CN1709523A - 含毛囊人工皮肤的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种含毛囊人工皮肤的制备方法，通过以下步骤实现：分离鼠触须毛囊，加入分离酶消化，离心，得毛囊上皮细胞；取去除毛干的鼠触须毛囊用胶原酶D消化，离心，用DMEM培养基进行真皮鞘细胞培养和进行毛乳头细胞培养；将传代培养的细胞分别与毛囊上皮细胞按5－1∶1－5比例进行混合，移植到胶原/壳聚糖多孔支架上，加入DMEM培养基培养即得。本发明方法解决了大面积烧创伤中皮肤来源困难的难题。用发明制备的人工皮肤含有毛囊，具有一定的皮肤生理功能，具有一定的抗菌活性、不易收缩、可吸收的特点；为临床上大面积烧创伤患者提供创面覆盖的医用材料，促进创面的正常化愈合；本发明方法设计合理、操作方便，容易规模化生产。

Description

含毛囊人工皮肤的制备方法
技术领域
本发明属生物医学，涉及人工皮肤的制备方法，尤其涉及含毛囊人工皮肤的制备方法。
背景技术
最近国内外已成功地研制出含有真皮和表皮的人工皮肤，但这些人工皮肤尚没有其他细胞成份，如无皮脂腺腺体细胞，皮脂腺分泌的产物称皮脂，有润滑皮肤的作用，在皮肤表面形成脂膜，形成皮肤屏障(skin barrier)的一部分。脂膜中的游离脂肪酸对某些病原微生物的生长起抑制作用；毛囊周围真皮组织中的成纤维细胞能产生天然抗生素，有抗菌防御能力。毛囊中的外毛根鞘相当于表皮的棘层和基底层细胞，具有表皮修复能力，这些细胞还存在有多种细胞因子受体，又能分泌重要的细胞因子，成为皮肤细胞信息交换的重要场所。
因此，如果在人工皮肤中具有上述细胞成分，人工皮肤就会在功能上较为完善。由于毛囊在皮肤中的重要作用，研制出一种具有一定生理功能的含毛囊的人工皮肤对研究创面的正常化愈合具有重要的理论意义和应用前景。
目前临床上适用于大面积创面覆盖的人工皮肤主要是以胶原等天然材料为支架的人工皮肤，该类人工皮肤具有培养面积小、产量低、易收缩和移植成功率低等缺点；或是以合成材料为支架的，虽易生产，但易于感染，移植成功率低，没有表皮层，不利于细胞生长；人工皮肤的研究重点集中在基质的改善和抗感染能力方面，对人工皮肤中的细胞成份研究较少，虽然近年来国内外已成功地研制出含真皮和表皮的人工皮肤，并具有一定的抗感染能力，但是迄今为止尚未见到含毛囊人工皮肤的报道。
毛囊是细胞生物学和皮肤病学等学科的研究热点，它涉及毛囊真表皮间相互作用、信号传导、生长因子和细胞因子的作用、毛囊生长周期的调控、毛发的色素、毛发的定型、毛囊干细胞的定位及其生物学功能等多个方面，现在已初步阐明毛囊干细胞定位于毛囊外根鞘的立毛肌附着处。如何利用皮肤毛囊干细胞在人工皮肤中发挥重要的生理功能已成为发展趋势。
毛囊的功能：毛囊是皮肤的主要辅助器官，它具有重要的生理功能：如皮肤的屏障作用，抗菌作用，抑制疤痕形成作用；同时毛囊是表皮-毛囊-皮脂腺单位干细胞的所在部位，在适当的环境因素刺激下毛囊干细胞可定向分化为表皮、毛囊和皮脂腺组织，这些组织细胞及其细胞因子对创面的正常化愈合具有不可替代的作用。
由于上述毛囊组织在皮肤中的重要作用，研制出一种具有一定生理功能的含毛囊的人工皮肤对研究创面的正常化愈合具有重要的理论意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供含毛囊人工皮肤的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)毛囊上皮细胞制备：分离鼠触须毛囊(C57小鼠)，加入0.5％的分离酶(dispase，Sigma公司)，4℃，消化16～18小时，将毛囊移入D-Hanks液中，离心去除分离酶，从毛囊中挤出毛干，用0.125％胰蛋白酶加0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)消化即成毛囊上皮细胞，5％新生牛血清D-Hanks液中止消化，吹散细胞，过筛，计数，离心。
(2)毛囊毛乳头细胞培养：将去除毛干的鼠触须毛囊用0.3％的胶原酶D，37℃，消化4～6小时，待包绕毛囊的真皮鞘消化成单细胞而其内的毛乳头尚未开始消化时，中止消化，D-Hanks液洗，离心去除胶原酶D三次，300rpm低速离心5分钟，收上清用DMEM培养基(Dulbecco`s低限量基础培养基)，37℃，5％CO2中进行真皮鞘细胞培养，吸沉淀过200目的筛网，倒冲筛网，用DMEM培养基，37℃，5％CO2中进行毛乳头细胞培养。
(3)含毛囊人工皮肤的制备：将传代培养的毛乳头细胞(＜6代)与毛囊上皮细胞按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例的进行细胞混合，分别注射到胶原/壳聚糖多孔支架上(见专利号：ZL02112498.1记载)，传代培养细胞的浓度分别为2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106/ml。每一含毛囊细胞的胶原/壳聚糖多孔支架置入24孔培养板中，每孔加入1mL DMEM培养基[由含表皮生长因子(EGF)10ng/mL、氢化考的松0.4μg/mL、胰岛素5μg/mL]，每2天换液1次。浸没培养2周后再行气液界面培养，培养8周后做苏木素伊红(H.E.)染色。
本发明具有以下特点：(1)首次在胶原/壳聚糖多孔支架上(见专利号：ZL02112498.1)制备含毛囊人工皮肤；(2)该人工皮肤含有毛囊，使其具有一定的皮肤生理功能；(3)该人工皮肤具有一定的抗菌活性；(4)该人工皮肤具有不易收缩、可吸收特点；(5)该人工皮肤可作为临床上大面积烧创伤患者的创面覆盖的医用材料，促进创面的正常化愈合；(6)本发明方法解决了大面积烧创伤中皮肤来源困难的难题；(7)制备方法设计合理、操作方便，容易规模化生产。
附图说明
图1为制备人工皮肤用的支架。
图2为共聚焦显微镜观察可见成团细胞，从中有毛干长出。
图3为真皮鞘细胞培养8周后未见毛囊样结构，可见巨大角囊肿。
具体实施方式
实施例1
(1)在解剖显微镜下用显微外科剪和显微外科摄分离鼠触须毛囊若干(＞100个)，加入0.5％的分离酶，4℃，消化16～18小时，将毛囊移入D-Hanks液中，离心去除分离酶。从毛囊中挤出毛干，用0.125％胰蛋白酶加0.02％EDTA消化即成毛囊上皮细胞，5％新生牛血清D-Hanks液中止消化，吹散细胞，过筛，计数，离心。
(2)去除毛干的鼠触须毛囊用0.3％的胶原酶D，37℃，消化4～6小时，待包绕毛囊的真皮鞘消化成单细胞而其内的毛乳头尚未开始消化时，中止消化，D-Hanks液洗，离心去除胶原酶D三次，低速(300rpm)离心5分钟，收上清用DMEM培养基，37℃，5％CO2中进行真皮鞘细胞培养。吸沉淀过200目的筛网，倒冲筛网，用DMEM培养基，37℃，5％CO2中进行毛乳头细胞培养。
(3)将传代培养的毛乳头细胞(＜6代)与毛囊上皮细胞分别按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5的比例进行细胞混合，注射(移植)到胶原/壳聚糖多孔支架上(见图1)，移植用的传代培养细胞的浓度为2.5×104/ml，每一含毛囊细胞的胶原/壳聚糖多孔支架置入24孔培养板中，每孔加入DMEM培养基(含EGF10ng/mL、氢化考的松0.4μg/mL、胰岛素5μg/mL)1mL培养，每2天换液1次，浸没培养2周后再行气液界面培养，培养8周后做H.E.染色，偶见毛囊样结构形成，参见图2。
实施例2
制备方法参照实施例1，将传代培养的毛乳头细胞(＜6代)与毛囊上皮细胞分别按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例进行细胞混合，注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，移植细胞的浓度为5×104/ml。培养8周后可见少量毛囊样结构形成。
实施例3
制备方法参照实施例1，将传代培养的毛乳头细胞(＜6代)与毛囊上皮细胞分别按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例进行细胞混合，注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，移植细胞的浓度为1×105/ml。培养8周后可见少量毛囊样结构形成。
实施例4
制备方法参照实施例1，将传代培养的毛乳头细胞(＜6代)与毛囊上皮细胞分别按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例进行细胞混合，注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，移植细胞的浓度为2.5×105/ml。培养8周后可见少量毛囊样结构形成。
实施例5
制备方法参照实施例1，将传代培养的毛乳头细胞(＜6代)与毛囊上皮细胞分别按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例进行细胞混合，注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，移植细胞的浓度为5×105/ml。培养8周后可见少量毛囊样结构形成。
实施例6
制备方法参照实施例1，将传代培养的毛乳头细胞(＜6代)与毛囊上皮细胞分别按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例进行细胞混合，注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，移植细胞的浓度为1×106/ml。培养8周后可见毛囊样结构形成。
实施例7
制备方法参照实施例1，将传代培养的真皮鞘细胞(＜6代)与毛囊上皮细胞分别按5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5比例进行细胞混合，注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，各种移植细胞浓度，培养8周后未见毛囊样结构，部分偶见角囊肿形成，参见图3。

Claims (7)

1.含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：
(1)毛囊上皮细胞制备：分离鼠触须毛囊，加入0.5％的分离酶，4℃，消化16～18小时，将毛囊移入D-Hanks液中，离心，从毛囊中挤出毛干，用0.125％胰蛋白酶加0.02％EDTA消化即成毛囊上皮细胞，5％新生牛血清D-Hanks液中止消化，吹散细胞，过筛，计数，离心；
(2)毛乳头细胞培养：将去除毛干的鼠触须毛囊用0.3％的胶原酶D，37℃，消化4-6小时，D-Hanks液洗，离心，300rpm低速离心5分钟，吸沉淀过筛网，用DMEM培养基，37℃，5％CO2中进行毛乳头细胞培养；
(3)含毛囊人工皮肤：将传代培养的毛乳头细胞与毛囊上皮细胞按5-1∶1-5比例的进行细胞混合，注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，每一含毛囊细胞的胶原/壳聚糖多孔支架置入24孔培养板中，每孔加入DMEM培养基1mL培养，浸没培养2周后再行气液界面培养，培养8周后做苏木素伊红染色。
2.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征是：步骤(2)毛乳头细胞培养，吸取沉淀过200目的筛网，倒冲筛网。
3.根据权利要求1或2所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征是：步骤(3)中选用＜6代的毛乳头细胞。
4.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征是：步骤(3)中传代培养的毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合比例选用5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶5中任一种。
5.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征是：步骤(3)中传代培养细胞的浓度选用2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106/ml中任一种。
6.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征是：步骤(3)中DMEM培养基由10ng/mL表皮生长因子、0.4μg/mL氢化考的松、5μg/mL胰岛素组成。
7.根据权利要求1-6任一所述的含毛囊人工皮肤的制备方法制备的人工皮肤，其特征是：在临床上大面积烧创伤患者的创面覆盖的医用材料中应用。
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