostumukseen silloittuneen fibriinin II mudostumisen varmistamiseksi. N. 4 yksikköä - n. 500 yksikköä trombiinia/ml koostumusta, joka sisältää silloit-tumatonta fibriiniä, voidaan lisätä tai trombiini voi muodostua halutussa kohdassa.

10 Mikäli silloittumaton fibriini on liuennut, ts. on fibriinimonomeeri, se miten fibriinimonomeeri muutetaan fibriinipolymeeriksi riippuu siitä, kuinka liuottaminen toteutettiin, esim. happopuskurilla tai kaotrooppisella aineella. Fibriinipolymeerin muodostaminen voidaan toteut-15 taa samoilla menetelmillä kuin edellä on kuvattu. Tämä fibriinipolymeeri, haluttaessa, voidaan sitten muuttaa silloittuneeksi fibriiniksi lisäämällä kalsiumionien lähdettä ja aktivoitua tekijää XIII (tai aktivoidun tekijän XIII prekursoreita) silloittuneen fibriinin muodostamisek-20 si, ja, valinnaisesti trombiinia koostumukseen, joka si- I sältää fibriinimonomeeriä, kuten edellä on kuvattu. Teki- ···· jää XIII on käytettävä, koska nämä silloittumattoman fib- · riinin lähteet eivät sisällä lainkaan tekijää XIII. Akti- . voitua tekijää XIII voidaan lisätä koostumukseen, joka 25 sisältää silloittumatonta fibriiniä, loppupitoisuudeksi n.

1,0 - n. 20 yksikköä tekijää XIII/ml koostumusta, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä. Vaihtoehtoisesti tekijää XIII voidaan lisätä veren tai kehon nesteiden mukana haluttuun kohtaan tai lisäämällä autologista plasmaa koos-. 30 tumukseen, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä. Ei- rajoittavia kalsiumionien lähteitä ovat kalsiumkloridi, ’·; % edullisesti pitoisuutena 30 mM. Vaihtoehtoisesti, eikä “· ' yhtä edullisesti, kalsiumioneja voidaan lisätä veren tai :··* kehon nesteiden mukana haluttuun kohtaan. Myös, vaihtoeh- . 35 toisesti, trombiinia voidaan lisätä tällaiseen koostumuk- 41 110616 seen silloittuneen fibriinin II mudostumisen varmistamiseksi. N. 4 yksikköä - n. 500 yksikköä trombiinia/ml koostumusta, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä, voidaan lisätä tai trombiini voi muodostua halutussa kohdassa.

5 Tässä kuvattu fibriinipeiteaine voi sisältää myös apuaineita, esimerkiksi antibiootteja, esim. gentamysii-niä, kefotaksiimia, nebasetiinia ja sisomisiiniä, histamiini H2 -antagonisteja, esim. ranitidiiniä ja syöpää vastustavia lääkkeitä, esim. OK-432. Tämä voidaan toteut-10 taa lisäämällä haluttu antibiootti koostumukseen, joka sisältää fibriinimonomeeriä tai silloittumatonta fibriiniä. Katso M. C. H. Gersdorff ja T. A. J. Robillard, Laryngoscope, 95: 1278 - 80 (1985); A. Ederle et ai., Ital. J. Gastroenterol., 23: 354 - 56 (1991); V. Ronfard 15 et ai., Burns, Γ7: 181 - 84 (1991); T. Sakurai et ai., J.

Control. Release, 18: 39 - 43 (1992); T. Monden et ai.,

Cancer, 69: 636 - 42 (1992); F. Greco, J. of Biomedical Materials Research, 25: 39 - 51 (1991) ja H.B. Kram et ai., Journal of Surgical Research, 50: 175 - 178 (1991), ... 20 joiden sisällöt on liitetty tähän viitteinä. Muita apuai- *" neita voidaan myös lisätä, kuten esimerkiksi fibronektii- niä, fibrinolyyttisiä inhibiittejä, kuten aprotiiniä, ai- * · ψ f a-2-atiplasmiinia, PAI-1, PAI-2, 6-aminoheksanoiinihap-poa, 4-aminometyylisykloheksanoiinihappoa, kollageeniä tai 25 keratinosyteesiä. Uskotaan, että tällaisen apuaineen annos on sama, jota käytetään tavallisissa fibriinipeiteaineis-sa.

Lisäksi seuraavassa kuvataan myös fibriinipeiteai-nepakkaukset. Pakkaus voi sisältää ensimmäisenä aineosana . 30 koostumusta, joka sisältää fibriinimonomeeriä ja toisena aineosana emäspuskuria, joka pystyy polymeroimaan fibrii-'·· > nimonomeerin, tai tislattua vettä riippuen siitä, miten liuottamisvaihe toteutettiin. Toinen aineosa voi valin- naisesti sisältää kalsiumionien lähteen. Vaihtoehtoisesti , V 35 ensimmäinen aineosa voi olla koostumus, joka sisältää sil- 42 1 106 1 6 loittumatonta fibriiniä ja toinen aineosa voi olla kal-siumionien lähde. Mikäli käytetyn fibrinogeenin lähde, jota käytetään koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä, on peräisin soluviljelmistä, 5 jotka erittävät fibrinogeeniä tai rekombinanttifibrinogee-niä, ensimmäinen aineosa voi olla koostumus, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä, toinen aineosa voi olla kal-siumionien lähde ja kolmas aineosa on aktivointitekijä XIII.

10 5. Esimerkkejä 5.1. Plasman valmistus kokoverestä

Kokoveri (100 ml) kerätään standardimaiseen kaupallisesti saatavilla olevaan veripussiin, joka sisältää antikoagulanttia, kuten sitraatti/fosfaatti/dekstroosia.

15 Veri siirretään sitten säiliöön, joka on sopiva sentrifu-goimiseen, ja sentrifugoidaan huoneenlämpötilassa 10 minuuttia 3 000 g:ssa. Kirkas ylin kerros plasmasta (n. 50 ml) dekantoidaan sitten ja soluaineosat poistetaan.

Vaihtoehtoinen plasman valmistusmenetelmä kokove- 20 restä on suodattaminen. 100 ml kokoverta kerätään jälleen ’··; pussiin, joka sisältää antikoagulanttia, kuten sitraat- t t ti/fosfaatti/dekstroosia. Verta kierrätetään sitten suo- • * * ....* dattimen läpi, jolla on hyvä proteiinin läpäisevyys, suo- lan aaltomaisen liikkeen (peristaltic) aikaansaavalla pum-' ’ : 25 pulla. Paineen putous pitkin kalvoa johtaa siihen, että V plasma pakotetaan soluaineosien läpi, joita on jäljellä kierrätettävässä veressä. Plasma (50 ml) kerätään jatkokäsittelyä varten.

5.2. Batroksobiinin immmobilisointi agaroosihel- 30 mille

Agaroosihelmiä (Pharmacia) käytettiin immobili-’·· ( sointitutkimuksissa. Käytetty agaroosi oli 4-% :isesti sil- · loittunut, 45 - 165 pm (90 % partikkeleista). Tämä aines ;··' paisui viisinkertaiseksi sen tilavuuden suhteen hydratoi- , V 35 taessa. Batroksobiiniä hapetetaan ensin 0,1 M nat- 43 110616 riumperjodaatilla yksi tunti huoneenlämpötilassa suljetussa tuikeampullissa. Batroksobiini puhdistetaan antamalla sen kulkea Sephadex PD-10 geelipermeaatiopylvään läpi. Hapetettu batroksobiini liitetään sitten hydratsidiakti-5 vointi agaroosigeeliin yön ajaksi huoneenlämpötilassa 50 mM natriumasetaatissa pH 5,5 + 10 mM natriumboorihydridis-sä (30 - 200 U/1,75 g kosteaa geeliä). Ei-sitoutuneet re-aktioaineet poistetaan geelistä pesemällä seuraavilla liuoksilla: 50 ml:11a mM natriumasetaattia, pH 5,5, 100 10 ml :11a 50 mM glysiini/1 M natriumkloridia, pH 3,0, 100

ml :11a 50 mM natriumkarbonaatti/1 M natriumkloridia, pH

10,0, 100 ml:11a 50 mM natriumfosfaatti/1 M natriumklor

idia, pH 7,0, 100 ml:lla vettä, 100 ml:lla 50 mM natriumfosfaatti/1 M natriumkloridia, pH 7,0, 100 ml: 11a 50 mM

15 natriumfosfaattia, pH 7,0.

5.3. Immobilisoidun entsyymin reaktio plasmafibri-nogeenin kanssa silloittumatonta fibriiniä sisältävän koostumuksen muodostamiseksi

Immobilisoitua entsyymiä (350 mg) lisätään n. 50 ,, 20 ml:aan sentrifugoitua tai suodatettua plasmaa ja sekoite- “* taan varovasti 7-20 minuuttia, kunnes ei-sitoutunut fib- *···’ riini I polymeeripeiteaine on muodostunut.

ia.

...: Fibriini I polymeeri ja liittynyt immobilisoitu entsyymi otetaan sitten talteen joko: a) sentrifugoimalla : ' 25 3 000 g:ssa 10 minuuttia, mitä seuraa ylimmän kerroksen /:’ seerumin poistaminen dekantoimalla tai b) suodattamalla » sopivan, alhaista proteiinia sitovan suodattimen läpi, mitä seuraa suodatetun seerumin poistaminen ja jäljelle jääneen fibriini I -polymeerin ja immobilisoidun entsyymin , 30 jatkokäsittely. Tämä fibriini I -polymeeri on esimerkki s t koostumuksesta, joka sisältää silloittumatonta fibriiniä.

'·· 5.4. Fibriini I -polymeerin solubilisointi fibrii- • nimonomeeriä sisältävän koostumuksen muodostamiseksi ... Fibriini I -polymeerin liuottaminen toteutetaan , */ 35 lisäämällä n. 1 - 4 ml 0,2 M natriumasetaattia, pH 4,0,

I 1 I I

« 110616 joka sisältää 30 mM kalsiumkloridipuskuria, talteen-otettuun fibriini I polymeeriin ja immobilisoituun entsyymiin. Tämän jälkeen näytettä sekoitetaan voimakkaasti, esim. vortex-sekoittimessa, kaksi minuuttia. Immobili-5 soidun entsyymin poistaminen voidaan sitten toteuttaa suodattamalla fibriini I -liuos 1 - 20 pm alhaista proteiinia sitovan suodattimen läpi. Agaroosientsyymi jää suodattimelle mahdollistaen täten sen poistamisen järjestelmästä. Jäljelle jäänyt liuos, koostumus, joka sisältää 10 fibriini I -monomeeriä, koostuu väkevöidystä happamasta fibriini I -monomeeriliuoksesta yhdessä muiden plasma-proteiinien kanssa. Yleensä n. 100 ml kokoverta aikaansaa n. 4 ml tai 5 ml koostumusta, joka sisältää fibriini-monomeeriä, jossa fibriinimonomeeripitoisuus on n. 25 15 mg/ml - n. 35 mg/ml. Tämä voidaan nyt helposti antaa potilaalle, joko pelkästään, tai puristettuna yhteen uudelleenpolymerointipuskurin kanssa, muodostamaan fibrii-nipeiteaine.

5.5. Fibriini I -monomeeriä sisältävän koostu-20 muksen uudelleenpolymerointi

Uudelleenpolymerointi toteutetaan sekoittamalla ···' samanaikaisesti 9 osaa liuosta, joka sisältää fibriini I

-monomeeriä, yhden osan kanssa sopivaa uudelleenpolyme-rointipuskuria, esim. 0,75 M natriumkarbonaatti/natrium-: ·': 25 bikarbonaattia, pH 10,0. Sekoittamissuhdetta voidaan muut- taa; kuitenkin 9:l-suhde ylläpitää fibriinin korkean pitoisuuden lopputuotteessa. Puristettaessa yhteen fibriini I uudelleenpolymeroituu spontaanisti ja muuttuu fibriinik-si II, mitä seuraa fibriinin silloittuminen n. 30 minuutin . . 30 aikana.

; ’· Tätä keksintöä ei kuvattujen spesifisten suoritus muotojen tulisi rajoittaa, joiden tarkoituksena on ainoas-*· ' taan kuvata keksinnön yksittäisiä kohtia. Monet tämän kek- sinnön modifioinnit tässä esitettyjen ja kuvattujen lisäk-35 si ovat tosiaan ilmeisiä alaan perehtyneelle edeltävästä 45 1 10616 kuvauksesta. Tällaiset modifioinnit kuuluvat liitettyjen patenttivaatimusten piiriin.

5.6. Agaroosin hydratsidiaktivointi ja kytkentä entsyymin hiilihydraattiosan kautta 5 Batroksobiinin hiilihydraattiosan saattamiseksi reagoimaan hydratsidiaktivoidun kantoaineen kanssa sokeri on ensin hapetettava antamaan vapaita -CHO-ryhmiä. Tämä toteutetaan seuraavasti.

1 - 7 mg batroksobiinia liuotetaan 2 ml:aan vettä 10 ja 0,2 ml:aan 0,1 M natriumperjodaattia. Seosta inkuboi-daan huoneenlämpötilassa yksi tunti, minkä jälkeen suola poistetaan Sephadex G-25 geelisuodatuspylväässä. Hapetettu aktiivinen batroksobiini eluoidaan pylväästä 0,9-%:isella paino/tilav. natriumkloridilla.

15 Standardimaista kaupallisesti saatavaa hydratsidi- aktivoitua agaroosia (Bio-rad Laboratories Ltd UK) tai mitä tahansa muuta ryhmää, jolla on vapaa pääteaminoryhmä, voidaan käyttää suoraan vapaiden aldehydiryhmien (-CHO) liittämiseen. Mikäli hydratsidi-agaroosia käytetään, lii-20 täntämenetelmä on seuraavanlainen.

·· 1 - 5 g hydratsidi-agaroosigeeliä suspendoidaan 4 ··.: ml: aan 50 mM natriumasetaattia, pH 5,5. Tähän suspensioon lisätään 1 ml 10 mM natriumboorihydridiä yhdessä halutun L" määrän kanssa hapetettua batroksobiiniä (tavallisesti 25 100 - 200 BU/g kosteaa geeliä) .

Näytettä sekoitetaan yön yli huoneenlämpötilassa

ja pestään tämän jälkeen sintratussa lasisuppilossa 50 ml :11a 50 mM natriumasetaattia, pH 5,5, 100 ml :11a 50 mM

glysiini/1 M natriumkloridia, pH 3,0, 100 ml :11a 50 mM

, . 30 natriumkarbonaatti/1 M natriumkloridia, pH 10,0, 100 ; ’ ml :11a 50 mM natriumfosfaatti/1 M natriumkloridia, pH 7,0, 100 ml:11a vettä ja 100 ml:11a 50 mM natriumfosfaatti/1 M ·· ' natriumkloridia, pH 7,0 ja lopuksi 100 ml: 11a 50 mM nat- ...· riumfosfaattia, pH 7,0.

35 4β 110616

Immobilisoidun batroksobiinin reaktiomenetelmä plasman kanssa on seuraavanlainen.

Plasman (50 ml) pH alennetaan arvoon 5,5 lisäämällä etikkahappoa. Plasmaan lisätään 100 - 200 BU:n 5 ekvivalenttinen määrä batroksobiiniä immobilisoituneena n.

1,75 g:aan (kostean geelin paino) agaroosia. Plasmaa inkuboidaan 37 °C:ssa 10 - 15 minuuttia, minkä jälkeen pH nostetaan arvoon 7,4 lisäämällä natriumhydroksidia. Fibriinin I polymeroituminen tapahtuu lähes välittömästi. 10 Fibriini I polymeeri otetaan talteen sentrifugoimalla 3500 kierrosta minuutissa 10 minuuttia ja liuotetaan uudestaan 3 - 4 ml:aan 0,2 M natriumasetaattia, pH 4,0, joka sisältää 30 mM kalsiumkloridia. Sitten agaroosientsyymi voidaan erottaa fibriinistä I sentrifugoimalla tai suodat-15 tamalla. Tämän jälkeen fibriini I uudelleenpolymeroidaan muodostamaan fibriinipeiteaine lisäämällä 9 osaa fibriini I -liuosta 1 osaan 0,75 M natriumkarbonaatti/bi-karbonaattia, pH 10,0.

5.7. Entsyyminvangitsemissysteemi, jossa käytetään .. 20 biotiinia ja avidiinia ’·*· Entsyymin vangitseminen toteutetaan biotinyloi- ...: maila ensin batroksobiini ja vangitsemalla biotiini- entsyymi immobilisoidulla avidiinilla (avidiinilla, joka 11' on liittynyt 6-%:isesti silloittuneeseen agaroosiin).

'*·’· 25 Proteiinien biotinylointi voidaan toteuttaa käyt- täen monia reagensseja. Tässä tapauksessa käytetään N-hyd-roksisukkiini-imidi-biotiinia (veteen liukenematon) (kaupallisesti saatavissa Amershamista). NHS-biotiinia (50 μΐ) lisätään 1 mg:aan batroksobiiniä pH:ssa 8,6 ja liuosta 30 inkuboidaan huoneenlämötilassa yksi tunti. Ylimäärä bio-’· * tinylointireagenssia poistetaan geelisuodattamalla Sepha- dex G-25 pylväässä, 0,1 M kaliumfosfaatilla, pH 7,5, elu- • · enttina.

10 BU:n ekvivalenttinen määrä biotiini-batrokso-35 biiniä lisätään 50 ml:aan plasmaa ja inkuboidaan 37 °C:ssa 4V 110616 10 minuuttia. Fibriini I -polymeeri otetaan talteen sent-rifugoimalla (3 500 kierrosta minuutissa 10 minuuttia) ja liuotetaan uudestaan 3-4 ml:aan 0,2 M natriumasetaattia, pH 4,0, joka sisältää 30 mM kalsiumkloridia. Fibriiniin I 5 lisätään avidiini-agaroosia (kaupallisesti saatavissa Sigma Chemical Co:sta) 0,2 g (kostea geeli)/ml fibriiniä I. Näytettä inkuboidaan huoneenlämpötilassa 10 minuuttia ja sentrifugoidaan 2 000 kierrosta minuutissa 10 minuuttia. Muodostunut fibriini I on pääosin vapaa batroksobiinistä. 10 Fibriinin uudelleenpolymerointi suoritetaan, kuten esimerkissä 5.6 on kuvattu, muodostamaan fibriinipeiteaine.

« > t

Claims (34)

48 1 106 1 6

1. Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää ei-dynaamista fibriinimonomeeriä, fibrinogeenis-5 tä, tunnettu siitä, että: (a) saatetaan koostumus, joka sisältää fibrinogee-niä, kosketukseen trombiinin kaltaisen entsyymin kanssa fibrinogeenin muuttamiseksi silloittumattomaksi fib-riinipolymeeriksi; 10 (b) erotetaan silloittumaton fibriinipolymeeri koostumuksesta, joka sisältää fibrinogeeniä; ja (c) liuotetaan silloittumaton fibriinipolymeeri muodostamaan koostumus, joka sisältää ei-dynaamista fib-riinimonomeeriä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trombiinin kaltainen entsyymi immobilisoidaan kantoaineelle ja kontaktivaihe johtaa siihen, että trombiinin kaltainen entsyymi liittyy silloittu-mattoman fibriinipolymeerin kanssa ja edelleen erotetaan 20 trombiinin kaltainen entsyymi koostumuksesta, joka sisäl- '1 tää f ibriinimonomeeriä. «

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, * * "I tunnettu siitä, että kantoaine valitaan ryhmästä ·; selluloosa, polydekstraani, agaroosi, polystyreeni, piidi- . 25 oksidi, polyakryylihapot, polyakryyliamidit, polyvinyyli- alkoholit, lasihelmet, polykarbonaatti, kollageeni, selluloosa j ohdannaiset, polytetrafluorietyleeni ja niiden seokset .

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että kantoaine valitaan ryhmästä .·· agaroosi ja piidioksidi.

" . 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trombiinin kaltainen entsyymi '·' immobilisoidaan suodattimelle tai trombiinin kaltainen : .· 35 entsyymi immobilisoidaan kantoaineelle ja muodostaa toisen * · « 110616 puolen suodattimesta ja kontaktivaiheen jälkeen saadun fibriinimonomeerin annetaan kulkea suodattimen läpi.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuotinvaihe toteutetaan hap- 5 popuskuriliuoksen avulla, jonka pH on vähemmän kuin n. 5, tai kaotrooppisella aineella.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happopuskuriliuos valitaan ryhmästä etikkahappo, meripihkahappo, glukuronihappo, kys- 10 teiinihappo, krotonhappo, itakonihappo, glutamiinihappo, muurahaishappo, asparagiinihappo, adipiinihappo ja niiden suolat.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happopuskuriliuos tai kao- 15 trooppinen aine sisältää lisäksi kalsiumionien lähteen.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erotusvaihe toteutetaan suodattamalla .

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ’* 20 tunnettu siitä, että trombiinin kaltainen entsyymi j voi muuttaa fibrinogeenin fibriiniksi I.

‘ 11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trombiinin kaltainen entsyymi • valitaan ryhmästä Ancrod ja Batroksobiini. : .25

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poistetaan trombiinin kaltainen entsyymi koostumuksesta, joka sisältää fibriini-monomeeriä, biotinyloimalla trombiinin kaltainen entsyymi ja saattamalla koostumus, joka sisältää fibriinimonomee- .·. 30 riä, kosketukseen immobilisoidun avidiinin kanssa, poista- • · , ··* en täten trombiinin kaltaisen entsyymin koostumuksesta, ! . joka sisältää fibriinimonomeeriä.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan vesipitoinen 35 koostumus, joka sisältää silloittumatonta fibriinimonomee- 50 110616 riä, jossa fibriinimonomeeripitoisuus on n. 10 mg/ml - n. 200 mg/ml ja koostumuksella on pH n. 1 - n. 5.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu pitoisuus on n. 20 5 mg/ml - n. 100 mg/ml.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fibriinimonomeeri valitaan ryhmästä fibriini I, des BB -fibriini ja fibriini II.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että fibriinimonomeeri on fibriini I.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan vesipitoinen koostumus, joka sisältää fibriinimonomeeriä, jonka pitoi- 15 suus on n. 20 mg/ml - n. 200 mg/ml.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu pitoisuus on n. 20 mg/ml - n. 100 mg/ml.

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, ·' . 20 tunnettu siitä, että fibriinimonomeeri valitaan •j ryhmästä fibriini I, des BB -fibriini ja fibriini II.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fibriinimonomeeri on fibrii- ni I-

21. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan vesipitoinen koostumus, joka sisältää: (a) fibriinimonomeeriä ja (b) kalsiumionien lähteen, '/. 30 ja jossa kalsiumionien pitoisuus on n. 5 mM - n. 200 mM.

22. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan koostumus, joka on kiinteässä muodossa.

’ 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, ' 35 tunnettu siitä, että koostumus muodostetaan lyofi- 51 110616 lisoimalla vesipitoinen liuos, joka sisältää fib-riinimonomeeriä.

24. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan koostumus, joka 5 sisältää fibriinimonomeeriä ja yhdistettä valittuna ryhmästä antibiootti, histamiini ^-antagonisti, syöpää vastustava lääke, fibronektiini ja fibrinolyyttinen inhibiittori .

25. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan (a) koostumus, jossa on fibriinimonomeeriä; ja (b) koostumus, joka on valittu ryhmästä emäspus-kuri ja tislattu vesi, ja pakataan ne yhteen.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emäspuskuri tai tislattu vesi sisältää edelleen kalsiumionien lähteen.

27. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan , “ 20 (a) koostumus, jossa on silloittumatonta fibrii- >| niä; ja (b) koostumus, joka sisältää kalsiumionien läh->; teen, ja pakataan ne yhteen.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että valmistetaan pakkaus, joka edelleen sisältää aktivointitekijää XIII.

29. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koostumus, joka sisältää fib-riinimonomeeriä, laitetaan kiinteän kantoaineen pinnalle.

: ·.* 30 30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä kantoaine valitaan ’ ; ryhmästä side, ommel ja proteesi. » i »

31. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeeri valitaan ryhmästä : ;* 35 fibriini I, des BB -fibriini ja fibriini II. 52 1 106 1 6

32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeeri on fibriini I.

33. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koostumus on kiinteässä muo- 5 dossa.

34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koostumus muodostetaan lyofi-lisoimalla vesipitoinen liuos, joka sisältää fib-riinimonomeeriä. * t · * · I · · · > t · k « · 53 1 10616