KR102252223B1 - 힘줄 치료 및 회복을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 힘줄 부상 치료 또는 예방에서의 사용을 위한 모낭 유래 비-구근 진피 초 세포를 사용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
Description
<관련 출원의 상호-참조>
본원은 2013년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 61/763,908호의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 이익을 주장하며, 그 출원은 전체로서 본원에 참조문헌으로 포함된다.
<기술 분야>
본 발명은 힘줄 회복을 위한 방법 및 조성물, 및 보다 구체적으로는, 힘줄 치료 및 회복에의 사용, 및 힘줄 부상 예방을 위한 비-구근 진피 초 세포(non-bulbar dermal sheath cell)를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
힘줄은 보통 근육을 뼈에 연결하는 섬유질의 결합 조직의 강한 끈이다. 흔한 힘줄의 예는 종아리 근육을 발뒤꿈치 뼈에 연결하는 아킬레스건(Achilles tendon), 및 슬개골을 경골에 연결하는 슬개건(Patellar tendon)을 포함한다.
힘줄은 예를 들어, 과도한 사용, 염좌, 질병 및 일반적인 노화를 통한 것을 포함하여 다양한 방식으로 부상당할 수 있다. 용어 "건병증(tendinopathy)"은 염증 및 미세파열로 인한 것을 포함한 다양한 부상을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 힘줄은 또한 파열되거나 찢어질 수 있고, 이는 통상적으로 외과적 개입을 필요로 한다.
힘줄 부상 치료에 사용할 수 있는 다양한 외과적 방법이 있지만, 그러한 방법으로도 힘줄 치유는 적어도 치유가 된다면 수년이 걸릴 수 있다. 본 발명은 힘줄 부상 치료를 위한 신규 조성물 및 방법을 개시하고, 다른 관련된 이점을 추가로 제공한다.
간단히 말해서, 본 발명은 모낭(hair follicle) 유래 비-구근 진피 초(Non-Bulbar Dermal Sheath)("NDBS") 세포를 사용한 힘줄 부상 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 한 측면에서 (a) 생생한(vital)(즉, '살아있는(living)') 모발을 준비하는 단계; 및 (b) NBDS 세포 집단이 얻어질 수 있도록 생생한 모발을 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 바람직한 실시태양에서 NBDS 세포는 단리(isolate)된다.
본 발명의 한 측면에서: (a) 생생한 모발을 준비하는 단계; (b) (a) 단계에서 준비한 모발을 쪼개어 모낭 구근(hair follicle bulb)(진피 초 컵(dermal sheath cup) 및 모유두(dermal papilla)를 포함함)을 제거하는 단계; (c) 비-구근 진피 초 조직을 단리하는 단계; 및 (d) 단리된 비-구근 진피 초 조직을 배양하여 NBDS 세포를 생성하는 단계를 포함하는 NBDS 세포 단리 방법이 제공된다. 본 발명의 한 실시태양에서 생생한 모발은 대상의 후두 두피로부터 생검에 의해 얻어진다. 다른 실시태양에서 모발은 미세조작기 및 메스를 사용하여 쪼개진다. 또 다른 실시태양에서, 본원에서 제공하는 방법은, 임의적으로, 예를 들어 콜라게나아제, 디스파아제, 및 류펩틴과 같은 콜라겐 소화 효소로 단리된 비-구근 진피 초 조직의 효소에 의한 소화를 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 세포는 여러 번의 계대를 거친다.
본 발명의 다른 측면에서, 임의적으로, CD 90, CD73 및 CD49b 중 하나 이상에 대해 주로 양성, 및/또는 CD34, CD45 및 KRT14 중 하나 이상에 대해 주로 음성인(임의적으로 배양 전 또는 후) 집단을 제공하기 위해 세포가 단리되는 위에서 기술한 방법에 따라 생성된, 단리된 NBDS 세포가 제공된다. 바람직한 실시태양에서 단리된 NBDS 세포는 위에서 기술한 양성 마커 중 하나 이상에 대해 적어도 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 100 % 양성, 및/또는 위에서 기술한 음성 마커 중 하나에 대해 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 또는 98 % 음성이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 단리된 NBDS 세포는 세포 집단 내에 15 %, 10 %, 5 %, 또는 1 % 미만의 케라티노사이트 및/또는 세포 집단 내에 15 %, 10 %, 5 %, 또는 1 % 미만의 멜라노사이트를 갖는다. 그러나, 다른 실시태양에서, 단리된 NBDS 세포 집단은, 예를 들어, 세포 집단 내에 1, 5, 10, .0.01 %, 0.1 %, 또는 1 % 이상의 케라티노사이트, 및/또는 5, 10, 0.1 %, 0.1 % 이상의 멜라노사이트를 포함한 일부 오염 세포 유형을 갖는 표피 세포 집단으로부터(바람직하게는 모낭으로부터) 유래한다. 본 발명의 다른 실시태양에서 단리된 NBDS 세포는 순도 95 % 이상이고, 세포 집단 내에 하나 이상의 오염 세포 유형(예를 들어, 하나 이상의 케라티노사이트)을 갖는다.
이들 NBDS 세포(또는 단리된 NBDS 세포)는 예를 들어, 혈청 혈장, 피브린, 및/또는 히알루론과 같은 다른 성분과 함께 조성물에 포함될 수 있다. 다른 실시태양에서 NBDS 세포(또는 단리된 NBDS 세포)는 주사에 적합한 조성물, 예를 들어, 젖산 링거 또는 완충 생리 식염수를 구성할 수 있다. 본 발명의 조성물을 형성하는 데에 사용할 수 있는 다른 성분은, 예를 들어, 세포 외 기질의 구성성분(예를 들어, 글리코사미노글리칸(GAG), 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 히알루론산, 알부민(예를 들어, 인간 알부민), 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌), 시토킨 및 케모킨(예를 들어, 형질전환 성장 인자 베타(TGF-beta) 및 그의 동형, 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 및 그의 동형, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 부갑상선-호르몬-관련 단백질, 간세포 성장 인자/분산 인자(HGF/SF), 대식세포 자극 단백질(MSP), 표피 성장 인자(EGF), 인터류킨 6(IL-6), 스트로마 세포-유래 인자 1(SDF-1), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)) 및/또는 다양한 치료제(예를 들어, 진통제, 소염제 및 면역조절제)를 포함한다. 그러나 다른 실시태양에서 NBDS 세포(및 단리된 NBDS 세포)는 임의의 전술한 성분(예를 들어, 혈청 또는 혈장을 포함하여)을 포함하지 않는 조성물로 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 위에서 기술한 NBDS 세포(및 바람직한 실시태양에서 단리된 NBDS 세포)를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 힘줄 부상 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 한 실시태양에서, 대상은 인간, 말, 돼지, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 쥐 및 생쥐로 이루어지는 군에서 선택되는 포유류이다.
본 발명의 다양한 실시태양에서, 힘줄 부상은 힘줄 찢김 또는 파열, 또는 건증(tendinosis), 건막염(tenosynovitis), 및 건열(avulsion)로 이루어지는 군에서 선택되는 다른 부상이다. 또 다른 실시태양에서, 힘줄은 아킬레스건 또는 슬개건이다. 다른 실시태양에서, 힘줄은 굴곡건(flexor tendon), 또는 신전건(extensor tendon)이다. 또 다른 실시태양에서 힘줄 부상은 또한 본원에서 제공되는 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 다양한 힘줄 관련 질병(건병증(tendinopathies), 건증(tendinoses), 건염(tendinitis), 건막염, 건주위증(partenonitis), 건증(teninosis)을 동반한 건주위염(paratenonitis), 및 힘줄의 미세파열을 포함)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 치료할 수 있는 대표적인 힘줄은 예를 들어 a) 아킬레스건(예를 들어, 중간-부위 아킬레스 건병증(Mid-portion Achilles tendinopathy); 아킬레스 건주위병증(Achilles paratendinopathy); 유착성 아킬레스 건병증(Insertional Achilles tendinopathy); 후종골 점액낭염(Retrocalcaneal bursitis); 표재종골 점액낭염(Superficial calcaneal bursitis): b) 어깨 힘줄(예를 들어, 이두근 건병증(Bicipital tendinopathy); 회전 근개 건병증(Rotator cuff tendinopathy): c) 팔꿈치 힘줄(예를 들어, 내측 또는 외측 상과염(Medial or Lateral epicondylitis) 또는 테니스 엘보(tennis elbow)) d) 손과 손목:(예를 들어, 굴곡 / 신전 건병증; 굴곡 / 신전 건막염; 드퀘르뱅 병; 및 뒤퓌트랑 구축; e) 미세파열을 동반하거나 동반하지 않은 슬와(hamstring) 및 슬개(patellar) 건병증; 및 f) 미세파열을 동반하거나 동반하지 않은 족저근막염(plantar fasciitis)을 포함한다.
하나 이상의 실시태양의 세부사항을 아래의 상세한 설명에서 기술한다. 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명, 도면, 및 청구항으로부터 명확할 것이다. 또한, 본원에서 참조되는 모든 특허 및 특허 출원의 내용은 전체로서 참조문헌으로 포함된다.
도 1은 인간 모낭의 절개도를 나타난대. 도 1A는 단리된 진피 초(도 1B 참조)를 얻기 위해 모근의 구근 부 위(즉, 모유두 및 진피 초 컵 세포 위), 그러나 피지샘관의 기저부 아래에서 쪼개질 수 있는, 단리된 인간 모낭을 나타낸다. 도 1B에 나타낸 구조체는 도 1C 및 1D에 나타낸 대로 둘 이상의 별개 부분으로 분리될 수 있다. 도 1C는 모발 섬유 및 관련 내 모근 초, 및 외 모근 초(케라티노사이트를 주로 포함함)를 나타내고, 도 1D는 NBDS 세포를 포함하는 진피 초(결합-조직 초로 또한 종종 나타냄)이다.
도 2는 모유두("DP") 세포, 진피 초 컵("DSC") 세포, 및 비-구근 진피 초("NBDS") 세포의 출처를 나타내는 모낭의 도시이다.
도 3은 배양물 내의 NBDS 세포의 현미경 사진이다.
도 4는 콜라겐 생산을 확인하기 위해 염색된 NBDS 세포를 나타낸다. 보다 구체적으로는, NBDS / 혈장 겔 혼합물은 5 일(도 4A) 및 12 일(도 4B) 후에 약하게 신장되었다. 도 4B의 세포는 도 4A의 그것보다 현저히 어두워, 제1형 콜라겐 생산을 나타낸다.
도 2는 모유두("DP") 세포, 진피 초 컵("DSC") 세포, 및 비-구근 진피 초("NBDS") 세포의 출처를 나타내는 모낭의 도시이다.
도 3은 배양물 내의 NBDS 세포의 현미경 사진이다.
도 4는 콜라겐 생산을 확인하기 위해 염색된 NBDS 세포를 나타낸다. 보다 구체적으로는, NBDS / 혈장 겔 혼합물은 5 일(도 4A) 및 12 일(도 4B) 후에 약하게 신장되었다. 도 4B의 세포는 도 4A의 그것보다 현저히 어두워, 제1형 콜라겐 생산을 나타낸다.
위에서 언급한 대로, 본 발명은 포유류의 힘줄 부상 치료 또는 예방에의 사용을 위한 모낭 유래 비-구근 진피 초 세포를 제공한다. 그러나 본 발명을 기술하기에 앞서, 본원에서 사용되는 특정 용어의 정의를 먼저 기술하는 것이 본 발명의 이해에 도움될 것이다.
비-구근 진피 초 세포, 또는 "NBDS" 세포는 진피 유래 세포(또는 보다 구체적으로는, 모낭으로부터 유래)를 나타낸다. 바람직한 실시태양에서, 초 세포는 모근의 구근 부 위(즉, 모유두 및 진피 초 컵 세포 위), 그러나 피지샘관의 기저부 아래에서 모낭의 외 진피 초로부터 얻어진다. NBDS 세포는, 예를 들어, 생성 및 배양 방법에 의해(아래에서 기술하는 대로); 형태학(예를 들어, 도 3 참고); 및 세포 특이적 마커(예를 들어, 배양 전 또는 후, NBDS 세포는 CD 90, CD73 및 CD49b에 대해 주로 양성, 및/또는 CD34, CD45 및 KRT14에 대해 주로 음성이다)를 포함한 다양한 방법에 의해 쉽게 확인할 수 있다. 그러나 모든 경우에서, 세포는 진피 기원, 및 보다 구체적으로는, 모낭 기원이어야 한다.
확장된 비-구근 진피 초 세포, 또는 "eNBDS 세포"는 여러 번의 계대 배양으로 확장되었지만, 콜라겐(예를 들어, 제I형 콜라겐) 및 다양한 시토킨 및 케모킨을 생산하는 능력을 유지하는 NBDS 세포를 나타낸다. 위와 같이, 예상외로, eNBDS 세포는 또한 면역조절성일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 세포는 배양물에서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 이상의 계대 배양으로 확장될 수 있다.
"단리된" NBDS 세포는 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % 초과 또는 100 %의 NBDS 세포의 세포 집단을 나타낸다. NBDS 세포는 콜라겐(예를 들어, 제I형 콜라겐), 및 다양한 시토킨 및 케모킨을 생산할 수 있는 능력을 갖는다. 예상외로, NBDS 세포는 또한 면역조절성으로, 힘줄 부상 치료에 특히 적절하게 될 수 있다(예를 들어, 임의의 염증 반응 억제를 도움으로써).
본 발명의 특정 실시태양에서, 마이크로 규모의 세포를 시각화하기 위해 사용할 수 있는 소프트웨어 또는 다른 시각화 기술이 시계에 있는 다수의 세포의 크기, 모양, 생육 및 입도를 평가하고, 케라티노사이트, 멜라노사이트 DSC, 및 상이한 형태학의 다른 세포 유형이 아닌 NBDS 세포(섬유아세포-유사임 - 도 3에 나타낸 대로)의 수를 확인하는 데에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시태양에서 단리된 NBDS 세포 집단이 생성되도록 모낭으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 또는 20 이상의 계대로 세포를 배양하는 단계를 포함하는 NBDS 세포 단리 방법이 제공된다. 바람직한 실시태양에서 세포는 NBDS 세포가 부착되게 하는 접시 또는 플라스크에 놓여지고, 각 계대 배양으로 비-부착 세포는 제거되고, 남은 부착 세포는 해방되고(예를 들어, 트립신 처리에 의해), 이어서 신선한 배지가 첨가된다. 이러한 실시태양에서 NBDS 세포 대 비-NBDS 세포 수를 가늠하기 위해 세포 배양물 내의 세포를 시각화함으로써 언제 충분한 단리된 NBDS 세포 집단이 얻어졌는지를 확인할 수 있다. 시각화 기술은 직접 현미경 시각화, 마커에 대한 세포 염색(또는 이것의 부족 - 예를 들어, 케라틴의 부족에 대한), 및 상이한 세포 유형의 회절 무늬를 보기 위한 광 / 레이저 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는다(일반적으로 문헌 ["Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue" Lidia Bakota and Roland Brandt, eds., Humana Press, 2014] 참고; 또한 문헌 ["Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells: Optical and Spectroscopic Techniques", Conn ed., Academic Press, 2012] 참고).
다른 실시태양에서, NBDS 세포 대 오염 세포 유형의 정도를 평가하기 위해 세포 특이적 마커(예를 들어, NBDS 세포는 CD 90, CD73 및 CD49b에 대해 주로 양성, 및/또는 CD34, CD45 및 KRT14에 대해 주로 음성이다(임의적으로 배양 전 또는 후))를 사용할 수 있다. 문헌 ["Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration", Krishan, Krishnamurthy, and Totey eds., Wiley-Blackwell, 2010]을 참고하기 바란다. 예를 들어, 단리된 NBDS 세포는 a) 하나 이상의 생생한 모낭을 얻는 단계; b) 모낭으로부터 세포를 배출시키는 단계(예를 들어, 효소의 사용을 통해, 또는 성장 세포를 모낭 밖에서 배양함에 의해); 및 c) 세포를 분류하여(예를 들어, 유동 세포분석법에 의해 또는 마그네틱 비드의 사용을 통해) 단리된 NBDS 세포 집단을 얻는 단계에 의해 생성할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서 임의의 프로세스 단계의 세포가 위에서 기술한 대로 임의적으로 배양될 수 있다(예를 들어, 위에서 기술한 대로 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 또는 20 이상의 계대로 배양될 수 있고, 생성된 세포는, 예를 들어, 유동 세포분석법 또는 마그네틱 비드에 의해 추가로 단리된다).
바람직한 실시태양에서 단리된 NBDS 세포는 위에서 기술한 양성 마커 중 하나 이상에 대해 최소한 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 100 % 양성이고/이거나, 위에서 기술한 음성 마커 중 하나에 대해 최소한 80 %, 90 %, 95 %, 또는 98 % 음성이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서(및 본원에서 기술한 임의의 기술을 사용하여), 단리된 NBDS 세포는 세포 집단 내에 15 %, 10 %, 5 %, 또는 1 % 미만의 케라티노사이트 및/또는 세포 집단 내에 15 %, 10 %, 5 %, 또는 1 % 미만의 멜라노사이트를 갖는다. 그러나, 다른 실시태양에서, 단리된 NBDS 세포 집단은 예를 들어, 세포 집단 내에 1, 5, 10, .0.01 %, 0.1 %, 또는 1 % 이상의 케라티노사이트, 및/또는 5, 10, 0.1 %, 0.1 % 이상의 멜라노사이트를 포함한 일부 오염 세포 유형을 갖는 진피 세포 집단으로부터(바람직하게는, 모낭으로부터) 유래한다.
본원에서 사용되는 "힘줄 부상"은 힘줄(및 뼈 및 근육과 같은 힘줄과 관련있는 구조체)을 적절히 사용하기 어렵게 하거나, 결국 어렵게 할 수 있는 힘줄과 관련 있는 다양한 상이한 병태를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 힘줄 부상은 외상성 부상(예를 들어, 스포츠 부상, 과도한 사용, 또는 의학적 또는 외과적 개입으로 인한), 유전적 기원의 부상, 및 임의의 위의 것에 의해 발생할 수 있는 질병을 포함할 수 있다. 대표적인 힘줄 부상은 건병증, 건증, 건염, 건막염, 건주위증, 건증을 동반한 건주위염, 및 힘줄의 미세파열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 치료할 수 있는 대표적인 힘줄은 예를 들어 a) 아킬레스건(예를 들어, 중간-부위 아킬레스 건병증; 아킬레스 건주위병증; 유착성 아킬레스 건병증; 후종골 점액낭염; 표재종골 점액낭염: b) 어깨 힘줄(예를 들어, 이두근 건병증; 회전 근개 건병증: c) 팔꿈치 힘줄(예를 들어, 내측 또는 외측 상과염 또는 테니스 엘보) d) 손과 손목:(예를 들어, 굴곡 / 신전 건병증; 굴곡 / 신전 건막염; 드퀘르뱅 병; 및 뒤퓌트랑 구축; e) 미세파열을 동반하거나 동반하지 않은 슬와 및 슬개 건병증; 및 f) 미세파열을 동반하거나 동반하지 않은 족저근막염을 포함한다.
NBDS
생성
위에서 기술한 대로, 본 발명은 NBDS 세포 단리 방법을 제공한다. 본 발명의 한 측면에서 이러한 방법은 (a) 생생한 모발을 준비하는 단계; 및 (b) NBDS 세포 집단이 얻어질 수 있도록 생생한 모발을 배양하는 단계를 포함한다. 단계 (a)와 관련하여, 생생한 모발을 얻기 위해, 예를 들어, 다양한 모낭(피부와 함께)을 제거하는 외과적 방법, 또는 대상으로부터 직접 하나 이상의 모낭을 뽑는 것을 포함한 다양한 방법이 사용될 수 있다.
일단 생생한 모발이 얻어지면, 이는 NBDS 세포의 성장을 가능하게 하고, 우선적으로는 촉진하는 조건에서 배양될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 섬유아세포-유사 세포가 증식할 수 있는 조건에서 배양된다. 바람직한 실시태양에서 배양 단계는 무-혈청 배지로 수행된다. 여러 번의 계대(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 10 또는 그 이상의 계대) 후, 충분한 양의 NBDS 세포가 있는지, 및 세포가 오염 세포로부터 충분히 단리되었는지를 확인하기 위해 위에서 기술한 대로 배양된 세포를 분석한다.
본 발명의 다른 측면에서, (a) 생생한 모발을 준비하는 단계; (b) (a) 단계에서 준비한 모발을 쪼개어 모낭 구근(진피 초 컵 및 모유두를 포함함)을 제거하는 단계; (c) 비-구근 진피 초 조직을 단리하는 단계; 및 (d) 단리된 비-구근 진피 초 조직을 배양하여 NBDS 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
생생한(또는 '살아있는') 모발을 준비하기 위해, 샘플은 통상적으로 주어진 대상(예를 들어, 인간, 말, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 기니피그, 쥐 또는 생쥐와 같은 포유류)으로부터 얻어진다. 샘플은 다양한 부위(예를 들어, 인간의 경우, 두피의 후두부, 가슴 또는 허벅지로부터, 및 말의 경우 갈기 또는 꼬리로부터)로부터 얻을 수 있다. 샘플은 생검, 또는 다른 적절한 수단(예를 들어, '뽑기', 또는 절개에 의해)을 통해 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 발육의 성장기에 있는 모낭이 선택되지만, 다른 발육 단계(예를 들어, 퇴행기)가 또한 사용될 수 있다.
일단 샘플이 대상으로부터 얻어지면, 이어서, 통상적으로 미세조작기 및 메스를 사용하여 모낭을 단리하기 위해 샘플을 분리할 수 있지만, 바늘과 같은 다른 기구 또한 사용할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단리된 진피 초(도 1B 참고)를 얻기 위해서, 도 1A에 나타낸 것과 같은 단리된 모낭은 모근의 구근 부 위(즉, 모유두 및 진피 초 컵 세포 위), 그러나 피지샘관의 기저부 아래에서 추가로 쪼개질 수 있다. 도 1B에 나타낸 구조체는, 도 1C 및 1D에 나타낸 대로 둘 이상의 별개 부분으로 분리될 수 있다. 도 1C는 모발 섬유 및 관련 내 모근 초, 및 외 모근 초(케라티노사이트를 주로 포함함)를 나타내고, 도 1D는 NBDS 세포를 포함하는 진피 초(결합-조직 초로 또한 종종 나타냄)이다.
진피 초(도 1D)는, 특정 실시태양에서, 예를 들어, 한 쪽을 따라 길이-방향으로 절단하거나, 효소에 의한 소화(예를 들어, 콜라게나아제, 디스파아제 및 류펩틴과 같은 콜라겐 소화 효소로)와 같은 기술을 사용하여 추가로 분리될 수 있다.
이어서 NBDS 세포, 또는 분리된 NBDS 세포를 포함하는 진피초는 세포 증식(예를 들어, 도 3 참고)을 촉진하는 배지(혈청이 있거나 없는)에서 배양될 수 있다. 적절한 배지는, 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 태아 송아지/소 혈청 및 항생제가 보충된 DMEM/Hams F12를 포함한다. 다르게는, 세포는 다양한 조합의 무-혈청 배지 및 보충물이 사용된 무-혈청 프로세스에서 복제될 수 있다. 무-혈청 배지의 예는 혈청 보충물 및/또는 인간 유래 혈소판 추출물을 포함하는 X-VivoTM 및 TheraPEAKTM FGM-CDTM을 포함한다. 3 내지 5 일 후, 신선한 증식 배지가 배양 배지에 통상적으로 첨가된다. 이어서 배지는 2 내지 4 일마다 교체될 수 있다. 배양이 약 80 내지 90 % 밀집도(confluence)에 도달하면, 트립신 처리를 통해 배양 플라스크로부터 세포를 분리하고 더 큰 조직 배양 플라스크에 접종한다. 약 5 내지 1억 세포가 얻어질 때까지 이 단계를 여러 번의 계대(예를 들어, 2, 4, 또는 6)로 반복한다.
일단 원하는 수의 세포가 얻어지면, 세포를 여러 번 세척하고, 트립신 처리하고, 젖산 링거액, 10 % 인간 혈청 알부민(HAS) 및 5 % 디메틸술폭시드(DMSO)로 이루어진 세포 수송 배지(CTM)에 재현탁한다. 세포를 세어서 2천만 세포/ml의 최종 농도가 되도록 조정하고 액체 질소에 보관한다.
NBDS
세포를 포함하는 조성물 생성
위에서 기술한 대로, NBDS 세포(및 단리된 NBDS 세포)는 예를 들어, 혈청, 혈장, 혈소판-풍부-혈장, 알부민(예를 들어, 인간 알부민), 피브린, 및/또는 히알루론산과 같은 다른 성분과 함께 조성물에 포함될 수 있다. 적절한 조성물을 생성하기 위해 예를 들어, 티실(TISSEEL) 및 코실(COSEAL)(백스터(Baxter)로부터 입수 가능), 티수콜(TISSUCOL), 베리플라스트(BERIPLAST), 퀵실(QUIXIL), 타코실(TACHOSIL), 및 에비셀(EVICEL)을 포함한 다른 상업적으로 입수 가능한 제품이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-락트산, 및 폴리 카프로락톤을 포함한 다른 중합체-기재 조성물이 또한 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서 조성물은 자유롭게 유동하고 주사 가능한 하나 또는 두 부(예를 들어, 성분을 혼합하는 이중벽 주사기 내에)로 제공된다.
예를 들어, 세포 외 기질의 구성성분(예를 들어, 글리코사미노글리칸(GAG), 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 히알루론산, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌), 시토킨 및 케모킨(예를 들어, 형질전환 성장 인자 베타(TGF-beta) 및 그의 동형, 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 및 그의 동형, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 부갑상선-호르몬-관련 단백질, 간세포 성장 인자/분산 인자(HGF/SF), 대식세포 자극 단백질(MSP), 표피 성장 인자(EGF), 인터류킨 6(IL-6), 스트로마 세포-유래 인자 1(SDF-1), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)) 및/또는 다양한 치료제(예를 들어, 진통제, 소염제 및 면역조절제)를 포함한 다른 성분이 또한 이들 조성물에 포함될 수 있다.
NBDS
세포를 사용한 힘줄 부상 치료 방법
NBDS 세포를 포함하는 조성물(위에서 기술한 단리된 NBDS 세포를 포함하는 조성물을 포함해서)을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 힘줄 부상 치료 또는 예방 방법이 또한 제공된다. 통상적으로, 세포는 주사에 의해 투여되지만, 다양한 실시태양에서, 외과적 방법이 사용되는 경우 세포는 열린 상처에 직접 제공될 수 있다. 적절한 주사 방법의 대표적인 예는 보통 주사기, 및 모두 전체로서 참조문헌으로 포함된 미국 특허 출원 12/153,248호 및 PCT 공개 WO/2013/113121에 개시된 것과 같은 특수화된 장치를 포함한다.
본원에서 제공하는 NBDS 세포(및 단리된 NBDS 세포) 및 방법을 사용하여 다양한 힘줄 부상을 치료하거나 예방할 수 있다. 예를 들어, 사고 또는 부상으로부터의 힘줄 찢김 또는 파열, 외과적으로 발생된 손상 또는 회복을 치료할 수 있다. 또한, 예를 들어 건염 또는 건증, 건막염, 및 건열과 같은 건병증을 포함한 다른 만성 부상을 또한 치료할 수 있다.
다양한 힘줄을 본원에서 제공하는 NBDS 세포(및 단리된 NBDS 세포) 및 조성물로 치료할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서 질병 및/또는 외상(예를 들어, 의료적 또는 외과적 부상 또는 다른 부상에 의한)으로 인해 부상당한 힘줄을 치료한다. 힘줄은 찢어질 수 있고/있거나, 완전 또는 부분 파열(또는 미세파열)될 수 있다. 힘줄 관련 부상의 예는 건병증, 건증, 건염, 건막염, 건주위증, 건증을 동반한 건주위염, 및 힘줄의 미세파열을 포함한다. 치료할 수 있는 대표적인 힘줄은 예를 들어 a) 아킬레스건(예를 들어, 중간-부위 아킬레스 건병증; 아킬레스 건주위병증; 유착성 아킬레스 건병증; 후종골 점액낭염; 표재종골 점액낭염: b) 어깨 힘줄(예를 들어, 이두근 건병증; 회전 근개 건병증: c) 팔꿈치 힘줄(예를 들어, 내측 또는 외측 상과염 또는 테니스 엘보) d) 손과 손목:(예를 들어, 굴곡 / 신전 건병증; 굴곡 / 신전 건막염; 드퀘르뱅 병; 및 뒤퓌트랑 구축; e) 미세파열을 동반하거나 동반하지 않은 슬와 및 슬개 건병증; 및 f) 미세파열을 동반하거나 동반하지 않은 족저근막염을 포함한다.
예를 들어, 인간, 말, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 쥐 및 생쥐와 같은 포유류를 포함한 다양한 종을 본원에서 제공하는 NBDS 세포(및 단리된 NBDS 세포) 및 조성물로 치료할 수 있다.
다음의 예는 본 발명을 설명하며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예
1
조직 채취
두피 후두부로부터의 피부 생검이 다음과 같이 대상으로부터 얻어진다. 간단히 말해서, 일단 두피의 적절한 부위가 선택되면, 일부 짧은 부분(stubble)이 남도록 이발기로 이발한다. 이어서 생검 부위를 완전히 소독하고 마취한다. 일단 마취 효과가 나타나면, 생검 부위로부터 4-10 mm 깊이 펀치 생검을 조심스럽게 제거하고 12-14 일 후 제거할 수 있는 봉합사로 절개를 봉합한다. 이어서 무균 상태에서 피부 생검을 DMEM/Hams F12와 항생제로 이루어진 생검 수송 배지를 포함하는 사전-표지된 생검 튜브에 넣는다.
실시예
2
NBDS
세포의 단리 및 배양
샘플이 오염되지 않도록, 또는 다르게는, 샘플이 오염되었다면 항생제가 있는 배지가 이후에 사용되도록 생검이 수송된 배지에 무균 테스트를 수행한다. 이어서 생검 수송 배지 및 임의의 잔해를 제거하도록 생검을 여러 번 세척하여 후속 처리를 위해 조직을 준비시킨다. 소독한 메스로 피부 상피를 절단해내고 소독한 집게를 사용하여 주변 진피 조직으로부터 전체 모낭 단위를 "뽑기" 또는 절개함으로써 모낭을 Hams F10에서 처리한다. 집게로 모낭을 피부 표면에 최대한 가깝게 잡고 모낭 단위에서 모발을 당겨 모근을 노출시킨다. 후속 처리를 위해 성장기(모발 사이클의 성장 단계, 가시적인 외 모근초, 및 모발 구근의 DSC에 의해 나타남)에 있는 모낭을 선택한다.
먼저 모근 진피 초 컵 세포 및 모유두를 나머지 모낭으로부터 미세 소독된 소형-메스 또는 바늘을 사용하여 떼어내고, 버림으로써 NBDS 단리를 Hams F10에서 수행한다. NBDS 세포를 포함하는 진피 초를 제거하고, 조직은 배양을 위해 준비된다.
6 내지 10 진피 초 조직을 3 % 히알루론산 겔에 조심스럽게 넣고, 예를 들어, FGF, 10 % FCS 및 항생제가 보충된 DMEM/Hams F12와 같은 세포 증식 촉진 배양 배지로 덮는다. 3 내지 5 일 후, 신선한 증식 배지를 배양물에 첨가한다. 이어서 배지는 2 내지 4 일 마다 교체된다. 배양이 약 80 내지 90 % 밀집도에 도달하면, 트립신 처리를 통해 배양 플라스크로부터 세포를 분리하고 더 큰 조직 배양 플라스크에 접종한다. 약 1억만 세포를 얻기 위해 이 단계를 네 번의 계대로 반복한다.
일단 약 1억만 세포가 얻어지면, 세포를 PBS로 세척하고, 트립신 처리하고 세포 수송 배지(CTM: 10 % 인간 혈청 알부민 및 5 % 디메틸술폭시드를 포함하는 젖산 링거액)에 재현탁한다. 원심분리에 의해 세포를 침강시키고 한데 모은다. 상청액을 흡입하고 세포 펠릿을 CTM에 재현탁한다. 품질 대조 및 세포 계수를 위해 두 세포 샘플/표본을 세포-CTM 혼합물로부터 제거한다. 세포를 센 후, 원심분리에 의해 한 번 더 침강시키고, 생성된 펠릿을 2천만 세포/ml의 최종 농도가 되도록 CTM에 재현탁한다. 발송할 때까지 최종 세포 생성물을 액체 질소 내에서 -130 ℃ 미만으로 보관한다.
실시예
3
NBDS
세포 준비 및 힘줄로의 투여
2실형 주사기에서의 사용을 위해 세포를 준비한다. 제1실은 1 ml의 총 부피에 현탁한 약 2천만 세포를 포함한다. 제2실은 환자로부터의 1.5 ml의 자가 혈장 (이 절차 이전에 별도로 준비됨)을 포함한다.
2실형 주사기를 사용해서 회복되어야 하는 힘줄의 복수의 위치에 세포를 주사한다(초음파 유도하에서).
실시예
4
힘줄 신장 연구에서의
제I형
콜라겐 합성
간단히 말해서, 0.15 ml CaCl2(500 mM 저장액)과의 혼합에 의해 1.5 ml의 냉동 NBDS 세포(총 3 백만 세포)를 해동시킨다. 1.5 ml의 혈장을 첨가하고 현탁액을 타원형 주형 틀로 옮긴다. 약 한 시간 후 금형으로부터 제거될 수 있는 겔이 형성될 것이다. 이어서 이 링을 시간에 따라 성형된 링 구조체를 신장할 수 있는 기계에 넣는다. 시간에 따라 가해지는 신장력에 대해 측정이 이루어질 수 있다.
성형된 링은 또한 제거되고, 파라포름알데히드에 고정되고, 하나 이상의 단백질(예를 들어, 제I형 콜라겐, 제III형 콜라겐, 비글리칸, 테나신 C, 엘라스틴, 테노모듈린 및 데코린)의 존재를 확인하기 위해 면역조직화학적으로 염색될 수 있다.
도 4에 나타낸 대로, NBDS / 혈장 겔 혼합물을 5 일(도 4A) 및 12 일(도 4B) 후 약하게 신장했다. 제1형 콜라겐 생산을 확인하기 위해 샘플을 면역염색했다(고추냉이 퍼옥시다아제로). 도 4B는 도 4A보다 현저히 어두워(갈색), 세포가 콜라겐 생성에 대해 양성이었다는 것을 나타내고, 이는 기계적 신장 후 증가되었다. 이 연구로부터의 결과는 NBDS 세포가 시험관 내에서 콜라겐을 생산하고 힘줄-유사 구조체를 형성할 수 있다는 것을 명확히 증명한다. 특히, 성형된 겔 내의 세포는 신장 방향에 따라 배향된다(보통의 힘줄 내의 세포와 같이).
위에서 기술한 다양한 실시태양은 다른 실시태양을 제공하도록 조합될 수 있다. 이 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 문헌은 전체로서 본원에 참조문헌으로 포함된다. 또 다른 실시태양을 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 사용할 필요가 있다면 실시태양의 측면은 수정될 수 있다.
위에서 기술한 상세한 설명에 비추어 실시태양에 이들 및 다른 변화를 가할 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구항에서, 사용된 용어는 명세서 및 청구항에 개시된 특정 실시태양으로 청구항을 제한하는 것으로 여겨져서는 안되고, 이러한 청구항에 주어진 균등물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 실시태양을 포함하는 것으로 여겨져야 한다. 따라서, 청구항은 명세서에 의해 제한되지 않는다.
Claims (33)
- 단리된 비-구근 진피 초(Non-Bulbar Dermal Sheath) (NBDS) 세포를 포함하는, 대상에서 힘줄 부상을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 대상이 인간, 말, 개 및 고양이로 이루어지는 군에서 선택되는 포유류인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 힘줄 부상이 힘줄 찢김, 완전, 부분 또는 미세파열인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 힘줄 부상이 건증(tendinosis), 건막염(tenosynovitis), 및 건열(avulsion)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 힘줄이 아킬레스건(Achilles tendon) 또는 슬개건(Patellar tendon)인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 힘줄이 굴곡건(flexor tendon)인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 힘줄이 신전건(extensor tendon)인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 단리된 NBDS 세포가,
(a) 생생한 모발을 준비하는 단계,
(b) 상기 (a) 단계에서 준비한 모발을 쪼개어 모낭 구근을 제거하는 단계,
(c) 비-구근 진피 초 조직을 단리하는 단계, 및
(d) 단리된 비-구근 진피 초 조직을 배양하여 NBDS 세포를 생성하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 제약 조성물. - 제8항에 있어서, 상기 생생한 모발을 대상의 후두 두피로부터 생검에 의해 얻는 것인 제약 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 모발을 미세조작기 및 메스를 사용하여 쪼개는 것인 제약 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 방법이
상기 단리된 비-구근 진피 초 조직의 효소에 의한 소화를 수행하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물. - 제11항에 있어서, 상기 효소에 의한 소화를 콜라게나아제로 수행하는 것인 제약 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 NBDS 세포를 혈청 함유 또는 무-혈청 배지에서 여러 번의 계대에 걸쳐 배양하는 것인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 혈청 및/또는 혈장을 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 혈청 또는 혈장을 포함하지 않는 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 피브린, 히알루론산, 세포 외 기질의 구성성분, 시토킨, 케모킨, 및 진통제, 소염제 및 면역조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 세포 외 기질의 구성성분이 글리코사미노글리칸(GAG), 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 히알루론산, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 제약 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 시토킨이 형질전환 성장 인자 베타(TGF-beta) 및 그의 동형, 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 및 그의 동형, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 부갑상선-호르몬-관련 단백질, 간세포 성장 인자/분산 인자(HGF/SF), 대식세포 자극 단백질(MSP), 표피 성장 인자(EGF), 인터류킨 6(IL-6), 스트로마 세포-유래 인자 1(SDF-1), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 제약 조성물.
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