ES2353061T3

ES2353061T3 - Reparación de articulaciones utilizando células madre mesenquimatosas.

Info

Publication number: ES2353061T3
Application number: ES01930730T
Authority: ES
Inventors: Francis P. Barry; J. Mary Murphy; Robert Deans; David J. Fink; Annemarie Moseley
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-24
Publication date: 2011-02-25
Anticipated expiration: 2021-04-24
Also published as: US20090041730A1; JP2015128633A; ES2353061T5; EP1276486A2; WO2001080865A3; EP1276486B1; AU5723601A; US20150216904A1; ATE489101T1; DE60143517D1; US20120148548A1; CA2405345A1; EP1276486B2; JP5090604B2; JP5792686B2; PT1276486E; AU2001257236B2; EP1276486B8; WO2001080865A2; US9814580B2

Abstract

Utilización de células madre mesenquimatosas y un excipiente farmacéutico aceptable para la preparación de una composición farmacéutica inyectable para la regeneración o reparación del tejido meniscal en una articulación, en la que dicha composición farmacéutica inyectable comprende una cantidad eficaz de células madre mesenquimatosas para la regeneración o reparación del tejido meniscal en una articulación y debe inyectarse en el espacio articular; y en la que dichas células madre mesenquimatosas se diferencian en, o estimulan la producción de, tejido meniscal.

Description

Reparación de articulaciones utilizando células madre mesenquimatosas.

La presente invención se refiere a la reparación de articulaciones, que se han lesionado y/o han sido sometidas a trastornos tales como osteoartritis. Más particularmente, esta invención se refiere a la reparación de articulaciones para prevenir o reducir la esclerosis del hueso subcondral en una articulación, y para prevenir el daño al cartílago articular en una articulación, y para prevenir o reducir la formación de osteofitos en una articulación, administrando células madre mesenquimatosas a una articulación que necesita una reparación.

La osteoartritis es una de las enfermedades más comunes de la articulación. Existen evidencias radiológicas de la enfermedad en aproximadamente el 70% de los individuos de más de 65 años, con una incidencia ligeramente superior en mujeres. En el intervalo de edad de 45-65 años, la incidencia se aproxima al 30% de la población (American Academy of Orthopedic Surgeons, 1992). La osteoartritis es una enfermedad degenerativa que supone la erosión de la superficie articular en los extremos de los huesos, conduciendo en última instancia a una pérdida completa de la superficie del cartílago y exposición del hueso subcondral. Estos cambios van acompañados de la aparición de síntomas intensos incluyendo pérdida de movimiento, rigidez y dolor articular. El cartílago articular, una vez dañado, no muestra una capacidad de autorreparación significativa. La poca reparación tisular que se produce es normalmente de naturaleza fibrosa y es un sustituto auténtico funcional inadecuado para el cartílago articular. Se ha investigado una variedad de procedimientos para potenciar la curación de defectos en el cartílago articular, con diversos grados de éxito.

Aunque la osteoartritis es una enfermedad muy importante que afecta a una gran proporción de la población, se desconocen los factores que la causan. Las lesiones de rodilla que implican al menisco o el ligamento cruzado anterior (LCA) aumentan significativamente el desarrollo de gonartrosis radiográfica. La lesión meniscal sola da como resultado un aumento de 20 veces del riesgo de desarrollar osteoartritis. En pacientes que padecen lesión del LCA u otros ligamentos en combinación con rotura de menisco, existe una probabilidad muy alta de que se desarrolle osteoartritis de la rodilla. (Gillquist y Messner, Sports Med., Vol. 27, págs. 143-156 (1999)).

Se ha utilizado la meniscectomía medial o lateral o la resección de LCA como medios para crear inestabilidad en las articulaciones de rodilla conduciendo al desarrollo de lesiones de osteoartritis de animales grandes tales como la oveja (Ghosh, et al., Clin. Orthop., Vol. 252, págs. 101-113, 1990; Little, et al., J. Rheumatol., Vol. 11, págs. 2199-2209, 1997) y el perro (para una revisión, véase Brandt, Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 732, págs. 199-205, 1994). Sin embargo, estos animales se diferencian de los seres humanos con respecto a la estructura de la capa de cartílago articular y el hueso subcondral y también en las propiedades mecánicas del tejido. La cabra adulta presenta la ventaja de ser activa y presentar una organización tisular y estructural en la articulación de la babilla que se comparan bien con la rodilla humana. Existen pocos informes en la bibliografía que demuestren la utilización de la cabra como modelo para la osteoartritis humana. En un estudio preliminar, en el que se incluyeron 4 cabras, la transección del ligamento cruzado anterior dio como resultado defectos focales en el cartílago condilar (Ho, et al., Invest. Radiol., Vol. 27, págs. 84-90, 1992). Sin embargo, en un estudio más reciente la transección quirúrgica del ligamento cruzado no logró producir cambios de osteoartritis tras 8 meses en cabras jóvenes, confinadas (Rorvik y Tiege, Acta. Vet. Scand., Vol. 37, págs. 265-272, 1996).

En un esfuerzo por desarrollar lesiones de osteoartritis reproducibles en la babilla de cabra, se sometieron cabras a resección de LCA, meniscectomía medial o una combinación de ambos procedimientos. (Murphy, et al., Transactions of the 45th Meeting of the Orthopedic Research Society, Vol. 24, página 1035 (1999)). Este estudio se realizó en colaboración con la Tufts University School of Veterinary Medicine. Se produjo un espectro completo de cambios de osteoartritis en las babillas de estos animales y la intensidad de los cambios dependía del procedimiento quirúrgico utilizado. Las lesiones más leves se produjeron como resultado de resección de LCA y las lesiones más intensas se produjeron como resultado del procedimiento combinado. La meniscectomía medial sola produjo lesiones moderadas. La resección de LCA dio como resultado la formación de osteofitos y otros cambios subcondrales y fibrilación de la superficie de cartílago principalmente en el cóndilo medial anterior. La meniscectomía medial también indujo la formación de osteofitos y otros cambios subcondrales y lesiones de cartílago principalmente limitadas al cóndilo medial medio. Estos cambios fueron más intensos que los encontrados como resultado de la resección de LCA. La meniscectomía medial en combinación con resección de LCA dio como resultado cambios de osteoartritis avanzados tanto en tejido duro como blando en la babilla de cabra tras 12 semanas. El cartílago en la meseta tibial medial sin proteger también se vio afectado aunque existe cierto grado de osteoartritis espontánea en este sitio. No hubo reparación de LCA o el menisco medial en estas cabras tras 12 semanas aunque hubo fibrosis evidente como resultado de la meniscectomía medial. Se observó desarrollo de un tejido similar a menisco fibroso en un animal tras una combinación de resección de LCA y meniscectomía medial. Esto puede haber sido resultado de meniscectomía
incompleta.

En un segundo estudio, se investigó adicionalmente la generación de lesiones de osteoartritis leves como resultado de la resección de LCA en la cabra. Este procedimiento es relativamente no agresivo y potencialmente reversible y, como tal, presenta una opción adicional para la evaluación de la terapia con MSC en la osteoartritis. El segundo estudio se realizó para validar que los síntomas de osteoartritis leves observados a los tres meses evolucionaban a una forma más intensa con mayor daño a la superficie articular en un momento posterior. En este estudio, las cabras, que se sometieron a resección de LCA unilateral en combinación con un régimen de ejercicio leve, desarrollaron síntomas de osteoartritis en tres meses. Estos síntomas fueron principalmente cambios osteofíticos con poco daño a la superficie del cartílago. A los 6 meses había un daño condral más intenso. Esto confirmó que la resección de LCA en la babilla de cabra conduciría a cambios del cartílago similares a la osteoartritis temprana en seres
humanos.

La mayoría de los enfoques al tratamiento de la osteoartritis disponibles actualmente suponen el control de síntomas con poco impacto sobre la erosión del cartílago. La terapia celular ofrece posibles oportunidades para la intervención invirtiendo o inhibiendo la erosión del cartílago. Existen varios enfoques posibles que suponen o bien una implantación directa de condrocitos o bien la administración de mitógenos apropiados o factores de crecimiento que pueden estimular la proliferación de condrocitos huésped. Otros enfoques suponen la administración de factores citotácticos o de unión celular para potenciar la población de células progenitoras locales, conduciendo en última instancia a la inversión del proceso de degradación. Gran parte del trabajo en esta área se ha centrado en los denominados constructos de cartílago diseñados por ingeniería, es decir, el cultivo de condrocitos sobre un soporte de biomatriz en un entorno ex vivo, con posterior administración del constructo al sitio de lesión. Otros enfoques se han basado en el desarrollo de procedimientos que suponen la fijación de células implantadas bajo un colgajo con sutura de tejido ectópico, o bien de aponeurosis o bien del periostio. Sin embargo, no es probable que ninguno de estos procedimientos sea aplicable en la estabilización mecánica de la articulación dañada o
enfermada.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de reparación de una articulación en un animal. El procedimiento comprende administrar a la articulación células madre mesenquimatosas. El animal puede ser un mamífero, y en particular, puede ser un ser humano o primate no humano.

Las células madre mesenquimatosas pueden ser autólogas con respecto al receptor, o pueden ser alogénicas con respecto al receptor.

Las células madre mesenquimatosas pueden obtenerse por medios conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las células madre mesenquimatosas pueden obtenerse a partir de un aspirado de médula ósea, y después expandirse en cultivo. Una vez expandidas en cultivo, las células madre mesenquimatosas se administran a la articulación.

Las células madre mesenquimatosas pueden administrarse a la articulación junto con un excipiente farmacéutico aceptable. La selección de un excipiente adecuado se encuentra dentro de la habilidad del experto habitual. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, hialuronano, hialuronano modificado químicamente, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, sulfato de condroitina, glucosamina, manosamina, proteoglicano, fragmentos de proteoglicano, quitina, quitosano u otro material de polímero o polisacárido.

Se ha descubierto que las células madre mesenquimatosas, cuando se administran a una articulación, proporcionan la reparación y estabilización de una articulación dañada, en la que tal daño se debe a lesión, inflamación y/o una enfermedad o trastorno tal como osteoartritis, por ejemplo. Las células madre mesenquimatosas no necesitan administrarse en un soporte, aunque puede utilizarse un soporte. Cuando se administran a una articulación, las células madre mesenquimatosas se diferencian en dar tejido cartilaginoso, incluyendo tejido meniscal. Aunque no se pretende que el alcance de la presente invención se limite a ningún razonamiento teórico, se cree que las células madre mesenquimatosas, cuando se administran a la articulación, responden a las fuerzas destructivas en la articulación, debidas a tejido que falta y/o dañado, mediante lo cual las células madre mesenquimatosas se diferencian para dar tejido de fibrocartílago. Por tanto, las células madre mesenquimatosas, cuando se administran a una articulación, pueden sustituir a tejido que falta y/o dañado en la articulación, incluyendo tejido meniscal. Por tanto, la administración de células madre mesenquimatosas a una articulación proporciona la regeneración de tejido cartilaginoso, incluyendo tejido meniscal, en la articulación, proporcionando así la reparación y estabilización de la articulación, así como reduciendo el dolor en la articulación y reduciendo la esclerosis del hueso subcondral.

Por tanto, las células madre mesenquimatosas pueden administrarse a una articulación para proporcionar la reparación y estabilización de articulaciones dañadas, lesionadas o inflamadas. El daño, la lesión o la inflamación pueden estar asociados con una enfermedad o trastorno, tal como osteoartritis, artritis reumatoide, gota, artritis reactiva, artritis psoriásica o artritis juvenil, por ejemplo. También puede resultar de una osteoartrosis o enfermedad crónica de la articulación de carácter no inflamatorio.

Las articulaciones que pueden repararse y/o estabilizarse, y/o en las que puede reducirse la inflamación, incluyen, pero no se limitan a, articulaciones de rodilla, articulaciones de cadera, articulaciones de hombro, articulaciones de codo, articulaciones de tobillo, articulaciones tarsal y metatarsal, articulaciones de muñeca, articulaciones de columna, carpal y metacarpal, y la articulación temporomandibular.

Las células madre mesenquimatosas se administran en una cantidad eficaz para reparar y/o estabilizar una articulación en el receptor. En general, las células madre mesenquimatosas se administran en una cantidad comprendida entre aproximadamente 1 x 10^{4} y aproximadamente 1,5 x 10^{8}, preferentemente desde aproximadamente 1 x 10^{5} y aproximadamente 1 x 10^{8}, más preferentemente desde aproximadamente 1 x 10^{6} y aproximadamente 1 x 10^{7}. El número exacto de células depende de una variedad de factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la edad, el peso y el sexo del paciente, el grado y la intensidad del daño o la lesión a la articulación, o de la enfermedad que afecta a la articulación, el grado de exudación dentro de la articulación, el espacio articular, y otras características anatómicas que influirán en la administración. La lesión de una articulación específica puede determinarse mediante la práctica médica común, incluyendo, pero sin limitarse a, datos de radiografía y RMN, visualización mediante artroscopía, y la revisión de una historia clínica y examen físico del paciente.

La invención se describirá a continuación haciendo referencia a los dibujos, en los que:

Figura 1. Efecto de MSC sobre la formación de tejido similar a menisco en rodillas de cabra previamente desestabilizadas mediante una combinación de resección de LCA y meniscectomía medial. Se formó tejido similar a menisco inmaduro (flecha negra) en la zona entre el cóndilo medial (MC) y la meseta tibial medial (MTP) en rodillas, previamente desestabilizadas mediante resección de LCA y meniscectomía medial y expuestas a MSC, de G151 (A), G154 (B) y G163 (C).

Figura 2. Efecto de MSC sobre el desarrollo de lesiones de cartílago en el cóndilo medial medio en rodillas de cabra previamente desestabilizadas mediante una combinación de resección de LCA y meniscectomía medial. Se desarrollaron lesiones de cartílago clasificadas tal como se describe en la tabla 2 y con las puntuaciones indicadas en la tabla 3 en el cóndilo medial medio de cabras sólo con vehículo (G102, G127 y G143, imágenes izquierda, del centro y derecha del panel superior, respectivamente). MSC inyectadas junto con el vehículo previnieron el desarrollo de lesiones intensas en este sitio en varios animales, por ejemplo, en el caso de G151 (panel inferior, imagen del centro) pero no en todos los casos, como en el caso de G166 (panel inferior, imagen derecha).

Figura 3. Aspecto macroscópico del tejido 6 meses tras la cirugía. El aspecto macroscópico de las superficies tibiales con meniscos unidos (A y C) y el cóndilo medial anterior medio (B y D) de una rodilla de cabra con osteoartritis a la que se inyectó HA (A y B) y MSC transducidas con GFP más HA (C y D). Las flechas indican el nuevo tejido meniscal formado en una articulación expuesta a MSC y a una proliferación de tipo sinovial observada en una rodilla de cabra control. El asterisco indica la formación de osteofitos.

Figura 4. Análisis histológico de nuevo tejido meniscal. Micrografías de fluorescencia de tejido meniscal muestran células positivas para GFP en la superficie condilar del nuevo tejido meniscal (B y C). Se tomó una micrografía negativa de la parte posterior del tejido cortado no expuesto al entorno de la articulación. Las células en el centro del tejido se unieron al anticuerpo anticolágeno tipo II (D a F). El aumento original fue de 200x para A a E y de 100x para F.

Figura 5. Análisis histológico del cóndilo medial medio de cabras a los 3 meses que recibieron una inyección intraarticular de hialuronano de sodio (grupo tratado con HA) o inyección intraarticular de MSC suspendidas en hialuronano de sodio (grupo tratado con HA + MSC). Secciones transversales del cóndilo medial medio de cabras tratadas con HA (n=3, paneles izquierdos) y de cabras tratadas con HA + MSC (n=6, paneles central y derecho). Las flechas indican osteofitos.

Figura 6. Aspecto macroscópico de la meseta tibial de animales tratados con células alogénicas suspendidas en una disolución de hialuronano de sodio o bien 1 o bien 6 semanas tras la meniscectomía medial completa. Los animales control se trataron únicamente mediante inyección con hialuronano de sodio. En los grupos tratados el nuevo tejido meniscal se desprendió de la meseta tibial y pareció proporcionar una superficie de soporte.

Se describirá la invención a continuación haciendo referencia a los ejemplos siguientes; que se proporcionan a título no limitativo del alcance de la presente invención.

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Ejemplo 1

Se obtuvieron un total de 12 cabras Western Cross macho castradas que se confirmó que eran negativas para fiebre Q, brucelosis y artritis encefalitis caprina. Se aleatorizaron las cabras en 4 grupos que no eran diferentes entre sí en cuanto a la edad o el peso. Todas las cabras se sometieron a un aspirado de médula ósea para obtener células madre mesenquimatosas (MSC) y a cirugía para crear inestabilidad en una rodilla para el desarrollo de osteoartritis experimental. Se sometieron las cabras o bien a resección del LCA (n=6) o bien a meniscectomía medial total (n=6). Tras un periodo de recuperación de 2 semanas, se sometieron las cabras a ejercicio 5 días por semana durante 12 semanas. Entonces se introdujeron células madre mesenquimatosas autólogas transducidas con proteína verde fluorescente (GFP) tanto en las articulaciones operadas como de control contralateral. Todas las cabras en cada grupo recibieron inyecciones de 5 ml de una suspensión de 1x10^{6} células/ml con (n=3) o sin (n=3) hialuronano de alto peso molecular (4 mg/ml). Se examinaron las articulaciones mediante necropsia tras 7 días. En todos los casos, se detectaron células transducidas con GFP en el líquido sinovial y lavado de líquido sinovial, y se recogieron del líquido sinovial en un estado viable y pudieron expandirse en cultivo. La microscopía de fluorescencia reveló que las células añadidas habían colonizado y se habían integrado con capas de superficie de tejido blando dentro de la articulación, incluyendo el menisco. Estas observaciones demostraron que las células madre mesenquimatosas pueden administrarse satisfactoriamente a una articulación con osteoartritis mediante inyección directa, que las células se retienen dentro de la articulación, colonizan superficies de tejido blando, y pueden recuperarse en una forma viable tras 1
semana.

Ejemplo 2

Se obtuvieron un total de 24 cabras Western Cross macho castradas que se confirmó que eran negativas para fiebre Q, brucelosis y artritis encefalitis caprina. Se aleatorizaron las cabras en 4 grupos que no eran diferentes entre sí en cuanto a la edad. Todas las cabras se sometieron a una aspiración de médula ósea para obtener células madre mesenquimatosas (MSC) y cirugía para crear inestabilidad en una rodilla para el desarrollo de osteoartritis experimental. Los grupos se muestran en la tabla 1.

1

Los grupos 1 y 2 no fueron significativamente diferentes con respecto al peso (prueba de la t de Student, p=0,68) (tabla 2); sin embargo, el grupo 4 pesaba más que el grupo control correspondiente (grupo 3) (prueba de la t, p=0,001). Se alojaron las cabras por grupos y se alimentaron con una dieta para rumiantes comercial de alimentación de cereales y heno.

El peso de todas las cabras, en la cirugía para desestabilizar una babilla, en la inyección de células madre mesenquimatosas y en el sacrificio se facilita en la tabla 2 a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

2

Por lo menos dos semanas antes de la cirugía, se aspiró médula de la cresta ilíaca de cada cabra y se aislaron células madre mesenquimatosas y se cultivaron a partir de los aspirados utilizando el siguiente procedimiento. Se añadió médula a medio de MSC humanas (hMSC) completo (DMEM con bajo contenido en glucosa que contenía suero bovino fetal al 10% de lotes seleccionados, y penicilina-estreptomicina a 10 ml por litro) y se centrifugó para sedimentar las células y retirar la capa de grasa. Se lavaron las células con medio y se sembraron en placas de cultivo a 100.000-400.000 células/cm^{2}. Se cultivaron todas las preparaciones a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Se eliminaron células no adherentes 3-5 días tras el sembrado en el momento del primer cambio de medio, y posteriormente se cambió el medio dos veces por semana. Cuando las placas de cultivo se volvieron casi confluentes, se desprendieron las células con tripsina al 0,05% (p/v) que contenía EDTA 1 mM durante 5 min a 37ºC. Para el subcultivo, se sembraron MSC en matraces T-185 a 0,5-1,0x10^{6} células por matraz en 35 ml de medio de hMSC completo. Las MSC que no se utilizaron inmediatamente se crioconservaron mediante congelación en medio de congelación de MSC (40 ml de medio de MSC completo, 5 ml de FBS y 5 ml de DMSO).

Las MSC humanas pueden aislarse y cultivarse según el procedimiento dado a conocer en el documento US 5.486.359. También pueden adquirirse MSC humanas de BioWhittaker (Walkersville, MD). La utilización de MSC alogénicas se da a conocer en la solicitud PCT n.º PCT/US99/05351.

Se creó la inestabilidad de una babilla en cada cabra mediante resección quirúrgica del LCA y meniscectomía medial. En el día previo a la cirugía, se retiró la alimentación y justo antes de la cirugía se anestesiaron las cabras con Torbutrol (preanalgésico) y un cóctel de ketamina y diazepam (para la inducción). Se pinzó una extremidad posterior desde el tarso hasta el nivel de la articulación coxofemoral y se limpió de manera aséptica. Se transportó el animal al quirófano y se anestesió utilizando isofluorano en el que se realizó una preparación estéril final utilizando una técnica de pata colgante. Se envolvió la pata utilizando toallas y la pezuña distal se envolvió en toallas estériles y vendajes veterinarios. Se realizó una artrotomía lateral y se escindió el ligamento cruzado anterior (craneal) de su unión en el aspecto medial del cóndilo femoral lateral utilizando una cuchilla n.º 11. Esta unión proximal se llevó hacia delante (anterior) y se escindió todo el ligamento cruzado de su unión tibial. Se agarró el cuerno caudal del menisco con pinza hemostática y se escindió su unión axial (lateral) de su unión tibial. Trabajando desde la zona caudal hacia la lateral, después craneal, se escindió el menisco de las uniones hasta que se retiró completamente. Se movió la babilla en una prueba del cajón para garantizar que se había escindido todo el ligamento cruzado. Se cerró la cápsula articular utilizando material de sutura sintético absorbible (ejemplos incluyen Vicryl, PSD, Dexon, Maxon, etc.) en un sencillo patrón continuo o cruzado. Se cerró la aponeurosis lateral utilizando material de sutura sintético absorbible 0 ó 2-0 en un patrón continuo. Se cerraron los tejidos subcutáneos utilizando material de sutura sintético absorbible 2-0 en un patrón subcuticular. Se cerró la piel utilizando grapas cutáneas.

Se administraron analgésicos dos veces al día durante tres días, tras la operación. Se monitorizó la incisión para detectar signos de infección, incluyendo enrojecimiento, exudado e hinchamiento excesivo. Se retiraron las suturas/grapas cutáneas en dos semanas. Tras un periodo de recuperación de dos semanas, se sometieron todos los animales a ejercicio durante cinco días por semana hasta el sacrificio. El régimen de ejercicio consistió en una carrera de aproximadamente 90 m de longitud.

Preparación de MSC transducidas para su inyección en la articulación de rodilla

Se transfectó el plásmido pOT24, que incluye una secuencia polinucleotídica que codifica para proteína GFP, en la línea celular de empaquetamiento GP+E86, y se produjo el virus mediante las células GP+E86 modificadas. Entonces se transdujo este virus en la línea celular de empaquetamiento PG13, y se produjo virus mediante las células PG13 modificadas.

Se descongelaron las MSC, crioconservadas al final del cultivo primario, y se transdujeron con retrovirus producido a partir de la línea celular de empaquetamiento PG13 (basada en 3T3 de ratón) que contenía una envuelta de simio gibón (Coffin et al, Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., págs. 71-119, 1997). El virus portaba la secuencia para la proteína verde fluorescente potenciada de la medusa Aequorea victoria. Se realizó la transducción convencional de la siguiente manera: se cultivaron células madre mesenquimatosas de cabra a 37ºC en CO_{2} al 5% en aire durante la noche en matraces T80 tras lo cual se sustituyó el medio de cultivo en cada matraz por 15 ml de cóctel de transducción para la transducción centrífuga, tras lo cual se añadieron 2 ml de medio reciente y se continuó la incubación. Se realizó la transducción centrífuga de la siguiente manera: se sustituyó medio de cultivo en cada matraz por 15 ml de cóctel de transducción y se centrifugó en una centrifugadora Beckman GS-6R utilizando soportes de matraces a diferentes fuerzas centrífugas y duraciones a 32ºC. Tras la centrifugación, se añadieron 15 ml de medio reciente a cada matraz. Se realizó un segundo protocolo de transducción al día siguiente. Se seleccionaron células en G418 a una concentración de 1,0 mg/ml y se mantuvieron en cultivo. Tras la selección de G418 se expandieron las MSC transducidas hasta el final del cultivo de paso 2 (P2), y se trataron con tripsina y se congelaron hasta que se requirieron para la inyección. Se determinó la eficacia de transducción utilizando citometría de flujo antes de la crioconservación.

Se descongelaron rápidamente viales que contenían las MSC de cabra transducidas crioconservadas a 37ºC y se añadieron a 40 ml de medio completo de hMSC. Se centrifugaron las células durante 5 min a 1500 rpm y 20ºC y se resuspendieron en 5 ml de PBS. Se retiraron 50 \mul de suspensión celular para la determinación del recuento de células viables utilizando azul trípano. Se lavaron un total de 10 x 10^{6} células con 20 ml de PBS dos veces y se resuspendieron en 5 ml de Hyalartin V 4 mg/ml (Pharmacia) utilizando una jeringuilla de 12 ml con una aguja de 18G unida. Se aspiró la suspensión celular dentro de la jeringuilla para su inyección en la rodilla de cabra y se añadió 1 ml de PBS al tubo para el lavado.

Inyección de MSC de cabra transducidas en la barbilla de cabra

Se pesaron las cabras y se extrajo sangre para obtener suero. Se afeitó la zona de la rodilla y se anestesiaron las cabras y se intubaron. Tras adquirir radiografías craneales a caudales y laterales de ambas rodillas, se colocó la cabra en decúbito dorsal con la rodilla en la que iba a inyectarse sujetada hacia arriba. Se esterilizó la zona alrededor de la rodilla y se flexionó y extendió la rodilla 20 veces para hacer circular el líquido sinovial. Con la rodilla colocada en una flexión de 70-90º, se aspiró tanto líquido como fue posible desde la articulación y se conservó para su análisis. Con la rodilla en la misma posición, se inyectaron 10-20 ml de PBS en la articulación de manera lateral. Se insertó una aguja de 18G justo proximal al menisco y posterior al borde lateral del ligamento de la rótula, a través del triángulo formado por el epicóndilo del fémur, la meseta meniscal/tibial y la muesca formada por su unión. Tras flexionar y extender 20 veces se aspiró el lavado de la articulación y se conservó. Se insertó una válvula de cierre de tres vías con una aguja de 18G unida dentro del triángulo descrito anteriormente en el lado medial de la articulación, justo medial con respecto al ligamento de la rótula. Con la válvula de cierre en la posición abierta, se unió la jeringuilla que contenía la suspensión celular preparada tal como se describió anteriormente a la válvula de cierre y se inyectó la suspensión celular en la cápsula articular. Se lavó cualquier suspensión restante en la válvula de cierre con 1 ml de PBS. Se flexionó y extendió la articulación 20 veces y se mantuvo la cabra en esta posición durante al menos 10 min antes de la recuperación y transferencia al corral de alojamiento.

Necropsia de cabras y recogida de tejidos

Se sacrificaron las cabras de los grupos 1 y 2 seis semanas tras la inyección de células transducidas en la articulación. Se recogieron los ganglios linfáticos poplíteo e inguinal de las extremidades tanto operada como de control contralateral antes de la desarticulación en la cadera. Se tomaron radiografías y se recogió líquido sinovial sin lavado y también tras un lavado con 10 ml de PBS. Tras aspirar el lavado se disecó la articulación y se recogieron los siguientes tejidos: revestimiento de la cápsula articular/sinovial, almohadilla adiposa, tendón largo del músculo extensor de los dedos, ligamento cruzado posterior y menisco lateral. También se recogió cualquier tejido meniscal medial reparado.

Tras la disección, se clasificaron visualmente 13 zonas de cartílago tanto en las articulaciones operadas como control contralaterales y ambas articulaciones de animales control utilizando el sistema de clasificación descrito en la tabla 3 a continuación.

TABLA 3

3

Las zonas seleccionadas se ubicaron en las secciones protegida y sin proteger de las mesetas tibiales medial y lateral, las secciones anterior, media y posterior del cóndilo medial, las secciones media y posterior del cóndilo lateral, las secciones lateral, central y medial de la cresta troclear y en la rótula. Utilizando un escalpelo, se obtuvieron muestras de cartílago de los cóndilos mediales medio y lateral, y de la zona sin proteger de las mesetas tibiales medial y lateral. Se congelaron instantáneamente partes de todos los tejidos recogidos para su análisis molecular y se fijaron en formalina para su análisis histológico. Las articulaciones también se fijaron en formalina. Se fotografiaron todas las articulaciones antes de la fijación y se fotografiaron y volvieron a examinarse tras la fijación para confirmar las puntuaciones de clasificación y para observar la presencia de osteofitos. Se midió la distancia entre las crestas trocleares medial y lateral y se expresó como la distancia troclear (TRD). Se cortaron segmentos de los cóndilos mediales medio y lateral, y la zona sin proteger de las mesetas tibiales medial y lateral utilizando una sierra y se descalcificaron e incrustaron en parafina para su análisis histológico o se incrustaron en metacrilato de metilo sin descalcificación. Algunas articulaciones contralaterales se trataron de la misma manera que la articulación operada y se evaluaron como tejidos control.

Radiografía

Se realizó una radiografía previa a la cirugía inicial, en la inyección y en el sacrificio.

Resultados y discusión

En el sacrificio a los 3 meses, todas las articulaciones operadas (grupos 1 y 2, sólo vehículo, y + células) eran fibróticas y con efusión. En la tabla 4 a continuación se proporcionan los volúmenes de líquido sinovial como indicación del grado de la efusión, la puntuación de cartílago y la TRD como indicación de cambios subcondrales o ampliación de osteofitos del surco troclear.

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TABLA 4

4

Todas las articulaciones operadas mostraron formación de osteofitos.

En cuatro de las seis rodillas que se trataron con MSC la cantidad de formación de osteofitos fue inferior. La formación de osteofitos en otros sitios en la articulación en estas cabras también fue inferior en comparación con rodillas expuestas a hialuronano solo. En todos los casos se produjo formación de osteofitos intensa en la meseta tibial medial posterior; sin embargo, la superficie recién formada en las rodillas expuestas a MSC pareció ser más lisa y se observó hematoma en este sitio en el caso de dos de las tres cabras tratadas sólo con vehículo. En el caso de G165 (MSC y vehículo) el osteofito se manifestó como una masa de tejido calcificado duro (31,2 mm x 41,29 mm x 23,65 mm) recubierta por una estructura similar a menisco. Todas las articulaciones contralaterales presentaban aspecto normal y no mostraron efusión en el sacrificio.

En las seis cabras "+MSC" existía tejido con aspecto de "menisco inmaduro" que cubría algo de la parte expuesta de la meseta tibial medial, y en 3 casos este tejido estaba organizado. Las figuras 1A, 1B y 1C muestran el aspecto y la ubicación del tejido de reparación para G151, G154 y G163, respectivamente. En estos casos, el tejido recién regenerado ocupaba una ubicación ligeramente posterior en la articulación debido al entorno mecánico alterado. En los dos casos en los que el tejido estaba lo más organizado y no como posterior a la articulación (G154 y G163), parecía haber algo de protección del cartílago sobre el cóndilo medial medio y menos formación de osteofitos sobre el surco y el cóndilo femoral lo que indica osteoartritis menos intensa. En el caso de G151 también parecía haber algo de protección con una lesión mucho menor formada. En estos casos, el grado de efusión y el cambio de TRD fueron mínimos (tabla 4). Por tanto, el tejido similar a menisco inmaduro se regeneró en una zona que actuaba como cojín entre las superficies opuestas del cóndilo medial y la meseta tibial medial y protegía la articulación frente a desarrollar osteoartritis como resultado de la carga mecánica alterada en esas articulaciones.

En un caso (G166) el tejido de reparación no protegió las superficies articulares, ya que se formó demasiado posterior en la meseta tibial medial. La figura 2 muestra el grado de protección proporcionado por el tejido similar a menisco en G151 y G154 (panel inferior). El daño al cartílago fue significativamente inferior en estas articulaciones, en las que se habían inyectado MSC, en comparación con el encontrado en articulaciones tratadas sólo con vehículo (figura 2, panel superior). La formación de osteofitos en el aspecto medial del cóndilo medial también fue significativamente inferior en estas articulaciones en las que se inyectaron MSC en comparación con cabras tratadas "sólo con vehículo" (figura 2). Se observó una reparación meniscal mal organizada, fibrosa, limitada en 2 de 3 cabras tratadas "sólo con vehículo" en el aspecto anterior de la articulación. En ninguno de los casos fue la masa o el grado de organización tan significativo como el observado en el grupo "+Células", y no hubo protección aparente de la articulación según se indicó por la puntuación de cartílago (tabla 4).

Los resultados anteriores muestran que las células madre mesenquimatosas autólogas infundidas en babillas con artritis de cabras, seis semanas tras meniscectomía medial y resección de LCA combinadas, estimularon la producción de tejido similar a menisco en las articulaciones de 4 de 6 cabras sacrificadas seis semanas tras la infusión. No se observó ningún tejido similar en las articulaciones de 3 cabras en las que se infundió sólo excipiente.

En las articulaciones en las que se observó el tejido similar al menisco, se ralentizó el transcurso de la destrucción progresiva de cartílago hialino en la superficie articular, basándose en una puntuación macroscópica de la superficie de la articulación; es decir, la inyección de células madre mesenquimatosas previno la destrucción rápida del cartílago de la articulación. Este efecto no se observó en las articulaciones control tratadas sólo con excipiente. Otros cambios, efusión de la articulación, y ensanchamiento, también disminuyeron en el grupo con infusión de MSC, lo que concordaba con el efecto protector del tratamiento con células madre mesenquimatosas. Estas observaciones muestran que las células madre mesenquimatosas, cuando se inyectan en articulaciones con artritis en la babilla de cabra, se retienen en la articulación durante un periodo suficiente para tener un efecto terapéutico. En los resultados resumidos en la presente memoria, las células madre mesenquimatosas inyectadas estabilizaron la articulación y protegieron las superficies articulares frente a la degeneración progresiva observada en articulaciones control.

En 4 de 6 cabras a los 3 meses y en 7 de 9 cabras a los 6 meses, el tejido similar a menisco generado estaba algo organizado con un aspecto similar a hialino (figura 3C). No se observó tejido similar en las articulaciones de las cabras control a los 3 meses con infusión de HA solo; sin embargo, se observó una delgada proliferación sinovial en las articulaciones control a los 6 meses (figura 3A). Este tejido se encontró posterior con respecto a la zona que soporta el peso de la articulación con osteoartritis desestabilizada.

En aquellas articulaciones en las que se observó tejido similar a menisco organizado, se ralentizó la destrucción progresiva del cartílago en la superficie articular, basándose en una puntuación macroscópica de la superficie de las articulaciones. La figura 3B muestra el aspecto del cóndilo medial de una cabra control a los 6 meses con degradación completa del cartílago articular por toda la superficie y repoblación de la zona con osteofitos. Se observó la protección de esta superficie en articulaciones de prueba expuestas a MSC (figura 3D). Este efecto no se observó en las articulaciones control tratadas sólo con vehículo. Otros cambios tales como efusión de la articulación, formación de osteofitos en el cóndilo femoral y ensanchamiento de la articulación también se redujeron, lo que concordaba con el efecto protector del tratamiento con MSC.

El examen del nuevo tejido meniscal organizado a los 3 meses mediante microscopía de fluorescencia indicó la presencia de células positivas para GFP en la superficie del tejido (figuras 4B y 4C). La tinción inmunohistoquímica del tejido similar a menisco posterior indujo una red fibrosa, positiva para colágeno de tipo I, celular, densa (no mostrada) con pequeñas zonas de células más redondeadas que eran positivas para colágeno de tipo II (figuras 4D a 4F).

Para los animales a los 6 meses, el grado de daño, basándose en puntuaciones de superficie de cartílago, es mayor en las cabras control que en las que recibieron las células madre mesenquimatosas, tal como se muestra en la
tabla 5.

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TABLA 5

5

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Una aplicación del descubrimiento es la reducción del dolor a modo de regeneración de tejido meniscal entre superficies opuestas de hueso y osteocondral.

Otra aplicación de los resultados anteriores es impedir o eliminar la necesidad de sustitución de la articulación. Todavía otra aplicación es la reducción de la inflamación en una articulación dañada o enfermada, conduciendo así a la reducción del dolor y a la restauración de la función de la articulación.

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Ejemplo 3

Este ejemplo describe el análisis histológico del cóndilo medio medial de cabras a los 3 meses que recibieron inyección intraarticular de hialuronano de sodio o inyección intraarticular de MSC suspendidas en hialuronano de sodio (grupo tratado con HA+MSC). En la figura 5 se muestran secciones transversales del cóndilo medial medio de cabras tratadas con HA (n=3, paneles izquierdos) y de cabras tratadas con HA+MSC (n=6, paneles central y
derecho).

Se examinó histológicamente el fémur distal tomado de la articulación de rodilla de animales tratados y control. Se muestran secciones transversales del cóndilo medial medio de todas las articulaciones operadas de cabras sacrificadas a los 3 meses. Todas las secciones de las articulaciones contralaterales de estos animales fueron histológicamente normales.

En las tres articulaciones tratadas con HA varios cambios estructurales fueron evidentes. Éstos incluyeron (1) espesamiento de la placa ósea subcondral, (2) reorganización de hueso trabecular, (3) formación de osteofitos mediales y (4) fibrilación de la capa de cartílago.

Los osteofitos fueron particularmente prominentes en el grupo control (figura 5, panel izquierdo) y se marcan con una flecha. En el grupo tratado, hubo significativamente menos formación de osteofitos asociada con aquellas articulaciones en las que había evidencia de regeneración meniscal (figura 5, panel central) y los cóndilos presentaban un aspecto más simétrico, lo que sugiere que pueden haber estado menos expuestos a fuerzas mecánicas anómalas. Los cóndilos mediales de 2 de los 6 animales tratados mostraron evidencias de formación de osteofitos significativa (figura 5, panel derecho, marcado con flecha). En estas articulaciones había menos evidencia de formación de nuevo tejido meniscal.

Las lesiones en la capa articular fueron pronunciadas en el grupo tratado con HA y pueden observarse como fisuras profundas (figura 5, panel izquierdo, parte superior) o como erosión con pérdida de tinción de matriz (figura 5, panel izquierdo, parte inferior). En 4 de los 6 animales tratados la capa de cartílago estaba menos dañada (figura 5, panel central), aunque había pérdida de tinción de superficie (figura 5, panel central, segundo desde la parte superior) y algo de fibrilación superficial (figura 5, panel central, tercero desde la parte superior). De nuevo, en 2 de los 6 animales tratados hubo daño significativo al cartílago incluyendo fisuras (figura 5, panel derecho, parte superior) y erosión (figura 5, panel derecho, parte inferior), lo que sugiere que había poca regeneración en esas articulacio-
nes.

En la zona ósea inmediatamente bajo la superficie de cartílago (la placa subcondral) hubo algunos cambios evidentes. En el grupo sin tratar (figura 5, panel izquierdo) hubo evidencias de espesamiento de la placa, según se observa mediante una tinción más intensa. Esto puede observarse comparando el panel izquierdo, imagen superior, con el panel central, imagen superior, por ejemplo, en las que las diferencias en el espesamiento de la placa son evidentes. Además se produjeron cambios dentro del hueso trabecular que sugieren que las trabéculas eran más espesas y estaban más juntas en el grupo sin tratar (figura 5, panel izquierdo) en comparación con el grupo tratado (figura 5, paneles central y derecho). En 2 de 6 animales en el grupo tratado hubo cambios óseos sustanciales (figura 5, panel derecho). Tal como se mencionó anteriormente estos animales presentaban menos formación de nuevo tejido meniscal en comparación con los otros.

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Ejemplo 4

Introducción

El propósito de este experimento era demostrar el efecto de la administración de MSC derivadas de un donante que no correspondía en un modelo de lesión de rodilla en la cabra. En este caso, se creó la lesión de la articulación de la babilla mediante meniscectomía medial completa sin resección de LCA, un procedimiento que se ha demostrado que provoca cambios degenerativos en la articulación similares a la osteoartritis. No se proporcionó ninguna terapia inmunosupresora.

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Procedimientos

Diseño del estudio. Los animales utilizados en el estudio fueron cabras Western Cross macho castradas (n=20) y se confirmó que estaban libres de fiebre Q, brucelosis y artritis encefalitis caprina. Se aleatorizaron en 4 grupos que no eran diferentes entre sí en cuanto a la edad. Se llevó a cabo una meniscectomía medial unilateral total y, tras un periodo de recuperación de 2 semanas, se sometieron los animales a un régimen de ejercicio impuesto. Se trató la articulación operada mediante inyección de una suspensión de 10^{7} MSC alogénicas en 5 ml de hialuronano de sodio (4 mg/ml) o bien 1 o bien 6 semanas tras el procedimiento quirúrgico. Las tres preparaciones de células de donante alogénico se distribuyeron aleatoriamente entre los animales receptores. Los animales control recibieron 5 ml de hialuronano de sodio sin células. El diseño del estudio se resume en la tabla 6.

TABLA 6 Diseño del estudio para la evaluación de MSC alogénicas en el tratamiento de lesión de rodilla resultante de meniscectomía medial completa (MMX)

6

El régimen de ejercicio comenzó dos semanas tras la inyección y se mantuvo hasta el sacrificio a las 12 semanas tras el procedimiento quirúrgico. Se tomaron radiografías craneal a caudal y lateral de ambas babillas antes de la cirugía inicial, y en el sacrificio.

Preparación de células. Se descongelaron los viales que contenían las MSC de cabra alogénicas transducidas crioconservadas a 37ºC y se lavaron con medio de hMSC. Se centrifugaron las células durante 5 min a 1500 rpm y 20ºC y se resuspendieron en 10 ml de PBS. Se retiraron 50 \mul suspensión celular para la determinación del recuento de células viables utilizando azul trípano. Tras un segundo lavado con PBS (20 ml), se sedimentaron 10 x 10^{6} células en un tubo estéril de 50 ml y se resuspendieron en 5 ml de Hyalartin V (4 mg/ml) utilizando una jeringuilla de 12 ml con un aguja de calibre 18.

Inyección. Antes de la inyección de células en la articulación de rodilla operada, se pesaron las cabras y se extrajo una muestra de sangre para obtener suero. Se esterilizó la zona alrededor de la rodilla y se colocó en 70-90 grados de flexión y se flexionó y extendió 20 veces para hacer circular líquido sinovial por todo el espacio articular. Se aspiró tanto fluido como fue posible desde el surco troclear proximal. Se insertó una aguja de calibre 18 posterior al borde medial del ligamento de la rótula, a través del triángulo formado por el epicóndilo del fémur, la meseta meniscal/tibial y la muesca formada por su unión. Se unió una jeringuilla que contenía la suspensión celular a la aguja y se inyectó la suspensión celular en la cápsula articular. Se flexionó y extendió la articulación 20 veces y se mantuvo la cabra en la posición decúbito prono durante aproximadamente 10 minutos a medida que se retiró la anestesia. Se llevaron los animales a un corral de alojamiento cuando había evidencias de recuperación y respiración normal. Entonces se devolvieron las cabras al aire libre.

Ejercicio. El régimen de ejercicio consistió en 12 carreras en una pista circular con una circunferencia exterior de 28,6 m y una circunferencia interior de 16,3 m. Esto se llevó a cabo una vez al día, cinco días por semana.

Recogida de tejido. Se recogieron las articulaciones operadas y contralaterales mediante desarticulación en la cadera, se fotografiaron y se evaluaron para detectar cambios macroscópicos. Entonces se fijaron las articulaciones en formalina y se fotografiaron y volvieron a examinarse tras la fijación para confirmar las puntuaciones de clasificación y para observar la presencia de osteofitos.

Resultados

La evaluación macroscópica de articulaciones en el sacrificio mostró la presencia de tejido de reparación asociado con el compartimento medial posterior en articulaciones tratadas con MSC alogénicas (figura 6). Este tejido de reparación pareció ser de naturaleza hialina y se desprendió de la meseta tibial de modo que se estableció una superficie de soporte. Los animales control (tratados sólo con hialuronano de sodio) presentaban evidencias de proliferación sinovial en este sitio, que generalmente estaba unida en la tibia proximal con una extensión mínima en las superficies de articulación.

Conclusión

Estas observaciones sugieren que el tratamiento de la rodilla sometida a meniscectomía mediante inyección directa de una suspensión de MSC alogénicas da como resultado la rápida organización de un nuevo tejido meniscal y la posibilidad de condroprotección. La inyección directa de MSC alogénicas en el espacio articular puede aplicarse por tanto en el tratamiento de articulaciones dañadas, por ejemplo, como resultado de lesión meniscal.

Claims

1. Utilización de células madre mesenquimatosas y un excipiente farmacéutico aceptable para la preparación de una composición farmacéutica inyectable para la regeneración o reparación del tejido meniscal en una articulación,

: en la que dicha composición farmacéutica inyectable comprende una cantidad eficaz de células madre mesenquimatosas para la regeneración o reparación del tejido meniscal en una articulación y debe inyectarse en el espacio articular; y

: en la que dichas células madre mesenquimatosas se diferencian en, o estimulan la producción de, tejido meniscal.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que se reduce la esclerosis del hueso subcondral en una articulación, se previene o se reduce la formación de osteofitos en una articulación, o se previene el daño del cartílago en una articulación.

3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho excipiente farmacéutico comprende hialuronano o un hialuronano modificado químicamente.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho excipiente farmacéutico es el hialuronano de sodio.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha articulación se selecciona del grupo constituido por articulaciones de rodilla y la articulación temporomandibular.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas células madre mesenquimatosas son autólogas con respecto al receptor.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas células madre mesenquimatosas son alogénicas con respecto al receptor.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas células madre mesenquimatosas están presentes en dicha composición farmacéutica inyectable en una cantidad de desde aproximadamente 1 x 10^{4} células hasta aproximadamente 1,5 x 10^{8} células.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que dichas células madre mesenquimatosas están presentes en dicha composición farmacéutica inyectable en una cantidad de desde aproximadamente 1 x 10^{5} células hasta aproximadamente 1 x 10^{8} células.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la que dichas células madre mesenquimatosas están presentes en dicha composición farmacéutica inyectable en una cantidad de desde 1 x 10^{6} células hasta aproximadamente 1 x 10^{7} células.

11. Utilización de células madre mesenquimatosas y un excipiente farmacéutico aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para la regeneración o reparación del tejido meniscal en una articulación,

: en la que dicha composición farmacéutica debe administrarse a dicha articulación en ausencia de un soporte y debe inyectarse dentro del espacio articular;

: en la que dicha composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de células madre mesenquimatosas para la regeneración o reparación del tejido meniscal en una articulación; y