JPH05506169A - 合成生体皮膚等価物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成生体皮膚等価物 コ　技術の分野 り　この発明は生体皮膚等価物に関し、特に培養されたケラα　チン細胞の表皮 層と、高度にＷＩ製された非多孔性コラーゲンの層と、多孔性の、架橋コラーゲ ンスポンジ内の培養さζ　れた繊維芽細胞の真皮層を含む合成生体皮膚等価物に 関する。発明は、またこの合成生体皮膚等価物の調製方法にも口　関連する。

ｒ　背景技術 皮膚等価物は皮膚移植のためのヒトまたは動物の皮膚の代替物としてのみならず 、薬品および化粧品の皮膚への影［響を決定するための試験用皮膚としてなど多 くの用途を有している。

薬理学的、化学的および化粧品の試験における主な困難点は、その製品の皮膚に 対する効力と安全性を決定するうえでのものである。この発明の皮膚等価物の１ つの利点は、試験用皮膚に対する但庄塁の試験により、このような物質により生 じる影響の指標としての用途である。

また、肉芽を形成する傷および火傷により裸出した領域の皮膚移植は、移植技術 の発達にもかかわらず、依然として大きな治癒上の問題を抱えている。中間層自 家移植片および表皮自家移植片（培養自原性ケラチン細胞）が利用された場合に は様々な成功をおさめている。しがしながら、双方の治療形態ともに多くの問題 点を抱えている。たとえば、中間層自家移植片は一般的には大きな体表面ｆ＊（ ＢＳＡ）の火傷の場合には利用不可能であり、患者にさらに傷を与え、ジストロ フィー性の表皮水痘症（ＤＥＢ）の患者の治療においての利用は制限されており 、限られた組織の伸張を示し、何度も外科手術を繰返さなければならず、長期入 院を必要としかつ美容的に見ても望ましくない結果をもたらす。表皮自家移植片 は製作に時間がかかり、３〇−５〇％の範囲の低い成功（「生着」）率であり、 しばしば自然水痘を形成し、壊れやすくかつ扱いにくく、元のサイズの６０−７ ０％までの収縮を示し、移植後約１５日の間は傷つきやすく、かつ表皮と真皮と が破壊されているような深い火傷の治療にはほとんど全（使用されていない。

代替的な治療の形態が表皮同種移植（培養された同種異系ケラチン細胞）である 。アメリカの研究者は、２度の火傷の患者を、その傷に表皮同種移植を行なうこ とで幾分かの成功をおさめている。このような同種移植の有利点は以下のとおり である、すなわち患者が単一の経過において、永久治癒を可能とする物質で覆わ れるようにこのような移植片の容易な供給が維持され得ること、傷の領域を広げ かつ痛みを伴い、感染しやすい供与体部位が残る自家移植をなくし、培養された 同種移植片で覆われた火傷の傷が自家移植片で覆われている火傷の傷と同じぐら い早く治癒し、かつＤＥＢを伴う患者の治療も可能な点である。

しかしながら、表皮同種移植にも依然として表皮自家移植の限界の多くがみられ る。

火傷による全層皮膚の傷は表皮と真皮の双方を破壊し、培養皮膚による治療では これら部分の双方を置換する必要かある。

バンズポロ＋、Ｊ、Ｆ　（Ｈａｎｓｂｏｒｏｕｇｈ、　Ｊ、　Ｆ）およびボイス 、Ｓ、　Ｔ　（Ｂｏｙｃｅ、　Ｓ、　Ｔ）　（ＪＡＭＡ　Ｉ　９８９．　２１２ ５−２１３０）は、真皮の等価物に自家表皮細胞を付与してこれを今度は傷の上 に移植する方法を報告している。

この方法の主な欠点は真皮等価物の調製にある。

さらに、この方法は中性のｐＨでコラーゲンに対し結合か弱（、かつしたがって 傷の周囲に放出されて、被験者に対し予測のできない長期間にわたっての影響を 引き起こしかねないコンドロイチン−６−硫酸（ＧＡＧ）の使用を含んでいた。

ＧＡＧは、移植では避けるべきである傷における傷痕の形成を増大させることが 報告されている。コラ−・ゲンの血液凝固能力を減少させるコラーゲンスポンジ を含むＧＡＧのもう１つの影響は出血する傷に適用する場合にはあまり好ましい ものではないと考えられ得る。フィブリンの凝血は移植片の傷への癒着の原因と なる。

またこの方法においては、コラーゲンスポンジは０．２５％のグルタルアルデヒ ド（ＧＴＡ）と架橋させられることにより安定する。このような架橋コラーゲン は、より遅い速度で再吸収されかつ細菌または真菌の感染に対し抵抗がある。同 時に、ＧＴＡ架橋コラーゲンマトリックスに浸入する細胞の内破も少ない。ＧＴ Ａと架橋されたコラーゲンは、この溶剤を継続的に加水分解される高分子重量ポ リマとして保持してもよくかつ単量体のＧＴＡか６週間までの間に放出されかつ 分離可能である。組織培養における繊維芽細胞に対するＧＴＡの細胞障害効果は 、宿主細胞により浸入されかつその中でウシのコラーゲンマトリックスが急速に 劣化してＧＴＡを体液内に放出する真皮等価物には理想的な架橋剤とは言えない ことを提示している。

最近、溶解性コラーゲンに投入されたラットの繊維芽細胞からなる真皮層と培養 されたラットのケラチン細胞の表皮層とを含む生体皮膚等価移植片が、ベル聾（ Ｂｅｌｌ　ｅｔ、　ａｌ、）によりＳＤクラット対して同種異系移植片としてう まく移植された（Ｊｏｕｒｎａｌ　［ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔ ｏｌｏｇｙ　、１９８　３；８１：２ｓ−１０ｓ）。移植片を組織的に検査する ことで、表皮細胞が完全に変化してデスモゾーム、トノフィラメント、ケラトヒ アリンおよび基底板を形成したことがわかった。しかしながら、ヒトの繊維芽細 胞とケラチン細胞とを使用して生体皮膚等価物を再生しようとする試みはほんの 少ししか成功しなかった。ケラチン細胞は基底板を形成するほど十分には変化を 遂げずかつ真皮−表皮関係は直線的であった。

上記真皮等価物の表面を表皮化することに関する問題により、ベルは公開された ＷＯ３６１０２２７３号の国際ＰＣＴ出願に記載されるような、皮膚の生検材料 をケラチン細胞源として使用することにより彼の方法を修正することになった。

この方策にまつわる問題は、こうして生成された皮膚の代替物がその全表面にわ たって均一でないことであり、つまり真皮部分を含む生検材料か真皮の代替物に 挿入されたままだからである。また、得られた皮膚代替物の表面積は１人の人間 から採取され得る生検の数により制限される。生検をとることは感染と傷痕をつ くるという潜在的問題を伴う医療的な経過を含むものである。皮膚等価物のパン チバイオブシは、付加的な皮膚等価物の生成を拡大する手段としては時間のかか る方法である。結果として、このような皮膚の等価物は臨床学的には使用されて いない。

１９８８年には、雑誌“火傷”（１３ｕｒｎｓ）に掲載されたコロンブ他　（Ｃ ｏｌｏｕｎｂ　ｅｔ、ａｌ、）による論文は、ベルの方法を利用しての１００％ の失敗率を報告している。

オーストラリア特許出願ＡＵ−Ａ−１３７４３／８８号の発明者である、パーナ ート他（Ｂｅｒｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ）は上置のシースに含まれるケラチン細胞 の培養能力を利用して上記の問題を回避することを試みる。皮膚の生検材料がそ のシース内に放出された上置で置換えられ、形成されている真皮の代替物の自由 な表面における直角をなす位置に移植される。上記の発明に関する主な批判点は 、その真皮の性質、および表皮が成長する期間が数カ月かかるかもしれないとい う点である。

したかって、皮膚の損傷の一回の治療を可能にするのに十分な量で容易に調製さ れかつ維持され得る表皮および真皮の層双方を含む生体皮膚等価移植片の開発の 必要かある。

生体皮膚等価物を開発するうえで、その等価物か以下に述へる特徴の少なくとも 幾つかまたはすべてを含んでいることか望ましい、すなわち傷の表面に対して迅 速かつ持続する粘着か可能であること、組織適合性があること、繊維芽細胞組織 の内破を促進する傷の表面と接触する内側表面を育していること、および／また は感染から保護しかつ体液の損失を防止することである。

したがって、本件発明の目的は、これらの特徴の少なくとも幾つかを提示し、か つ上記の問題の１つまたは２つ以上を実質的に克服するかまたは改善する培養生 体皮膚等価物を提供することにある。

発明の開示 この発明の１つの局面は、培養ケラチン細胞からなる表皮層と、高純度で、非多 孔性のコラーゲンからなる層と、多孔性の、架橋されたコラーゲンスポンジ内の 培養繊維芽細胞からなる真皮層とを含む、合成生体皮膚等価物に関する。

この発明のもう１つの局面は、合成生体皮膚等価物の調製のための方法であって 、皮膚のサンプルを入手し、その皮膚のサンプルに対し真皮から表皮を分離する ように酵素集密するまで表皮ケラチン細胞を培養し、並行してまたは別々に、真 皮を酵素て処理して繊維芽細胞を放出させ、準集密状態になるまで繊維芽細胞を 培養し、培養した繊維芽細胞を多孔性の架橋されたコラーゲンスポンジ膜に植え つけ、その表面上に植えつけられたコラーゲンスポンジをインキュベートしてコ ラーゲンスポンジを通して繊維芽細胞を成長させ、コラーゲンスポンジを倒置し 、かつスポンジの他方の表面を高純度の、好ましくはペプシンで処理された非多 孔性のコラーゲンからなる薄膜でラミネート処理して積層のスポンジ複合体を形 成し、その複合体をインキュベートして非多孔性コラーゲンを重合し、かつその 後それに培養したケラチン細胞を接種し、かつその合成皮膚等価複合体をインキ ュベートして細胞の成長を促進することを含む。

繊維芽細胞の初代培養物は好ましくは以下の工程により調製される、すなわち真 皮のサンプルを入手し、その真皮のサンプルをコラゲナーゼの溶液に懸濁して繊 維芽細胞を放出させ、培養物をインキュベートし、その培養物を遠心分離して繊 維芽細胞の細胞ペレットを生成し、培地を取り細胞の数と生存度を決定し、培養 フラスコに細胞を接種しかつ準集密状態まで培養する工程である。

好ましくは、非多孔性の、高度に精製されたコラーゲンが、タイプ１、タイプ３ またはタイプｌとタイプ３の混合物のコラーゲンから選択される。たとえば、適 当なウシの皮膚のコラーゲンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手可能である。

このコラーゲンは理想的にはペプシンでの処理により精製されて、抗原物質を取 り除く。

使用されるコラーゲンスポンジはミタブラスト（Ｍｉｔａｐｌａｓｔ）から入手 可能なものなど、任意の適当なコラーゲンスポンジでよい。

本願発明において使用されるケラチン細胞は、好ましくは［滴下（ｄｒｏｐ）　 Ｊ法により調製される。ケラチン細胞は表皮から放出されて単細胞懸濁物を生成 する。この懸濁物の別々の雫が培地上に均一に置かれてインキュベートされ、細 胞か広がりかつ最終的に合着する。

図面の簡単な説明 この発明は、限定目的ではない例によりかつ添付の図面を参照して以下に説明さ れ、図面において；第１図は本願発明の合成生体皮膚等価物を生成するための方 法を示す模式図である。

第２図はａ）において移植後２週１Ｉｆｆ後の合成生体皮膚等価物の組織学的外 観を、正常な皮膚の組織学的外観を示す図ｂ）と比較して示すものである。

第３図はこの発明の皮膚等価物を利用する移植片からの皮膚バイオプシの組織構 造を示す図である。

第４図は本願発明の合成皮膚等価物を示す図である。

第５図は被験者からの皮膚の移植片における皮膚等価物のバイオブシを示す。

発明を実施するためのモード 第１図は合成生体皮膚等価物の調製のための方法を模式第１図において、皮膚の サンプルが、繊維芽細胞（ｌＯ）の源として使用される真皮と、ケラチン細胞（ １１）の源として使用される表皮とに分けられる。培養された繊維芽細胞（１０ ）はコラーゲンスポンジ（１２）に植えつけられ、かつ繊維芽細胞がスポンジに コロニーを形成した後、スポンジの反対側にペプシンで処理した非多孔性のコラ ーゲンが植えつけられる。さらにインキュベートした後、非多孔性コラーゲンに 好ましくは「滴下」法によりケラチン細胞培養物が接種され、かつ培養されて最 終的に皮膚等価物（１３）を生成する。

細胞培養技術に従う任意の皮膚サンプルが本願発明に従い使用可能である。皮膚 のサンプルは１原性でもよいし同種異系性のものでもよい。

皮膚のサンプルはトリプシンで処理されて真皮から表皮が分離される（エイジン ガー１Ｍ、による皮膚研究における方法、編集者り、スケロー、（１９８５）ｐ ｐ１９３）（Ｅｉｓｉｎｇｅｒ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　５ｋｉｎ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ、　Ｅｄｉｔｏｒ　Ｄ、　Ｓｋｅｒｒｏｗ　）。表皮は細かく切ら れてトリプシンで処理されケラチン細胞を放出する。ケラチン細胞は標準的な方 法を利用して集密状態まで培養される。好ましい局面においては、ケラチン細胞 は集密するまで単細胞懸濁物として培養され本願の発明に従い使用される繊維芽 細胞の初代培養物はたとえば「単層培養物におけるウサギの繊維芽細胞からの特 異性コラゲナーゼ」　（ジャーナル　オブ　バイオケミストリー（１９７４）１ ３７．３７３−３８５）に開示されるような方法なとの標準的な方法を使用して 調製され得る。

好ましくは、繊維芽細胞の初代培養物は以下のような方法で調製される。

真皮のサンプルが１ｍｍの立方体にまで切りわけられてトリス−ＨＣ１ｐＨ７， ４で緩衝されたコラゲナーゼの溶液に懸濁される。真皮のサンプルは自原住のも のでもよいし同種異系性のものでもよい。適切なコラゲナーゼはヒストリチフス 菌（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｏ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のコラゲナーゼであ る。真皮のサンプルは好ましくは１マイクログラム／ｍｌの濃度で溶液に懸濁さ れる。懸濁液はインキュベートされその後１５００ｒｅｖ／ｓｅｃで遠心分離に かけられ溶液から細胞を取り除く。懸濁液は好ましくは３０分間インキュベート される。細胞のペレットがＤＭＥＭで洗浄されかつ繊維芽細胞の数か血球計数器 により測定される。

繊維芽細胞の生存度がトリパンブルーを使用する色素排除試験により測定される 。繊維芽細胞は直接コラーゲンスポンジ内に注入されてもよいしまたは培養フラ スコに植えるために使用され標準的な方法を利用して草葉密状態まで成長させら れる。驚（べきことに、この方法は繊維芽細胞の初代培養物を調製するために３ 週間までの時間を必要とする他の公知の方法に比へて、２週間まで、かかる時間 か短上記の培養方法はまた汗腺または他の皮膚細胞のタイプにまで成長する可能 性を有する他の真皮上皮細胞を生しさせる。

架橋されたウシのコラーゲンのスポンジ膜は商業的に入手されかつ冷凍保存が可 能である。使用の前に、スポンジは滅菌された水で洗われかつ膜を目の詰まった 状態にするために３７°Ｃで脱水される。

コラーゲンスポンジには培養された繊維芽細胞か接種される。一実施例において は、このスポンジには草葉密細胞培養物が接種される。好ましくは、繊維芽細胞 の接種物は約４Ｘ１０Ｓ細胞／ｍｌの密度を有する。

接種されたスポンジは標準的な方法を利用してインキュベートされ、繊維芽細胞 の、コラーゲンマトリックスを通しての成長を可能にする。一実施例においては 、このスポンジはＤＭＥＭとならし培地において３７℃で、５％のＣＯ７および 飽和湿度で１０日間インキュベートされる。ＤＭＥＭどならし培地は好ましくは ２日置きに取り替えられる。ならし培地は２日間にわたってヒトのケラチン細胞 からなる培養物において使用されていたＤＭＥＭである。これは繊維芽細胞を刺 激することが知られているケラチン細胞により分泌された様々な高分子を含む。

ならし培地は使用まで凍結保存が可能である。これはＩ：２の割合で新鮮なりＭ ＥＭと関連して使用される。

スポンジはそこで反転され、かつ上の面が、ペプシン処理した非多孔性のコラー ゲンでラミネートされる。本願発明の一実施例においては、ラミネート層は、（ 精製された）ペプシンで処理され、非多孔性の、無菌のタイプ１のウシのコラー ゲンか、またはタイプｌとタイプ３のウシのコラーゲンの混合物である。ウシの コラーゲンは実質的に精製された形態で商業的に入手可能である。これはドレー ク、Ｍ、Ｐ、　、デビソン、Ｐ、Ｆ、およびバンブ、Ｓ、の（１９６６）バイオ ケミストリー５：３０１−３１２（叶ａｋｅ、　Ｍ、　Ｐ、、　Ｄａｖｉｓｏｎ 　、Ｐ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｂｕｍｐ、　Ｓ）の方法を使用してヘブシンで処理さ れ、テリオペプチド（ｔｅｌｉｏｐｅｐｔｉｄｅ）が取り除かれる。コラーゲン 溶液のｐＨは中性のｐＨに調節されかつγ線の放射により殺菌される。コラーゲ ン溶液の適切な濃度は２ｍｇ／ｍｌである。コラーゲンは薄膜としてスポンジ上 に積層されかつ３７℃で６０分間インキュベー１・されてコラーゲンの重合化が 完了する。

培養されたケラチン細胞はその後ラミネート層上に接種される。好ましくは、細 胞はｌＸｌ０’細胞／ｍの密度で細胞を含む媒質の雫を接種される。スポンジは その後２％のウシ胎児血清、１０ｍｇ／ｍｌのヒトの表皮成長因子、０．４ｍｇ ／ｍｌのヒドロコルチゾンおよび１０−”Ｍコレラ毒素を加えられたＤＭＥＭ内 でｐＨ７，２および３５°ＣてｌＯ日間インキュベートされる。

皮膚等価物はこのインキュベート期間を通して上記の培地に浸されたままである 。

この合成生体皮膚等価物の臨床学的または生体外付与に先立って、ウシの下垂体 抽出物を伴わない培養液が培地に加えられる。

驚いたことに、臨床学的応用においては、本願発明の合成生体皮膚等価物は治癒 した移植片の表皮と真皮との間の界面の急速な正常化を結果としてもたらす。生 体外での２週間の培養を経た本願の皮膚等価物の組織学的検査によれば、均一な 膜の上に多層の表皮が成長しているのが明らかとなった。移植の後２週間を経た 本願の皮膚等価物のバイオブシのサンプルを組織学的に検査したところ非炎症性 結合組繊細胞が密集した真皮の上に十分にケラチン化された表皮を有する角質層 の形成が確認された（図２ａを参照）。

重要なことは、光および電子顕微鏡で見たときに、波状の形態的に成熟した表皮 −真皮の接合部が存在していることである。正常な皮膚の特徴でありかつ表皮と 真皮との間の界面が正常化される場合に重要である、乳頭間隆起と真皮乳頭の嵌 合襞が存在していた。

皮膚等価物が０．０５ＸＩＯ−’ＭのＣａ−を育するＤＭＥＭ培地に最初に４日 間浸されて培養された後、０．０５Ｘ　１０−’Ｍの濃度を上げたＣａ”を含む ＤＭＥＭ培地内で表皮を露出して（気相液相界面）で１０日間培養された場合に は、よく発達した基底板上の基底細胞層と初期のケラチン化を示す数層の上基底 細胞から構成される、多層の、分化した表皮を検出することか可能である。

上記の生体外のシステムは、ヒトの皮膚の内部構造的構成および生合成産物に非 常に類似しておりかつ化学殺虫剤の安全性や化粧品の皮膚への刺激について試験 を行なうべく適合され得る。このシステムの表面に塗布されたテスト物質は細胞 の刺激を引き起こしかつ培養液で測定され得る炎症反応の媒介物質の放出の引金 となるかもしれない。このシステムは生体外の細胞毒性試験に適しているかもし れない、すなわち細胞におけるタンパク質濃度を測定する全体的細胞性タンパク 質検定とニュートラルレッド取込み検定により生存しているおよび死んでいる細 胞の存在に関する量的な検定が行なわれる。

皮膚等価物はガラスのボトルまたは皿で培養が可能で、かつテスト対象の様々な 化学物質がこの培養皮膚に塗布される。適切な培地を継続して供給することで、 皮膚はテストが終了するまで成長し続けることになる。

コラーゲンのスポンジは、ヒトまたは動物において、傷の表面への、合成生体皮 膚等価物の急速なかつ持続した粘着を可能にする一時的なマトリックスを提供し 、これが傷表面からの繊維芽細胞の内部を可能にし、かつ新真皮構造が成長する ことを可能にする傷の表面に接触した面を提供する。コラーゲンのマトリックス は変化させられかつ繊維芽細胞と物理的に反応しかつ生合成的な影響を受けるう ちに崩壊して内因性のコラーゲンにとって代わられる。しかしなから、コラーゲ ンスポンジは架橋されたコラーゲンなので、収縮することはなく、したがっであ る期間貯蔵されることは可能であり、かつ傷に対して移植された際にも収縮を示 すことはない。

コラーゲンスポンジの上表面上に置かれた、ペプシンで処理された、非多孔性の コラーゲンにより培養されたケラチン細胞によるコラーゲンスポンジへの侵入を 防ぎ、それにより皮膚等価物の、表皮および真皮層への区画化を確実なものとす る。このラミネート層はまた徐々に崩壊して真皮と表皮の間に正常な界面が形成 することを可能にする。

本願の合成生体皮膚等価物は、約０．８ｍｍの厚さでありかつしたがって表皮移 植片よりも強くかつ移植の際により容易に扱われる。本願の皮膚等価物の成功（ 生着）率は約９０％であり、これは移植片の血管新生の進行を促進する真皮層の 存在によるものかもしれない。最後に、本願の合成生体皮膚等価物は１段階で付 与することが可能で、したがって移植片を受入れるのはたった１回で良い。合成 生体皮膚等価物の移送および付与を容易にするために、ワセリンガーゼが培養さ れた移植片の上に置かれてもよい。

本願発明に従い使用される繊維芽細胞とケラチン細胞は１原性のものでもよいし 同種異系性のものでもよい。同種異系性細胞を使用することにより、本願発明の 生体皮膚等個物の生成と貯蔵か可能となり、それにより傷の治療のために移植片 を調達する際の遅れが回避される。ケラチン細胞と繊維芽細胞双方の細胞タイプ 共に単細胞懸濁物として公知の方法により凍結貯蔵が可能である。解凍の後、こ れらの細胞は生存しており、培養物において簡単に成長し、かつ皮膚等個物の製 造に適していた。皮膚等価物はボランティアの被験者にうまく移植された。冷却 することにより皮膚移植片の免疫原性が抑制されるので、（ボールドウィンＷＭ 他（Ｂａｌｄｗｉｎ　Ｗ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ）の［移植Ｊ　（Ｔｒａｎｓｐｌａｎ ｔａｔｉｏｎ）　１９７３年；１５：４１９−４２２）、同種異系性細胞の冷凍 保存か幾つかの望ましくない抗原を軽減するうえでの助けとなる。表面領域の傷 の治療のための合成生体皮膚等個物が入手可能になったことによって恒久的な傷 被覆の源としての恐らくは無限の量の移植可能な皮膚が提供され得る。

ヒトの同種異系性皮膚細胞を利用した以下の例において本件発明に関し説明する 。

例１ 合成移植片が、同種異系性ヒトケラチン細胞（ＨＫ）とヒト繊維芽細胞（ＨＦ） の別個、並行培養物と細胞性ウシコラーゲン膜から製作された。真皮膜はタイプ Ｉのウシのコラーゲンを使用して修正され、培養されたＨＫのための平坦な表面 がもたらされた。

外科的な標本、すなわち新生児の環状切除（包皮）から′こ　ヒトの皮膚が入手 された。切除の後、ダルベツコの修正さ１）　れたイーグル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　 Ｍ　−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ｍｏｄｉｆ　ｉｅｄ　ＥａｇｌＣｅ’ｓ　ｍｅ ｄｉｕｍ）に置かれた。標本は、短時間で組織培養実験１　室に運ばれて、表皮 がエイジンガー１Ｍの方法により酵素で真皮から分離された（皮膚研究における 方法（Ｍｅｔｈｏｄ　１ｎＳｋｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、編集者り、スケロー 、１９８５年第１９）　３頁）。

ケラチン細胞は以下のように修正されたエイジンガーの１　方法により単細胞懸 濁物として培養される、すなわちＨＫａ　が２％のウシの胎児血清と、表皮成長 因子と、インシュリンと、ｐＨ７，２でのヒドロコルチゾンを加えられたＤＭＥ Ｍ内で培養された。集密培養物は二次培養またはコラ−【　ゲン膜への接種のた めに１２日から１４日後に採取可能と繊維芽細胞はそれらをヒストリチフス！Ｉ （Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のコラゲナーゼで消化す ることにより真皮の断面から放出された。ＨＦはその後標準的な方法を利用して ＤＭＥＭ内で成長させられた。

ペトリ皿で凍結保存されたコラーゲンスポンジ膜（直径６ｃｍ）は無菌水で洗わ れかつ膜を緊密にするためにインキュベータ内で３７℃で脱水された。スポンジ はその後ならし培地を加えられたＤＭＥＭ内で一晩インキユベートされた。ＨＦ の草葉密培養物は４Ｘ１０’セル／ｍｌの密度でスポンジの表面に接種された。

スポンジはその後３７°Ｃ１５％の二酸化炭素と飽和湿度でインキュベータ内の ＤＭＥＸｔに１０日Ｍ置かれた。

培地は２日置きに変えられた。この期間の最後には、スポンジはひっくり返され て非多孔性の表面か培養ＨＫのための平坦な表面を提供するべく調製された。

ペプシンて処理した、非多孔性の、無菌のタイプ１のウシのコラーゲンの薄膜を 付与することによりラミネート処理が行なわれた。膜はテリオベブチドを取り除 くためにペプシン化されかつγ線放射で殺菌された商業的に入手可能な精製され たタイプＩのコラーゲンから調製された。コラーゲンの溶液は中性のｐＨにされ かつ薄膜としてコラーゲンスポンジの表面に塗布されかつ３７°Ｃで６０分間に わたってインキュベートされた。

培養されたＨＫは一滴あたりｌＸｌ０’の密度の水滴でスポンジの非多孔性の表 面に接種されかつ上記に述べた添加物を加えられたＤＭＥＭ内で１０日間インキ ュベートされた。臨床的な適用の前に、ウシの下垂体の抽出液を持たない培地が 培養皿に加えられた。移植片の傷への移送および固定を容易にするために、ワセ リンガーゼが培養移植片の上に置かれた。

本願の生体皮膚等個物を使用した５人の子供に対する８つの手術においては、成 功率は９０％であった。

ＲＤＥＢの子供たちの８つの手術においては、上記の移植片の臨床的かつ組織学 的な外観が、拒否反応が存在していないことを提示していた。

しかしながら、培養された同種移植片か長期にわたって生き残っているかまたは それらの恒久的な上皮への役割に関して直接的な証拠を見定めるために、以下の 例に述へる健康な成人の自発的被験者に対して臨床試験が行なわれた。

例２ 合成移植片と同種移植片とが例１に概要を述べたような態様で生成された。培養 されたケラチン細胞に平坦な表面を与えて、ヒトのケラチン細胞が架橋されたウ シのコラーゲンの基質の表面に付着させられた。この「皮膚培養物サンドイッチ 」か−塊で患者の漬床に移植され、コラーゲンのマトリックスが下に横たわる漬 床からの繊維芽細胞の内破を可能にする枠組みとしての役割を果たし、それによ りヒトのケラチン細胞が生き残り、かつ新しい真皮構造の形成が可能になった。

刺青をとるために、４人の自発的被験者に対して臨床研究が行なわれた。各被験 者は腕の上で除去された４つの皮膚の領域を育していた。２つの領域において、 皮膚は脂肪の位置まで除去されており、一方残りの２つの除去箇所はそこに真皮 の要素を残していた。全層および部分的な層の切除部分には培養された皮膚と中 間層自家移植片（コントロールとして）か移植された。傷が完全に治癒するまで ２週間にわたり包帯が巻かれた。傷は写真に撮られ、バイオプシが組織構造の研 究およびＤＮＡのフィンガブリンティングのために行なわれた。

被験者ｌは培養された皮膚を移植された２つの領域と自家移植片を移植された他 の２つの領域を有していた。２週間の後、移植片は生着しかつ移植片の収縮の証 拠は見られなかった。移植片の中心領域のバイオブシはよく分化しておりかつ多 層になった表皮を存しており、かつその真皮が緩く詰められたコラーゲンのマト リックスで、数々の繊維芽細胞と非炎症性の細胞を含んでいた。第３図と第５図 が培養された移植片からの皮膚のバイオブシの術後２週間の組織構造を示す。第 ４図は移植前の皮膚等傷物を示す。ＤＮＡフィンガプリンティングによれば、マ ークをつけた真皮の細胞性の証拠が見られたので、真皮細胞の幾つかが患者から 発生していることを示す供与体と受容体双方の細胞の混合された密集を示してい た。

被験者２゜移植片はとの領域においても生着しなかった。

３週間で肉芽を形成する傷という組織学的証拠が見られた。

被験者３゜４週間でいかなる収縮も伴わずにすべての移植片が治癒した。Ｍｉ織 学的検査によれば、十分に分化した表皮とハイパーセルの真皮が見られた。ＤＮ Ａのフィンガプリンティングにより、供与体と受容体細胞の混ざった密集状態か 見られた。

被験者４゜８週間の後、移植片は幾らかの収縮（約１５−２０％）を示し、この 患者の中央の移植片領域は完全に分化した表皮と付属器を伴わない成熟した真皮 とを存していた。

本願発明の全体的範囲および精神から逸脱することなく、上に記載した発明につ いて様々な変更および修正が加えられ得ることは、当業者にとり自明であろう。

Ｆ工ＧＵＲＥ　２ａ。

Ｆ工ＧＵＲＥ　２ｂ。

ｒｘｃｕｐｘ　ｓ。

要約 培養されたケラチン細胞からなる表皮層と、非多孔性コラーゲンからなる層と、 多孔性で架橋されたコラーゲンスポンジマトリックスにおける培養された繊維芽 細胞からなる真皮層とからなる合成生体皮膚等価物が記載される。好ましくはこ の非多孔性コラーゲンはタイプ１、タイプ３またはタイプ１と３のウシのコラー ゲンの混合物であって、ペプシンで処理されたものである。皮膚等価物を調製す るための方法が記載され、かつ皮膚等価物の生体外のテストを行なうためのテス トキットも記載される。この皮膚等価物は皮膚移植のための用途と、様々な物質 の皮膚に対する

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．培養されたケラチン細胞からなる表皮層と、高い純度の非多孔性コラーゲン からなる層と、多孔性の架橋されたコラーゲンスポンジ内にある培養された繊維 芽細胞からなる真皮層とを含む合成生体皮膚等価物。
2. ２．非多孔性コラーゲンがタイプ１コラーゲン、タイプ３コラーゲン、またはそ れらの混合物から選択される、請求項１に記載の合成生体皮膚等価物。
3. ３．非多孔性コラーゲンが、ペプシンで予め高度に精製されている、請求項１に 記載の合成生体皮膚等価物。
4. ４．繊維芽細胞が、真皮のサンプルをコラゲナーゼで処理することから得られる 、請求項１に記載の合成生体皮膚等価物。
5. ５．ケラチン細胞の層が、ケラチン細胞の単細胞懸濁物を入手し、かつその懸濁 物の水滴を非多孔性のコラーゲンの層に均一にかつ断続的に分配することにより 調製され、それがその後インキュベートされる、請求項１に記載の合成生体皮膚 等価物。
6. ６．適切な培地においてさらに培養されかつそれに物質が付与され得る、請求項 １に記載の合成生体皮膚等価物を含む、皮膚に対する物質の影響を試験するため のテストキット。
7. ７．合成生体皮膚等価物を調製するための方法であって、（ａ）皮膚のサンプル を入手しかつそのサンプルを酵素で処理して真皮から表皮を分離させるステップ と、（ｂ）表皮を酵素で処理してケラチン細胞を放出させ、かつ集密状態になる まで表皮ケラチン細胞を培養するステップと、 （ｃ）真皮を酵素で処理して繊維芽細胞を放出させ、かつ繊維芽細胞を準集密状 態に至るまで培養するステップと、 （ｄ）多孔性の、架橋されたコラーゲンスポンジ膜の片側にはステップ（ｃ）か ら培養された繊維芽細胞を接種し、かつ接種を受けたスポンジをインキュベート してコラーゲンスポンジを通る繊維芽細胞の成長を可能にするステップと、 （ｅ）架橋されたコラーゲンスポンジの他方側に非多孔性コラーゲンからなる層 を形成しかつそれをインキュベートして非多孔性コラーゲンの層を重合するステ ップと、（ｆ）ステップ（ｅ）からの重合された層にステップ（ｂ）からの培養 されたケラチン細胞を接種し、かつこうして形成された合成皮膚等価物をインキ ュベートしてさらなる細胞の成長を可能にするステップとを含む、方法。
8. ８．非多孔性のコラーゲンがタイプ１コラーゲン、タイプ３コラーゲン、または それらの混合物から選択される、請求項７に記載の方法。
9. ９．非多孔性コラーゲンがペプシンでの前処理でさらに精製される、請求項７に 記載の方法。
10. １０．繊維芽細胞が、真皮をコラゲナーゼで処理することにより放出される、請 求項７に記載の方法。
11. １１．ステップ（ｆ）の接種が、重合された非多孔性コラーゲン層に対しケラチ ン細胞の単細胞懸濁物の水滴を均一にかつ断続的に分配することにより行なわれ る、請求項７に記載の方法。
12. １２．皮膚に対する物質の影響をテストするためのテストキットを調製する方法 であって、請求項７に従う合成生体皮膚等価物を調製しかつその後その皮膚等価 物を適切な培地において空気中でさらに培養するステップを含む、方法。
13. １３．皮膚に対する物質の影響をテストする方法であって、適切な培地において 空気中でさらに培養をされた、請求項１の皮膚等価物に対して、テスト対象の物 質を塗布し、かつその後その皮膚等価物における変化を観察またはテストするス テップを含む、方法。