CN1468634A - 双层人工皮肤及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双层的人工皮肤移植物，它包括：(a)真皮层，所述的真皮层含有聚羟基乙酸等生物可降解材料、成纤维细胞和基质蛋白；(b)位于真皮层一个主表面之上的表皮层。在本发明的人工皮肤中，有连续的表皮细胞生长在成纤维细胞－PGA复合物表面，且表皮细胞分化良好，有较明显的分层。切片显示组织工程人工皮肤具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征。本发明还提供了该人工皮肤的制备方法和用途。

Description

双层人工皮肤及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及以聚羟基乙酸为支架构建的双层人工皮肤，及其制备方法和用途。

发明背景

皮肤被覆于人体全身表面，与外界环境直接接触，是解剖学和生理学上的重要边界器官。皮肤约占成人体重的16％，面积约1.2-2.2m²。皮肤由表皮和真皮组成，借皮下组织与深部的深筋膜、腱膜或骨膜相连。皮肤起源于外胚层和中胚层，结构较复杂并高度特化，有重要的屏障作用和保护作用，可防止外界的刺激损伤体内的组织，能阻挡异物和微生物侵入，并可阻止体液外渗和对外界物质的吸收。

皮肤作为人体最大的器官，是与外界环境接触的屏障。当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，其危害可以极轻微，也可以是致命的。

皮肤缺损修复的历史可以追溯到数百年前。目前常用修复途径有：自体植皮、同种异体植皮、异种植皮，但由于供区不足、免疫排斥及传播疾病等缺点，寻找一种理想的皮肤替代物一直是临床上一个亟需解决的难题(Naughton GK.Skin and Epithelia.In Lanza RP，Langer R，Chick WL.Principles of Tissue Engineering.R.G.Landes Company and AcademicPress，Inc.，1997，769.)。

组织工程学是应用工程学和生命科学的原理与方法，构建生物性替代物，以恢复、维持或增进受损器官或组织功能的一门科学(Nerem RM.Tissueengineering in the USA.Med Biol Eng Comput，1992，30(4)：CE8)。“组织工程”的提出为人工构建一种皮肤替代物提供了崭新且富有挑战性的途径。

Dermagraft^是由Advanced Tissue Sciences公司生产的一种人工真皮。将从新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于生物可降解的合成材料聚羟基乙酸(PGA)网架上，14-17天后，成纤维细胞大量增殖并分泌胶原、纤维连接蛋白、蛋白多糖、生长因子等，形成由成纤维细胞、细胞外基质和可降解生物材料构成的人工真皮。Dermagraft主要用于烧伤创面及慢性溃疡创面的修复(Eaglstein WH，Falanga V.Tissue engineering for skin：An update.JAm Acad Dermatol，1998，39(6)：1007)。然而，Dermagraft^是只具有人工真皮层的单层组织工程皮肤，移植于创面后仍需一期或二期移植自体断层皮片。理想的组织工程化皮肤应包含表皮与真皮两层，因为表皮与真皮无论在解剖上还是在功能上都是相互依存的整体。

Apligraft^(又称作Graftskin)是第一种商品化的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，这种由Organogenesis公司注册生产的产品已在加拿大和美国获准用于临床治疗静脉性溃疡及糖尿病足部溃疡。Apligraft^的制法是将从新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于牛I型胶原，1周后再在其表面接种新生儿角质形成细胞。4天后角质形成细胞融合成片，覆盖其下的“真皮层”。整个复合物随后被置于气-液界面以促使角质形成细胞进一步分化成熟。在一项临床研究中，Apligraft与传统治疗静脉性溃疡的压迫疗法相比较，6个月治愈率分别为63％和48.8％(P＝0.012)；平均愈合时间分别为61天和181天(P＝0.003)；对于超过6个月的难治性溃疡Apligraft治疗组愈合时间明显短于对照组(92天/190天，P＝0.001)(Falanga V，Margolis D，Alvarez O，et al.Rapid healing of venous ulcers and lackof clinical rejection with an allogeneic cultured human skinequivalent.Arch Dermatol，1998，134：293.)。然而，Apligraft的缺点是胶原凝胶的收缩率较大；使用同种异体细胞和牛胶原，存在着不可预料的免疫排斥反应和潜在病毒感染的风险；脆性大，操作困难。

因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、可操作性强的人工皮肤代用品。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的安全性高、制法简便的人工皮肤。

本发明的另一目的就是提供所述人工皮肤的制法和用途。

在本发明的第一方面，提供了一种人工皮肤移植物，它包括：

(a)真皮层，所述的真皮层含有药学上可接受的生物可降解材料、成纤维细胞和基质蛋白；

(b)位于真皮层一个主表面之上的表皮层。

在一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自：聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-甘醇酸、或其混合物。

在另一优选例中，所述的真皮层含有10-30％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。更佳地，所述的真皮层含有15-25％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，60-80％基质蛋白。

在另一优选例中，所述的真皮层的厚度为0.2-4mm，所述表皮层的厚度是20-120um。

在另一优选例中，所述的表皮层含有角质形成细胞。

在另一优选例中，所述的成纤维细胞选自：真皮成纤维细胞，以及胚胎时期间充质细胞来源的多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。

在另一优选例中，所述的表皮角质形成细胞和成纤维细胞包括经过基因修饰、改造的表皮角质形成细胞和成纤维细胞。

在本发明的第二方面，提供了一种制备人工皮肤移植物的方法，包括步骤：

(a)将成纤维细胞接种于药学上可接受的生物可降解材料；

(b)在适合生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料复合物；

(c)将角质形成细胞接种于所述的成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料复合物表面；

(d)在适合角质形成细胞生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料-表皮复合物。

在一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自：聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-甘醇酸、或其混合物；

在另一优选例中，在步骤(a)中，成纤维细胞的接种量为1×10⁵-1×10⁷个细胞/10mg生物可降解材料(如聚羟基乙酸)。更佳地，成纤维细胞的接种量为5×10⁵-5×10⁶个细胞/10mg生物可降解材料(如聚羟基乙酸)。

在另一优选例中，在步骤(c)中，角质形成细胞的接种量为1×10⁴-1×10⁷个细胞/平方厘米。更佳地，角质形成细胞的接种量为1×10⁵-5×10⁶个细胞/平方厘米。

在另一优选例中，步骤(d)包括二个阶段：

(i)将步骤(c)获得的复合物在完全浸没的条件下，于37±0.5℃，5％CO₂和饱和湿度下培养4-14天，从而使角质形成细胞增殖，形成角质形成细胞层；

(ii)将步骤(i)中获得的复合物的角质形成细胞层部分暴露于空气中，继续培养4-21天，从而使角质形成细胞角化。

附图描述

图1是本发明双层人工皮肤的组织学切片照片。

图2A和2B是本发明双层人工皮肤的透射电镜照片。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，改进了双层人工皮肤的结构和制备方法，首次制得了基于聚羟基乙酸(Polyglycolic Acid，PGA)等生物可降解材料的双层人工皮肤。本发明的双层人工皮肤具有真皮及表皮双层结构，无收缩，可以直接缝合覆盖创面，替代自体皮肤移植用于皮肤缺损的修复。

如本文所用，术语“表皮层”指位于人工皮肤表面，主要由角质形成细胞构成的细胞层。

如本文所用，术语“真皮层”指位于人工皮肤表面下方，主要由聚羟基乙酸等生物可降解材料网架、成纤维细胞及其分泌的基质蛋白构成的细胞层。应理解，在本发明的人工皮肤中，聚羟基乙酸等生物可降解材料网架、成纤维细胞及其分泌的基质蛋白的含量并不是一成不变的。由于本发明人工皮肤中所用的聚羟基乙酸等材料是生物可降解的，会随着时间会发生降解，因此其含量是逐渐下降的。通常，真皮层含有10-30％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。更佳地，所述的真皮层含有15-25％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，60-80％基质蛋白。(应指出，在本发明人工皮肤中的水分基本上都以结合水的形式存在，因此被包括在细胞成分和基质蛋白中。)

可用于本发明的人工皮肤的网架的材料是医学上可接受的生物可降解材料，较佳地选自：聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-甘醇酸(PLGA)、或其混合物。更佳地选自聚羟基乙酸(PGA)。

生物可降解材料的形状没有特别限制，通常为扁平的、带空隙的三维网状结构。

可用于本发明的成纤维细胞没有特别限制，可以是任何来源的成纤维细胞，尤其是真皮成纤维细胞。成纤维细胞的分离和培养方法都是本领域中熟知的。

可用于本发明的角质形成细胞没有特别限制，可以是任何来源的角质形成细胞。角质形成细胞的分离和培养方法都是本领域中熟知的。

在优选例中，成纤维细胞和角质形成细胞宜来自相同来源，即来自同一哺乳动物，更佳地来自同一个体。

本发明的人工皮肤的厚度没有特别限制。通常所述的真皮层的厚度约为0.2-4mm，所述表皮层的厚度约为20-120um。

本发明的人工皮肤可用以下方法制备：

(a)将成纤维细胞接种于聚羟基乙酸等生物可降解材料(如编织状聚羟基乙酸)。成纤维细胞的接种量约为1×10⁵-1×10⁷个细胞/10mg聚羟基乙酸，较佳地约为5×10⁵-5×10⁶个细胞/10mg聚羟基乙酸。

(b)在适合生长的条件下培养一段时间(通常约为4-14天)，使成纤维细胞增殖，从而形成成纤维细胞-聚羟基乙酸复合物。

(c)将角质形成细胞接种于所述的成纤维细胞-聚羟基乙酸复合物表面；角质形成细胞的接种量通常约为1×10⁴-1×10⁷个细胞/平方厘米，较佳地约为1×10⁵-5×10⁶个细胞/平方厘米。

(d)在适合角质形成细胞生长的条件下培养复合物一段时间(约4-21天)，从而形成成纤维细胞-聚羟基乙酸-表皮复合物。一种优选的方式是分两个阶段培养，即第一阶段中将获得的复合物在不与空气接触的条件下，即浸没在培养液中，在培养条件下培养4-14天，从而使角质形成细胞迅速增殖；第二阶段中，将角质形成细胞层部分暴露于空气中，继续培养4-21天，从而使角质形成细胞进一步分化，即角化。这样就形成了本发明的双层结构的人工皮肤。

可用各种不同手段将角质形成细胞层部分暴露于空气。例如将在细胞一PGA复合物置于一金属支架上，使部分表皮层暴露于空气，而其余部分仍位于培养液的液面之下即可。另一种优选方式是在细胞-PGA复合物下加垫可渗透滤膜，制造气-液界面。

用于本发明的培养液可以选用本领域常见的用于成纤维细胞和角质形成细胞的培养基。一种优选的人工真皮培养的培养液为含10％胎牛血清的DMEM培养基。一种优选的用于双层人工皮肤复合培养的培养基(角化细胞培养基)为：DMEM与F12的混合培养基，按约3∶1(v/v)比例混合，使用时还可添加其他添加剂，例如约50ug/ml牛垂体提取物(BPE)约50ug/ml，人重组表皮细胞生长因子(rEGF)约5ng/ml等。

用本发明方法可形成有活性的、双层组织工程皮肤。组织工程双层皮肤的真皮层是由PGA和成纤维细胞及其分泌的基质蛋白共同组成，表皮是由接种在表面的角质形成细胞不断增殖、分化形成。组织学显示本发明的人工皮肤具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征，不具备毛囊、皮脂腺、汗腺等附属器和血管，也不含有黑素细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞等。

本发明的双层组织工程人工皮肤具有真皮及表皮双层结构，无收缩，可以直接缝合覆盖创面，替代自体皮肤移植用于皮肤缺损的修复。

本发明的优点在于：

(1)聚羟基乙酸是可降解吸收材料，具有良好的力学性能、可靠的生物安全性和生物相容性；

(2)具有已角化的表皮层，可发挥皮肤的重要屏障和保护功能；

(3)由可降解吸收材料和细胞及其分泌的基质蛋白共同构成，是真正意义上的有活性的双层人工皮肤。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

角质形成细胞的分离与培养

1)取材

手术切除的小儿包皮，置入含抗生素的角化细胞培养液中，带入细胞培养室。

2)分离表皮

用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织及部分真皮，并修剪成宽约1-2mm的条状，用无钙镁PBS漂洗两次，表皮面朝上浸于0.24U/ml中性蛋白酶(Dispase II)中4℃过夜。

3)消化

18小时后，用两把眼科镊子将表皮从真皮上撕下，剪成碎片，再用0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA在37℃消化15分钟，10ml胰酶抑制剂(10mg/ml)终止消化。经150目不锈钢滤网过滤，以1000r/min离心10分钟，弃去上清，加入角化细胞培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数，细胞活力＞85％。

4)原代培养

计数后制成单细胞悬液，按3×10⁶/75cm²密度接种培养，无血清角化细胞培养基(GIBRO，USA)，在37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养，培养液3天换一次。

5)传代培养

当细胞融合到60％-75％密度时，用10ml无钙镁PBS冲洗，经0.05％胰酶-0.53mM EDTA 37℃消化5-10分钟，加入10ml胰酶抑制剂终止消化，移入离心管中，1000r/min离心10分钟。弃去上清液，加入角化细胞培养液10ml，混匀，计数，按1∶3的比例传代培养。2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60％-75％密度时，再传代培养。

实施例2

真皮成纤维细胞分离与培养

1)消化

将撕下表皮后的真皮剪成碎块，用0.1％的胶原酶在37℃消化2小时，经150目不锈钢滤网过滤，以1000r/min离心5分钟，弃去上清，加入无钙镁PBS清洗3次。加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数。

2)原代培养

计数后制成单细胞悬液，按1-2×10⁶/75cm²密度接种培养，含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养，培养液3天换一次。

3)传代培养

当细胞融合到60％-75％密度时，用10ml无钙镁PBS冲洗，经0.25％胰酶37℃消化5分钟，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，1000r/min离心5分钟。弃去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，混匀，计数，按1∶3的比例传代培养。2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60％-75％密度时，再传代培养。

实施例3

制备人工皮肤

(1)构建成纤维细胞-PGA复合物

对实施例2中制备的真皮成纤维细胞，用胰蛋白酶消化法收集，然后分别以0.2×10⁶/10mg聚羟基乙酸、1×10⁶/10mg聚羟基乙酸、5×10⁶/10mg聚羟基乙酸的浓度将其接种于网状的聚羟基乙酸(PGA)。然后将接种后的PGA材料，在37±0.5℃，5％CO₂、饱和湿度条件下，在含10％胎牛血清的DMEM培养液(培养液每3天换一次)中培养1-2周，形成成纤维细胞-PGA复合物。

(2)双层皮肤的形成

收集实施例1中制备的角质形成细胞，然后分别以0.5×10⁵/平方厘米、5×10⁵/平方厘米、50×10⁵/cm²的密度将其接种在上一步骤制得的成纤维细胞-PGA复合物表面。将接种后的复合物在DMEM与F12的混合培养基(按约3∶1(v/v)比例混合，添加有牛垂体提取物(BPE)50ug/ml，人重组表皮细胞生长因子(rEGF)5ng/ml)，于37±0.5℃，5％CO₂、饱和湿度条件下，在角化细胞培养基中培养4-14天。

4-14天后，在细胞-PGA复合物下加垫可渗透滤膜，使角质形成细胞层部分暴露于空气中，制造气-液界面，其中成纤维细胞层(即真皮层)和部分角质形成细胞层(即表皮层)仍位于培养液中，而部分角质形成细胞层(即表皮层)暴露于空气。在37±0.5℃，5％CO₂、饱和湿度条件下继续培养4-21天，从而使角质形成细胞的进一步分化(即角化)。从而获得具有双层结构的人工皮肤移植物。

	成纤维细胞接种量(106/10mg PGA)	角质形成细胞接种量(105/平方厘米)
			人工皮肤1	0.2	0.5
人工皮肤2	1	0.5
			人工皮肤3	5	0.5
人工皮肤4	0.2	5
			人工皮肤5	1	5
人工皮肤6	5	5
			人工皮肤7	0.2	50
人工皮肤8	1	50
			人工皮肤9	5	50

检测方法

各组分别于复合培养后1、2、3、4周留取标本，剪成两块，一块用10％中性福尔马林液固定，石蜡包埋，制成4um厚的切片，作常规HE染色。另一小块组织用2％戊二醛、1％锷酸固定，梯度乙醇逐级脱水，EPON包埋后，行透射电镜观察。

结果

成纤维细胞在PGA上生长良好并分泌大量基质；接种表皮角质形成细胞一周后可见1-2层连续的表皮细胞在“成纤维细胞-PGA”复合物上生长良好；4周时PGA已部分降解，表皮分层分化较完善，可见基底层、棘细胞层及角化层，与正常皮肤结构相似。其中，真皮层含有10-30％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。

组织切片结果如图1所示。在人工皮肤1-9的组织切片中可看见有连续的表皮细胞生长在成纤维细胞-PGA复合物表面，且表皮细胞分化良好，有较明显的分层。切片显示组织工程人工皮肤具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征，不具备毛囊、皮脂腺、汗腺等附属器和血管，也不含有黑素细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞等。人工皮肤的超微结构显示表皮角质形成细胞和成纤维细胞的形态正常，表皮分化较完全，有基底细胞层、棘细胞层及角化层的复层分化，真皮中胶原纤维纵横交错，可见尚未完全降解的聚羟基乙酸材料。

超微结构照片如图2A和2B所示。扫描电镜显示成纤维细胞、表皮角质形成细胞在PGA上黏附生长并分泌大量基质蛋白成分。透射电镜观察组织工程皮肤，2-4周时可见表皮细胞分层分化良好，胞浆中可见分散、纤细的角蛋白丝，细胞的相邻面有桥粒连接，人工真皮层中成纤维细胞形态正常，分布有大量胶原纤维，尚可见未完全降解的PGA，在两层细胞交界处可见不连续的基底膜成分。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种人工皮肤移植物，其特征在于，它包括：

(a)真皮层，所述的真皮层含有药学上可接受的生物可降解材料、成纤维细胞和基质蛋白；

(b)位于真皮层一个主表面之上的表皮层。

2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自：聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-甘醇酸、或其混合物，并且所述的真皮层含有10-30％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。

3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮层含有15-25％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，60-80％基质蛋白。

4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮层的厚度为0.2-4mm，所述表皮层的厚度是20-120um。

5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的表皮层含有角质形成细胞，

6.如权利要求5所述的移植物，其特征在于，所述的表皮角质形成细胞和成纤维细胞包括经过基因修饰、改造的表皮角质形成细胞和成纤维细胞。

7.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的成纤维细胞选自：真皮成纤维细胞，以及胚胎时期间充质细胞来源的多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。

8.一种制备人工皮肤移植物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将成纤维细胞接种于药学上可接受的生物可降解材料；

(b)在适合生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料复合物；

(c)将角质形成细胞接种于所述的成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料复合物表面；

(d)在适合角质形成细胞生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料-表皮复合物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自：聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-甘醇酸、或其混合物；

而且在步骤(a)中，成纤维细胞的接种量为1×10⁵-1×10⁷个细胞/10mg聚羟基乙酸；

在步骤(c)中，角质形成细胞的接种量为1×10⁴-1×10⁷个细胞/平方厘米。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，成纤维细胞的接种量为5×10⁵-5×10⁶个细胞/10mg聚羟基乙酸；

步骤(c)中，角质形成细胞的接种量为1×10⁵-5×10⁶个细胞/平方厘米。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括二个阶段：

(i)将步骤(c)获得的复合物在完全浸没的条件下，于37±0.5℃，5％CO₂和饱和湿度下培养4-14天，从而使角质形成细胞增殖，形成角质形成细胞层；

(ii)将步骤(i)中获得的复合物的角质形成细胞层部分暴露于空气中，继续培养4-21天，从而使角质形成细胞角化。

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