CN1062441C - 复合的活的皮肤等同物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明说明了一种复合的活的皮肤等同物,它是由培养的角化细胞的表皮层,无孔胶原层和在多孔的、交联化的胶原海绵基质上有培养的成纤维细胞的真皮层所组成。无孔胶原最好是1型、3型或1和3型混合的牛胶原,并经胃蛋白酶处理。本发明叙述了制备该皮肤等同物的方法,以及进行离体试验的皮肤等同物试验盒。该皮肤等同物用于皮肤移植并用于离体试验各种物质对皮肤的影响。
Description
本发明涉及活的皮肤等同物,特别是涉及复合的活的皮肤等同物,该等同物是由培养的角化细胞的表皮层、非常纯化的无孔胶原蛋白层 和在多孔的交联 的胶原海绵内的培养的成纤维细胞真皮层组成。本发明还涉及该复合的活的皮肤等同物的制备方法。
皮肤等同物有许多种用途,不仅在植皮时作为人或动物皮肤的替代物,也可以作为试验性皮肤用来测定药物及化妆品对皮肤的影响。
药理学的、化学的和化妆品的试验中主要的困难是难于确定这些产品对皮肤的效用及安全性。本发明皮肤等同物的一个优点是可用于通过体外试验,在试验皮肤上显示出这些物质所产生的影响。
虽然皮肤移植术有了进展,但被剥露部分、长出肉芽的创伤面及烧伤的皮肤移植存在的主要问题仍然是愈合问题。裂厚自身移植及表皮自身移植(培养的自生角化细胞)已取得不同程度的成功,但这两种治疗方法有许多缺点:例如裂厚自身移植通常无法用于大面积烧伤(BSA),並会引起患者进一步损伤,而且对营养障碍性表皮水疱症(DEB)患者的治疗有局限性,还显示出有限的组织膨胀,並需反复进行外科手术和延长住院时间,以及产生不希望有的外貌后果。表皮自身移植需要生产时间,成功率低(30~50%),常常形成自发性水疱,这种移植术是脆弱的,难以掌握,而且移植物缩小到原来的大小的60~70%,在植皮后的大约前15天非常脆弱,对真皮和表皮都受损伤的深度烧伤,这种治疗实际是无用的。
另一种治疗方法是表皮异体移植(培养性异体同种角化细胞)。美国研究者用移植性表皮异体移植术治疗二度烧伤的患者的创伤获得一些成功。这种异体移植的益处包括有:能够经常备有已准备好的此种移植的供给者,致使患者可以用一种可以产生永久性痊愈的材料,以简便的方法加以复盖;可以排除因自身移植造成的创面增大和供皮部位的疼痛及感染的危险;用培养性异体移植复盖烧伤面,愈合的速度与用自身移植复盖烧伤面一样地快;还可以处理DEB患者。
然而表皮异体移植仍然有表皮自身移植术的许多局限性。
使全厚皮肤受到损伤的烧伤,毁坏了表皮和真皮,在用培养性皮肤处理时需要把这两部分都换掉。
Hansborough ,J.F和Boyce,S.T(JAMA 1989,2125-2130)报导将自身表皮细胞应用于皮肤等同物,然后再移植到伤面上。该方法的主要缺点是要制备皮肤等同物。
而且,该法还要使用6-硫酸酯软骨素(GAG),后者在PH中性条件下与胶原有弱键结合,因而可能被释放到创面区域,对人体造成预料不到的长期作用。已有报导GAG会增进伤面瘢痕的形成,这在移植术中是应该避免的。而含有胶原海绵的GAG的另一种作用是可降低胶原血凝的能力,此点被认为对于出血性创伤相当的不利。血纤维蛋白凝块有助于将移植物粘连到伤面上。
而且在这个方法中,胶原海绵也经与0.25%戊二醛(GTA)的交联而稳定化。这种交联胶原被再吸收的速率较慢,並对细菌和真菌感染是有耐受性的。在细胞内向生长的同时,GAG交联的胶原基质的浸润变少。与GAG交联的胶原可以高分子量的聚合物形式保持这种试剂,並不断地水解,释放出GTA,在6周以后还可检测出。GTA对组织培养中的成纤维细胞的细胞毒作用提示:GTA不是皮肤等同物中理想的交联剂,该皮肤等同物被宿主细胞浸润,且该皮肤等同物中的牛胶原基质被迅速地降解,並将GTA释放到体液中。
最近Bell等(Journal InvestigativeDermatology,1983;81:2S-10S)把由大鼠成纤维细胞置于溶解的胶原的真皮层和培养的大鼠角化细胞的表皮层组成的皮肤等同移植物作为异体移植物成功地移植到SpragueDawley大鼠身上。移植后的组织学检查表明,表皮层分化完全,生成桥粒,张力丝、角质透明蛋白和基底板。然而用人的成纤维细胞和角化细胞试图再生成活的皮肤等同物却成功有限。角化细胞不能完全分化,生成基底板,真皮一表皮关系是条直线。
上述皮肤等同物的表面的表皮化问题使Bell改进了他的方法,他用皮肤活组织作为角化细胞的来源,如于《国际PCT应用》中所述,公布于wo86/02273。这个方法的问题是,这样制成的皮肤代用品的整个表面不均匀,因为该活体组织,包括真皮部分,仍然植入在该皮肤代用品中。而且,得到的皮肤代用品的表面积,受能够从单个人体上取材的活体组织数目的限制,取活体组织涉及医学的手段,具有引起感染和瘢痕形成的潜在问题。皮肤等同物的钻孔活体取材是扩大生产另一皮肤等同物的方法,是个费时间的过程。因而这种皮肤等同物未于临床应用。1988年Colounb等在《烧伤》杂志上发表文章,报导用Bell方法失败率达100%。
澳大利亚专利申请AU-A-13743/88的发明者Bernard等利用毛囊鞘中得到的角化细胞的培养能力,试图避免上述的问题。皮肤活体组织用封闭于根鞘中的毛囊代替,后者垂直位置植入于形成的皮肤代用品的游离表面上。对上述发明的主要批评意见是这种皮肤的性质以及表皮生长时间会需数月之久。
因此,需要发展活的皮肤等同移植物,此种移植物包括有表皮层和真皮层,能容易制备和保存足够数量,以便对皮肤创伤作简便的处理。
在发展活的皮肤等同物时,希望它能包含以下数个或全部特征:它应可迅速和持久的粘附在伤面上;应可与组织兼容;在与伤面接触时应有内表面,以加速纤维血管组织的内向生长;和(或)应保护创面不受感染並防止体液损失。
因此,本发明的目的是提供至少有这些特征的某几项的培养的活的皮肤等同物,基本上克服了或改善了前述的一个或多个问题。
本发明的一个内容是关于复合的活的皮肤等同物,它是由一层培养的角化细胞的表皮层、非常纯净的无孔性的胶原层和在多孔的交联胶原海绵内培养的成纤维细胞真皮层所组成。
本发明的另一内容是制备复合的活的皮肤等同物的方法,包括有:获得皮肤材料;用酶法处理皮肤材料以分开表皮和真皮;用酶法处理表皮以游离出角化细胞;培养该表皮角化细胞直到产生融合;与此平行或分别地用酶法处理真皮,以游离出成纤维细胞;培养该成纤维细胞直到产生亚融合;将培养的成纤维细胞接种于多孔的交联胶原海绵膜;将接种胶原海绵在其表面上温孵,使成纤维细胞在整个胶原海绵上生长;翻转胶原海绵,将另一表面用一高纯的、最好用胃蛋白酶处理过的无孔胶原薄层覆盖以形成层状的海绵复合物;温孵该复合物使该无孔胶原发生聚合;然后接种培养的角化细胞;温孵该复合的皮肤等同物复合物,以加速细胞生长。
成纤维细胞的初始培养物最好是这样制备:获取皮肤材料;将皮肤材料混悬于胶原酶溶液中以游离出成纤维细胞;温孵该培养物;离心,得到成纤维细胞的细胞球;除掉培养基;洗涤细胞球以除掉残留的培养基;测定细胞数目和活力;将细胞接种在培养瓶中,培养成亚融合状态。
无孔的非常纯化的胶原最好是选自1型、3型或1、3型混合的胶原。例如由Sigma公司得到的适宜的牛皮胶原。
胶原用胃蛋白酶处理纯化比较理想,以除去抗原性物质。
所用的胶原海绵任何一种胶原海绵都是适宜的,例如由Mitaplast公司得到的产品。
本发明所用的角化细胞最好是用“滴降”法制备。角化细胞自表皮游离出,得到单个细胞的混悬液。该混悬液的分散滴均匀地铺点在培养基上並温孵,以便细胞展开並最后融合。
现对本发明加以说明,但並不只限于这些实例;关于附图的说明如下:
图1是本发明的复合的活的皮肤等同物生产过程的表示图;
图2a)是如Organogenesis公司(150,Dan Road,Canton,Massachusetts 02021,U.S.A)的1987年度报告中所示的现有技术中的活的皮肤等同物的组织学形状;
图2b)是正常皮肤的组织形状;
图3是用本发明的皮肤等同物后从移植处取皮肤活体组织的组织学形状;
图4是本发明的复合的皮肤等同物图;
图5是人的皮肤移植中皮肤等同物的活体组织形式。
图1是用图解方式表示复合的活的皮肤等同物的制备过程。
图1中,皮肤样本分离成作为成纤维细胞(10)源的真皮和作为角化细胞(11)源的表皮。培养的成纤维细胞(10)接种到胶原海绵(12)上,成纤维细胞在海绵上克隆后,把胃蛋白酶处理过的无孔胶原接种到海绵的另一面。再温孵后,将角化培养物最好用“滴降”法接种到无孔胶原上,培养后生成皮肤等同物(13)。
适于细胞培养技术的任何种皮肤样本都可用于本发明。该皮肤样品可以是自生的或是同种异体的。
皮肤样品用胰蛋白酶处理,以将表皮同真皮分开(Eisinger.M。皮肤研究方法,D.Skerrow编,(1985),pp193)。表皮切碎后用胃蛋白酶处理,游离出角化细胞。用标准方法培养该角化细胞直到融合。优选的情况是角化细胞以单个细胞的悬浮状态培养直至融合。
用于本发明的成纤维细胞的原始培养物的制备可用标准方法进行,例如在“在单层培养中家兔成纤维细胞的特异的胶原酶”一文中所述的方法(Jounal of Brochemistry(1974)137,373-385)。成纤维细胞的原始培养物最好按如下方法进行制备。
皮肤样本切成1mm见方,悬浮于用Tris-HclPH7。4缓冲的胶原酶溶液中。该皮肤样本可以是自生的或是同种异体的。适宜的胶原酶是溶组织梭菌的胶原酶。皮肤样本最好以1μ/ml的浓度悬浮于溶液中。悬浮液温孵后于1500转/秒速度下离心将细胞自溶液中分出。悬浮液温孵最好是30分钟。细胞球用DMEM洗涤,用血细胞计数器测定成纤维细胞的数目。成纤维细胞的活力用锥虫蓝染料排斥试验进行测定。成纤维细胞可直接注射到胶原海绵中或用于接种到培养瓶中,以标准方法使其生长成亚融合状态。意外的是这个方法比其它已知的方法缩短了2周的时间,这些已知方法制备成纤维细胞的原始培养物需3周。
上述培养方法也意外地产生其它的上皮细胞,这类细胞具有能发展成汗腺细胞或其它皮肤细胞类型的潜力。
交联的牛胶原海绵膜可以买到,冷冻贮存。使用之前,用灭菌水洗涤海绵,于37℃脱水使膜密致。
将培养的成纤维细胞接种于胶原海绵上。有一种实例是把亚融合细胞培养物接种到海绵上。该成纤维细胞接种物的密度最好是大约4×105细胞/ml。
已接种的海绵用标准方法温孵以使成纤维细胞遍布生长于胶原基质上。一种实例是,海绵在37℃、含5%CO2和饱和温度下于DMEM和条件培养基中保温温孵10天。DMEM和条件培养基最好是每隔一天更换。条件培养基是已在人角化细胞培养中使用超过两天的DMEM。它含有角化细胞分泌的各种大分子,这些大分子已知可以刺激成纤维细胞生长。条件培养基使用之前冷冻贮存,使用时与新鲜的DMEM以1∶2比例混合之。
然后将海绵翻转,上表面以胃蛋白酶处理的、无孔的胶原覆盖。本发明的一个实例是,该覆盖层是(纯制的)胃蛋白酶处理的、无孔的、无菌的1型牛胶原,或是1型和3型牛胶原的混合物。牛胶原可以买到,为基本纯制的胶原。用Drake,M.P.,Davison,P.F.和Bump,S(1966)Biochemistry 5:301-312所述的方法经胃蛋白酶处理以除去冬孢子肽(teliopeptides)。胶原溶液调节PH到中性,用r-射线灭菌。胶原溶液的适宜浓度为2mg/ml。该胶原以薄膜形式涂层于海绵上,37℃温孵60分钟使胶原完全聚合。
然后将培养的角化细胞接种到覆盖层上。接种的细胞最好是用含有细胞的培养基的悬滴接种,细胞密度为1×105细胞/滴。海绵于DMEM中补以2%胎牛血清、10mg/ml人表皮生长因子、0.4mg/ml氢化可替松和10-9M霍乱毒素,在PH7.2,35℃温孵10天。
在整个温孵期间,该皮肤等同物仍浸渍于上述培养基中。
在临床或离体应用该复合的活的皮肤等同物之前,将无牛垂体提取液的介质加入该培养基中。
在临床应用中,本发明的复合的活的皮肤等同物能意外地使愈合的移植物的表皮和真皮间的界面迅速地正常化。本发明的皮肤等同物离体培养2周后的组织学检查表明,多层化的表皮生长在均质的膜上。本发明的皮肤等同物在移植2周后活体组织样本的组织学检查证明,在被非炎性结缔组织细胞所群殖的真皮上形成了完全角化的表皮的角质层。用光学和电子显微镜观察,明显地看到一种波形的、形态学上成熟的表皮一真皮连接,存在有网状脊和真皮乳头的犬牙交错,这是当表皮和真皮之间的介面正常化后正常皮肤的特征,並且是非常重要的。
如果皮肤等同物培养时先浸渍于DMEM培养基中加上0.05×10-3M浓度的Ca++,培养4天,然后将表皮暴露(空气-液体界面)于含有增高的Ca++浓度0.05×10-3M的DMEM培养其中培养10天,则可以检查出多层化的分化了的表皮,它是由发育很好的基板上的基细胞层和数层超基细胞组成,该超基细胞呈现有早期角化。
上述离体系统非常类似于人体皮肤的无结构性排列和生物合成的产物,可适用于化学物农药的安全性试验和化妆品的皮肤刺激试验。受试物质用于本系统的表面上,可引起细胞的刺激作用並启动了炎症反应的调控剂的释放,该调控剂可在培养液中测量。该系统可适用于离体的细胞毒试验:总细胞-蛋白测定和中性红摄入测定,这些是细胞中蛋白质浓度的量度,提供了存在的活细胞和死细胞的定量测定。
皮肤等同物可在玻璃瓶或器中培养,各种待试化合物应用于该培养的皮肤上。经不断地供给适宜的培养基,皮肤会继续生长,直到试验完成。
胶原海绵提供了一个暂时性基质,它可将复合的活的皮肤等同物迅速而持久的粘合于人或动物的创伤面上,胶原海绵提供了一个与伤面接触的表面,可使纤维血管在伤面处内向生长,并且新皮结构得以发育。随着成纤维细胞与胶原基质物理上的相互作用並在生物合成上成纤维细胞贡献于胶原基质,胶原基质发生变化,逐渐破坏並被内源性胶原取代。然而,由于胶原海绵是交联性胶原,它们不会收缩,故可以贮存一段时间,当移植于伤面时不会收缩。
置于胶原海绵上表面的胃蛋白酶处理的无孔胶原可以防止培养的角化细胞向胶原海绵中侵入,因此可以保障本皮肤等同物的表皮层和真皮层的定区域化。该覆盖层也逐渐破坏,以形成真皮和表皮间正常的介面。
本发明的复合的活的皮肤等同物大约0.8mm厚,因而比表皮移植要牢固些,在移植时较容易处理。本发明的皮肤等同物的应用成功率大约为90%,这可归因于真皮层的存在,它可促进移植的血管化作用的发展。最后,本发明的复合的活的皮肤等同物使移植术一步进行,因而只需要单一的移植接受过程。凡士林纱布可以放到培养的移植物上,以使容易运输和使用该复合的活的皮肤等同物。
按照本发明所用的成纤维细胞和角化细胞或可以是自生的,或可以是同种异体的。用同种异体细胞可以使本发明的活的细胞等同物容易生产和贮存,因而在处理伤面时避免了为获取移植物引起的耽误。角化细胞和成纤维细胞这两种类型的细胞可按已发表的方法以单个细胞悬浮物的形式冷冻贮存数月。解冻后,这些细胞就活了,培养时可迅速生长,因而适于生产皮肤等同物。该皮肤等同物已成功地移植于志愿者身上,由于冷却可抑制皮肤移植的免疫原性(Baldwin,W M等.Transplantation 1973;15:419-422),同种异体细胞的冷冻保存减弱了某些不希望有的抗原。复合的活的皮肤等同物用于治疗创伤表面的可利用性可以提供实际上是无限量的可移植性皮肤,作为永久性的伤面敷盖物的来源。
现用人的同种异体皮肤细胞为例,对本发明加以说明。
实施例1
复合的移植物是由同种异体的人角化细胞(HK)和人成纤维细胞(HF)及细胞的牛胶原膜经分开的或平行的培养制得的。皮肤膜经用1型牛胶原改良后,得到用以培养HK的平表面。
人体皮肤取自外科手术标本,即新生儿包皮环切术(包皮),切除后,将皮肤放到有Dulbecc′s改良Eagle培养液(DMEM)的无菌容器内。在短时间内将标本送到组织培养实验室内,按M.Eisinger的方法(皮肤研究方法,D.Skerow编,1985,P193)用酶法将表皮与真皮分开。
角化细胞以单个细胞悬浮物按Eisinger法进行培养,该法改良如下:HK在DMEM中附加以2%胎牛血清、表皮生长因子、胰岛素和氢化可替松,在PH7.2条件下培养。12-14天后融合的培养物加以采集,或用作传代培养或接种到胶原膜上。
真皮部分用溶组织梭菌胶原酶消化,以释离出成纤维细胞。HF然后用标准方法在DMEM中生长。
胶原海绵膜(直径6cm)冷冻贮存于佩特里培养皿中。为使该膜密致,用无菌水洗涤,于37℃温孵器中脱水。然后将海绵于DMEM附加条件培养基中温孵过夜,HF的亚融合培养物以4×105细胞/ml的密度接种到海绵表面上。将海绵置于DMEM中,37℃、5%CO2和饱和温度下于温孵器中保温10天。
每隔一天更换一次培养基,到期后将海绵翻转,以准备成无孔表面,为培养的HK提供平面。
叠层采用胃蛋白酶处理的、无孔的、无菌的1型牛胶原薄膜。薄膜是由市售的纯化的1型胶原经胃蛋白酶消化除去冬孢子肽(teliopeptides)和用r-射线灭菌而制成的。胶原溶液PH调到中性,以薄膜形式用于胶原海绵的表面上,37℃温孵60分钟。
培养的HK然后以悬滴方式按1×105细胞/滴的密度接种到海绵的无孔表面上,于DMEM附加上述的补充物中温孵10天。临床应用前,将没有牛垂体提取液的培养基加到培养皿中,在培养的移植物上敷盖上凡士林棉纱,以便容易将移植物转移並固定在创伤面上。
在5个儿童身上用本发明的活的皮肤等同物进行了8个手术,成功率为90%。
在RDEB儿童身上进行的上述8个移植手术,临床和组织学表象提示无排异反应。
然而为了确定培养的同种异体移植物长期存留的直接证据和它们对永久性上皮组织的贡献,在健康成年志愿者身上进行了如下实例所述的临床试验。
实施例2
复合的移植物及同种异体移植物按实施例1所述方法制出。为培养的角化细胞准备好平面后,人的角化细胞连接到交联化的牛胶原底物的表面上,这种“皮肤培养夹心物”成簇的移植到病人的伤床上,此处的胶原基质作为构架,得以使纤维血管的内向生长从下面的伤床上长出,因而人的角化细胞可以存活,並形成了新的皮肤结构。
临床研究是在4个志愿者身上为除掉装饰性纹身而进行的,每个志愿者的臂上切除4块皮肤,两块皮肤切到脂肪处,另外两块切除时留下真皮。全深切除和部分厚度切除部用培养的皮肤和裂厚自身移植皮(作为对照)进行皮肤移植。每个星期换敷料,直至完全愈合。伤处照相,取活体组织进行组织学检查以及DNA图谱法检查。
志愿者1,两块用培养的皮肤植皮,另两块用自身移植术植皮,移植术2周后无移植物收缩作用。移植的中央区域进行活体组织检查,表明分化良好,表皮多层化,真皮含有许多成纤维细胞,並且在疏松排列的胶原基质中有非炎性细胞。图3和5表示术后2周的培养的移植皮肤进行活组织检查的组织学,图4是移植前的皮肤等同物,DNA图谱表明,给入细胞和接受细胞都呈混合的群体,说明某些真皮细胞来自患者,因为有明显的真皮细胞构成的证据。
志愿者2,任何一块都没有进行移植术,3周后组织学证明伤处有肉芽生长。
志愿者3,移植术4周后愈合无任何收缩,组织学检查证明表皮分化完全,並有细胞过多的真皮,DNA图谱表明有混合的给入细胞和接受细胞的群体。
志愿者4,移植术8周后,该患者移植的中央区域有一些收缩(约15~20%),表皮分化完全,成熟的真皮没有附属物。
对本领域熟悉的人显然可以对上述本发明作多种变换和改进,而不会越出本发明的范围和真谛。
Claims (13)
1.一种复合的活的皮肤等同物,是由培养的角化细胞的表皮层、高纯的、无孔的胶原层和在有孔的、交联化的胶原海绵内的培养的成纤维细胞的真皮层所组成。
2.按照权利要求1的复合的活的皮肤等同物,其特征是,该无孔的胶原是选自1型胶原,3型胶原或它们的混合物。
3.按照权利要求1的复合的活的皮肤等同物,其特征是,该无孔胶原经胃蛋白酶预处理而高度纯净化。
4.按照权利要求1的复合的活的皮肤等同物,其特征是,该成纤维细胞是由胶原酶处理皮肤样本而得到的。
5.按照权利要求1的复合的活的皮肤等同物,其特征是,角化细胞层的制备是得到单个角化细胞的悬浮液,均匀而断续地将悬浮液悬滴分布至无孔胶原层上,然后温孵。
6.测定一种物质对皮肤影响的试验盒,它含有权利要求1的复合的活的皮肤等同物,该皮肤等同物在一种适宜的培养基中被进一步培养,并且可在其上加上该物质。
7.一种制备复合的活的皮肤等同物的方法,其特征是,
(a)获得皮肤样本,酶法处理该样本以将表皮和真皮分开;
(b)用酶法处理表皮,使角化细胞游离,培养该表皮角化细胞直到融合;
(c)用酶法处理真皮,使成纤维细胞游离,培养该成纤维细胞,直到亚融合;
(d)将多孔的、交联化的胶原海绵膜的一面,接种上(c)步的培养的成纤维细胞,温孵该接种过的海绵,使成纤维细胞遍布生长于胶原海绵上。
(e)在多孔胶原的交联化的胶原海绵的另一面形成一层无孔胶原,温孵,使其聚合成无孔胶原层;
(f)(e)步的聚合层接种(b)步的培养的角化细胞,这样得到的复合的皮肤等同物进行温孵,使其进一步细胞生长。
8.按照权利要求7的方法,其特征是,无孔胶原是选自1型胶原、3型胶原或它们的混合物。
9.按照权利要求7的方法,其特征是,无孔胶原经用胃蛋白酶预处理而进一步纯化。
10.按照权利要求7的方法,其特征是,用胶原酶处理真皮,使成纤维细胞游离。
11.按照权利要求7的方法,其特征是,笫(f)步的接种是将角化细胞的单个细胞悬浮液的悬滴,均匀而断续地分布到聚合了的无孔胶原层上。
12.为测定物质对皮肤影响的试验盒的制备方法,其特征是,按照权利要求7制备复合的活的皮肤等同物,然后在空气中征适宜的培养基中对此皮肤等同物进一步培养。
13.测定一物质对皮肤影响的一种方法,其特征是,将受试物质施于权利要求1的皮肤等同物上,再于空气和适宜的培养基中进一步培养,然后观察或测定该皮肤等同物的任何变化。
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