CN106390205A - 一种3d打印人工皮肤及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及3D打印人工皮肤，自上而下依次包括含角质细胞的水凝胶层、编织层、含毛囊细胞的水凝胶层和编织层；编织层由高分子可降解材料编织而成，含有孔隙；含角质细胞的水凝胶层和含毛囊细胞的水凝胶层中均含有表皮生长因子和纳米银。本发明的有益效果是:1)所用材料为高分子可降解材料，易于获得、生物相容性好，通过编织获得的编织层孔隙较多，利于营养物质的运输和交换；2)多层结构增加了人工皮肤的耐磨性、韧性和机械强度等物理特性；3)常压等离子体射流处理增加了编织层表面积，有利于水凝胶和皮肤附属器细胞的粘附；4)人工皮肤制作完毕即初步具有正常皮肤结构，便于皮肤功能的恢复。

Description

一种3D打印人工皮肤及制备方法
技术领域
本发明属于组织工程生物医用材料领域，尤其涉及3D打印人工皮肤及制备方法。
背景技术
皮肤作为人体面积最大的器官，是人体与外界环境的天然屏障，具有保护、调节、排泄等作用。当炎症、溃疡、外伤、烧伤、手术等原因造成皮肤的缺损和异常时，轻则影响患者的外表美观，重则引发感染或电解质和水分的大量流失，导致患者的死亡。尤其对于治疗大面积皮肤缺损，关键在于尽早封闭创面、减少机体的消耗和内环境的紊乱、防止有害物质的入侵、促进创面皮肤的再生。目前医学上对于皮肤的缺损，多采用自体皮肤移植的方法，这不仅造成供皮区新的创伤缺陷，而且经常受到供皮来源的限制。
为了弥补皮肤缺损对机体带来的伤害，修复、替代缺损的皮肤组织，各国科学家都致力于人工皮肤的研究。既往很多解决方案或者产品，是通过对异体或异种皮肤加工处理而得到的，存在着加工成本高、免疫排斥等问题。随着工程学技术的发展，工程化人工皮肤已成为皮肤缺损治疗的热点，但至今没有真正理想的皮肤替代物得以应用。
现有技术中也有用不同的材料制成的合成人工膜作为人工皮肤。但诸如透明质酸钠、壳聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素一类的水凝胶，存在制成的人工皮肤强度不够，透气性差的问题，而且随着用量增加，有抑制成纤维细胞生长的作用。而聚氨酯、硅橡胶、聚乙二醇、对苯二甲酸乙二醇酯等医用高分子材料，虽然解决了人工皮肤的强度问题，但是亲水性不高，往往降解缓慢、存留时间较久甚至不降解，造成异物残留，引起无菌性炎症，影响自身细胞在创面的定植和生长，而且由于这些材料不能参与进行生理代谢，往往只能用做外层敷料。
理想的人工皮肤需要足够柔软、舒适、既透气又透水，能够与创面有良好的贴合，同时又需要有一定的延展性、韧性和机械强度，即使是用来修复关节附近的皮肤缺损时，也能适应关节活动引起的局部皮肤张力升高而不至于形成新的创口，此外还应具有良好的材料-细胞界面，以利于细胞的定植、生长。但还应考虑到合成材料制备由于没有表皮层、毛囊等主要皮肤辅助器官往往无法再生，若完全依靠创面附近的细胞增殖后移行定植到材料表面，需要耗费的时间较久，不利于创面的修复。且这些皮肤附属器具有重要的生理功能：如形成角质层、分泌皮脂、润滑作用，分泌汗液、调整内环境作用等，还涉及信号传导、响应生长因子和细胞因子的作用等方面。仅依靠形态的修复无法满足恢复再生皮肤的生理功能需求。
已有研究发现毛囊是表皮-毛囊-皮脂腺单位干细胞的所在部位，毛囊干细胞定位于毛囊外根鞘的立毛肌附着处。在适当的环境因素刺激下毛囊干细胞可定向分化为表皮、毛囊和皮脂腺组织，这些组织细胞及其细胞因子对创面的正常化愈合具有不可替代的作用。因此，要构建功能性的人工皮肤，必须重视皮肤附属器的构建，从而缩短创面修复时间，恢复皮肤功能，使人工皮肤具有初步的生理功能已成为发展趋势。
故而设计一种工艺简单，易于量产，容易保存，生物相容性好，应用便捷，价格低廉的人工皮肤，对于快速、高效修复创面，减少创面缺损对人们带来的不便和危害具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种易于量产，容易保存，生物相容性好的3D打印人工皮肤及制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:这种3D打印人工皮肤，自上而下依次包括含角质细胞的水凝胶层、编织层、含毛囊细胞的水凝胶层和编织层；编织层由高分子可降解材料编织而成，含有孔隙；含角质细胞的水凝胶层和含毛囊细胞的水凝胶层中均含有表皮生长因子和纳米银。
这种3D打印人工皮肤的制备方法，包括如下步骤：
将高分子可降解编织线按照编织工艺编织成具有一定孔隙率和厚度的编织层；
1)用常压等离子态氦气对编织层表面进行处理；
2)将细胞生长因子和纳米银离子与水凝胶一起配置成水凝胶溶液；
3)将角质细胞和毛囊细胞分别与水凝胶溶液混合形成具有一定细胞浓度的混悬液
4)采用连续打印方法将含有角质细胞的水凝胶悬液打印在一张编织层表面；
5)采用点阵打印方法将含有毛囊细胞的水凝胶悬液打印在另一张编织层表面；
6)将打印完毕的角质细胞的编织层重叠在打印了毛囊细胞的编织层上面，然后进行固化，冻干处理。
作为优选：步骤1)中，高分子可降解编织线采用聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的一种或几种材料，编织工艺科采用赫格利斯编织或二维三轴向编织，编织层厚度为50-500μm，得到的编织层孔隙率为15％-35％。
作为优选：步骤2)中，所用常压等离子态氦气的气体温度为90-110℃，流量为4-12L/min，处理时长为3-10min。
作为优选：步骤3)中，水凝胶材料选用透明质酸钠、壳聚糖或硫酸软骨素中的一种，水凝胶和去离子水的摩尔比为1:20～1:50。
作为优选：步骤3)中，所选细胞生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子，细胞生长因子、纳米银离子和水凝胶材料的摩尔比为10:1:5000～5:1:1000。
作为优选：步骤4)中，角质细胞和毛囊细胞的来源为毛囊干细胞、经诱导分化的间充质干细胞或基因修饰的间充质干细胞，角质细胞的来源为经诱导分化的间充质干细胞或基因修饰的间充质干细胞，角质细胞和毛囊细胞在水凝胶中的浓度范围均为2×104～5×106cells/mL。
作为优选：步骤5)中，打印角质细胞时，喷嘴喷速为10-50μL/s，喷嘴在编织层表面的移动速度为0.5-2.5mm/s。
作为优选：步骤6)中，打印毛囊细胞时，喷嘴喷速为5-25μL/s，喷嘴在编织层表面的移动速度为1-5mm/s，其每个打印点之间的距离为2-5mm。
作为优选：步骤7)中，固化、冻干处理的条件为在4-6℃环境下，固化1-2h，真空冷冻干燥6-8h。
本发明的有益效果是:1)所用材料为高分子可降解材料，易于获得、生物相容性好，通过编织获得的编织层孔隙较多，利于营养物质的运输和交换；2)多层结构增加了人工皮肤的耐磨性、韧性和机械强度等物理特性；3)常压等离子体射流处理增加了编织层表面积，有利于水凝胶和皮肤附属器细胞的粘附；4)人工皮肤制作完毕即初步具有正常皮肤结构，便于皮肤功能的恢复；5)表皮生长因子有利于皮肤附属器细胞的定植和分化，银离子使得人工皮肤具有良好的抗菌性能，延长人工皮肤保存期；6)本发明的制备方法步骤简单，质控方便，易于工业化制备。
附图说明
图1为3D打印人工皮肤含角质细胞的水凝胶层-编织层的侧面观示意图；
图2为3D打印人工皮肤含毛囊细胞的水凝胶层-编织层的侧面观示意图；
图3为3D打印人工皮肤修复裸鼠背部皮肤4周后的病理切片，放大100倍；
图4为正常裸鼠背部皮肤病理切片，放大100倍；
附图标记说明：编织层1、含角质细胞的水凝胶层2、含毛囊细胞的水凝胶层3。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
实施例1
1)编织层的制备：取PLA编织线，采用赫格利斯编织工艺进行编织，得到厚度200μm的编织层，孔隙率为25％；
2)常压等离子体处理:所用气体温度为90℃，流量为4L/min，处理时长为4min；
3)配置水凝胶溶液:取透明质酸钠与去离子水按照1:50的摩尔比例配置成水凝胶溶液，再将表皮生长因子、纳米银离子和水凝胶溶液按照10:1:3000的摩尔比例均匀混合；
4)制备细胞悬液：将角质细胞、毛囊细胞分别按照2×104/mL的浓度悬于水凝胶溶液；
5)角质细胞打印：无菌条件下将角质细胞水凝胶溶液进行连续3D打印，喷嘴喷速为10μL/s，移动速度为0.5mm/s；
6)毛囊细胞打印：无菌条件下将毛囊细胞水凝胶溶液进行点阵3D打印，喷嘴喷速为5μL/s，移动速度为1mm/s，每个打印点之间的距离为20μm；
7)将打印了角质细胞的编织层覆盖在打印了毛囊细胞的编织层上面，并在6℃下固化2h，真空冷冻干燥8h。
实施例2
1)编织层的制备：取PGA编织线，采用赫格利斯编织工艺进行编织，得到厚度100μm的编织层，孔隙率为35％；
2)常压等离子体处理:所用气体温度为100℃，流量为6L/min，处理时长为6min；
3)配置水凝胶溶液:取透明质酸钠与去离子水按照1:30的摩尔比例配置成水凝胶溶液，再将成纤维细胞生长因子、纳米银离子和水凝胶材料按照10:1:4000的摩尔比例均匀混合；
4)制备细胞悬液：将角质细胞、毛囊细胞分别按照1×105/mL的浓度悬于水凝胶溶液；
5)角质细胞打印：无菌条件下将角质细胞水凝胶溶液进行连续3D打印，喷嘴喷速为20μL/s，移动速度为1mm/s；
6)毛囊细胞打印：无菌条件下将毛囊细胞水凝胶溶液进行点阵3D打印，喷嘴喷速为10μL/s，移动速度为2mm/s，每个打印点之间的距离为30μm；
7)将打印了角质细胞的编织层覆盖在打印了毛囊细胞的编织层上面，并在4℃下固化2h，真空冷冻干燥7h。
实施例3
1)编织层的制备:取PLGA编织线采用二维三轴向编织工艺进行编织，得到厚度150μm的编织层，孔隙率为20％；
2)常压等离子体处理:所用气体温度为100℃，流量为8L/min，处理时长为8min；
3)配置水凝胶溶液:取透明质酸钠与去离子水按照1:40的摩尔比例配置成水凝胶溶液，再将血管内皮细胞生长因子、纳米银离子和水凝胶材料按照10:1:5000的摩尔比例均匀混合；
4)制备细胞悬液：将角质细胞、毛囊细胞分别按照2.5×106/mL的浓度悬于水凝胶溶液；
5)角质细胞打印：无菌条件下将角质细胞水凝胶溶液进行连续3D打印，喷嘴喷速为40μL/s，移动速度为1.5mm/s；
6)毛囊细胞打印：无菌条件下将毛囊细胞水凝胶溶液进行点阵3D打印，喷嘴喷速为20μL/s，移动速度为3mm/s，每个打印点之间的距离为40μm；
7)将打印了角质细胞的编织层覆盖在打印了毛囊细胞的编织层上面，并在4℃下固化1h，真空冷冻干燥6h。
人工皮肤性能测试如下：
1.实施例1-3制备的人工皮肤的机械强度比较
表1三组人工皮肤的机械强度比较结果(n＝8，)
样本 厚度(μm) 拉伸强度(Mpa) 断裂伸长率(％)
1 403±1.6 1.21±0.13 411±9.5
2 201±0.5 0.96±0.08 294±4.7
3 300±0.9 1.08±0.25 356±6.9
机械强度测试结果提示人工皮肤的拉伸强度和断裂伸长率与人工皮肤的厚度呈正相关。
2.用3D打印人工皮肤修复裸鼠背部皮肤4周后与正常裸鼠背部皮肤病理切片比较。如图3至图4所示。可见3D打印人工皮肤已形成薄层角质层，并可在表皮层下观察到毛囊结构(黑箭头)，初步具备正常人皮肤的基本结构。

Claims (10)

1.一种3D打印人工皮肤，其特征在于：自上而下依次包括含角质细胞的水凝胶层(2)、编织层(1)、含毛囊细胞的水凝胶层(3)和编织层(1)；编织层(1)由高分子可降解材料编织而成，含有孔隙；含角质细胞的水凝胶层(2)和含毛囊细胞的水凝胶层(3)中均含有表皮生长因子和纳米银。
2.一种如权利要求1所述的3D打印人工皮肤的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将高分子可降解编织线按照编织工艺编织成具有一定孔隙率和厚度的编织层(1)；
2)用常压等离子态氦气对编织层(1)表面进行处理；
3)将细胞生长因子和纳米银离子与水凝胶一起配置成水凝胶溶液；
4)将角质细胞和毛囊细胞分别与水凝胶溶液混合形成具有一定细胞浓度的混悬液
5)采用连续打印方法将含有角质细胞的水凝胶悬液打印在一张编织层(1)表面；
6)采用点阵打印方法将含有毛囊细胞的水凝胶悬液打印在另一张编织层(1)表面；
7)将打印完毕的角质细胞的编织层(1)重叠在打印了毛囊细胞的编织层(1)上面，然后进行固化，冻干处理。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，高分子可降解编织线采用聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的一种或几种材料，编织工艺科采用赫格利斯编织或二维三轴向编织，编织层厚度为50-500μm，得到的编织层孔隙率为15％-35％。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所用常压等离子态氦气的气体温度为90-110℃，流量为4-12L/min，处理时长为3-10min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，水凝胶材料选用透明质酸钠、壳聚糖或硫酸软骨素中的一种，水凝胶和去离子水的摩尔比为1:20～1:50。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所选细胞生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子，细胞生长因子、纳米银离子和水凝胶材料的摩尔比为10:1:5000～5:1:1000。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中，角质细胞和毛囊细胞的来源为毛囊干细胞、经诱导分化的间充质干细胞或基因修饰的间充质干细胞，角质细胞的来源为经诱导分化的间充质干细胞或基因修饰的间充质干细胞，角质细胞和毛囊细胞在水凝胶中的浓度范围均为2×104～5×106cells/mL。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤5)中，打印角质细胞时，喷嘴喷速为10-50μL/s，喷嘴在编织层(1)表面的移动速度为0.5-2.5mm/s。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤6)中，打印毛囊细胞时，喷嘴喷速为5-25μL/s，喷嘴在编织层(1)表面的移动速度为1-5mm/s，其每个打印点之间的距离为2-5mm。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤7)中，固化、冻干处理的条件为，在4-6℃环境下，固化1-2h，真空冷冻干燥6-8h。
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