PT1276486E - Reparação de articulação utilizando células estaminais do mesênquima - Google Patents

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ΕΡ 1 276 486/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Reparação de articulação utilizando células estaminais do mesênquima" A presente invenção refere-se à reparação de articulações que tenham sido feridas e/ou sujeitas a desordens como a osteoartrite. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à reparação de articulações para a prevenção ou redução da esclerose óssea subcondral numa articulação, e para a prevenção dos danos na cartilagem articular numa articulação, e para a prevenção ou redução da formação de osteófitos numa articulação, pela administração de células estaminais do mesênquima (MSC) a uma articulação que precise de reparação. A osteoartrite é uma das doenças mais comuns da articulação. Há evidência radiológica da doença em aproximadamente 70% dos indivíduos acima dos 65 anos, com uma incidência ligeiramente mais elevada nos indivíduos do sexo feminino. No intervalo etário de 45-65 anos, a incidência aproxima-se dos 30% da população (American Academy of Orthopedic Surgeons, 1992) . A osteoartrite é uma doença degenerativa que envolve a erosão da superfície articular nas extremidades dos ossos, conduzindo em última análise à perda completa da superfície da cartilagem e à exposição do osso subcondral. Estas alterações acompanham o início de sintomas graves incluindo perda de movimento, rigidez e dor na articulação. A cartilagem articular, uma vez danificada, não demonstra significativa auto-reparação. A pouca reparação de tecido que ocorre é de natureza tipicamente fibrosa e é um substituto verdadeiro funcional inadequado para a cartilagem articular. Investigaram-se vários métodos para melhorar a cura de defeitos na cartilagem articular, com vários graus de sucesso.

Embora a osteoartrite seja uma doença principal que afecta uma grande proporção da população, os factores causais são desconhecidos. As lesões no joelho que envolvem o menisco ou o ligamento cruzado anterior (LCA) aumentam significativamente o desenvolvimento de gonartrose radiográfica. A lesão meniscal resulta por si só num aumento de 20 vezes no risco de desenvolver osteoartrite. Em pacientes 2 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ que sofrem lesões no LCA ou noutros ligamentos em combinação com ruptura do menisco, há uma probabilidade muito alta de se desenvolver osteoartrite do joelho. (Gillquist and Messner, Sports Med., Vol. 27, pgs. 143-156 (1999)). A meniscectomia medial ou lateral ou a ressecção do LCA têm sido usadas como um meio de criar instabilidade nas articulações do joelho conduzindo ao desenvolvimento de lesões osteoartriticas de animais grandes como a ovelha (Ghosh, et al., Clin. Orthop., Vol. 252, pgs. 101-113, 1990; Little, et al., J. Rheumatol., Vol. 11, pgs. 2199-2209, 1997) e o cão (para revisão veja-se Brandt, Ann. N.Y. Acad. Sei., Vol. 732, pgs. 199-205, 1994). Estes animais, contudo, diferem dos seres humanos relativamente à estrutura da camada de cartilagem articular e do osso subcondral e também nas propriedades mecânicas do tecido. A cabra adulta tem a vantagem de ser activa e ter uma organização estrutural e tecidual na articulação da babilha que se compara bem com o joelho humano. Há poucos relatos na literatura que demonstrem a utilização da cabra como um modelo da osteoartrite humana. Num estudo prévio, que envolve quatro cabras, a transecção do ligamento cruzado anterior resultou em defeitos focais na cartilagem condilar (Ho, et al., Invest. Radiol., Vol. 27, pgs. 84-90, 1992) . Num estudo mais recente, contudo, a transecção cirúrgica do ligamento cruzado não produziu alterações osteoartriticas após 8 meses em cabras confinadas, novas (Rorvik e Tiege, Acta. Vet. Scand., Vol. 37, pgs. 265-272, 1996) .

Num esforço para desenvolver lesões osteoartriticas reprodutíveis na babilha da cabra, as cabras foram sujeitas a ressecção do LCA, meniscectomia medial ou a uma combinação de ambos os procedimentos. (Murphy, et al., Transactions of the 45th Meeting of the Orthopedic Research Society, Vol. 24, page 1035 (1999)). Este estudo foi conduzido em colaboração com a Tufts University School of Veterinary Medicine. Um espectro completo de alterações osteoartriticas ocorreu nas babilhas destes animais e a gravidade das alterações dependeu do procedimento cirúrgico utilizado. As lesões mais suaves ocorreram como resultado da ressecção do LCA e as lesões mais graves ocorreram como resultado do procedimento combinado. A meniscectomia medial isolada produziu lesões moderadas. A 3 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ ressecção do LCA resultou na formação de osteófitos e de outras alterações subcondrais e na fibrilação da superfície da cartilagem, principalmente no côndilo medial anterior. A meniscectomia medial também induziu a formação de osteófitos e de outras alterações subcondrais e lesões na cartilagem, confinadas principalmente ao côndilo medial médio. Estas alterações foram mais graves do que as verificadas como resultado da ressecção do LCA. A meniscectomia medial em combinação com a ressecção do LCA resultou em alterações osteoartríticas avançadas em ambos os tecidos moles e duros na babilha da cabra após 12 semanas. A cartilagem na meseta tibial medial desprotegida também foi afectada, embora haja algum grau de osteoartrite espontânea neste local. Não houve reparação do LCA ou do menisco medial nestas cabras após 12 semanas, embora houvesse fibrose evidente como resultado da meniscectomia medial. Observou-se num animal o desenvolvimento de um tecido fibroso semelhante a meniscal, no seguimento de uma combinação de ressecção do LCA e meniscectomia medial. Isto pode ter sido o resultado de meniscectomia incompleta.

Num segundo estudo, investigou-se ainda a formação de lesões osteoartríticas ligeiras como resultado da ressecção do LCA na cabra. Este procedimento é relativamente não agressivo e potencialmente reversível e, como tal, apresenta uma opção adicional para a avaliação da terapia de MSC em osteoartrite. 0 segundo estudo foi conduzido para validar que os ligeiros sintomas osteoartríticos observados aos três meses progrediram para uma forma mais grave com maior dano para a superfície articular num momento posterior. Neste estudo, as cabras, que foram submetidas a ressecção unilateral do LCA em combinação com um ligeiro regime de exercício, desenvolveram sintomas de osteoartrite em três meses. Os sintomas eram principalmente alterações osteofíticas com pouco dano para a superfície da cartilagem. Aos 6 meses houve dano condral mais grave. Isto confirmou que a ressecção do LCA na babilha da cabra conduziria a alterações de cartilagem semelhantes às da osteoartrite precoce em seres humanos. A maioria das aproximações actualmente disponíveis para o tratamento da osteoartrite envolve o controlo de sintomas com pouco impacto na erosão da cartilagem. A terapia celular oferece oportunidades potenciais para intervenção, pela 4 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ inversão ou inibição da erosão da cartilagem. São possíveis uma série de aproximações, que envolvem tanto a implantação directa de condrócitos como a entrega de mitógenos ou factores de crescimento apropriados que podem estimular a proliferação de condrócitos do hospedeiro. Outras aproximações envolvem a entrega de factores citostáticos ou de ligação celular para melhorar a população de células progenitoras local, conduzindo em última análise à reversão do processo de degradação. Muito do trabalho nesta área tem-se centrado em torno da chamada engenharia de construção de cartilagem, i.e., o cultivo de condrócitos num suporte de biomatriz numa montagem ex vivo, com subsequente entrega da construção ao local da lesão. Outras aproximações confiaram no desenvolvimento de procedimentos que envolvem a fixação de células implantadas debaixo de uma aba suturada de tecido ectópico, ou fáscia ou periósteo. Nenhum destes métodos, contudo, é provável que seja aplicável na estabilização mecânica da articulação doente ou danificada.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é divulgado um método de reparação de uma articulação num animal. 0 método compreende a administração de células estaminais do mesênquima à articulação. 0 animal pode ser um mamífero e, em particular, pode ser um primata não humano ou humano.

As células estaminais do mesênquima podem ser autólogas para o receptor, ou podem ser alogénicas para o receptor.

As células estaminais do mesênquima podem ser obtidas por meios conhecidos para os peritos na especialidade. Por exemplo, as células estaminais do mesênquima podem ser obtidas a partir de um aspirado de medula óssea e depois expandidas em cultura. Uma vez expandidas em cultura, as células estaminais do mesênquima são administradas à articulação.

As células estaminais do mesênquima podem ser administradas à articulação em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável. A selecção de um transportador adequado está dentro do conhecimento da pessoa competente na matéria. Transportadores farmaceuticamente adequados incluem, mas não se lhes limitam, hialuronano, hialuronano modificado 5 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ quimicamente, solução salina, solução salina tamponizada com fosfato, sulfato de condroitina, glucosamina, manosamina, proteoglicano, fragmentos de proteoglicano, quitina, quitosano, ou outro polissacárido ou material de polímero.

Os candidatos descobriram que as células estaminais do mesênquima, quando administradas a uma articulação, proporcionam a reparação e a estabilização de uma articulação danificada, onde tal dano seja devido a lesão, inflamação e/ou uma doença ou desordem como a osteoartrite, por exemplo. As células estaminais do mesênquima não precisam de ser administradas num suporte, embora um suporte possa ser empregue. Quando administradas a uma articulação, as células estaminais do mesênquima diferenciam-se em tecido cartilaginoso, incluindo tecido meniscal. Embora o âmbito da presente invenção não se destine a ser limitado a qualquer raciocínio teórico, acredita-se que as células estaminais do mesênquima, quando administradas à articulação, respondem às forças destrutivas na articulação devidas ao tecido perdido e/ou danificado, pelo que as células estaminais do mesênquima se diferenciam em tecido fibrocartilaginoso. Assim, as células estaminais do mesênquima, quando administradas a uma articulação, são capazes de substituir tecido perdido e/ou danificado na articulação, incluindo tecido meniscal. Assim, a administração de células estaminais do mesênquima a uma articulação proporciona a regeneração de tecido cartilaginoso, incluindo tecido meniscal, na articulação, proporcionando desse modo a reparação e a estabilização da articulação, assim como a redução de dor na articulação e a redução de esclerose óssea subcondral.

Assim, as células estaminais do mesênquima podem ser administradas a uma articulação para proporcionar a reparação e a estabilização de articulações danificadas, lesionadas ou inflamadas. 0 dano, lesão ou inflamação pode ser associado com uma doença ou desordem, como osteoartrite, artrite reumatóide, gota, artrite reactiva, artrite psoriática ou artrite juvenil, por exemplo. Também pode resultar de uma osteoartrose ou doença crónica da articulação de carácter não inflamatório.

As articulações que podem ser reparadas e/ou estabilizadas e/ou nas quais a inflamação pode ser reduzida, 6 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ incluem, mas não se lhes limitam, articulações do joelho, articulações da anca, articulações dos ombros, articulações do cotovelo, articulações do tornozelo, articulações do tarso e do metatarso, articulações do pulso, coluna vertebral, articulações carpal e metacarpal e a articulação temporo-mandibular.

As células estaminais do mesênquima são administradas numa quantidade eficaz para a reparação e/ou estabilização da articulação no receptor. Em qeral, as células estaminais do mesênquima são administradas numa quantidade que varia de cerca de lxlO4 até cerca de l,5xl08, preferivelmente de cerca de lxlO5 até cerca de lxlO8, mais preferivelmente de cerca de lxlO6 até cerca de lxlO7. O número exacto de células está dependente de uma variedade de factores, incluindo, mas não se lhes limitando, a idade, peso e sexo do paciente, a extensão e gravidade do dano ou lesão para a articulação, ou da doença que afecta a articulação, o grau de exsudação no interior da articulação, o espaço da articulação e outras caracteristicas anatómicas que irão influenciar a entrega. A lesão de uma articulação especifica pode ser determinada pela prática médica comum, incluindo mas não se lhes limitando, dados de raios-X e MRI, visualização por artroscopia e revisão de uma história médica e exame físico do paciente. A invenção será agora descrita relativamente aos desenhos, em que:

Figura 1. Efeito de MSC na formação de tecido semelhante a meniscal em joelhos de cabra previamente desestabilizados por uma combinação de ressecção do LCA e meniscectomia medial.

Formou-se tecido semelhante a meniscal imaturo (seta preta) na área entre o côndilo medial (MC) e a meseta tibial medial (MTP) nos joelhos previamente desestabilizados por ressecção do LCA e meniscectomia medial e expostos a MSC, de G151 (A), G154 (B) e G163 (C).

Figura 2. Efeito de MSC no desenvolvimento de lesões na cartilagem no côndilo medial médio em joelhos de cabra previamente desestabilizados por uma combinação de ressecção do LCA e meniscectomia medial. As lesões na cartilagem classificadas como descrito na Tabela 2 e com pontuações 7 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ indicadas na Tabela 3 desenvolveram-se no côndilo medial médio das cabras apenas com o veiculo (G102, G127, e G143, imagens do painel superior esquerdo, médio e direito, respectivamente). As MSC injectadas juntamente com o veiculo preveniram o desenvolvimento de graves lesões neste local em vários animais, por exemplo, no caso de G151 (painel do fundo, imagem do meio) mas não em todos os casos, como no caso de G166 (painel do fundo, imagem da direita).

Figura 3. Aspecto bruto de tecido 6 meses após a cirurgia. Aspecto bruto das superfícies tibiais com meniscos ligados (A e C) e do côndilo medial médio e anterior (B e D) de um joelho de cabra osteoartrítico injectado com HA (A e B) e com MSC transduzidas com GFP, mais HA (C e D) . As setas indicam o neotecido meniscal formado numa articulação exposta a MSC e a uma proliferação semelhante a sinovial observada num joelho de cabra controlo. 0 asterisco indica formação de osteófitos.

Figura 4. Análise histológica de Neotecido Meniscal.

Micrografias de fluorescência de tecido meniscal mostram células positivas para GFP na superfície condilar do neotecido meniscal (B e C). Tomou-se uma micrografia negativa do posterior do tecido de corte não exposto ao ambiente da articulação. As células no centro do tecido ligam o anticorpo anti-colagénio Tipo II (D a F). A ampliação original foi 200x para A a E e lOOx para F.

Figura 5. Análise histológica do côndilo medial médio de cabras de 3 meses que receberam uma injecção intra-articular de hialuronano de sódio (grupo tratado com HA) ou injecção intra-articular de MSC suspensa em hialuronano de sódio (Grupo tratado com HA+MSC). Secções transversas do côndilo medial médio de cabras tratadas com HA (n=3, painéis esquerdos) e de cabras tratadas com HA+MSC (n=6, painéis central e direito) . As setas apontam para osteófitos.

Figura 6. Aspecto macroscópico da meseta tibial de animais tratados com células alogénicas suspensas numa solução de hialuronano de sódio ou 1 ou 6 semanas a seguir a meniscectomia medial completa. Os animais controlo foram tratados por injecção unicamente com hialuronano de sódio. Nos 8 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ grupos tratados ο neotecido meniscal foi separado da meseta tibial e pareceu proporcionar uma superfície de suporte. A invenção será agora descrita relativamente aos exemplos seguintes; contudo, o âmbito da presente invenção não se destina a ser deste modo limitado. EXEMPLO 1

Foram obtidas um total de 12 cabras macho Western Cross castradas, que foram confirmadas como negativas para Febre Q, brucelose e artrite encefalite caprina. As cabras foram divididas aleatoriamente em 4 grupos que não eram diferentes uns dos outros em idade ou peso. Todas as cabras foram submetidas a uma aspiração de medula óssea para obter células estaminais do mesênquima (MSC) e a cirurgia para criar instabilidade num joelho para o desenvolvimento de osteoartrite experimental. As cabras foram sujeitas ou a ressecção do LCA (n=6) ou a meniscectomia medial total (n=6). Após um período de recuperação de 2 semanas, as cabras foram exercitadas 5 dias por semana durante 12 semanas. As células estaminais do mesênquima autólogas transduzidas com proteína fluorescente verde (GFP) foram então introduzidas em ambas as articulações controlo contralateral e operada. Todas as cabras em cada grupo receberam injecções de 5 ml de uma suspensão de lxlO6 células/ml com (n=3) ou sem (n=3) hialuronano de elevado peso molecular (4 mg/ml). As articulações foram examinadas em necropsia após 7 dias. Em todos os casos foram detectadas células transduzidas com GFP no fluido sinovial e na lavagem de fluido sinovial e foram recolhidas do fluido sinovial num estado viável e puderam ser expandidas em cultura. A microscopia fluorescente revelou que as células adicionadas colonizaram e integraram-se com camadas superficiais de tecidos moles no interior da articulação, incluindo o menisco. Estas observações demonstraram que células estaminais do mesênquima podem ser entregues com sucesso a uma articulação osteoartrítica por injecção directa, que as células são retidas no interior da articulação, colonizam superfícies de tecidos moles e podem ser recuperadas numa forma viável após 1 semana. 9 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ EXEMPLO 2

Foram obtidas um total de 24 cabras macho Western Cross castradas, que foram confirmadas como negativas para Febre Q, brucelose e artrite encefalite caprina. As cabras foram divididas aleatoriamente em 4 grupos que não eram diferentes uns dos outros em idade ou peso. Todas as cabras foram submetidas a uma aspiração de medula óssea para obter células estaminais do mesênquima (MSC) e a cirurgia para criar instabilidade num joelho para o desenvolvimento de osteoartrite experimental. Mostram-se os grupos na Tabela 1.

Tabela 1 Grupo n Injecção de células Sacrifício 1 3 Apenas com o veículo (5ml) 6 semanas após a operação. 12 semanas após a operação. 2 6 MSC transduzidas com GFP & veículo 6 semanas após a operação. 12 semanas após a operação. 3 6 Apenas com o veículo (5ml) 6 semanas após a operação. 26 semanas após a operação. 4 9 MSC transduzidas com GFP & veículo 6 semanas após a operação. 26 semanas após a operação.

Os Grupos 1 e 2 não foram significativamente diferentes relativamente ao peso (Teste t de Student, p=0,68) (Tabela 2); contudo, o Grupo 4 era mais pesado do que o grupo de controlo correspondente (Grupo 3) (Teste t, p=0,001). As cabras foram alojadas em grupo e alimentadas com uma dieta comercial de ruminantes de alimentação em grão e feno.

Na Tabela 2 abaixo é dado o peso de todas as cabras, na cirurgia para desestabilizar uma babilha, na injecção de células estaminais do mesênquima e no sacrifício. 10 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ

Tabela 2

Marca auricular No. Animal Osiris No. Grupo Peso na Cirurgia (kg) Peso na Injecção (kg) Peso no Sacrificio (kg) 350 G102 Veículo isolado/12 semanas sacrifício 93,2 81,8 92, 7 394 G12 7 Veículo isolado/12 semanas sacrifício 82,3 67, 7 76,4 390 G143 Veículo isolado/12 semanas sacrifício 70,0 5 9,6 66,4 Média Desvio Padrè o (SD) 81,8 11,6 69,7 11,2 78,5 13,3 367 G151 Veículo + células/12 semanas sacrifício 86,8 76,8 84,1 379 G154 Veículo + células/12 semanas sacrifício 79,6 70,0 70,5 329 G163 Veículo + células/12 semanas sacrifício 70, 9 68,2 68,6 336 G164 Veículo + células/12 semanas sacrifício 75, 0 65,5 64,1 342 G165 Veículo + células/12 semanas sacrifício 89,1 81, 4 84,1 352 G166 Veículo + células/12 semanas sacrifício 73, 6 66,8 73,2 Média SD 79,2 7,4 71,5 6,3 74,1 8,3 324 G144 Veículo isolado/26 semanas sacrifício 80,0 67, 3 90, 9 355 G152 Veículo isolado/26 semanas sacrifício 84,1 64,6 80,0 319 G153 Veículo isolado/26 semanas sacrifício 85,5 65, 0 81, 4 302 G13 7 Veículo isolado/26 semanas sacrifício 80, 5 67, 7 80,5 338 G139 Veículo isolado/26 semanas sacrifício 85,0 72, 7 94, 1 387 G094 Veículo isolado/26 semanas sacrifício 78,2 69,6 84,1 Média SD 82,2 3,0 67,8 3,0 85,2 5,9 326 G112 Veículo + células/26 semanas sacrifício 97, 7 79,1 97,3 395 G114 Veículo + células/26 semanas sacrifício 111,8 88,6 118,6 363 G120 Veículo + células/26 semanas sacrifício 90,9 76,4 83,2 392 G122 Veículo + células/26 semanas sacrifício 100,0 80,5 93,6 327 G131 Veículo + células/26 semanas sacrifício 90,9 76,4 87,7 332 G141 Veículo + células/26 semanas sacrifício 110,9 89,1 106,4 389 G150 Veículo + células/26 semanas sacrifício 79,1 64,1 80,9 378 G16 7 Veículo + células/26 semanas sacrifício 72, 7 66,4 83,6 391 G168 Veículo + células/26 semanas sacrifício 81,8 68,6 90,9 Média SD 92,9 13,6 76,6 9,0 93,6 12,3

Pelo menos duas semanas antes da cirurgia aspirou-se medula da cristã ilíaca de cada cabra e foram isoladas e 11 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ cultivadas células estaminais do mesênquima a partir dos aspirados utilizando o procedimento seguinte. A medula foi adicionada a Meio Completo de MSC Humanas (hMSC) (DMEM com baixa concentração de glucose contendo 10% de soro fetal de bovino de lotes seleccionados e Penicilina-Estreptomicina a 10 mL por litro) e centrifugada para peletizar as células e remover a camada de gordura. As células foram lavadas com meio e plaqueadas em placas de cultura a 100 000-400 000 células/cm2. Todas as preparações foram cultivadas a 37°C numa atmosfera humidificada contendo CO2 a 5%. As células não aderentes foram removidas 3-5 dias após o plaqueamento, no momento da primeira mudança de meio e o meio foi mudado duas vezes por semana depois disso. Quando as placas de cultura se tornaram quase confluentes, as células foram separadas com tripsina a 0,05% (p/v) contendo EDTA 1 mM, durante 5 min a 37°C. Para subcultura, as MSC foram plaqueadas em recipientes T-185 a 0,5-l,0xl06 células por recipiente em 35 mL de Meio Completo hMSC. As MSC não utilizadas imediatamente foram criopreservadas por congelação em meio de congelação de MSC (40 ml de Meio Completo de MSC, 5 ml de FBS e 5 ml de DMSO).

As MSC humanas podem ser isoladas e cultivadas de acordo com o método divulgado em US 5 486 359. As MSC humanas podem também ser compradas a BioWhittaker (Walkersville, MD). A utilização de MSC alogénicas é discutida no Pedido PCT N° PCT/US99/05351.

Criou-se instabilidade de uma babilha em cada cabra por ressecção cirúrgica do LCA e meniscectomia medial. No dia anterior à cirurgia, a alimentação foi removida e imediatamente antes da cirurgia as cabras foram anestesiadas com torbutrol (pré-analgésico) e um cocktail de quetamina e diazepam (para a indução). Um membro posterior foi grampeado do tarso até ao nivel da articulação coxofemoral e limpo de modo asséptico. O animal foi transportado para a sala de operações e anestesiado utilizando isofluorano, onde foi realizada uma preparação estéril final utilizando uma técnica de pernas suspensas. A perna foi envolta utilizando toalhas e o pé distai embrulhado em toalhas estéreis e ligadura veterinária. Foi realizada uma artrotomia lateral e 0 ligamento cruzado anterior (cranial) foi excisado da sua inserção na face medial do côndilo lateral femoral utilizando 12 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ uma lâmina #11. Esta inserção proximal foi trazida para a frente (anterior) e todo o ligamento cruzado foi excisado da sua inserção tibial. 0 corno caudal do menisco foi apreendido com pinça hemostática e a sua inserção axial (lateral) foi excisada da sua inserção tibial. Trabalhando de caudal para lateral, depois cranial, o menisco foi excisado das inserções até ser completamente removido. A babilha foi movida num teste de gaveta para assegurar que todo o ligamento cruzado tinha sido excisado. A cápsula da articulação foi fechada utilizando material de sutura sintético absorvível (exemplos incluem Vicryl, PSD, Dexon, Maxon, etc.) num padrão simples contínuo ou cruzado. A fáscia lateral foi fechada utilizando material de sutura sintético absorvível 0 ou 2-0 num padrão contínuo. Os tecidos subcutâneos foram fechados utilizando material de sutura sintético absorvível 2-0 num padrão subcuticular. A pele foi fechada utilizando agrafos para pele.

Foram administrados analgésicos duas vezes por dia durante três dias, após a operação. A incisão foi monitorizada para sinais de infecção, incluindo vermelhidão, exsudado e inchaço excessivo. Os agrafos/suturas da pele foram removidos em duas semanas. Após um período de recuperação de duas semanas, todos os animais foram exercitados durante cinco dias por semana até ao sacrificio. 0 regime de exercício consistiu de uma corrida de aproximadamente 90 m de comprimento.

Preparação de MSC transduzidas para Injecção na Articulação do joelho O plasmideo pOT24, que inclui uma sequência de polinucleótidos que codifica a proteína GFP, foi transfectado para a linha de células de encapsidação GP+E86 e o vírus foi produzido pelas células GP+E86 modificadas. Este vírus foi então transduzido para a linha de células de encapsidação PG13 e o vírus foi produzido pelas células PG13 modificadas.

As MSC, criopreservadas no final da cultura primária, foram descongeladas e transduzidas com o retrovírus produzido a partir da linha de células de encapsidação PG13 (com base em 3T3 de ratinho) contendo um envelope de macaco gibão (Coffin et ai., Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Cold Spring Harbor, N.Y., pgs. 71-119, 1997). O vírus 13 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ transportou a sequência para a proteína fluorescente verde melhorada da medusa Aequorea victoria. A transdução padrão foi realizada do seguinte modo: as células estaminais do mesênquima de cabra foram cultivadas durante a noite em recipientes T80 a 37°C em C02 a 5% em ar após o que o meio de cultura em cada recipiente foi substituído com 15 mL de cocktail de transdução para transdução centrífuga, após o que se adicionaram 2 mL de meio fresco e a incubação continuou. A transdução centrífuga foi realizada do seguinte modo: o meio de cultura em cada recipiente foi substituído com 15 mL de cocktail de transdução e centrifugado numa centrífuga Beckman GS-6R utilizando transportadores de recipientes a diferentes forças centrífugas e duração a 32°C. Após a centrifugação, adicionaram-se 15 mL de meio fresco a cada recipiente. Um segundo protocolo de transdução foi realizado no dia seguinte. As células foram seleccionadas em G418 a uma concentração de 1,0 mg/mL e mantidas em cultura. Após a selecção em G418, as MSC transduzidas foram expandidas para o fim da cultura de passagem 2 (P2) e tripsinizadas e congeladas até serem requeridas para injecção. A eficiência da transdução foi determinada utilizando citometria de fluxo antes da criopreservação.

Descongelaram-se os frascos contendo as MSC de cabra transduzidas criopreservadas rapidamente a 37°C e adicionaram-se a 4 0 ml de Meio hMSC Completo. As células foram centrifugadas durante 5 min a 1500 rpm e 20°C e ressuspensas em 5 ml de PBS. Removeram-se 50 μΐ de suspensão celular para determinação da contagem de células viáveis utilizando Azul de Tripano. Lavou-se um total de lOxlO6 células com 20 ml de PBS duas vezes e ressuspendeu-se em 5 ml de Hyalartin V 4 mg/ml (Pharmacia) utilizando uma seringa de 12-ml com uma agulha 18G ligada. A suspensão celular foi aspirada para a seringa para injecção no joelho da cabra e 1-ml de PBS foi adicionado ao tubo para lavagem.

Injecção de MSC de Cabra Transduzidas na Babilha da Cabra

As cabras foram pesadas e o sangue foi recolhido para a obtenção de soro. A área do joelho foi rapada e as cabras foram anestesiadas e intubadas. Após a obtenção de radiografias crânio-caudal e lateral de ambos os joelhos, a 14 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ cabra foi colocada em decúbito dorsal com o joelho a ser injectado mantido em cima. A área em redor do joelho foi esterilizada e o joelho foi flexionado e estendido 20 vezes para a circulação do fluido sinovial. Com o joelho colocado em flexão de 70-90°, foi aspirado tanto fluido quanto possível da articulação e retido para análise. Com o joelho na mesma posição, injectaram-se lateralmente na articulação 10-20 ml de PBS. Uma agulha 18G foi inserida imediatamente proximal ao menisco e posterior à borda lateral do ligamento patelar, através do triângulo formado pelo epicôndilo do fémur, a meseta meniscal/tibial e o entalhe formado pela sua junção. Após flexionar e estender 20 vezes, a lavagem foi aspirada da articulação e retida. Foi inserida uma torneira de paragem de três vias com uma agulha 18G ligada no triângulo acima descrito no lado medial da articulação, imediatamente medial ao ligamento patelar. Com a torneira de paragem na posição aberta, a seringa contendo a suspensão celular preparada como acima descrito foi ligada à torneira de paragem e a suspensão celular injectada na cápsula da articulação. Qualquer suspensão remanescente na torneira de paragem foi lavada com 1 ml de PBS. A articulação foi flexionada e estendida 20 vezes e a cabra foi mantida nesta posição durante pelo menos 10 min antes da recuperação e transferência para o recinto de espera.

Necropsia da Cabra e Colecção de Tecidos

Os Grupo 1 e 2 de cabras foram sacrificados seis semanas após a injecção de células transduzidas na articulação. Recolheram-se os gânglios linfáticos poplíteo e inguinal de ambos os membros controlo operado e contralateral antes da desarticulação na anca. Foram tiradas radiografias e foi recolhido fluido sinovial sem lavagem e também após uma lavagem com 10 ml de PBS. Após aspiração da lavagem, a articulação foi dissecada e os seguintes tecidos foram recolhidos: revestimento da cápsula sinovial/articulação, almofada adiposa, tendão extensor digitorum longus, ligamento cruzado posterior e menisco lateral. Qualquer tecido de reparação meniscal medial foi também recolhido.

Após dissecção, foram classificadas visualmente as 13 áreas de cartilagem em ambas as articulações controlo operada e contralateral e ambas as articulações dos animais 15 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ controlo utilizando ο sistema de classificação descrito na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

Pontuação Descrição <0, 5 Dentro dos limites normais. 0,5 Rugosidade menor. 1,0 Condromalácia evidente, mas não grave. 1,5 Erosão de cartilagem com fibrilação. Condromalácia grave. 2, 0 Lesão definida. Sem exposição de osso subcondral. 2,5 Exposição de osso subcondral. Lesão avançada. 3, 0 Completa degradação da cartilagem.

As áreas seleccionadas foram localizadas nas secções protegidas e desprotegidas das mesetas lateral e medial, nas secções anterior, média e posterior do côndilo medial, nas secções média e posterior do côndilo lateral, nas secções lateral, central e medial da cristã troclear e na patela. Utilizando um bisturi, obtiveram-se amostras de cartilagem dos côndilos mediais lateral e médio e da área desprotegida das mesetas tibiais medial e lateral. As porções de todos os tecidos recolhidos sofreram congelação rápida para análise molecular e foram fixadas em formalina para análise histológica. As articulações também foram fixadas em formalina. Todas as articulações foram fotografadas antes da fixação e fotografadas e reexaminadas após fixação para confirmação das pontuações de classificação e para observar a presença de osteófitos. A distância entre as cristãs trocleares medial e lateral foi medida e expressa como a Distância Troclear (TRD). Foram cortados segmentos dos côndilos mediais lateral e médio e da área desprotegida das mesetas tibiais lateral e medial utilizando uma serra e foram ambos descalcifiçados e embebidos em parafina para análise histológica ou embebidos em metilmetacrilato sem descalcificação. Algumas articulações contralaterais foram tratadas da mesma maneira que a articulação operada e avaliadas como tecidos controlo. 16 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ

Radiografia

Realizaram-se radiografias antes da cirurgia inicial, na injecção e no sacrificio.

Resultados e Discussão

No sacrificio dos 3 meses, todas as articulações operadas (Grupos 1 e 2, apenas com o veiculo e +Células) estavam fibróticas e com efusão. Na Tabela 4 abaixo são dados os volumes de fluido sinovial como uma indicação da extensão da efusão, a pontuação da cartilagem e o TRD como uma indicação de alterações subcondrais ou de alargamento de osteófitos do sulco troclear.

Tabela 4 ID da Cabra Grupo Efusão (Volume de Fluido Sinovial ml) TRD (% aumento sobre a articulação controlo) Pontuação da Cartilagem no Côndilo medial médio (Escala 0-3) Estruturas semelhantes a meniscal G102 Veículo 8, 6 19, 7 2,0 Sem reparação visível do menisco medial (MM) . G127 Veículo 3, 5 14, 1 2,0 Tecido de reparação MM fibroso anterior amostrado e fixado. G143 Veículo 6, 0 24, 4 2,0 Tecido de reparação MM fibroso anterior amostrado e fixado. G151 +Células 4,0 11,5 2,0 (Pequena Lesão) Massa vascularizada semelhante a menisco encontrada sobre a área desprotegida da meseta tibial medial. Opaca, micácea. 17 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ ID da Cabra Grupo Efusão (Volume de Fluido Sinovial ml) TRD (% aumento sobre a articulação controlo) Pontuação da Cartilagem no Côndilo medial médio (Escala 0-3) Estruturas semelhantes a meniscal G154 +Células 1,4 9,3 1,0 Reparação anterior e posterior de menisco medial Parte posterior opaca, micácea. G163 +Células 6,5 2, 8 1,5 Reparação anterior e posterior de menisco medial Parte posterior opaca, micácea. G16 4 +Células 7,0 3,2 2,0 Reparação anterior e posterior de menisco medial Parte posterior opaca, micácea, mas pequena e não organizada. G165 +Células 10, 5 20,5 1,0 Material semelhante a meniscal na meseta tibial medial protegida, anterior e posterior. Assente na porção óssea, massa calcificada na meseta tibial medial posterior. G166 +Células 10, 0 18,6 2,5 (3,0) Reparação anterior e posterior de menisco medial Parte posterior opaca, micácea, mas pequena e não organizada.

Todas as articulações operadas mostraram formação de osteófitos.

Em quatro dos seis joelhos que foram tratados com MSC, a quantidade de formação de osteófitos foi menor. A formação de osteófitos noutros locais na articulação destas cabras também foi menor quando comparada com joelhos expostos a hialuronano 18 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ isolado. Em todos os casos houve formação grave de osteófitos na meseta tibial medial posterior; contudo, a superfície recém-formada nos joelhos expostos a MSC pareceu ser mais suave e foi observado hematoma neste local no caso de duas das três cabras apenas com o veículo. No caso de G165 (MSC e veículo) o osteófito manifestou-se como uma massa de tecido calcificado duro (31,2mm x 41,29mm x 23,65mm) coberto por uma estrutura semelhante a meniscal. Todas as articulações contralaterais estavam com aspecto normal e não mostraram efusão no sacrifício.

Em todas as seis cabras'+MSC' havia tecido com o aspecto de "menisco imaturo" cobrindo alguma da parte exposta da meseta tibial medial e em 3 casos este tecido era organizado. As Figuras ΙΑ, 1B e 1C mostram o aspecto e a localização do tecido de reparação para G151, G154 e G163, respectivamente. Nestes casos o tecido recém-regenerado ocupava uma localização ligeiramente posterior na articulação devido ao ambiente mecânico alterado. Nos dois casos em que o tecido estava mais organizado e não tão posterior na articulação (G154 e G163), parecia haver alguma protecção da cartilagem no côndilo medial médio e menos formação de osteófitos no côndilo e sulco femorais indicando osteoartrite menos grave. No caso de G151 parecia também haver alguma protecção com uma lesão formada muito menor. Nestes casos, o grau de efusão e a alteração em TRD foram mínimas (Tabela 4) . Assim, o tecido imaturo semelhante a meniscal foi regenerado numa área que amorteceu as superfícies opostas do côndilo medial e da meseta tibial medial e protegeu a articulação do desenvolvimento de osteoartrite como resultado da carga mecânica alterada nestas articulações.

Num caso (G166), o tecido de reparação não protegeu as superfícies articulares, pois formou-se muito posterior na meseta tibial medial. A Figura 2 mostra o grau de protecção proporcionado pelo tecido semelhante a meniscal em G151 e G154 (painel do fundo). 0 dano na cartilagem foi significativamente menor nestas articulações, que tinham sido injectadas com MSC, comparado com o encontrado em articulações injectadas apenas com o veículo (Figura 2, painel de topo) . A formação de osteófitos na face medial do côndilo medial também foi significativamente menor nestas articulações injectadas com 19 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ MSC em comparação com as cabras 'apenas com o veículo' (Fig. 2) . Foi observada reparação meniscal fibrosa limitada, mal organizada, em 2 de 3 cabras 'apenas com o veículo' na face anterior da articulação. Em nenhum dos casos a massa ou o grau de organização foram tão significativos como os observados no grupo ’+Células', e não houve protecção aparente da articulação como indicado pela Pontuação da Cartilagem (Tabela 4).

Os resultados acima mostram que as células estaminais do mesênquima autólogas, infundidas nas babilhas artríticas de cabras, seis semanas após meniscectomia medial e ressecção do LCA combinadas, estimularam a produção de tecido semelhante a menisco nas articulações de 4 das 6 cabras sacrificadas seis semanas após a infusão. Não foi observado nenhum tecido semelhante nas articulações de 3 cabras infundidas apenas com o transportador.

Nas articulações em que foi observado o tecido semelhante a menisco, foi retardado o curso da destruição progressiva de cartilagem hialina na superfície articular, com base na pontuação bruta da superfície da articulação; i.e., a injecção de células estaminais do mesênquima preveniu a destruição rápida da cartilagem da articulação. Este efeito não foi observado nas articulações controlo apenas com transportador. Outras alterações, a efusão da articulação e o alargamento, também estavam diminuídas no grupo infundido com MSC, o que é consistente com o efeito protector do tratamento com células estaminais do mesênquima. Estas observações mostram que as células estaminais do mesênquima, quando injectadas nas articulações artríticas na babilha da cabra, são retidas na articulação durante um período suficiente para terem um efeito terapêutico. Nos resultados aqui resumidos, as células estaminais do mesênquima injectadas estabilizaram a articulação e protegeram as superfícies articulares contra a degeneração progressiva observada nas articulações controlo.

Em 4 de 6 cabras aos 3 meses e em 7 de 9 cabras aos 6 meses, o tecido semelhante a meniscal gerado era algo organizado com um aspecto semelhante a hialina. (Figura 3C). Não foi observado nenhum tecido semelhante nas articulações das cabras controlo de 3 meses infundidas com HA isolado; 20 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ contudo, foi observada proliferação sinovial fina nas articulações controlo de 6 meses (Figura 3A) . Este tecido foi encontrado posterior à área de carga da articulação osteoartritica desestabilizada.

Nas articulações onde foi observado tecido organizado semelhante a meniscal, foi retardada a destruição progressiva de cartilagem na superfície articular, com base na pontuação bruta das superfícies da articulação. A Figura 3B mostra a aspecto do côndilo medial de uma cabra controlo de β-meses com degradação completa da cartilagem articular em toda a superfície e a repopulação da área com osteófitos. A protecção desta superfície foi observada em articulações teste expostas a MSC (Figura 3D). Este efeito não foi observado nas articulações controlo apenas com o veículo. Outras alterações como a efusão da articulação, a formação de osteófitos no côndilo femoral e o alargamento da articulação também foram reduzidas, consistente com o efeito protector do tratamento com MSC. O exame do neotecido meniscal organizado aos 3 meses por microscopia de fluorescência indicou a presença de células positivas para GFP à superfície do tecido (Figuras 4B e 4C). A coloração imuno-histoquímica do tecido posterior semelhante a meniscal induziu uma rede fibrosa (não mostrada) densa, celular positiva para colagénio do Tipo I, com pequenas áreas de células mais arredondadas que eram positivas para colagénio do Tipo II (Figuras 4D a 4F).

Para os animais de 6-meses, a extensão do dano, com base nas pontuações de superfície da cartilagem, é maior nas cabras controlo do que nas que receberam as células estaminais do mesênquima, como mostrado na Tabela 5. 21 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ

Tabela 5 Côndilo medial médio Proliferação Esbranquiçado Marca auricular # Cabra # Peso Grupo Tamanho da Lesão Pontuação da Cartilagem Nota Sinovial Semelhante a hialina (Kg) (mm) (rosada) 324 G144 90,91 Veículo 20,9x8, 9 3,5 Osteófitos na lesão Sim, ligada a MTP 355 G152 80,00 Veículo 18,9x10,7 3,5 Osteófitos na lesão Sim 319 G153 81,36 Veículo 27,9x14,6 3,5 Osteófitos na lesão Sim 302 G137 80, 45 Veículo 15,6x2,6 3,5 Osteófitos na lesão Sim 338 G139 94, 09 Veículo 22,5x11,5 1,5 Pequeno 387 GO 9 4 84, 09 Veículo 17,7x11 3,5 Osteófitos na lesão Sim Média/SD 3,17 0, 82 326 G112 97, 27 Células 22,7x11,3 3,5 Osteófitos na lesão Sim 395 G114 118,64 Células 17,5x12,3 2,5 Sim 363 G120 83,18 Células 12,3x7,7 1 Sim 392 G122 93,64 Células 25,4x11,3 2,5 M. Pequeno 327 G131 87, 73 Células 14,5x10,4 2 Sim 332 G141 106,36 Células 24,9x12 2 Pequeno 389 G150 80, 91 Células 11,5x4, 5 1,5 Sim 378 G167 83,64 Células 10x6 1 Sim 391 G168 90, 91 Células 15,4x8,9 2 Sim Médla/SD 2,00 0, 79

Uma aplicação da revelação é a redução de dor por meio da regeneração do tecido meniscal entre ossos opostos ou superfícies osteocondrais.

Outra aplicação dos resultados acima é evitar ou eliminar a necessidade de substituição da articulação. Ainda outra aplicação é a redução da inflamação numa articulação danificada ou doente, conduzindo assim à redução da dor e ao restauro da função da articulação. EXEMPLO 3

Este exemplo descreve a análise histológica do côndilo medial médio de cabras de 3-meses que receberam injecção intra-articular de hialuronano de sódio ou injecção intra-articular de MSC suspensas em hialuronano de sódio (grupo tratado com HA+MSC). As secções transversas do côndilo medial médio de cabras tratadas com HA (n=3, painéis esquerdos) e de 22 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ cabras tratadas com HA+MSC (n=6, painéis central e direito) são mostradas na Figura 5. 0 fémur distai retirado da articulação do joelho de animais controlo e tratados foi examinado histologicamente. São mostradas as secções transversas do côndilo medial médio de todas as articulações operadas de cabras sacrificadas aos 3 meses. As secções das articulações contralaterais destes animais eram todas histologicamente normais.

Nas três articulações tratadas com HA eram evidentes várias alterações estruturais. Estas incluíram (1) espessamento da placa do osso subcondral, (2) reorganização do osso trabecular, (3) formação de osteófitos mediais e (4) fibrilação da camada de cartilagem.

Os osteófitos eram particularmente proeminentes no grupo controlo (Figura 5, painel esquerdo) e estão marcados com uma seta. No grupo tratado, houve significativamente menor formação de osteófitos associada com as articulações onde houve evidência de regeneração meniscal (Figura 5, painel médio) e os côndilos tinham um aspecto mais simétrico, sugerindo que podem ter sido menos expostos a forças mecânicas anormais. Os côndilos mediais de 2 dos 6 animais tratados mostraram evidência de formação significativa de osteófitos (Figura 5, painel direito, marcado com seta). Nestas articulações houve menos evidência de formação de neotecido meniscal.

As lesões na camada articular eram pronunciadas no Grupo tratado com HA e podem ser observadas como fissuras profundas (Figura 5, painel esquerdo, em cima) ou como uma erosão com perda de coloração da matriz (Figura 5, painel esquerdo, em baixo). Em 4 dos 6 animais tratados a camada de cartilagem foi menos danificada (Figura 5, painel médio), embora houvesse perda da coloração de superfície (Figura 5, painel médio, segundo a partir de cima) e alguma fibrilação superficial (Figura 5, painel médio, terceiro a partir de cima). Novamente, em 2 dos 6 animais tratados houve dano significativo para a cartilagem incluindo fissura (Figura 5, painel direito, em cima) e erosão (Figura 5, painel direito, 23 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ em baixo), sugerindo que houve pouca regeneração nestas articulações.

Na área do osso imediatamente abaixo da superfície da cartilagem (a placa subcondral) houve algumas alterações evidentes. No grupo não tratado (Figura 5, painel esquerdo) houve evidência de espessamento da placa, como observado pela coloração mais intensa. Isto pode ser observado por comparação do painel esquerdo, imagem em cima, com o painel central, imagem em cima, por exemplo, onde as diferenças no espessamento da placa são evidentes. Além disso, houve alterações no interior do osso trabecular sugerindo que as trabéculas eram mais espessas e estavam mais juntas no qrupo não tratado (Figura 5, painel esquerdo) em comparação com o grupo tratado (Figura 5, painéis central e direito). Em 2 dos 6 animais no grupo tratado houve alterações ósseas substanciais (Figura 5, painel direito). Como previamente mencionado, estes animais tinham menos formação de neotecido meniscal em comparação com os outros. EXEMPLO 4

Introdução 0 objectivo desta experiência foi demonstrar o efeito da administração de MSC derivadas de um doador único num modelo de lesão no joelho na cabra. Neste caso, a lesão na articulação da babilha foi criada por meniscectomia medial completa sem ressecção do LCA, um procedimento que tem sido demonstrado que causa alterações degenerativas na articulação semelhantes à osteoartrite. Não foi dada nenhuma terapia imunossupressora. Métodos

Desenho do Estudo Os animais usados no estudo foram cabras macho Western Cross castradas (n=20) e confirmou-se estarem livres de Febre Q, brucelose e artrite encefalite caprina. Foram divididos aleatoriamente em 4 grupos que não diferiam uns dos outros em idade. Foi efectuada uma meniscectomia medial unilateral total e, após um período de recuperação de 2 semanas, os animais foram sujeitos a um 24 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ regime de exercício imposto. A articulação operada foi tratada por injecção de uma suspensão de 107 MSC alogénicas em 5 ml de hialuronano de sódio (4mg/ml) cada 1 ou 6 semanas após o procedimento cirúrgico. As três preparações de células alogénicas do doador foram distribuídas aleatoriamente entre os animais receptores. Os animais controlo receberam 5 ml de hialuronano de sódio sem células. 0 desenho do estudo está resumido na Tabela 6.

Tabela 6. Desenho do estudo para a avaliação de MSC alogénicas no tratamento de lesão de joelho resultante de meniscectomia medial completa (MMX)

Grupo n Procedimento cirúrgico (unilat.) Injecção Tempo de Injecção (semanas) Tempo até ao Sacrifício (meses) 1 5 MMX HA 1 3 2 5 MMX HA 6 3 3 5 MMX HA + MSC 1 3 4 5 MMX HA + MSC 6 3 0 regime de exercício começou duas semanas após a injecção e foi mantido até ao sacrifício, 12 semanas após o procedimento cirúrgico. Foram tiradas radiografias lateral e cranial a caudal de ambas as babilhas antes da cirurgia inicial e no sacrifício.

Preparação de Células Frascos contendo as MSC de cabra alogénicas transduzidas criopreservadas foram descongelados a 37°C e lavados com meio hMSC. As células foram centrifugadas durante 5 min a 1500 rpm e 20°C e ressuspensas em 10 ml de PBS. Removeram-se 50 μΐ de suspensão celular para determinação da contagem de células viáveis utilizando Azul de Tripano. Após uma segunda lavagem com PBS (20 ml), 10xl06 células foram peletizadas num tubo estéril de 50 ml e ressuspensas em 5 ml de Hyalartin V (4 mg/ml) utilizando uma seringa de 12 ml com uma agulha de 18 ga..

Injecção Antes da injecção de células na articulação do joelho operado, as cabras foram pesadas e foi recolhida uma amostra de sangue para obter soro. A área ao redor do joelho foi esterilizada e colocada em 70-90 graus de flexão e flexionada e estendida 20 vezes para circular fluido sinovial 25 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ através do espaço articular. Foi aspirado tanto fluido quanto possível do sulco troclear proximal. Uma agulha de 18 ga. foi inserida posterior à borda medial do ligamento patelar, através do triângulo formado pelo epicôndilo do fémur, a meseta tibial/meniscal e o entalhe formado pela sua junção. Uma seringa contendo a suspensão celular foi ligada à agulha e a suspensão celular foi injectada na cápsula da articulação. A articulação foi flexionada e estendida 20 vezes e a cabra foi mantida na posição de bruços durante aproximadamente 10 minutos enquanto a anestesia foi removida. Os animais foram retirados para um recinto de espera quando houve evidência de recuperação e respiração normal. As cabras retornaram então ao ar livre.

Exercício O regime de exercício consistiu em 12 corridas numa pista circular de circunferência exterior de 28,6 m e circunferência interior de 16,3 m. Foi efectuado uma vez por dia, cinco dias por semanas.

Colecção de tecido As articulações contralaterais e operadas foram colhidas por desarticulação na anca, fotografadas e avaliadas para alterações macroscópicas. As articulações foram então fixadas em formalina e foram fotografadas e reexaminadas após fixação para confirmação das pontuações de classificação e para observar a presença de osteófitos.

Resultados A avaliação bruta das articulações no sacrifício mostrou a presença de tecido de reparação associado com o compartimento medial posterior em articulações tratadas com MSC alogénicas (Figura 6) . Este tecido de reparação parecia ser de natureza hialina e estar separado da meseta tibial, de modo que foi estabelecida uma superfície de suporte. Os animais controlo (tratados só com hialuronano de sódio) apresentavam evidência de proliferação sinovial deste local, que estava genericamente ligada à tíbia proximal com extensão mínima nas superfícies de articulação. 26 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ

Conclusão

Estas observações sugerem que o tratamento do joelho meniscectomizado por injecção directa de uma suspensão de MSC alogénicas resulta na rápida organização de um tecido neomeniscal e no potencial para condroprotecção. A injecção directa de MSC alogénicas no espaço articular pode portanto ser aplicada no tratamento de articulações danificadas, por exemplo, como resultado de lesão meniscal.

Lisboa, 2011-01-31

Claims (11)

1. ΕΡ 1 276 486/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de células estaminais do mesênquima e de um transportador farmaceuticamente aceitável para a preparação de uma composição farmacêutica injectável para regeneração ou reparação de tecido meniscal numa articulação, em que a referida composição farmacêutica injectável compreende uma quantidade eficaz de células estaminais do mesênquima para regeneração ou reparação de tecido meniscal numa articulação e é destinada a ser injectada no espaço articular; e em que as referidas células estaminais do mesênquima se diferenciam em tecido meniscal ou estimulam a sua produção.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que é reduzida a esclerose óssea subcondral numa articulação, é prevenida ou reduzida a formação de osteófitos numa articulação, ou é prevenido o dano da cartilagem numa articulação.
3. 3. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o referido transportador farmacêutico compreende hialuronano ou um hialuronano quimicamente modificado.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido transportador farmacêutico é o hialuronano de sódio.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida articulação é seleccionada do grupo que consiste de articulações do joelho e da articulação temporo-mandibular.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as referidas células estaminais do mesênquima são autólogas para os receptores.
7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as referidas células estaminais do mesênquima são alogénicas para os receptores. ΕΡ 1 276 486/ΡΤ 2/2
8. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as referidas células estaminais do mesênquima estão presentes na referida composição farmacêutica injectável numa quantidade de cerca de lxlO4 células até cerca de l,5xl08 células.
9. 9. Utilização da Reivindicação 8, em que as referidas células estaminais do mesênquima estão presentes na referida composição farmacêutica injectável numa quantidade de cerca de lxlO5 células até cerca de lxlO8 células.
10. 10. Utilização de Reivindicação 9, em que as referidas células estaminais do mesênquima estão presentes na referida composição farmacêutica injectável numa quantidade de cerca de lxlO6 células até cerca de lxlO7 células.
11. 11. Utilização de células estaminais do mesênquima e de um transportador farmaceuticamente aceitável para a preparação de uma composição farmacêutica para regeneração ou reparação de tecido meniscal numa articulação, em que a referida composição farmacêutica é para ser administrada à referida articulação na ausência de um suporte e é para ser injectada no espaço articular; em que a referida composição farmacêutica compreende uma quantidade eficaz de células estaminais do mesênquima para regeneração ou reparação de tecido meniscal numa articulação; e em que as referidas células estaminais do mesênquima se diferenciam em tecido meniscal ou estimulam a sua produção. Lisboa, 2011-01-31 ΕΡ 1 276 486/ΡΤ 1/6 Reparação meniscal condroprotectora *ΤΓ·

    ld/98^ 9L·^ T <33 FIG.2 Lesões condilares/Controlo (Articulações-MSC)

    I ro \

    ΕΡ 1 276 486/ΡΤ 3/6

    ΕΡ 1 276 486/ΡΤ 4/6

    Η

    Id/98^ FIG. 6 Controlo Tratado

    EurepSiscties Patantamt European Patent OffIc« Office européen de» brevets European Patent Office 80298 MUNICH GERMANY Tel. +49 (0)89 2399 - 0 Fax +49 (0)89 2399 - 4465 Schnappauf, Georg Dr. Volker Vossius Patent- und Rechtsanwaltskanzlei Geibelstrasse 6 81679 MUnchen ALLEMAGNE For any questions about this communlcafion: Tel.:+31 (0)70 340 45 00 Date 19.11.10 Referenoe Applioatian No./Patení No. 44244ep/AW/hs 01930730.5-2107/1276486 Applioant/Prapristor Osiris Therapeutics, Inc. Commu n ication concerning the registration of amendments relating to □ atransfer (R. 22 and 85 EPC) entries pertaining to the applicant / the proprietor (R. 143(1)(f) EPC) As requested, the entries pertaining to the applicant of the above-mentioned European patent application /to the proprietor of the above-mentioned European patent have been amended to the following: AT BE CH CY DE DK ES Fl FR GB GR ΙΕ IT Li LU MC NL PT SE TR Osiris Therapeutics, Inc. 7015 Albert Einstein Drive Columbia, MD 21046/US The registration of the changes has taken effect on 15.11.10. In the case of a published application / a patent, the change will be recorded in the Register of European Paterrts and published in the European Patent Bulletin (Section 1.12 /11.12). Your attention is drawn to the fact that, in the case of the registration of a transfer, any automatic debit order only ceases to be effective from the date of its express revocation (cf. point 14(c) of the Arrangements for the automatic debiting procedure, Supplementto OJ EPO 3/2009). For the Examining Divisíon

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