CN109251883B - 治疗和修复肌腱的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用来自毛囊的非球形真皮鞘(NBDS)细胞治疗或预防肌腱损伤的组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年2月12日提交的美国临时专利申请No.61/763,908的权益，将其以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及修复肌腱的组合物和方法，更具体涉及用于肌腱治疗和修复以及肌腱损伤的预防的包含非球形真皮鞘(NBDS)细胞的组合物。
背景
相关技术描述
肌腱是纤维结缔组织的坚韧条带，其通常将肌肉与骨骼相连。常见肌腱的实例包括将小腿肌肉与跟骨相连的跟腱，以及将膝盖骨与胫骨相连的髌腱。
许多途径都可以使肌腱受到损伤，包括例如由于过度使用、扭伤、疾病和一般老化。术语“肌腱病”可用于指许多损伤，包括由炎症和轻微撕裂引起的那些损伤。肌腱也可能断裂或撕裂，通常需要使用外科方法治疗。
虽然许多外科方法可用于肌腱损伤的治疗，但是如果要肌腱完全治愈，即使用这些方法也会耗费几年。本发明公开了治疗肌腱损伤的新型组合物和方法，并且还提供了其它相关优势。
概述
简单来说，本发明提供利用毛囊来源的非球形真皮鞘(“NDBS”)细胞治疗或预防肌腱损伤的组合物和方法。在本发明的一方面，提供包括下述步骤的方法：(a)准备有活力的(即活的)毛发，和(b)培养有活力的毛发以便获得NBDS细胞群。在优选实施方案中，将NBDS细胞分离。
在本发明的一个方面，提供用于分离NBDS细胞的方法，其包括下述步骤：(a)准备有活力的毛发；(b)将步骤(a)中准备的毛发切割(cleave)以移出毛囊的球部(其包含真皮鞘杯和真皮乳头)；(c)分离非球形真皮鞘组织；和(d)培养所述分离的非球形真皮鞘组织以产生NBDS细胞。在本发明的一个实施方案中，通过来自对象枕部头皮的活体组织检查获得有活力的毛发。在另一实施方案中，使用显微操纵器和手术刀将毛发切割。然而在其它的实施方案中，本文提供的方法还包括下述步骤：任选地，用例如胶原消化酶(如胶原酶、分散酶和亮抑酶肽)将分离的非球形真皮鞘组织进行酶消化。在进一步的实施方案中，将细胞多次传代。
在本发明其它方面，提供分离的NBDS细胞，任选地根据上文描述的方法制备，其中将所述细胞分离以提供对于CD90、CD73和CD49b中的一种或多种主要为阳性的细胞群，和/或对于CD34、CD45和KRT14中的一种或多种主要为阴性的细胞群(任选在培养前或培养后)。在优选实施方案中，所述分离的NBDS细胞对于上文描述的阳性标志物中的一种或多种至少70％、80％、90％、95％、98％或100％为阳性，和/或对于上文描述的阴性标志物中的一种至少80％、90％、95％或98％为阴性。
在本发明的优选实施方案中，分离的NBDS细胞在细胞群中有少于15％、10％、5％或1％的角质细胞，和/或在细胞群中有少于15％、10％、5％或1％的黑色素细胞。然而，在进一步的实施方案中，分离的NBDS细胞来源于含有一些污染细胞类型的真皮细胞群(优选来源于毛囊)，包括例如，在细胞群中有至少1、5、10、0.01％、0.1％或1％的角质细胞，和/或在细胞群中有至少5、10、0.1％、0.1％的黑色素细胞。在本发明的进一步实施方案中，分离的NBDS细胞纯度为至少95％，并且在细胞群中有至少一种污染细胞类型(例如，至少一种角质细胞)。
这些NBDS细胞(或分离的NBDS细胞)可与其它组分一同存在于组合物中，例如血浆、纤维蛋白和/或透明质酸。在其它实施方案中，NBDS细胞(或分离的NBDS细胞)可能构成适合注射的组合物，例如乳酸林格氏液或盐水缓冲液。可被用于形成本发明的组合物的其它成分包括，例如细胞外基质组分(如葡糖氨基葡聚糖(GAG)、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白、透明质酸、白蛋白(如人白蛋白)、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)、细胞因子和趋化因子(如转化生长因子-β(TGF-β)和它的亚型、胰岛素样生长因子(IGF)和它的亚型、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、甲状旁腺激素相关蛋白、肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6(IL-6)、基质细胞源性因子-1(SDF-1)、血小板源性生长因子(PDGF)和纤维母细胞生长因子(FGF)和/或各种治疗剂(如止痛剂、抗炎剂和免疫调节剂)。然而在其它的实施方案中，将NBDS细胞(以及分离的NBDS细胞)提供至不含上文提及的任何成分(包括例如，血清或血浆)的组合物中。
然而在本发明的其它方面，提供了治疗或预防肌腱损伤的方法，该方法包括下述步骤：向对象施用包含上文描述的NBDS细胞(在优选实施方案中为分离的NBDS细胞)的组合物。在一个实施方案中，所述对象为选自人、马、猪、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠和小鼠的哺乳动物。
在本发明不同的实施方案中，肌腱损伤为肌腱断裂或撕裂，或选自肌腱变性、腱鞘炎和撕裂的其它损伤。而在其它实施方案中，肌腱为跟腱或髌腱。在其它实施方案中，肌腱为屈肌腱或伸肌腱。而在其它实施方案中，肌腱损伤应被理解为包括多种肌腱相关疾病(包括肌腱病、肌腱变性、肌腱炎、腱鞘炎、腱围炎、具有肌腱变性的腱围炎和肌腱轻微撕裂)，其也可利用本文提供的组合物进行治疗。可被治疗的代表性肌腱包括，例如：a)跟腱(如跟腱中部病、跟腱腱围病、跟腱止点病、跟骨后滑囊炎、表面跟骨滑囊炎)；b)肩部肌腱(如二头肌腱病、肩袖肌腱病)；c)肘部肌腱(如内侧上髁炎或外侧上髁炎或网球肘)；d)手部和腕部(如屈肌/伸肌腱病、屈肌/伸肌腱鞘炎、德奎尔万氏病和掌腱膜挛缩症(Dupuytren'scontracture))；e)发生或未发生轻微撕裂的腿筋和髌腱肌腱病；和f)发生或未发生轻微撕裂的足底筋膜炎。
将在下文的描述阐述一个或多个实施方案的详细说明。根据所述描述、附图和权利要求，其它的特征、目的和优势将是显而易见的。此外，本文参考的所有专利和专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。
附图说明
图1显示人毛囊的解剖。图1A显示分离的人毛囊，可将其在毛根的球部以上(即在真皮乳头细胞和真皮鞘杯细胞以上)，皮脂腺管基部以下切割，以获得分离的真皮鞘(参见图1B)。图1B中描述的结构可分为至少两个单独的部分，如图1C和1D所示。图1C描述了毛发纤维和相连的内毛根鞘以及主要包括角质细胞的外毛根鞘，图1D为含有NBDS细胞的真皮鞘(偶尔也被称为结缔组织鞘)。
图2是毛囊的图解，描述了真皮乳头(“DP”)细胞、真皮鞘杯(“DSC”)细胞和非球形真皮鞘(“NBDS”)细胞的来源。
图3是培养物中的NBDS细胞的显微照片。
图4显示了NBDS细胞，针对胶原的产生将其染色。更具体地，在5天(图4A)和12天(图4B)之后，将NBDS/血浆凝胶混合物轻轻地拉伸。图4B中的细胞明显暗于图4A中的那些细胞，这显示I型胶原的产生。
发明详述
如上文指出的，本发明提供治疗和预防哺乳动物肌腱损伤的毛囊来源的非球形真皮鞘(NBDS)细胞。然而在阐明本发明之前，首先阐明下文中使用的某些术语的定义可能有助于理解本发明。
非球形真皮鞘细胞或“NBDS”细胞指真皮来源的细胞(或更具体地，来源于毛囊)。在优选实施方案中，从毛囊的外真皮鞘获得鞘细胞，在毛根的球部以上(即，在真皮乳头和真皮鞘杯细胞以上)，但是在皮脂腺管基部以下。可以通过许多方法容易地鉴定NBDS细胞，包括例如，通过制备和培养的方法(如下文所述)、形态学方法(参见如图3)，以及特异性标志物(如，在培养之前或之后，对于CD90、CD73和CD49b，NBDS细胞主要为阳性，和/或对于CD34、CD45和KRT14，NBDS细胞主要为阴性)的方法。然而在所有的事件中，所述细胞必须是真皮来源的，更具体地，是毛囊来源的。
扩增的非球形真皮鞘细胞或“eNBDS细胞”指在培养中经过多次传代的NBDS细胞，但其仍具有产生胶原(如Ⅰ型胶原)以及各种细胞因子和趋化因子的能力。如上，出乎意料地，所述eNBDS细胞也具有免疫调节能力。在优选实施方案中，在培养中细胞可以传代1、2、3、4、5、10、20或更多代。
“分离的”NBDS细胞指含有高于70％、80％、90％、95％、98％或100％的NBDS细胞的细胞群。NBDS细胞具有产生胶原(如I型胶原)以及多种细胞因子和趋化因子的能力。出人意料地，NBDS细胞也具有免疫调节能力，这使它们特别适合用于肌腱损伤的治疗(如通过帮助抑制任何炎症反应)。
在本发明的某些实施方案中，可以使用能使细胞在微观范围可见的软件或其它可视技术来评估一个视野中大量细胞的尺寸、形状、生活力和粒度，以及确定NBDS细胞(其为如图3所示的成纤维细胞样，不同于角质细胞、黑色素细胞、DSCs和不同形态的其它细胞类型)的数量。因此，在本发明的一个实施方案中，提供用于分离NBDS细胞的方法，该方法包括将来自毛囊的细胞培养至少1、2、3、4、5、6、10或20代，从而产生分离的NBDS细胞群。在优选实施方案中，将所述细胞置于允许NBDS细胞贴壁的皿或瓶中，从而随着每次传代，将非贴壁细胞移出，并释放(例如通过胰蛋白酶消化)剩余的贴壁细胞，然后加入新鲜培养基。在此种实施方案中，通过观察细胞培养物中的细胞可确定何时获得足够的分离的NBDS细胞群，以评估NBDS细胞相对于非-NBDS细胞的数量。可视技术包括但不限于：直接显微镜观察、将具有标志物(或缺乏标志物-例如缺乏角蛋白)的细胞染色，以及光/激光分析，以查看不同细胞类型的衍射图样(通常参见，“Laser Scanning Microscopy and Quantitative ImageAnalysis of Neuronal Tissue”Lidia Bakota and Roland Brandt,eds.,Humana Press,2014；也参见，“Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells:Optical andSpectroscopic Techniques”,Conn ed.,Academic Press,2012)。
在其它实施方案中，可以利用细胞特异性标志物(例如对于CD90、CD73和CD49b，NBDS细胞主要为阳性，和/或对于CD34、CD45和KRT14，NBDS细胞主要为阴性(任选地，在培养前或培养后))来评估NBDS细胞相对于污染细胞类型的程度(“Applications of FlowCytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration”，Krishan,Krishnamurthy,and Totey eds.,Wiley-Blackwell,2010)。例如可通过下述方法制备分离的NBDS细胞：a)获得一个或多个有活力的毛囊；b)将细胞从毛囊中释放(例如通过使用酶，或通过在毛囊外培养来增殖细胞)；和c)将细胞进行分选(例如通过流式细胞仪或通过使用磁珠)以获得分离的NBDS细胞群。在本发明的某些实施方案中，任选地，可将处于所述过程中任意阶段的细胞按如上所述进行培养(例如，如上所述可以将细胞培养至少1、2、3、4、5、6、10或20代)，并且可通过例如流式细胞仪或磁珠将得到的细胞进一步分离。
在优选实施方案中，对于上文描述的阳性标志物中的一种或多种，所述分离的NBDS细胞至少70％、80％、90％、95％、98％或100％为阳性，和/或对于上文描述的阴性标志物中的一种，所述分离的NBDS细胞至少80％、90％、95％或98％为阴性。
在本发明的优选实施方案中(并且利用本文所述技术中的任一种)，分离的NBDS细胞的细胞群中，含有少于15％、10％、5％或1％的角质细胞，和/或少于15％、10％、5％或1％的黑色素细胞。然而，在进一步的实施方案中，所述分离的NBDS细胞群来源于含有一些污染细胞类型的真皮细胞群(优选地，来源于毛囊)，例如该细胞群包含至少1、5、10、0.01％、0.1％或1％的角质细胞，和/或至少5、10、0.1％、0.1％的黑色素细胞。
本文使用的“肌腱损伤”应被理解为，指导致或可最终导致充分使用肌腱(以及与肌腱相连的结构，如骨骼和肌肉)有困难的与肌腱相关的众多不同病况。肌腱损伤可包括创伤(例如由于运动损伤、过度使用或者医学或外科干预导致的)、遗传来源的损伤和疾病(其可由上述任一项引起)。代表性肌腱损伤包括但不限于：肌腱病、肌腱变性、肌腱炎、腱鞘炎、腱围炎、具有肌腱变性的腱围炎和肌腱轻微撕裂。可治疗的代表性肌腱包括，例如：a)跟腱(如跟腱中部病、跟腱腱围病、跟腱止点病、跟骨后滑囊炎、表面跟骨滑囊炎)；b)肩部肌腱(如二头肌腱病、肩袖肌腱病)；c)肘部肌腱(如内侧上髁炎或外侧上髁炎或网球肘)；d)手部和腕部(如屈肌/伸肌腱病、屈肌/伸肌腱鞘炎、德奎尔万氏病和掌腱膜挛缩症)；e)发生或未发生轻微撕裂的腿筋和髌腱肌腱病；和f)发生或未发生轻微撕裂的足底筋膜炎。
NBDS制备
如上文指出的，本发明提供分离NBDS细胞的方法。在本发明的一个方面，此种方法包括下述步骤：(a)准备有活力的毛发；和(b)培养所述有活力的毛发以获得NBDS细胞群。关于步骤(a)，可以使用很多方法来获得有活力的毛发，包括例如，外科方法以移出大量毛囊(和皮肤一起)，或者直接从对象拔除一个或多个毛囊。
一旦获得有活力的毛发，可将其在允许并优选促进NBDS细胞生长的条件下培养。在优选实施方案中，该培养在允许成纤维细胞样细胞增殖的条件下进行。在优选实施方案中，用无血清培养基实施所述培养步骤。在多次传代之后(如至少2、3、4、5、10或更多代)，按如上所述分析培养的细胞，以确定是否有足够量的NBDS细胞，以及所述细胞是否与污染细胞充分分离。
在本发明的其它方面，提供包括下述步骤的方法：(a)准备有活力的毛发；(b)将步骤(a)中准备的毛发切割以移出毛囊球部(该部位包含真皮鞘杯和真皮乳头)；(c)分离非球形真皮鞘组织；和(d)培养分离的非球形真皮鞘组织以产生NBDS细胞。
为了准备有活力的(活的)毛发，通常从给定对象(例如，哺乳动物如人、马、猪、猫、狗、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠)中获得样本。所述样本可从多个部位获得(如对人而言，从头皮的枕部区域、胸部或大腿；对马而言，从鬓毛或尾部)。所述样本可通过活体组织检查或其它合适的手段(如通过‘拔除’或解剖)获得。优选地，选择处于发展中的毛发生长期的毛囊，尽管也可使用处于发展中的其它阶段(例如退化期)的毛囊。
一旦从对象中获得样本，就将样本分开以分离毛囊，通常使用显微操纵器和手术刀，尽管也可使用其它的器械如针。在某些实施方案中，可将如图1A所示的分离的毛囊在毛根的球部之上(即，在真皮乳头细胞和真皮鞘杯细胞之上)、皮脂腺管的基部之下进一步切割，以获得分离的真皮鞘(参见图1B)。图1B中描述的结构可被分为至少两个单独的部分，如图1C和1D所示。图1C描述了毛发纤维以及相连的内毛根鞘和主要包含角质细胞的外毛根鞘；图1D是含有NBDS细胞的真皮鞘(偶尔也被称为结缔组织鞘)。
在某些实施方案中，可将真皮鞘(图1D)进一步分离，例如，通过沿一侧长度方向切割，或者通过使用如酶消化(例如，用胶原消化酶如胶原酶、分散酶和亮抑酶肽)的技术。
然后可将含有NBDS细胞的真皮鞘或分离的NBDS细胞在促进细胞增殖的培养基(含有或不含血清)中培养(参见，如图3)。合适的培养基包括，例如添加有纤维母细胞生长因子(FGF)、胎牛/牛血清和抗生素的DMEM/Hams F12。可选地，细胞可在无血清过程中复制，此过程可使用无血清培养基和补充物的不同组合。无血清培养基的实例包括含有血清补充物和/或人体来源的血小板提取物的X-VivoTM和TheraPEAKTM FGM-CDTM。在3-5天后，通常向培养基中加入新鲜的增殖培养基。随后可以每2-4天更换一次培养基。当培养物达到约80％-90％的汇合度时，通过胰蛋白酶消化将细胞从培养瓶中分离，并将其接种于更大的组织培养瓶。重复此步骤若干代(例如2、4或6代)直至获得约5-100百万个细胞。
一旦获得期望数量的细胞，就将细胞洗涤数次、用胰蛋白酶消化，并将细胞在细胞运送培养基(CTM)中重悬，所述CTM包括乳酸林格氏液、10％人血清白蛋白(HAS)和5％二甲亚砜(DMSO)。将细胞计数然后调节以提供终浓度为20百万个细胞/mL，并将其保存于液氮中。
包含NBDS细胞的组合物的制备
如上文所指出的，NBDS细胞(以及分离的NBDS细胞)可与其它组分(如血清、血浆、富含血小板的血浆、白蛋白(如人白蛋白)、纤维蛋白和/或透明质酸)一同包含于组合物中。也可使用其它市售的产品来制备合适的组合物，包括例如：TISSEEL和COSEAL(可从Baxter获得)、TISSUCOL、BERIPLAST、QUIXIL、TACHOSIL和EVICEL。也可使用其它基于聚合物的组合物，包括例如，聚乙二醇、聚乳酸和聚己内酯。在优选实施方案中，可以以能够自由流动和可注射的一部分或两部分(如用将组分混合的双筒注射器)的形式提供所述组合物。
这些组合物也可包含其它成分，包括例如：细胞外基质组分(如葡糖氨基葡聚糖(GAGs)、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白、透明质酸、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)、细胞因子和趋化因子(如转化生长因子-β(TGF-β)和它的亚型、胰岛素样生长因子(IGF)和它的亚型、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、甲状旁腺激素相关蛋白、肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6(IL-6)、基质细胞源性因子-1(SDF-1)、血小板源性生长因子(PDGF)和纤维母细胞生长因子(FGF)和/或各种治疗剂(如止痛剂、抗炎剂和免疫调节剂)。
使用NBDS细胞治疗肌腱损伤的方法
本文也提供治疗或预防肌腱损伤的方法，所述方法包括向对象施用包含NBDS细胞的组合物(包括含有如上所述的分离的NBDS细胞的组合物)的步骤。通常通过注射施用所述细胞，尽管在不同的实施方案中，在一定程度上也可施用外科方法以将细胞直接用于开放性的伤口。合适的注射方法的代表性实例包括标准注射器以及如那些公开于美国专利申请No.12/153,248和PCT公开WO/2013/113121的专业化设备，将这两项专利申请通过引用的方式整体并入本文。
使用本文提供的NBDS细胞(以及分离的NBDS细胞)和方法可治疗和预防众多肌腱损伤。例如，可治疗由事故或损伤导致的肌腱断裂或撕裂、外科手术引起的损害或修复。此外，也可治疗其它的慢性损伤，包括例如肌腱病(如肌腱炎或肌腱变性、腱鞘炎和肌腱撕裂)。
可用本文提供的NBDS细胞(以及分离的NBDS细胞)和组合物治疗众多肌腱。例如，在一个实施方案中，治疗由疾病和/或创伤(例如由药物或外科创伤或其它损伤)引起的肌腱损伤。肌腱可为断裂的，和/或可为全部或部分撕裂(或轻微撕裂)的。肌腱相关损伤的实例包括肌腱病、肌腱变性、肌腱炎、腱鞘炎、腱围炎、具有肌腱变性的腱围炎和肌腱轻微撕裂。可治疗的代表性肌腱的实例包括，例如：a)跟腱(如跟腱中部病、跟腱腱围病、跟腱止点病、跟骨后滑囊炎、表面跟骨滑囊炎)；b)肩部肌腱(如二头肌腱病、肩袖肌腱病)；c)肘部肌腱(如内侧上髁炎或外侧上髁炎或网球肘)；d)手部和腕部(如屈肌/伸肌腱病、屈肌/伸肌腱鞘炎、德奎尔万氏病和掌腱膜挛缩症)；e)发生或未发生轻微撕裂的腿筋和髌腱肌腱病；和f)发生或未发生轻微撕裂的足底筋膜炎。
可用本文提供的NBDS细胞(以及分离的NBDS细胞)和组合物治疗众多物种，包括例如哺乳动物(如人、马、猪、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠)。
下述实施例阐明了本发明，但不应被理解为限制本发明的范围。
实施例1
组织样本
从下述对象获得来自头皮枕部区域的皮肤活体组织。简要地，一旦选择了头皮上合适的区域，就用理发剪剃去毛发，确保留下一些茬。然后将活体组织检查区域充分消毒并进行麻醉。一旦麻醉发挥作用，将4-10mm深的穿孔活体组织从活体组织检查部位轻轻地移出，并且用手术缝合线缝合切口，缝合线可在12-14天后去除。然后在无菌条件将皮肤活体组织下放入预先标记的含有活体组织运送培养基的活体组织管中，所述培养基包括含有抗生素的DMEM/Hams F12。
实施例2
NBDS细胞的分离和培养
将转移有活体组织的培养基进行无菌测试，以确保样本未被污染，或者可选地，如果样本被污染，确保随后使用含有抗生素的培养基。然后将活体组织洗涤数次，以去除活体组织运送培养基和任何碎片，从而制备用于后续处理的组织。在Hams F10中，通过用无菌手术刀切除皮肤上皮以及用无菌镊子从周围的真皮组织“拔出”或解剖全部毛囊单元来处理毛囊。用镊子离皮肤表面尽可能近地夹住毛囊，并且通过拉拽位于毛囊单位中的毛发将毛囊暴露。选择处于毛发生长期(毛发周期的生长阶段，以可见的外根鞘和毛球的DSC为指示)的毛囊进行进一步的处理。
在Hams F10中，通过首先使用充分无菌的迷你手术刀或针将毛囊真皮鞘杯细胞和乳头与毛囊其余部分分离，并将其丢弃。移出含有NBDS细胞的真皮鞘，准备所述组织用于培养。
将6-10个真皮鞘组织轻轻地置于3％透明质酸凝胶中，并用细胞促增殖培养基(如添加有FGF、10％FCS和抗生素的DMEM/Hams F12)将其覆盖。在3-5天后，向培养物中加入新鲜的增殖培养基。随后每2-4天更换培养基。当培养物达到约80％-90％的汇合度时，通过胰蛋白酶消化将细胞与培养瓶分离，并且将其接种于更大的组织培养瓶。重复这一步骤四代以获得约100百万个细胞。
一旦获得约100百万个细胞，将细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化，并在细胞运送培养基(CTM：含有10％人血清白蛋白和5％二甲亚砜的乳酸林格氏液)中重悬。通过离心使细胞沉淀，并将细胞汇集到一起。抽取上清，并将细胞沉淀重悬于CTM中。从细胞-CTM混合液中移出两个细胞样本/等份用于质量控制和细胞计数。在对细胞进行计数之后，通过离心使其再次沉淀，将产生的沉淀重悬于CTM中以使终浓度为20百万个细胞/mL。将最终的细胞样品在液氮中以低于-130℃的温度保存直至装运(shipment)。
实施例3
制备NBDS细胞并将其施用于肌腱
准备细胞用于双筒注射器。第一筒包含重悬于1mL总体积中的约20百万个细胞。第二筒包含来自患者的1.5mL自体血浆(在该步骤之前单独制备)。
使用双筒注射器向需修复的肌腱的多处位置注射细胞(在超声波引导下)。
实施例4
在肌腱拉伸研究中I型胶原的合成
简要地，通过将1.5mL冻存的NBDS细胞(总共3百万个细胞)与0.15mL CaCl2(500mM储液)混合复苏细胞。加入1.5mL血浆，并将悬液转移至椭圆形铸模。在约1小时后将形成可从模具中移出的凝胶。然后将环形物置于能够随时间拉伸模制环形结构的机器中。可测量随时间施加的拉伸力。
也可移出模制环形物，将其固定于多聚甲醛中，并且将其中存在的一种或多种蛋白(例如，I型胶原、III型胶原、二聚糖、腱生蛋白C、弹性蛋白、腱调蛋白(Tenomoduline)和饰胶蛋白聚糖(Decorine))进行免疫组化染色。
如图4所示，在5天(图4A)和12天(图4B)后，将NBDS/血浆凝胶混合物轻微拉伸。针对I型胶原的产生将样本进行免疫染色(使用辣根过氧化物酶)。图4B明显暗于(棕色)图4A，针对胶原产生显示细胞为阳性，机械拉伸之后胶原产生有所增加。这些研究的结果清楚地证明，在体外，NBDS细胞能够产生胶原并形成肌腱样结构。具体地，在模制凝胶中的细胞可根据拉伸的方向来定向(如同在正常肌腱中的细胞)。
可将上文描述的各种实施方案组合，以提供进一步的实施方案。将本说明书涉及的和/或在申请数据表中列出的全部美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用的方式整体并入本文。如果需要应用不同专利、申请和出版物中的理念以提供进一步的实施方案，可将所述实施方案的方面进行修改。
根据以上详细描述，可对所述实施方案作出这些或其它修改。通常，在所附权利要求中，使用的术语不应被理解为将权利要求限于本说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应被理解为包括所有可能的实施方案以及所享有的权利要求等效物的全部范围。因此，所述权利要求并不局限于本公开的内容。
Claims (29)
1.分离的非球形真皮鞘(NBDS)细胞群在制备用于治疗或预防对象的肌腱损伤的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述分离的NBDS细胞群对于CD90、CD73和CD49b中的一种或多种主要为阳性，和/或对于CD34、CD45和KRT14中的一种或多种主要为阴性。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述分离的NBDS细胞群包含超过70％、80％、90％、95％、98％或100％的NBDS细胞。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述分离的NBDS细胞群包含少于15％、10％、5％或1％的角质细胞，和/或少于15％、10％、5％或1％的黑色素细胞。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中所述分离的NBDS细胞对于CD90、CD73和CD49b中的一种或多种至少70％、80％、90％、95％、98％或100％为阳性。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中所述分离的NBDS细胞对于CD34、CD45和KRT14中的一种至少80％、90％、95％或98％为阴性。
7.如权利要求1或2所述的用途，所述分离的NBDS细胞群根据包括以下步骤的方法制备：
(a)准备有活力的毛发；和
(b)培养所述有活力的毛发以获得所述分离的非球形真皮鞘细胞群。
8.如权利要求7所述的用途，其中通过下述方法获得所述有活力的毛发：外科方法以连同皮肤一起移出大量毛囊，或者直接从对象拔除一个或多个毛囊。
9.如权利要求7所述的用途，其中在允许成纤维细胞样细胞增殖的条件下进行所述(b)的培养。
10.如权利要求7所述的用途，其中用无血清培养基进行所述(b)的培养。
11.如权利要求1或2所述的用途，其中所述对象为选自以下的哺乳动物：人、马、猪、猫、狗、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠。
12.如权利要求1或2所述的用途，其中所述肌腱损伤为肌腱断裂，肌腱完全、部分或轻微撕裂。
13.如权利要求1或2所述的用途，其中所述肌腱损伤选自：肌腱变性、腱鞘炎和撕裂。
14.如权利要求1或2所述的用途，其中所述肌腱为跟腱或髌腱。
15.如权利要求1或2所述的用途，其中所述肌腱为屈肌腱。
16.如权利要求1或2所述的用途，其中所述肌腱为伸肌腱。
17.包含分离的非球形真皮鞘(NBDS)细胞群的组合物在制备用于治疗或预防对象的肌腱损伤的药物中的用途，其中所述分离的NBDS细胞纯度为至少95％。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述组合物还包含血清和/或血浆。
19.如权利要求17所述的用途，其中所述组合物不含有血清或血浆。
20.如权利要求17所述的用途，其中所述组合物还包含纤维蛋白、透明质酸、细胞外基质组分、细胞因子、趋化因子和治疗剂。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述细胞外基质组分选自：葡糖氨基葡聚糖(GAG)、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白、透明质酸、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。
22.如权利要求20所述的用途，其中所述细胞因子选自：转化生长因子β(TGF-β)和它的亚型、胰岛素样生长因子(IGF)和它的亚型、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、甲状旁腺激素相关蛋白、肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6(IL-6)、基质细胞源性因子-1(SDF-1)、血小板源性生长因子(PDGF)和纤维母细胞生长因子(FGF)。
23.如权利要求20所述的用途，其中所述治疗剂选自：止痛剂、抗炎剂和免疫调节剂。
24.如权利要求17所述的用途，其中所述对象为选自以下的哺乳动物：人、马、猪、猫、狗、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠。
25.如权利要求17所述的用途，其中所述肌腱损伤为肌腱断裂，肌腱完全、部分或轻微撕裂。
26.如权利要求17所述的用途，其中所述肌腱损伤选自：肌腱变性、腱鞘炎和撕裂。
27.如权利要求17所述的用途，其中所述肌腱为跟腱或髌腱。
28.如权利要求17所述的用途，其中所述肌腱为屈肌腱。
29.如权利要求17所述的用途，其中所述肌腱为伸肌腱。
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