ES2202306T3

ES2202306T3 - Composiciones de sellante de fibrina y procedimientos para su uso.

Info

Publication number: ES2202306T3
Application number: ES93308029T
Authority: ES
Inventors: Peter Andrew David Edwardson; John Esam Fairbrother; Ronald Stephen Gardner; Derek Andrew Hollingsbee; Stuart Anthony Cederholm-Williams
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1992-10-08
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2013-10-08
Also published as: SG49640A1; DE69333080D1; US5804428A; NO933624D0; BR9304185A; CZ211793A3; PL173858B1; PL176202B1; CN1091315A; FI110616B; HUT66587A; US5962420A; US5962026A; US6048966A; US5750657A; US5770194A; FI934440A0; AU4887893A; NO314412B1; CA2566574A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A OBTURADORES DE FIBRINA, MAS ESPECIFICAMENTE LA FINALIDAD DE LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE UN OBTURADOR DE FIBRINA, EN EL QUE SE UTILIZA UNA COMPOSICION QUE COMPRENDE MONOMERO DE FIBRINA O UNA COMPOSICION COMPRENDIENDO FIBRINA NO DEGRADADA, COMO UN COMPONENTE DEL OBTURADOR DE FIBRINA.

Description

Composiciones de sellante de fibrina y procedimientos para su uso.

La presente invención se refiere a sellantes de fibrina. Más específicamente, de acuerdo con la invención, se usa una composición que comprende un monómero de fibrina o una composición que comprende fibrina no reticulada como componente de un sellante de fibrina.

En un mamífero, un mecanismo de hemostasia, es decir, de detención de la hemorragia, es la formación de un coágulo. En los seres humanos, la formación de coágulos, es decir, la coagulación de la sangre, se produce mediante una cascada compleja de reacciones en la que los pasos finales son la conversión del fibrinógeno -un monómero- por la trombina, iones calcio y el factor XIII activado para formar finalmente el polímero de fibrina II reticulada, que es el coágulo de fibrina.

La formación del polímero de fibrina II reticulada se desarrolla por la conversión del fibrinógeno realizada por la trombina en monómero de fibrina I, que se polimeriza espontáneamente para formar el polímero de fibrina I, al que muchas veces se denomina fibrina I soluble porque por su tratamiento con los medios químicos adecuados el polímero de fibrina I puede reconvertirse en el monómero de fibrina I. Luego el polímero fibrina I es convertido por la trombina en polímero fibrina II al que muchas veces se denomina fibrina II soluble debido a que mediante los medios químicos adecuados se lo puede convertir en monómero de fibrina II. El polímero de fibrina II, bajo el efecto del factor XIIIa -conocido como factor activado XIII- se reticula para formar la fibrina II reticulada que es el coágulo de fibrina. El factor XIII es activado por la trombina en presencia de iones calcio. La fibrina II reticulada se denomina en ocasiones fibrina II insoluble porque no puede convertirse en monómero de fibrina II.

Se debe señalar que la trombina se forma a partir de la protrombina. La protrombina es convertida en trombina por el factor Xa en presencia de calcio y otras sustancias auxiliares.

El fibrinógeno representa alrededor de 2 a 4 gramos/litro de proteína del plasma sanguíneo. El fibrinógeno es un monómero que consiste en tres pares de cadenas polipeptídicas denominadas (A\alpha)_{2}, (B\beta)_{2}, \gamma_{2} unidas por bisulfuro. "A" y "B" representan los dos péptidos aminoterminales pequeños, conocidos como fibrinopéptido A y fibrinopéptido B, respectivamente. La escisión de los fibrinopéptidos A del fibrinógeno que se produce durante la transformación del fibrinógeno por la trombina deriva en el compuesto fibrina I y la posterior escisión de los fibrinopéptidos B deriva en el compuesto fibrina II. Esta escisión de los fibrinopéptidos A y B reduce el peso molecular del fibrinógeno en una cantidad extremadamente pequeña, de alrededor de 6.000 por cada 340.000 dalton, pero expone los sitios de polimerización. Para una revisión de los mecanismos de coagulación de la sangre y la estructura del fibrinógeno, véase C.M. Jackson, Ann. Rev. Biochem., 49: 765-811 (1980) y B. Furie and B.C. Furie, Cell, 53: 505-518 (1988).

Un sellante de fibrina es un sellante biológico cuyo efecto imita las etapas finales de la coagulación, produciendo, por tanto, un coágulo de fibrina. Los sellantes de fibrina convencionales consisten en un fibrinógeno humano concentrado, aprotinina bovina y factor XIII como primer componente y cloruro de calcio como segundo componente. Por lo general, su aplicación se realiza con una jeringa de cañón de doble, que permite la aplicación simultánea de ambos componentes en el lugar donde se desea que se forme el coágulo de fibrina. La aprotinina es un inhibidor fibrinolítico que se agrega para promover la estabilidad de los sellantes de fibrina

El componente fibrinógeno del sellante de fibrina se prepara a partir de mezcla de plasmas humanos. El fibrinógeno se puede concentrar a partir del plasma humano mediante crioprecipitación y precipitación usando varios reactivos, por ejemplo, polietilenglicol, éter, etanol, sulfato de amonio o glicina. Puede consultarse una excelente reseña de los sellantes de fibrina en M. Brennan, Blood Reviews, 5:240-244 (1991); J.W. Gibble y P.M. Ness, Transfusion, 30:741-747 (1990); H. Matras, J. Oral Maxillofac Surg., 43:605-611 (1985) y R. Lerner and N. Binur, J. of Surgical Research, 48:165-181 (1990).

Recientemente, también ha habido interés en la preparación de sellantes de fibrina que utilizan fibrina autóloga. Un sellante de fibrina autólogo es aquel en cual su componente fibrinógeno es extraído de la sangre del propio paciente. Se prefiere el uso de un sellante de fibrina autólogo porque elimina el riesgo de infecciones de transmisión hemática, como por ejemplo, la hepatitis B, la hepatitis ni A ni B y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que, de lo contrario, podrían estar presentes en el componente fibrinógeno extraído de la mezcla de plasma humano. Véase L.E. Silberstein et al., Transfusion, 28:319-321 (1988); K. Laitakari and J. Loutonen, Laryngoscope, 99:974-976 (1989) y A. Dresdale et al., The Annals of Thoracic Surgery, 40:385-387 (1985).

Un sellante de fibrina puede transmitir una infección no sólo por medio del fibrinógeno sino también por medio de la aprotinina bovina y el componente de trombina bovina. Se sabe que la trombina bovina es portadora del agente infeccioso de la encefalitis esponjiforme bovina (BSE: bovine spongiform encephalitis) y otros virus patógenos para los mamíferos. Además, la trombina bovina es un antígeno potente que puede causar reacciones inmunológicas en los seres humanos. Por tanto, el uso de trombina bovina podría dar como resultado que el receptor de la trombina bovina resulte afectado negativamente. Véase D.M. Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (Suplemento A): 141-146 (1991), S.B. Prusiner et al., Cornell Vet, 81 nº 2: 85-96 (1991) y D. Matthews, J. Roy. Soc. Health, 3-5 (febrero de 1991).

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Conforme a lo expuesto, existe la necesidad de un sellante de fibrina que se pueda administrar al paciente sin el riesgo de contaminación vírica u otros efectos adversos.

La presente invención se refiere al uso de una fibrina, que es un monómero o un oligómero no dinámico de fibrina, en la preparación de una composición para formar un sellante de fibrina, en el que dicho sellante de fibrina se forma convirtiendo dicho monómero u oligómero no dinámico de fibrina en un polímero de fibrina simultáneamente con el contacto de la composición con el lugar donde se desea que se forme el coágulo, formando así un sellante de fibrina; y en el que "no dinámico" significa que dicho monómero u oligómero de fibrina no se polimeriza durante 1,5 minutos como mínimo.

Varios aspectos más de la invención se exponen más abajo en las reivindicaciones independientes.

A los fines de la presente invención, se utilizan las siguientes definiciones:

Fibrina:: Fibrina significa cualquier forma de fibrina. Ejemplos no limitantes de fibrina incluyen: la fibrina I, la fibrina II y la des-BB-fibrina. La fibrina puede estar en forma de monómero o en forma de polímero, pudiendo ser esta última forma no reticulada o reticulada.

Monómero de fibrina:: El monómero de fibrina incluye cualquier forma de fibrina, por ejemplo, fibrina I, fibrina II o des-BB-fibrina, en la que la fibrina esté en forma de monómero o en forma de oligómero que se pueda solubilizar en la composición que comprende monómero de fibrina y en la que el monómero de fibrina se pueda convertir en polímero de fibrina.

Polímero de fibrina:: El polímero de fibrina incluye cualquier forma de fibrina, por ejemplo, fibrina I, fibrina II o des-BB-fibrina, en la cual dicha fibrina esté en forma polimérica, ya sea no reticulada o reticulada.

Fibrina no reticulada:: La fibrina no reticulada incluye cualquier forma de fibrina, por ejemplo, fibrina I, fibrina II o des-BB-fibrina, en la que dicha fibrina sea no reticulada y se pueda convertir en fibrina reticulada. La fibrina no reticulada puede ser monómero de fibrina o polímero de fibrina no reticulada.

Fibrina reticulada:: La fibrina reticulada incluye cualquier forma de fibrina, por ejemplo, fibrina I, fibrina II o des-BB-fibrina, en la que la fibrina sea un polímero de fibrina que sea reticulado.

4.1. La composición que comprende monómero de fibrina

La composición de fibrina de la presente invención que comprende monómero de fibrina es una composición que contiene cualquier forma de monómero de fibrina que se pueda transformar en polímero de fibrina. Ejemplos no limitantes del monómero de fibrina incluyen el monómero de fibrina I, el monómero de fibrina II o el monómero de des-BB-fibrina, siendo el monómero de fibrina I el preferido. Por supuesto, pueden estar presentes mezclas de monómero de fibrina. También, a los fines de la presente invención, polímero de fibrina incluye cualquier polímero que se produzca por la polimerización del monómero de fibrina. Así, por ejemplo, la conversión del monómero I de fibrina en polímero de fibrina puede dar como resultado polímero de fibrina I, reticulado o no reticulado, o polímero de fibrina II, reticulado o no reticulado, según la forma en que se lleve a cabo el paso de conversión.

Se prefiere el monómero de fibrina I porque, a diferencia del fibrinógeno, puede convertirse fácilmente en polímero de fibrina sin el uso de trombina o factor XIII. De hecho, el monómero de fibrina I puede formar espontáneamente polímero de fibrina I, que puede actuar como coágulo de fibrina, más allá de que el polímero de fibrina I esté reticulado o no reticulado, o se convierta luego en el polímero de fibrina II. La formación del polímero de fibrina I a partir del monómero de fibrina I es espontánea; por tanto, el polímero de fibrina I se puede formar sin trombina y factor XIII, evitando así los problemas asociados a la trombina bovina. (Se debe señalar que si se utiliza el monómero de fibrina I de modo tal que este monómero entre en contacto con la sangre del paciente, por ejemplo, en una herida, la trombina y el factor XIII del paciente pueden convertir el polímero de fibrina I en polímero de fibrina II reticulado).

La composición que comprende fibrina no reticulada es una composición que contiene cualquier forma de fibrina no reticulada. Ejemplos no limitantes de fibrina no reticulada son la fibrina I no reticulada, la fibrina II no reticulada y la des-BB-fibrina, siendo la fibrina I no reticulada la preferida. Desde luego, pueden estar presentes mezclas de fibrina no reticulada. También, a los fines de la presente invención la "fibrina reticulada" incluye cualquier forma de fibrina que se produzca por la conversión de fibrina no reticulada en fibrina reticulada. Así, la fibrina reticulada, por ejemplo, que se produce a partir de la conversión de fibrina I no reticulada en fibrina reticulada, puede ser fibrina I reticulada o fibrina II reticulada, dependiendo de la forma en que se realice el paso de conversión.

Se prefiere la fibrina I no reticulada porque puede convertirse en fibrina reticulada con mayor facilidad que el fibrinógeno. De hecho, se considera que la fibrina I puede formar fibrina I reticulada que puede actuar como sellante de fibrina. De este modo, la formación de la fibrina I reticulada a partir de fibrina no reticulada I se puede realizar sin trombina, evitando así los problemas asociados a la trombina bovina, a pesar de que puede requerirse factor XIII activado. (Se debe señalar que si se utiliza la fibrina I reticulada de modo tal que ésta fibrina entre en contacto con la sangre del paciente, por ejemplo en una herida, la trombina y el factor XIII del paciente pueden convertir la fibrina I en fibrina II reticulada).

También la fibrina no reticulada puede ser un polímero, un oligómero o un monómero, a pesar de que se prefiere un oligómero o un monómero, es decir, el monómero de fibrina. Esto se debe al hecho de que la fibrina no reticulada en forma de polímero es, por lo general, un gel y, por tanto, es muy difícil de administrar al lugar deseado y proporciona un contacto menos íntimo con las células del lugar deseado. Por el contrario, una fibrina no reticulada que tenga forma de oligómero o monómero es soluble y, por tanto, puede administrarse con mayor facilidad al lugar deseado y tener un contacto más íntimo con las células. Por supuesto, la composición puede contener una mezcla de esas formas de fibrina no reticulada.

La fuente de la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada puede ser cualquier fuente conocida o a desarrollar, siempre que el monómero de fibrina pueda convertirse en polímero de fibrina o que la fibrina no reticulada se pueda convertirse en fibrina reticulada. Fuentes no limitantes de composiciones que comprenden monómero de fibrina o fibrina no reticulada son la sangre, preferiblemente la sangre de mamífero e incluso más preferiblemente la sangre humana, los cultivos celulares que segregan fibrinógeno y fibrinógeno recombinante, siendo la sangre la fuente preferida. La sangre puede estar en cualquier forma incluyendo, por ejemplo, la sangre completa o los preparados de fibrinógeno. También puede utilizarse sangre para preparar un sellante de fibrina autólogo.

Se ha observado que una composición que comprende fibrina I no reticulada, ya sea como fibrina I monómero o fibrina I polímero, preparada a partir de sangre completa según lo descrito más abajo, se puede convertir en fibrina II reticulada, ¡ sin el agregado de trombina, factor XIII y otras sustancias necesarias para la coagulación de la sangre! Se considera que esto se debe al hecho de que la composición que comprende fibrina I no reticulada preparada a partir de sangre completa retiene cantidades suficientes de protrombina, factor XIII y otras sustancias necesarias similares del plasma de modo tal que se puede convertir la fibrina I no reticulada en fibrina II reticulada sin el agregado de trombina y factor XIII exógenos. La protrombina y el factor XIII endógenos se pueden utilizar en el sellante de fibrina de la presente invención como componentes de la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada.

Sin embargo, se debe señalar que no se retienen cantidades suficientes de trombina y factor XIII como para convertir el fibrinógeno en fibrina II reticulada a una tasa de reacción que sea adecuada para un sellante de fibrina. Se considera que se necesita más trombina para convertir el fibrinógeno en fibrina II reticulada que para convertir la fibrina I no reticulada en fibrina II reticulada a una tasa de reacción equivalente.

Cada una de esas tres fuentes contiene fibrinógeno, que se puede convertir en monómero de fibrina o fibrina no reticulada. Además de ese paso de conversión, la composición resultante que contiene monómero de fibrina o fibrina no reticulada debe estar en una forma concentrada. Se prefiere que la concentración del monómero de fibrina no sea inferior a aproximadamente 10 mg/ml, más preferiblemente desde alrededor de 20 mg/ml a alrededor de 200 mg/ml, incluso más preferiblemente, desde alrededor de 20 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml y es sumamente preferible que contenga entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml.

Además, el monómero de fibrina o la fibrina no reticulada no es dinámico. A los fines de la presente invención, que una composición que comprende fibrina no reticulada no sea dinámica significa que la fibrina no reticulada de esa composición no se reticula durante 1,5 minutos como mínimo, preferiblemente durante 3 minutos como mínimo y más preferiblemente durante 30 minutos como mínimo después de la preparación de esa composición. A los fines de la presente invención que una composición que comprende monómero de fibrina no sea dinámica significa que el monómero de fibrina de esa composición no se polimeriza durante alrededor de 1,5 minutos como mínimo, preferiblemente durante alrededor de 3 minutos como mínimo, más preferiblemente durante alrededor de 30 minutos como mínimo, y más preferiblemente aún durante alrededor de 2 horas como mínimo después de la preparación de la composición. De hecho se debe señalar que la composición que comprende el monómero de fibrina puede no ser dinámica durante al menos varios días, esto es, ¡alrededor de 72 horas, después de su preparación!.

La composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada se puede preparar a partir de sangre. El método puede producir un polímero de fibrina unido por enlaces de hidrógeno, que es una forma de fibrina no reticulada. Ese polímero se puede utilizar luego como componente del sellante de fibrina o convertirse en monómero de fibrina por un proceso denominado solubilización, todo según se describe más abajo. También se prefiere que la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada se prepare en condiciones estériles.

Las composiciones que comprenden monómero de fibrina o fibrina no reticulada se pueden preparar a partir de sangre completa extrayendo sangre de un donante y preferiblemente en presencia de un anticoagulante. Puede usarse cualquier anticoagulante. Ejemplos no limitantes son heparina, EDTA, hirudina, citrato o cualquier otro agente que pueda evitar directa o indirectamente la formación de trombina, siendo el citrato el preferido.

El plasma que contiene el fibrinógeno se separa luego de la sangre completa. Puede usarse cualquier técnica de separación, por ejemplo, sedimentación, centrifugación o filtración. La centrifugación se puede llevar a cabo a alrededor de 3.000 g durante alrededor de 10 minutos. Sin embargo, si se desea obtener plasma con alto contenido de trombocitos, la centrifugación puede realizase a una fuerza g inferior, por ejemplo, 500 g durante alrededor de 20 minutos. El sobrenadante que contiene el plasma puede separarse por las técnicas corrientes.

La filtración se puede realizar pasando la sangre completa a través de un filtro adecuado que separe las células sanguíneas del plasma. Se prefiere que el filtro sea una membrana microporosa que transmita bien las proteínas.

El plasma resultante se trata luego para convertir el fibrinógeno en monómero de fibrina o fibrina no reticulada. Esta conversión se puede realizar por cualquier técnica conocida o a desarrollar.

Una técnica preferida para producir monómero de fibrina o fibrina no reticulada es mediante una enzima del tipo trombina, incluyendo a la trombina. Una enzima del tipo trombina es una enzima que cataliza la formación de fibrina a partir del fibrinógeno. Una fuente común de enzimas del tipo trombina son los venenos de serpiente. Preferiblemente la enzima del tipo trombina se purifica a partir del veneno de serpiente. Dependiendo de la enzima de tipo trombina que se elija, esta enzima puede liberar el fibrinopéptido A -formándose la fibrina I-, el fibrinopéptido B -formándose la des-BB-fibrina- o de ambos fibrinopéptidos A y B -formándose la fibrina II. Es preciso señalar que aquellas enzimas de tipo trombina que liberan el fibrinopéptido A y B pueden hacerlo a tasas diferentes. Así, la composición resultante puede ser, por ejemplo, una mezcla de la fibrina II y la fibrina I, o una mezcla de la fibrina II y la des-BB-fibrina.

La Tabla I es una lista no limitante de las fuentes de venenos de serpiente que se pueden utilizar en la presente invención, el nombre de la enzima del tipo trombina y el(los) fibrinopéptido(s) que se libera(n) como resultado del tratamiento con la enzima.

TABLA I

Fuente	Nombre	Fibrinopéptido
		liberado
Agkistrodon acutus	Acutin	A
A. contortrix contortrix	Venzyme	B, (A)^{*}
A. halys Pallas		B, (A)^{*}
A. (Calloselasma) rhodostoma	Ancrod, Arvin	A
Bothrops asper (B. atrox)	Asperasa	A
B. atrox	Batroxobina, reactivo de reptilasa	A
B. insularis		A, B
B. jararaca	Botropasa	A
B. moojeni (B. atrox)	Batroxobina, Defibrasa	A
Lachesis muta muta		A, B
Crotalus adamanteus	Crotalasa	A
C. durissus terrificus		A
Trimeresurus flavoviridis	Flavoxobin	A
T. gramineus		A
Bitis gabonica	Gabonasa	A, B
* ( ) significa actividad baja.

Puede consultarse una reseña de las enzimas de tipo trombina provenientes de venenos de serpiente en H. Pirkle and K. Stocker, Thrombosis and Haemostasis, 65(4): 444-450 (1991).

Las enzimas de tipo trombina preferidas son Batroxobina, especialmente la que proviene de B. moojeni, B. maranhao y B. atrox y Ancrod, especialmente la que proviene de A. rhodostoma.

El monómero de fibrina o la fibrina no reticulada puede prepararse poniendo en contacto el plasma con la enzima de tipo trombina, permitiendo así que el fibrinógeno del plasma se convierta en monómero de fibrina. Sin embargo, el monómero de fibrina resultante se polimeriza espontáneamente para formar un polímero unido por enlaces de hidrógeno en forma de gel que se separa del suero remanente que es una solución. El gel es una forma de la composición que comprende fibrina no reticulada.

Este gel de fibrina no reticulada se puede separar, por ejemplo por centrifugación (3.000 g durante 10 minutos), separación manual de la fibrina no reticulada a partir del suero, o filtración directa o a presión seguida de la eliminación del suero separado. (Se puede utilizar un filtro con un tamaño de poro de 1-100 micrómetros, por ejemplo, un filtro de polipropileno sinterizado con un tamaño de poro de 20 micrómetros de Porex, Inc., un filtro de teflón con un tamaño de poro de 20-70 micrómetros de Fluorotechniques, Inc. o un filtro de nylon 66 con un tamaño de poro de 22-46 micrómetros de Costar, Inc.).

Este método de recuperación separa el gel de fibrina no reticulada del suero que es una solución y, de esta forma, concentra el gel de fibrina no reticulada con respecto al plasma. Se debe señalar que el gel de fibrina no reticulada retiene al menos algo de protrombina, factor XIII y otras sustancias necesarias similares del plasma de modo que la fibrina I no reticulada se puede convertir en fibrina II reticulada sin el agregado de trombina o factor XIII. Esta protrombina y factor XIII endógenos se pueden usar en el sellante de fibrina de la presente invención como un componente de la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada.

La fuerza de centrifugación o la presión de filtración aplicadas durante la separación determinará cuánto suero se elimina del gel de fibrina sin reticular: cuanto mayor sea esa fuerza o presión, más concentrado será el gel de fibrina no reticulada resultante. Sin embargo, se prefiere que esa fuerza o presión no sea tan alta como para que resulten eliminados la protrombina y el factor XIII del gel de fibrina no reticulada.

El gel de fibrina no reticulada queda así listo para usar como componente del sellante de fibrina en una forma de la composición que comprende fibrina no reticulada. Se ha observado que cuando esa composición se prepara a partir de sangre completa, entre alrededor del 60% hasta alrededor del 90% del fibrinógeno original está presente en la composición pero, desde luego, en la forma de una fibrina no reticulada.

La composición que comprende la fibrina no reticulada se puede utilizar de inmediato después de su preparación. De hecho, se prefiere particularmente que esa composición se use de inmediato después de su preparación cuando la composición es autóloga. Si la composición no se utiliza de inmediato después de su preparación, es posible almacenarla. El almacenamiento de la composición requiere su conservación mediante, por ejemplo, congelación o liofilización, o manteniéndola a 4ºC. La composición en forma congelada o liofilizada será estable durante un periodo de meses. Cuando la composición se mantiene a 4ºC se considera que es estable durante al menos un periodo de días.

Si la composición está congelada, debe descongelarse antes del momento de uso.

Esta técnica, que conduce a la formación del gel de fibrina no reticulada, convierte el fibrinógeno en gel de fibrina no reticulada y concentra ese gel esencialmente en un paso. Como alternativa, aunque menos preferida, es posible concentrar el fibrinógeno mediante las técnicas convencionales, por ejemplo, por crioprecipitación y precipitación usando varios reactivos, por ejemplo, polietilenglicol, éter, etanol, sulfato de amonio o glicina. El fibrinógeno concentrado puede convertirse luego en gel de fibrina no reticulada por las técnicas arriba descritas o, preferiblemente, puesto que ya está concentrado, puede convertirse en una composición que comprenda el monómero de fibrina sin la necesidad de formar primero el gel de fibrina no reticulada. Esto puede realizarse poniendo en contacto el fibrinógeno concentrado con un agente caotrópico para obtener una solución de fibrinógeno.

El agente caotrópico es necesario para evitar la polimerización espontánea del monómero de fibrina que se produce después de ponerse en contacto el fibrinógeno con la enzima de tipo trombina. El agente caotrópico se mezcla con la composición de fibrinógeno y luego se agita durante alrededor de 1 a 2 minutos para formar la solución de fibrinógeno. El fibrinógeno puede convertirse entonces en un monómero de fibrina, por ejemplo, mediante una enzima del tipo de trombina, como se ha descrito más arriba, o por una enzima de tipo trombina inmovilizada sobre un soporte como se describe más abajo.

Entre los agentes caotrópico adecuados se incluyen la urea, el bromuro de sodio, el clorhidrato de guanidina, el KCNS, el yoduro de potasio y el bromuro de potasio. La concentración preferida de agente caotrópico es desde alrededor de 0,2 a alrededor de 6,0 molar y, más preferiblemente, desde alrededor de 0,3 a alrededor de 2,0 molar. Se prefiere que se utilice la menor cantidad de agente caotrópico posible capaz de evitar que el monómero de fibrina se polimerice de forma espontánea.

Se debe señalar que es preferible no agregar una fuente de iones calcio al agente caotrópico hasta que se desee convertir el monómero de fibrina en polímero de fibrina como se describe más abajo. Esto asegura que el monómero de fibrina no se reticule debido a la activación de alguno de los factores de coagulación sanguínea endógenos.

En una realización preferida la enzima de tipo trombina se inmoviliza sobre un soporte. Se prefiere este tipo de realización porque permite separar con facilidad la enzima inmovilizada del plasma, evitando así que la composición que comprende fibrina no reticulada se contamine con la enzima.

Cualquier soporte al cual se pueda fijar la enzima de tipo trombina puede usarse en la presente invención. Ejemplos no limitantes de soporte son la celulosa, los polidextran, la agarosa, los poliestirenos, el sílice, los ácidos poliacrílicos, las poliacrilamidas, los polivinilalcoholes, las perlas de vidrio, el politetrafluoretileno, el policarbonato, el colágeno, los derivados de celulosa, el teflón y sus compuestos, siendo el poliestireno de sílice y la agarosa los más preferidos.

En otra realización preferida la enzima de tipo trombina se fija sobre un soporte que es un filtro, o sobre un lado del filtro y unida a otro soporte, por ejemplo, perlas. De lo contrario, la enzima de tipo trombina pasa a través del filtro. Por eso el tamaño de poro del filtro debe impedir que la enzima de tipo trombina inmovilizada atraviese el filtro, pero permitir que la fibrina no reticulada lo atraviese. La fibrina no reticulada se prepara poniendo en contacto el plasma con la enzima de tipo trombina de un lado del filtro para formar un monómero de fibrina, que pasa a través del filtro junto con el resto del plasma. Así la composición resultante que comprende fibrina no reticulada se separa necesariamente de la enzima de tipo trombina. Después de pasar a través del filtro, el monómero de fibrina se polimeriza espontáneamente para formar un polímero de fibrina no reticulada.

Para inmovilizar la enzima de tipo trombina en un soporte, el soporte debe estar activado. Esto puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las técnicas adecuadas. Por ejemplo, algunas de las químicas de activación disponibles para derivar soportes son: grupos diazonio, grupos isocianato, grupos cloruro, grupos anhídrido de ácidos, grupos cloruro de sulfonilo, grupos dinitrofluorofenilo, grupos isotiocianato, grupos hidroxilo, grupos amino, grupos n-hidroxisuccinimida, grupos triacina, grupos hidracina, grupos carbo-di-imida, grupos silano y bromuro de cianógeno. Véase (a) Patente Pentapharm DT 2440 254 A1; (b) P.D.G. Dean, W.S. Johnson and F.A. Middle (Editores) (1991) IRL Press Oxford. Affinity Chromatography. A practical approach. Capítulo 2. Activation Procedures, cuyas publicaciones se incorporan aquí como referencia.

La química de activación preferida es mediante un grupo hidracida. El uso de un soporte activado con hidracida produce un porcentaje máximo [como mínimo alrededor del 30% a alrededor del 50%, según lo medido por el análisis S2238 -véase Axelsson G. et al., Thromb. Haemost., 36:517(1976)] de enzima de tipo trombina que mantiene su actividad sin una lixiviación sustancial de la enzima. Para el acoplamiento de la enzima también se pueden utilizar valores de pH bajos, por ejemplo pH 4-6, para evitar que la enzima se degrade.

Por lo general, el soporte es activado por un compuesto altamente reactivo, que posteriormente reacciona con un grupo funcional de un ligando, por ejemplo, -OH, -NH_{2}, -SH, -COOH, -CHO para formar una unión covalente. Las químicas de activación preferidas para usar en la presente invención son:

(a): por medio de un grupo triacina y preferiblemente grupos halogenuros de triacina;

(b): por medio de un grupo cloruro de tresilo;

(c): por medio de un grupo carbonil-di-imidazola;

(d): por medio de un grupo bromuro de cianógeno; y

(e): por medio de un grupo hidracida o amino.

En (a) - (d) la proteína se acopla mediante la reacción con grupos -NH_{2}, -SH o -OH, mientras que en (e), la proteína se acopla mediante el grupo carbohidrato oxidado, esto es, -CHO. El uso de estas químicas produce un porcentaje máximo (como mínimo alrededor del 30% a alrededor del 50% según lo medido por el análisis S2238) de enzima de tipo trombina que retiene su actividad sin una lixiviación sustancial de esta enzima.

Para la activación con triacina se usaron dos métodos diferentes. El primer método implicó la unión del anillo de triacina directamente a la superficie de los grupos -OH. Este método es similar al empleado para la activación con CNBr, en el que los grupos diol superficiales se hicieron reaccionar con CNBr. Para la activación con triacina, los grupos OH de la agarosa se hicieron reaccionar con triacina (cloruro cianúrico).

Por lo general, el soporte es activado por un compuesto altamente reactivo, que posteriormente reacciona con un grupo funcional del ligando, por ejemplo, -OH, -NH_{2}, -SH, -CHO, para formar una unión covalente. Los grupos activos remanentes que no están unidos a una enzima de tipo trombina pueden bloquearse con compuestos no reactivos como etanolamina, anhídrido acético o glicina, aunque esto no es esencial.

Las químicas de activación preferidas para el uso en la presente invención son:

(a): Activación con bromuro de cianógeno seguida por el acoplamiento directo de la enzima mediante grupos -NH_{2} de la proteína.

(b): Activación del soporte con monoclorotriacina seguida del acoplamiento de una enzima mediante los grupos -NH_{2}, -OH o -SH.

(c): Activación del soporte con diclorotriacina seguida del acoplamiento de la enzima mediante los grupos -NH_{2}, -OH o -SH.

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(d): Activación del soporte con cloruro de tresilo seguida del acoplamiento de la enzima mediante los grupos -NH_{2}, -OH o -SH.

(e): Activación del soporte con hidracida de ácido adípico o hidracina seguida del acoplamiento de la enzima oxidada mediante los grupos -CHO.

(f): Activación del soporte con un ligando amino seguida del acoplamiento de la enzima oxidada mediante los grupos -CHO.

Todas las metodologías a las que se hace referencia más arriba emplean agarosa como soporte; sin embargo, es posible usar sílice. Cuando se usa este soporte, las químicas de activación preferidas son:

(a): Activación con \gamma-glucidoxipropiltrimetoxisilano con acoplamiento directo de la enzima de tipo trombina a través de los grupos -NH_{2} de la proteína.

(b): Activación con bromuro de cianógeno seguida por el acoplamiento directo de la enzima a través de los grupos -NH_{2} de la proteína.

(c): Activación con \gamma-glucidoxipropiltrimetoxisilano seguida de la apertura del anillo epóxido para formar un grupo diol que se puede activar posteriormente con bromuro de cianógeno. El acoplamiento directo de la enzima puede lograrse a través de los grupos -NH_{2} de la proteína.

(d): Activación con \gamma-glucidoxipropiltrimetoxisilano seguida de la preparación de amino-sílice por tratamiento con una solución de amoníaco.

El amino-sílice puede activarse posteriormente con cloruro cianúrico (triacina) y acoplarse la enzima a través de los grupos -NH_{2}, -OH o -SH.

El acoplamiento de la enzima al soporte activado se debe tamponar a un cierto pH para obtener una unión enzimática óptima. Por lo general, con las técnicas de activación corrientes, tales como el acoplamiento con \gamma-glucidoxipropiltrimetoxisilano de la enzima a un soporte activado, y el acoplamiento de cualquier proteína con bromuro de cianógeno a los grupos activos, se requiere un tamponado a un pH 1-2 unidades mayor que el pKa de las aminas primarias y secundarias de la enzima. Sin embargo, el uso de cloruro cianúrico como activador permite el uso de tampones de pH muy inferiores (el pH óptimo de acoplamiento es 4-6). Otro método de acoplamiento de glucoproteínas como la batroxobina a un soporte inerte es a través de sus grupos carbohidrato. Esto implica primero la oxidación del grupo azúcar a grupos -CHO seguida del acoplamiento directo en condiciones de pH ácido a un grupo amino como la hidracida. Se puede usar una gama amplia de tampones de acoplamiento. Véase, por ejemplo, la Tabla 2.

TABLA 2 Ejemplos de tampones de acoplamiento usados para la inmovilización de la enzima en los soportes de sílice y agarosa

Soporte	Método de activación	Tampón de acoplamiento
Sílice	\gamma-glucidoxipropiltrimetoxisilano	Bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8-9
		HEPES 10 mM pH 7,0
Sílice	\gamma-glucidoxipropiltrimetoxisilano +	Bicarbonato de sodio 0,1 M; pH 8-9
	bromuro de cianógeo	HEPES 10 mM pH 7,0
Sílice	Bromuro de cianógeno	Agua pH 7,0
		Bicarbonato de sodio 0,1 M; pH 7-9
		HEPES 10 mM pH 7,0
Agarosa	Monoclorotriacina	Acetato de sodio 50 mM / ClNa 1 M pH
		4,0
Agarosa	Diclorotriacina	Fosfato de potasio 0,1 M / ClNa 1 M pH
		8,0-9,0
Agarosa	Cloruro de tresilo	Fosfato de potasio 50 mM / ClNa 0,5 M pH
		7,7

TABLA 2 (continuación)

Soporte	Método de activación	Tampón de acoplamiento
Agarosa	Hidracida	Acetato de sodio 50 mM; pH 5,5
		NaBH_{4} 10 mM
Agarosa	Amina	Acetato de sodio 50 mM; pH 5,5
		NaBH_{4} 10 mM

Después de la activación el soporte tiene más centros activos que los necesarios para el acoplamiento enzimático. Estos centros, si no se desactivan, pueden formar uniones covalentes con las proteínas contaminantes, lo que podría afectar la función biológica de la enzima inmovilizada.

Los grupos en exceso pueden desactivarse mediante el acoplamiento covalente de aminas pequeñas que no interfieren tales como la etanolamina.

Si se usan soportes activados con hidracida o amina, el bloqueo de los grupos reactivos residuales después del acoplamiento de la enzima se puede lograr con el uso de anhídrido acético.

La inactivación de la enzima durante el proceso de inmovilización ocurre según del método de inmovilización y el soporte. Si se usa un soporte de sílice con la química de activación más deseable (por ejemplo, bromuro de cianógeno), se pierde hasta el 80-90% de la actividad enzimática. Sin embargo, el uso de agarosa como soporte con activación por cloruro cianúrico lleva a una pérdida menor de la actividad enzimática.

Para caracterizar la eficacia de la enzima inmovilizada sobre el soporte, se pueden utilizar dos métodos de evaluación de la cantidad de una enzima activa inmovilizada sobre el soporte: la Prueba del tiempo de coagulación [Clauss, A., Acta Haematol., 17:237 (1957)] y la Prueba S2238 [véase Axelsson G. et al., Thromb. Haemost. 36:517 (1976)].

Para evaluar la lixiviación de la enzima desde el soporte se puede utilizar la siguiente prueba.

La lixiviación se puede evaluar mediante el radiomarcado de la enzima de tipo trombina, por ejemplo, con I^{125} batroxobina. Sin embargo, antes de hacer la prueba de lixiviación es necesario eliminar todo el radiomarcado no unido. Esto se puede lograr lavando el soporte según la siguiente secuencia: 50 ml de acetato de sodio 50 mM pH 5,5; 100 ml de glicina 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 3,0; 100 ml de carbonato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 10,0; 100 ml de fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 7,0; 100 ml de agua y 100 ml de fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 7,0. Después de un procedimiento de lavado como el descrito no había radiomarcado detectable en los lavados, y \geq 50% de la enzima inicial radiomarcada se encontraba acoplada al soporte.

(a) Cantidad de enzima requerida

La cantidad de enzima requerida para el tratamiento de 30-70 ml de plasma (obtenido de 60-150 ml de sangre completa) es 30-200 unidades después de alrededor de 10-15 minutos de mezclado.

Si se emplea agarosa como matriz de soporte, 30-200 U de batroxobina dan como resultado la formación de fibrina no reticulada en alrededor de 7-20 minutos. Este sistema emplea la activación con hidracida y 0,25-1,0 g de agarosa anhidra. En este caso no se requiere el bloqueo de los grupos activos remanentes.

(b) Reacción de la enzima inmovilizada con el fibrinógeno del plasma

Por lo general, la reacción de la enzima inmovilizada con el fibrinógeno del plasma se realiza de la siguiente forma: se agregan alrededor de 30-70 ml de plasma a una cantidad conocida de un soporte desecado, que contiene la enzima de tipo trombina inmovilizada. Se mezcla suavemente la suspensión (por rotación sobre un mezclador espiral o mezcla a mano) durante alrededor de 7-20 minutos. Durante este periodo el fibrinógeno del plasma es escindido por la enzima inmovilizada liberando el fibrinopéptido A o fibrinopéptido B que lleva a la formación de un polímero de fibrina I unido por enlaces de hidrógeno, polímero de des-BB-fibrina unido por enlaces de hidrógeno o el polímero de fibrina II unido por enlaces de hidrógeno, en la que cada polímero está asociado a la enzima inmovilizada.

Como se describió más arriba, el polímero de fibrina unido por enlaces de hidrógeno está en forma de gel y se puede separar, por ejemplo, por centrifugación (3.000 g durante 10 minutos) o filtración (a través de un filtro de membrana de 1-50 micrómetros). Esta forma de recuperación separa el polímero de fibrina unido por enlaces hidrógeno del suero y, de esta forma, concentra el polímero.

Es preciso señalar que si se utiliza en el plasma una enzima de tipo trombina que produce la activación del factor XIII, entonces es preferible modificar la composición del plasma en el momento en que se utiliza la enzima de tipo trombina para evitar que la fibrina no reticulada, por ejemplo, la fibrina no reticulada I o II, forme fibrina reticulada, por ejemplo, fibrina reticulada I o II. Desde luego, es posible que no sea necesario modificar la composición del plasma si esa composición se utiliza como sellante de fibrina inmediatamente después de que el fibrinógeno se haya convertido en fibrina no reticulada.

La composición del plasma se puede modificar para evitar el reticulamiento de la fibrina no reticulada mediante cualquier técnica conocida o a desarrollar. Esto puede hacerse bloqueando la trombina endógena que pueda activar el factor XIII, por ejemplo con inhibidores de la hirudina o la trombina, o bloqueando la acción del factor XIII activado, por ejemplo mediante metales pesados (Hg), tiomerosal o anticuerpos inhibidores. El reticulamiento de la fibrina I o II requiere la presencia de iones calcio. Por tanto, si se elimina el calcio de la composición del plasma, se puede inhibir el reticulamiento de la fibrina I o II. Véase Carr et al., J. Biochem., 239:513 (1986); Kaminski et al., J. Biol. Chem. 258:10530 (1983) y Kanaide et al. 13:229 (1982). Pueden agregarse quelantes del calcio a la composición para evitar el reticulamiento de la fibrina I o II. Estos quelantes se unen al calcio, evitando así el reticulamiento. Puede usarse cualquier quelante del calcio. Ejemplos no limitantes de quelantes del calcio incluyen el ácido cítrico, el ácido sacárico, el ácido etilendiaminotetracético (EDTA), el ácido nitrilotriacético (NTA), el ácido hidroxietilendiaminotriacético (HEEDTA), el ácido etilendiaminodi-[o-hidroxifenilacético] (EDDHA), el ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetiléter)-tetracético (EGTA), el ácido dietilentriaminopentacético (DTPA), el ácido 1,2-diaminociclohexanotetracético (DCTA), la N,N-bis-hidroxietilglicina, el ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinaetanosulfónico (HEPES) y el ácido N-hidroxietiliminodiacético (HIMDA) y las sales de los mismos, siendo las sales del ácido cítrico las preferidas.

Cualquier cultivo celular capaz de segregar fibrinógeno puede usarse en la presente invención. El fibrinógeno del cultivo celular se puede convertir en monómero de fibrina o fibrina no reticulada por las mismas técnicas descritas más arriba con relación al plasma. Sin embargo, antes de esta conversión se prefiere que se eliminen los restos celulares.

El proceso se puede llevar a cabo de la siguiente forma: se cultivan células HEPG2 y se mantienen según lo descrito en los textos corrientes sobre cultivo de células de mamíferos. Véase también Liu et al., Cytotechnology, 5:129-139 (1991). Las células se siembran en matraces con una razón de dilución de 1:4 a 1:8 en Medio esencial mínimo con un 10% de suero fetal bovino y 5% de CO_{2} como tampón.

Después de 24-36 horas de cultivo a 37ºC, se elimina el medio de cultivo y se reemplaza por suero sin medio de cultivo con una cantidad adecuada de inhibidor de la proteasa y 2 Ul/ml de heparina. El cultivo continúa durante periodos de cultivo de 24 horas adicionales con tres cambios consecutivos de medio de cultivo sin suero.

Se centrifuga el medio de cultivo acondicionado a 3.000 g durante 10 minutos para eliminar todos los restos celulares, y se mezcla suavemente el sobrenadante clarificado que contiene el fibrinógeno con una enzima de tipo trombina durante 4-5 horas. Preferiblemente, se inmoviliza la enzima de tipo trombina. Una relación de alrededor de 1,0 ml a alrededor de 50 ml en un volumen establecido de agarosa-enzima de tipo trombina por cada 500 ml de medio es adecuada. Como se describe más arriba, es posible usar otros soportes diferentes a la agarosa. El monómero de fibrina resultante se polimeriza espontáneamente y se entrelaza en el soporte inmóvil.

El sobrenadante que ya no contiene fibrinógeno se decanta desde el gel de soporte/fibrina que luego se lava satisfactoriamente con cuatro cambios de NaCl 0,15 M a razón de alrededor de 10 ml a alrededor de 100 ml por 1,0 ml del volumen original establecido de soporte. El gel lavado se semideshidrata luego usando un embudo de vidrio sinterizado al vacío.

El uso de cultivos celulares que puedan segregar fibrinógeno son particularmente preferidos cuando se utiliza una composición que comprende un monómero de fibrina. Esto se debe a se considera que una composición de ese tipo se puede utilizar para formar un polímero de fibrina que sea útil como sellante de fibrina, sin importar si el polímero de fibrina finalmente se reticula. En efecto, este tipo de cultivo celular no contiene factor XIII que es esencial para el reticulamiento; no obstante, no es necesario agregar factor XIII exógeno para hacer un sellante de fibrina eficaz.

La composición de fibrina no reticulada también puede prepararse a partir de fibrinógeno recombinante. Es muy reciente la obtención de fibrinógeno por las técnicas del ADN recombinante. Véase S. Roy et al., The Journal of Biological Chemistry, 266:4758-4763 (1991), cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia. El grupo Roy et al. parece ser el primero en obtener la expresión de las tres cadenas de fibrinógeno y en explicar que las células COS expresan, juntan y segregan las cadenas de una forma capaz de formar un coágulo inducido por la trombina. La composición de fibrinógeno resultante se puede utilizar luego para producir la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada con las mismas técnicas descritas más arriba en relación con los cultivos celulares que segregan fibrinógeno. Sin embargo, se prefiere que antes de la formación de una composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada, se eliminen los restos celulares con las mismas técnicas descritas más arriba en relación con los cultivos de células. Los restos celulares se pueden eliminar por centrifugación o filtración.

El uso de fibrinógeno recombinante es particularmente preferido cuando se utiliza una composición que comprende un monómero de fibrina. Esto es así porque se considera que una composición de ese tipo puede utilizarse para formar un polímero de fibrina que es útil como sellante de fibrina, más allá de que el polímero de fibrina finalmente se reticule. En efecto, este tipo de cultivo celular no contiene factor XIII que es esencial para el reticulamiento; no obstante, no es necesario agregar factor XIII exógeno para hacer un sellante de fibrina eficaz.

La conversión de fibrinógeno en fibrina no reticulada, por ejemplo, por una enzima de tipo trombina, lleva a la formación de fibrina en forma de un polímero de fibrina unido por enlaces de hidrógeno. Sin embargo, como se comentó más arriba, se prefiere que la composición que comprenda fibrina no reticulada, y es esencial para la composición que comprende monómero de fibrina, tenga la forma de oligómero o monómero. Esto puede realizarse por solubilización de la composición que comprende fibrina no reticulada.

La solubilización es particularmente preferida cuando se forma la fibrina no reticulada mediante una enzima de tipo trombina que se inmoviliza sobre un soporte. Esto se debe al hecho de que el uso de una enzima de tipo trombina inmovilizada sobre un soporte por lo general, conduce a que el polímero de fibrina no reticulada unida por enlaces de hidrógeno se asocie a la enzima inmovilizada. Así, puesto que se prefiere que el soporte no esté contenido en la composición resultante, la solubilización permite eliminar el soporte de la composición que comprende fibrina no reticulada, junto con la enzima inmovilizada.

La solubilización se puede realizar mediante cualquier técnica conocida o a desarrollar que dé como resultado un monómero de fibrina. La solubilización puede llevarse a cabo poniendo en contacto la composición que comprende fibrina no reticulada con una solución tampón ácida adecuada, preferiblemente con un tampón ácido de pH inferior a alrededor de 5 y, preferiblemente, de alrededor de 1 a alrededor de 5. Ejemplos no limitantes de soluciones tampón ácidas adecuadas incluyen ácido acético, ácido succínico, ácido glucurónico, ácido cisteico, ácido crotónico, ácido itacónico, ácido glutámico, ácido fórmico, ácido aspártico, ácido adípico y sales de los mismos, siendo los preferidos el ácido succínico, el ácido aspártico, ácido adípico y sales del ácido acético y sumamente preferido el acetato de sodio. Se ha observado que los tampones ácidos preferidos funcionaron con mucha mayor eficacia que el resto de los tampones ácidos probados.

La concentración de tampón ácido preferida es desde alrededor de 0,02 M a alrededor de 1 M y más preferiblemente desde alrededor de 0,1 M a alrededor de 0,3 M. Una concentración preferida como tal hace que la fuerza iónica de la composición sea más compatible biológicamente.

Se prefiere utilizar el menor volumen posible de tampón ácido capaz de solubilizar la fibrina no reticulada para formar una solución acuosa que comprenda el monómero de fibrina. Esto da como resultado una solución acuosa que comprende monómero de fibrina con una concentración muy alta de este monómero. Por lo general, se requiere desde alrededor de 1 ml a alrededor de 4 ml de tampón ácido por cada 1 ml, aproximadamente, de composición que comprende fibrina no reticulada.

El tampón ácido se mezcla con la fibrina no reticulada y luego se agita vigorosamente durante alrededor de 1 a 2 minutos para asegurar que la solubilización sea completa.

La solubilización también se puede realizar a un pH neutro mediante un agente caotrópico. Agentes caotrópicos adecuados incluyen urea, bromuro de sodio, clorhidrato de guanidina, KCNS, yoduro de potasio y bromuro de potasio. La concentración preferida de agente caotrópico es desde alrededor de 0,2 a alrededor de 6,0 molar y más preferiblemente desde alrededor de 3,5 a alrededor de 5,0 molar.

Al igual que con el tampón ácido, se prefiere utilizar la menor cantidad posible de agente caotrópico capaz de solubilizar la fibrina no reticulada. Por lo general, se requiere desde alrededor de 1,0 ml a alrededor de 1,5 ml de agente caotrópico por cada 1 ml, aproximadamente, de composición que comprende fibrina no reticulada.

El agente caotrópico se mezcla con tal composición y luego se agita vigorosamente durante alrededor de 1 a 2 minutos para asegurar que la solubilización sea completa.

Conforme a lo anterior, la solubilización produce una composición que comprende un monómero de fibrina y, en particular, una solución acuosa que comprende monómero de fibrina. Se prefiere que la concentración de monómero de fibrina de la solución acuosa no sea inferior a alrededor de 10 mg/ml, más preferiblemente desde alrededor de 20 mg/ml hasta alrededor de 200 mg/ml, incluso más preferiblemente desde alrededor de 20 mg/ml hasta alrededor de 100 mg/ml y sumamente preferible desde alrededor de 25 mg/ml hasta alrededor de 50 mg/ml.

Si se utiliza una enzima de tipo trombina inmovilizada sobre un soporte que lleva a que este tipo de enzima esté presente en la composición que comprende fibrina no reticulada, después de la solubilización la enzima inmovilizada puede eliminarse de la composición que comprende el monómero de fibrina. Esto puede realizarse, por ejemplo, por filtración a través de cualquier filtro adecuado que pueda separar la enzima. Entre los filtros adecuados se incluye un filtro de polipropileno sinterizado con un tamaño de poro de 20 micrómetros de Porex, Inc., un filtro de teflón con un tamaño de poro de 20-70 micrómetros de Fluorotechniques, Inc. o un filtro de nylon 66 con un tamaño de poro de 22-46 micrómetros de Costar, Inc.

Un método alternativo para asegurar que la enzima de tipo trombina, como por ejemplo la batroxobina, no esté presente en la composición que comprende monómero de fibrina es usar una enzima de tipo trombina soluble en el sistema y eliminar la enzima después de la solubilización del polímero de fibrina unido por enlaces de hidrógeno. La eliminación de la enzima puede lograse usando una matriz de afinidad, por ejemplo, un ligando unido a un soporte inerte que tenga una afinidad específica con la enzima de tipo trombina, o un soporte intercambiador iónico o de interacción hidrófoba, o más eficazmente usando el sistema avidina-biotina. La interacción-avidina biotina presenta una de las constantes de unión no covalente más fuertes (K_{DIS} = 10^{-15} M) observadas en la naturaleza [véase E.A. Bayer y M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, 26:1 (1980)].

En este proceso, la biotina se une por unión covalente, por ejemplo, a la batroxobina, y el conjugado biotina-batroxobina (que es soluble) se hace reaccionar directamente con el plasma, por ejemplo, 10 UB más 50 ml de plasma se hacen reaccionar a 37ºC durante 10 minutos. El polímero de fibrina I producido se separa por centrifugación o filtración, y se vuelve a solubilizar en alrededor de 4 ml de acetato de sodio 0,2 M pH 4,0 que contiene cloruro de calcio 30 mM. A la solución de la fibrina I se agrega un exceso molar de avidina acoplada a un soporte inerte como la agarosa. El complejo agarosa:avidina:biotina-batroxobina se separa luego de la fibrina I por centrifugación o filtración obteniéndose una composición que comprende monómero de fibrina sustancialmente libre de batroxobina, que se puede volver a polimerizar según lo descrito más abajo para generar un sellante de fibrina.

Conforme a lo expuesto, en una realización de la presente invención, la composición que comprende monómero de fibrina está sustancialmente libre de enzima de tipo trombina. Por "sustancialmente libre" se entiende que se ha eliminado toda la enzima o que cualquier enzima de tipo trombina remanente en la composición se encuentra en niveles insuficientes como para proporcionar cualquier efecto farmacológico indeseable. Así, aquellas composiciones de la presente invención que se desee que sean "sustancialmente libres" pueden contener enzima de tipo trombina en una cantidad entre alrededor de cero y 10% de la enzima original, y preferiblemente entre alrededor de cero y un 2% de la enzima de tipo trombina usada para preparar la composición con monómero de fibrina.

Aunque estas realizaciones describen composiciones en las que la enzima de tipo trombina se ha eliminado después de la deseada conversión en fibrina soluble, se considera que las composiciones que retienen la mayor parte o toda la enzima de tipo trombina también son útiles y, como tales, forman parte de la presente invención.

La composición que comprende el monómero de fibrina queda lista para usar como un componente del sellante de fibrina. Se ha observado que cuando se prepara este tipo de composición a partir de sangre completa, desde alrededor del 60% hasta alrededor del 90% del fibrinógeno original está presente en la composición, aunque, desde luego, en la forma de monómero de fibrina.

La composición que comprende el monómero de fibrina se puede utilizar de inmediato después de su preparación. De hecho, se prefiere particularmente que este tipo de composición se utilice de inmediato después de su preparación cuando la composición es autóloga. Si la composición no se utiliza de inmediato después de su preparación, se la puede almacenar. El almacenamiento de la composición requiere que la misma se conserve, por ejemplo, congelándola o liofilizándola, o manteniéndola a 4ºC. Se considera que la composición en su forma congelada o liofilizada es estable durante un periodo de meses. Cuando la composición se mantiene a 4ºC se considera que es estable durante un periodo de días como mínimo.

Si la composición se congela se la debe descongelar en el momento de usarla. Si la composición se liofiliza, es preferible que en el momento de usarla se la reconstituya mediante el agregado del mismo tampón ácido que se utilizó en el paso de solubilización si ese ácido era volátil, como por ejemplo el ácido acético, o si se utilizó un agente caotrópico mediante el agregado de agua destilada. Al igual que en el paso de solubilización, en la reconstitución se debe usar la menor cantidad posible de solución tampón ácida o de agua destilada capaz de lograr que el monómero de fibrina sea soluble. De hecho, la reconstitución de una composición liofilizada que comprende monómero de fibrina puede producir una solución acuosa que comprenda monómero de fibrina en la que dicha concentración de monómero es de 200 mg/ml como máximo. Antes de la liofilización, puede agregarse a la composición un agente estabilizante, por ejemplo manitol o lactosa. Como alternativa, la composición liofilizada puede usarse en su forma liofilizada. Esa forma es particularmente preferida cuando se desea agregar adyuvantes, como por ejemplo antibióticos, a la composición.

La composición que comprende monómero de fibrina puede estar prácticamente en cualquier forma, por ejemplo, en solución, suspensión, emulsión o en forma sólida, siendo la solución la preferida. Por tanto, por ejemplo, una composición de este tipo puede ser un líquido, un gel, una pasta o una pomada. También, desde luego, la composición puede presentarse en forma de "gránulos", por ejemplo, el monómero de fibrina liofilizado, que inmediatamente antes de su uso puede tratarse, aunque no es necesario, para formar una solución, emulsión o suspensión.

Puede usarse cualquier disolvente adecuado para formar la solución; pero, desde luego, se prefiere que el disolvente sea atóxico. Ejemplos no limitantes de disolventes incluyen agua, alcohol etílico, glicerol y propilenglicol, siendo el agua el preferido.

Un ejemplo de una suspensión es la composición que comprende el monómero de fibrina que puede mezclarse con disolventes orgánicos, por ejemplo, etanol, hasta una concentración final de etanol en exceso de 3,0 M y agitarse. El monómero de fibrina precipita y puede recuperarse por centrifugación. El precipitado debe lavase con una fase orgánica para eliminar la solución acuosa usada en el paso de solubilización. Luego puede aplicarse una suspensión etanólica de monómero de fibrina directamente a un vendaje u otro portador o incluso aplicarse directamente a una zona herida. Se deja evaporar la fase orgánica. En el caso de un vendaje u otro portador, es posible rehidratar la suspensión poniéndola en contacto con el lugar de aplicación o por algún otro medio y dejar polimerizar la fibrina.

Como alternativa, una suspensión orgánica de monómero de fibrina preparada en una fase muy volátil, por ejemplo, éter dietílico, puede atomizarse y administrase como suspensión en aerosol al lugar deseado. Se prefiere que la fase volátil no sea inflamable. Es posible administrar la suspensión orgánica del monómero de fibrina al oído, la nariz, la garganta o los pulmones por pulverización o inhalación, o administrarse por ingestión a una lesión hemorrágica esofágica o gástrica.

El sellante de fibrina para usar en la invención se utiliza poniendo en contacto el lugar deseado con la composición que comprende el monómero de fibrina o fibrina no reticulada, y convirtiendo el monómero de fibrina en polímero de fibrina o la fibrina no reticulada en fibrina reticulada simultáneamente con el mencionado paso de contacto, formando así el coágulo de fibrina.

A los fines de la presente invención "lugar deseado" es la localización donde se desea que se forme el coágulo de fibrina. Qué o dónde es el lugar deseado depende del uso del sellante de fibrina de la presente invención. También se debe señalar que se considera que el sellante de fibrina se puede utilizar no sólo en seres humanos sino también en otros mamíferos. Además, si la fuente del sellante de fibrina es la sangre, entonces se prefiere, aunque no es esencial, que se derive la sangre de las mismas especies en que se va a utilizar el sellante de fibrina.

El sellante de fibrina se puede utilizar para cualquier uso conocido o a desarrollar para un sellante de fibrina. Los métodos, los equipos o el sellante de fibrina de la presente invención se pueden usar para conectar tejidos u órganos, detener la hemorragia, curar heridas, cerrar una herida quirúrgica; usar en cirugía vascular incluso proporcionando hemostasia para la hemorragia de los orificios de sutura de las anastomosis distales de la arteria coronaria; líneas de sutura del ventrículo izquierdo; sitios de aortotomía y canulación; hemorragia difusa epimiocárdica observada en operaciones repetidas y filtraciones desde lugares de hemorragia venosa, por ejemplo en los niveles auricular, de la cava o ventricular derecho. La presente invención también es útil para cerrar las prótesis arteriales de dacrón antes de practicar el injerto, cerrar los tejidos fuera del cuerpo, producir tramas de fibrina para el crecimiento celular, detener la hemorragia de los bazos (salvando así al órgano), hígados y otros órganos parenquimatosos lesionados; cerrar anastomosis traqueales y bronquiales y las fugas de aire o laceraciones del pulmón, cerrar los muñones bronquiales, las fístulas bronquiales y las fístulas esofágicas; para cicatrizaciones sin sutura y sin cierre (técnica "Zipper"), y embolización en radiología vascular de malformaciones arteriovenosas intracerebrales, malformaciones arteriovenosas hepáticas, angiodisplasia de colon, varices esofágicas, "bombeo" de pacientes hemorrágicos gastrointestinales secundarios a úlceras pépticas, etcétera. La presente invención es útil, además, para proporcionar hemostasia en los transplantes de córnea, hemorragias nasales, postamigdalectomía, extracciones dentales y otras aplicaciones. Véase G.F. Gestring and R. Lermer, Vascular Surgery, 294-304, sept./oct. 1983. También el sellante de fibrina de la presente invención es especialmente adecuado para individuos con deficiencias de la coagulación.

La dosis de la composición que comprende el monómero de fibrina o la composición que comprende fibrina no reticulada depende del uso particular del sellante de fibrina, pero la dosis debe ser una cantidad de la composición eficaz para realizar el uso al que está destinada. Por lo general, para una composición que comprende el monómero de fibrina que es una solución acuosa, se considera que alrededor de 3 ml a alrededor de 5 ml de la composición es suficiente para ser un sellante eficaz. Sin embargo, dependiendo del uso de la composición, la dosis puede variar desde alrededor de 0,05 ml a alrededor de 40 ml. Asimismo, si se utiliza una composición que comprenda fibrina no reticulada en forma de polímero o si la composición está en forma sólida, entonces la composición debe contener la cantidad de fibrina que está en una solución acuosa como esa.

A los fines de la presente invención la conversión de monómero de fibrina en polímero de fibrina, o de fibrina no reticulada en fibrina reticulada "simultáneamente" con el mencionado paso de contacto significa que ese paso de conversión y ese paso de contacto se producen dentro del periodo de cada paso de modo que forman el coágulo de fibrina en el lugar deseado. De modo que, "simultáneamente" puede significar que después del paso de contacto, el monómero de fibrina se convierte en polímero de fibrina, o la fibrina no reticulada se convierte en fibrina reticulada. Esto se realiza poniendo en contacto la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada, después de que esa composición se haya aplicado al lugar deseado, con una composición capaz de convertir el monómero de fibrina en polímero de fibrina o la fibrina no reticulada en fibrina reticulada. Por lo general, el paso de conversión se produce antes de transcurridos aproximadamente 0,5 minutos después del paso de contacto. De lo contrario, la composición que comprende el monómero de fibrina o la fibrina no reticulada, especialmente si la fibrina no reticulada es un monómero de fibrina, pueden alejarse del lugar deseado por flujo.

"Simultáneamente" también puede significar que el paso de contacto y el paso de conversión se producen de forma simultánea. Esto se realiza poniendo en contacto el lugar deseado con la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada al mismo tiempo que esa composición se pone en contacto con una composición que pueda convertir el monómero de fibrina en polímero de fibrina o la fibrina no reticulada en fibrina reticulada.

Por último, y preferiblemente, "simultáneamente" puede significar también que el paso de conversión puede comenzar antes del paso de contacto, aunque no tanto antes del paso de contacto como para que todo el monómero de fibrina se haya convertido en polímero de fibrina o toda la fibrina no reticulada se haya convertido en fibrina reticulada. De lo contrario, todo el monómero de fibrina se convierte en polímero de fibrina o toda la fibrina no reticulada se convierte en fibrina reticulada antes del paso de contacto, lo que da como resultado un sellante de fibrina muy deficiente. Esta realización se lleva a cabo mezclando la composición que comprende el monómero de fibrina o la fibrina no reticulada con una composición que pueda convertir el monómero de fibrina en polímero de fibrina o la fibrina no reticulada en fibrina reticulada antes del paso de contacto. El paso de conversión completo requiere alrededor de 30 segundos para completarse; por tanto, este paso no debe comenzar más de alrededor de 30 segundos antes del paso de contacto y preferiblemente no más de 3 segundos antes del paso de contacto. Se prefiere esta realización porque asegura que la máxima cantidad de la composición que comprende el monómero de fibrina o la fibrina no reticulada permanezca en el lugar deseado y, aún así, también forme un coágulo de fibrina excelente.

La conversión del monómero de fibrina en polímero de fibrina o de la fibrina no reticulada en fibrina reticulada se puede llevar a cabo con cualquier técnica conocida o a desarrollar. Sin embargo, la forma en que se realiza el paso de conversión depende de la fuente de la composición que comprende el monómero de fibrina o fibrina no reticulada, por ejemplo, sangre completa o fibrinógeno recombinante, de la forma de monómero de fibrina o de fibrina no reticulada, por ejemplo, fibrina I o des-BB-fibrina y, en menor medida, de si el lugar deseado contiene sangre del paciente u otros líquidos corporales en el momento de uso del sellante de fibrina.

También, si se utiliza una composición diferente, como un tampón alcalino (comentado más abajo) para el paso de conversión, entonces el método de la presente invención se puede realizar, por ejemplo, con una jeringa de doble cañón. La jeringa de doble cañón puede tener forma en Y, permitiendo así que la composición que comprende el monómero de fibrina o la fibrina no reticulada y la composición a utilizar en el paso de conversión se mezclen inmediatamente antes del paso de contacto. También, en lugar de usar una jeringa en forma de Y con dos cañones puede usarse una jeringa de dos cañones con dos aberturas. Esto permite que se produzca el contacto simultáneo del lugar deseado y la conversión en polímero de fibrina o fibrina reticulada. También las composiciones de la jeringa de doble cañón se pueden pulverizar sobre el lugar deseado. Véase H.B. Kram et al., The American Surgeon, 57:381 (1991).

Si la fuente de la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada es la sangre, entonces, como se comentó más arriba, se considera que la composición retiene protrombina, factor XIII y otras sustancias en cantidades suficientes como para convertir ese monómero de fibrina o fibrina no reticulada en fibrina reticulada, por ejemplo, activadores de protrombina. Si la fibrina no reticulada es un polímero de fibrina, es decir, si la fibrina no reticulada no se ha solubilizado, se puede convertir la fibrina no reticulada en fibrina reticulada por la activación de la protrombina y el factor XIII de esa composición para formar fibrina reticulada. Esa activación puede realizarse poniendo en contacto la composición con una fuente de iones calcio. Fuentes no limitantes de iones calcio incluyen el cloruro de calcio, preferiblemente a una concentración de 30 mM. Como alternativa, aunque menos preferida, los iones calcio pueden ser suministrados por la sangre en el lugar deseado.

Si la fibrina no reticulada se ha solubilizado, es decir, que es un monómero de fibrina, la forma en que el monómero de fibrina se convierte en fibrina reticulada depende del modo en que se realizó la solubilización. Si la fibrina no reticulada se solubilizó con un tampón ácido, la fibrina reticulada se puede formar aumentando el pH de la composición que comprende monómero de fibrina de forma tal que el monómero de fibrina pueda polimerizarse. Esto se puede llevar a cabo poniendo en contacto esa composición con un tampón alcalino adecuado. Ejemplos no limitantes de tampones alcalinos adecuados incluyen HEPES, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, tampones bicarbonato tales como el bicarbonato de sodio y el bicarbonato de potasio, sales trimetálicas del ácido cítrico, sales del ácido acético y sales del ácido sulfúrico. Los tampones alcalinos preferidos incluyen: carbonato/bicarbonato de sodio 0,5-0,75 M, pH 10-10,5; bicarbonato de sodio/NaOH 0,5-0,75 M, pH 10,0; Glicina/NaOH 1,5 M pH 10,0; ácido bis-hidroxietilaminoetanosulfónico (BES) 0,5-1,0 M, pH 7,5; ácido hidroxietilperacinapropanosulfónico (EPPS) 1M, pH 8,5; Tricina 0,5 M pH 8,5; ácido moforfolinopropanosulfónico (MOPS) 1 M, pH 8,0; ácido trishidroximetilaminoetanosulfónico (TES) 1 M, pH 8,0; ácido ciclohexilaminoetanosulfónico (CHES) 0,5 M, pH 10,0; con carbonato/bicarbonato de sodio 0,5-0,75 M pH 10-10,5; ácido bis-hidroxietilaminoetanosulfónico (BES) 0,5-1,0 M pH 7,5; ácido hidroxietilpiperacinapropanosulfónico (EPPS) 1 M, pH 8,5 y siendo el más preferido el ácido trishidroximetilaminoetanosulfónico (TES) 1 M pH 8,0.

La cantidad de tampón alcalino que se utiliza debe ser suficiente como para polimerizar la fibrina no reticulada. Se prefiere que alrededor de 10 partes a alrededor de una parte de composición que comprende monómero de fibrina se mezcle con aproximadamente una parte de tampón alcalino. Se prefiere más aún que esa relación sea de 9:1. Se debe señalar que la relación preferida depende de la elección del tampón y de la "fuerza" deseada del polímero de fibrina. Desde luego la fuerza deseada del polímero de fibrina depende del uso final del sellante de fibrina.

Si la solubilización se llevó a cabo con un agente caotrópico, entonces el monómero de fibrina puede convertirse en fibrina reticulada diluyendo la composición que comprende monómero de fibrina, por ejemplo, con agua destilada. La dilución debe realizarse de forma tal que se utilice la mínima cantidad de diluyente posible. Por lo general, la concentración resultante de agente caotrópico después de la dilución debe ser de alrededor de 0,5 a alrededor de 0,1 molar.

Además de aumentar el pH o diluir el agente caotrópico de la composición que comprende monómero de fibrina, se prefiere que se activen la protrombina y el factor XIII de esa composición para formar fibrina reticulada. Esa activación se puede realizar poniendo en contacto la composición con una fuente de iones calcio. La fuente de iones calcio puede ser parte del tampón alcalino o parte del tampón ácido que se utiliza en el paso de solubilización. Entre las fuentes no limitantes de iones calcio se incluye el cloruro de calcio, preferiblemente a una concentración de 30 mM. Como alternativa, y menos preferida, la fuente de iones calcio puede ser suministrada por la sangre en el lugar deseado.

Se debe señalar que si el tampón alcalino es un tampón carbonato/bicarbonato, la fuente de iones calcio debe agregarse al tampón ácido durante el paso de solubilización. Esto se debe al hecho de que el cloruro de calcio no es soluble en el tampón carbonato/bicarbonato. Se prefiere que la concentración de iones calcio de la solución tampón sea de alrededor de 5 milimolar a alrededor de 150 milimolar y más preferiblemente desde alrededor de 5 mM a alrededor de 50 mM.

Se considera que el coágulo de fibrina resultante será fibrina II reticulada, más allá de cuál sea la forma de fibrina no reticulada, es decir, si está presente el monómero de fibrina o el polímero de fibrina. Sin embargo, si la forma de fibrina no reticulada es des-BB-fibrina, entonces se considera que además de una fuente adicional de trombina puede ser necesario convertir la des-BB-fibrina en fibrina reticulada. Una fuente de trombina como tal puede ser, por ejemplo, el plasma del paciente, en cuyo caso ese plasma debe agregarse a la composición que comprende fibrina no reticulada.

Si el lugar deseado contiene sangre y se utiliza una composición que comprende un monómero de fibrina, es decir, se ha solubilizado la fibrina no reticulada, entonces esta sangre se puede utilizar como diluyente del agente caotrópico o para aumentar el pH de la composición que comprende monómero de fibrina. De esta forma, no se necesita usar ningún diluyente o tampón alcalino. En esta realización se prefiere que la fuente de iones calcio esté contenida en el tampón ácido o el agente caotrópico utilizado en el paso de solubilización. También en esta realización, la composición que comprende monómero de fibrina puede colocarse sobre un soporte sólido, por ejemplo, un vendaje, una sutura, una prótesis o un apósito, que estará en contacto con el lugar deseado. Ese soporte se coloca entonces en contacto con el lugar deseado, por ejemplo, hasta que se forme el coágulo de fibrina.

Sin embargo, se debe señalar que si la composición que comprende el monómero de fibrina no retiene suficiente protrombina o factor XIII como para formar fibrina reticulada, esa composición sigue siendo útil como sellante de fibrina, porque la polimerización del monómero de fibrina por sí misma es útil para formar un coágulo de fibrina. Además, esa composición se puede usar incluso para formar fibrina reticulada agregando una fuente de iones calcio y factor XIII activado (o precursores del factor XIII activado) y, opcionalmente, trombina. Esa fuente de iones calcio, factor XIII activado y trombina se puede agregar a la composición que comprende monómero de fibrina. El factor XIII activado se puede agregar a la composición que comprende monómero de fibrina a una concentración final de alrededor de 1,0 a alrededor de 20 unidades de factor XIII por ml de composición que comprende fibrina no reticulada. Como alternativa, el factor XIII se puede proporcionar mediante sangre o líquidos corporales al lugar deseado o por el agregado de plasma autólogo a la composición que comprende monómero de fibrina. Fuentes no limitantes de iones calcio incluyen el cloruro de calcio, preferiblemente a una concentración de 30 mM. Como alternativa, aunque menos preferida, los iones calcio pueden ser proporcionados en el lugar deseado por la sangre o los líquidos corporales. Pueden agregarse desde alrededor de 4 unidades hasta alrededor de 500 unidades de trombina por ml de composición que comprende monómero de fibrina o la trombina puede ser proporcionada por el lugar deseado.

Si la fuente de la composición que comprende fibrina no reticulada son cultivos celulares que segregan fibrinógeno o fibrinógeno recombinante, y la fibrina no reticulada es un polímero de fibrina, es decir, que la fibrina no reticulada no se ha solubilizado, entonces es preciso utilizar una fuente de iones calcio y de factor XIII activado (o precursores de factor XIII activado) para formar fibrina reticulada. Debe utilizarse factor XIII porque estas fuentes de fibrina no reticulada no contienen nada de factor XIII. El factor XIII activado se puede agregar a la composición que comprende fibrina no reticulada a una concentración final de alrededor de 1,0 hasta alrededor de 20 unidades de factor XIII por ml de composición que comprende fibrina no reticulada. Como alternativa el factor XIII puede ser suministrado por la sangre o los líquidos corporales en el lugar deseado o por el agregado de plasma autólogo a la composición que comprende fibrina no reticulada. Fuentes de iones calcio no limitantes incluyen el cloruro de calcio, preferiblemente a una concentración de 30 mM. Como alternativa, aunque menos preferida, los iones calcio pueden ser proporcionados por la sangre o los líquidos corporales en el lugar deseado. También, como opción, puede agregarse trombina a este tipo de composición para asegurar que se forme la fibrina II reticulada. Es posible agregar desde alrededor de 4 unidades hasta alrededor de 500 unidades de trombina por ml de composición que comprende fibrina no reticulada o la trombina puede ser proporcionada por el lugar deseado.

Si la fibrina no reticulada se ha solubilizado, es decir, es un monómero de fibrina, la forma en que el monómero de fibrina se convierte en polímero de fibrina depende de la forma en que se ha llevado a cabo la solubilización, por ejemplo, mediante tampón ácido o agente caotrópico. La formación de polímero de fibrina puede realizarse por los mismos métodos descritos más arriba. Si se lo desea, este polímero de fibrina, puede convertirse luego en fibrina reticulada mediante el agregado de una fuente de iones calcio y factor XIII activado (o precursores del factor XIII activado) y, opcionalmente, trombina a la composición que comprende monómero de fibrina, según lo descrito más arriba. El factor XIII activado se puede agregar a la composición que comprende monómero de fibrina no reticulada a una concentración final de alrededor de 1,0 hasta alrededor de 20 unidades de factor XIII por ml de composición que comprende monómero de fibrina no reticulada. Como alternativa, el factor XIII puede ser suministrado por la sangre o los líquidos corporales en el lugar deseado o por el agregado de plasma autólogo a la composición que comprende fibrina no reticulada. Fuentes no limitantes de iones calcio incluyen el cloruro de calcio, preferiblemente a una concentración de 30 mM. Como alternativa, aunque menos preferida, los iones calcio pueden ser suministrados por la sangre o los líquidos corporales en el lugar deseado. Pueden agregarse desde alrededor de 4 unidades hasta alrededor de 500 unidades de trombina por ml de composición que comprende monómero de fibrina o la trombina puede ser proporcionada por el lugar deseado.

El sellante de fibrina para usar en la invención también puede contener adyuvantes, por ejemplo, antibióticos, como la gentamicina, cefotaxim, nebacetina y sisomicina; antihistamínicos H_{2}, como la ranitidina; y fármacos anticancerígenos como OK-432. Esto puede llevarse a la práctica agregando el antibiótico deseado a la composición que comprende monómero de fibrina o fibrina no reticulada. Véase M.C.H. Gersdorff and T.A.J. Robillard, Laryngoscope, 95:1278-80 (1985); A. Ederle et al., Ital. J. Gastroenterol., 23:354-56 (1991); V. Ronfard et al, Burns, 17:181-84 (1991); T. Sakurai et al., J. Control. Release, 18: 39-43 (1992); T. Monden et al., Cancer, 69:636-42 (1992); F. Greco, J. of Biomedical Materials Research, 25:39-51 (1991) and H.B. Kram et al, Journal of Surgical Research, 50:175-178 (1991), cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia. Pueden agregarse también otros adyuvantes, por ejemplo, fibronectina, inhibidores fibrinolíticos como aprotinina, \alpha-2 antiplasmina, PAI-1, PAI-2, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-aminometilciclohexanoico, colágeno o queratinocitos. Se considera que la dosis de tal coadyuvante es la misma que la utilizada en los sellantes de fibrina convencionales.

5. Ejemplos 5.1. Preparación de plasma a partir de sangre completa

Se recoge sangre completa (100 ml) dentro de una bolsa corriente de sangre disponible comercialmente con un anticoagulante como citrato/fosfato/dextrosa. Luego se transfiere la sangre a un recipiente adecuado para centrifugación y se centrifuga a temperatura ambiente durante 10 minutos a 3.000 g. Se decanta el plasma sobrenadante transparente (aproximadamente 50 ml) y se desechan los componentes celulares.

Un método alternativo de preparación de plasma a partir de sangre completa es la filtración. Nuevamente se recogen 100 ml de sangre completa en una bolsa con un anticoagulante adecuado como citrato/fosfato/dextrosa. Luego se recircula la sangre sobre un filtro que tenga una buena transmisión de proteínas por medio de una bomba peristáltica. La caída de presión entre un lado y el otro de la membrana fuerza al plasma a atravesarla junto con los componentes celulares que permanecen en la sangre en recirculación. Se recoge el plasma (50 ml) para continuar con su procesamiento.

5.2. Inmovilización de batroxobina sobre agarosa en perlas

Se usó agarosa en perlas (Pharmacia) en estudios de inmovilización. La agarosa usada tenía un reticulamiento del 4%, 45-165 \mum (90% de partículas). Este material se hincha 5 veces su volumen cuando se lo hidrata. La batroxobina se oxida primero con periodato de sodio 0,1 M durante 1 hora a temperatura ambiente en un vial de gammagrafía cubierto. La batroxobina se purifica pasándola a través de una columna de filtración en gel Sephadex PD-10. La batroxobina oxidada se acopla luego a un gel de agarosa activado por hidracida toda la noche a temperatura ambiente en 50 mM de acetato de sodio pH 5,5 más borohidruro de sodio 10 mM (30-200 U por 1,75 g de gel húmedo). Las reacciones no fijadas se eliminan del gel por lavado con: -50 ml mM de acetato de sodio pH 5,5; 100 ml de glicina 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 3,0; 100 ml de carbonato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 10,0; 100 ml de fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M; pH 7,0; 100 ml de agua, 100 ml de fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 7,0; 100 ml de fosfato de sodio 50 mM pH 7,0.

5.3. Reacción de enzima inmovilizada con fibrinógeno del plasma para formar una composición que comprende fibrina no reticulada

Se agrega la enzima inmoviliza (350 mg) a aproximadamente 50 ml de plasma centrifugado o filtrado y se mezcla suavemente durante 7 a 20 minutos hasta que se forma un coágulo de polímero de fibrina I no reticulada.

El polímero de fibrina I más la enzima inmovilizada asociada se separan luego por: a) centrifugación a 3.000 g durante 10 minutos seguida de la eliminación del suero sobrenadante por decantación, o b) filtración a través de un filtro de baja fijación de proteínas seguida del desecho del suero filtrado y la retención del polímero de fibrina más la enzima inmovilizada para continuar su tratamiento. Este polímero de fibrina es un ejemplo de una composición que comprende fibrina no reticulada.

5.4. Solubilización del polímero de fibrina I para formar una composición que comprende monómero de fibrina

La solubilización del polímero de fibrina I se logra por el agregado de alrededor de 1-4 ml de acetato de sodio 0,2 M pH 4,0 que contiene tampón de cloruro de calcio 30 mM al polímero de fibrina I más la enzima inmovilizada separados. Posteriormente se agita la muestra vigorosamente, por ejemplo, sobre un mezclador vortex, durante 2 minutos. Luego se puede lograr la eliminación de la enzima inmovilizada por filtración de la solución de fibrina I a través de un filtro con baja fijación de proteína de 1 a 20 \mum. La enzima agarosa quedará retenida en el filtro, permitiendo así que se la elimine del sistema. El resto de la solución, una composición que comprende monómero de fibrina I, consiste en una solución ácida concentrada de monómero de fibrina I junto con otras proteínas del plasma. Por lo general, alrededor de 100 ml de sangre completa producen alrededor de 4 ml ó 5 ml de la composición que comprende monómero de fibrina en la que la concentración de monómero de fibrina es desde alrededor de 25 mg/ml a alrededor de 35 mg/ml. Este está ahora listo para administrarlo a un paciente, ya sea solo o extrusionado con tampón para repolimerizar y formar así un sellante de fibrina.

5.5. Repolimerización de la composición que comprende monómero de fibrina I

La repolimerización se logra mezclando simultáneamente 9 partes de la solución que comprende monómero de fibrina I con 1 parte de tampón repolimerizante adecuado, por ejemplo, carbonato de sodio/bicarbonato de sodio 0,75 M, pH 10,0. La relación de mezcla se puede modificar; no obstante, una relación de 9:1 mantiene alta la concentración de fibrina en el producto final. Durante la coextrusión la fibrina I se vuelve a polimerizar espontáneamente y se convierte en fibrina II; seguida por el reticulamiento de la fibrina durante un periodo de alrededor de 30 minutos.

La presente invención no debe limitar su campo de aplicación a las realizaciones específicas descritas que sólo tienen la intención de ser simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención. En realidad, varias modificaciones de la presente invención, además de las presentadas y descritas aquí serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Esas modificaciones están destinadas a estar comprendidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

5.6. Activación de la agarosa por la hidracida y acoplamiento a través del grupo carbohidrato de la enzima

Para que el grupo carbohidrato de la batroxobina reaccione con un soporte activado por hidracida, primero debe oxidarse el azúcar para liberar grupos -CHO. Esto se realiza de la forma que se describe a continuación.

Se disuelven 1-7 mg de batroxobina en 2 ml de agua y 0,2 ml de periodato de sodio 0,1 M. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora después de lo cual se desala en una columna de filtración en gel Sephadex G-25. La batroxobina activa oxidada se eluye luego desde la columna con cloruro de sodio 0,9% p/v.

Agarosa estándar disponible comercialmente activada por hidracida (Bio-rad Laboratories Ltd. Reino Unido) o cualquier grupo con un grupo amino terminal libre puede emplearse apara acoplar directamente grupos aldehído libres (-CHO). Si se usa hidracida-agarosa el procedimiento de acoplamiento es el siguiente:

Se suspenden 1-5 g de hidracida-agarosa en 4 ml de acetato de sodio 50 mM pH 5,5. Se agrega a la suspensión 1 ml de borohidrato de sodio 10 mM junto con la cantidad deseada de batroxobina oxidada (típicamente 100-200 UB por g de gel húmedo).

Se mezcla la muestra durante toda la noche a temperatura ambiente y posteriormente se lava en un embudo de vidrio sinterizado con 50 ml de acetato de sodio 50 mM pH 5,5, 100 ml de glicina 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 3,0; 100 ml de carbonato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 10,0; 100 ml de fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 7,0; 100 ml de agua y 100 ml de fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 1 M pH 7,0 y, por último, 100 ml de fosfato de sodio 50 mM pH 7,0.

El método de reacción para la batroxobina inmovilizada en el plasma es el siguiente.

El pH del plasma (50 ml) se reduce a pH 5,5 mediante el agregado de ácido acético. Se agrega al plasma el equivalente a 100-200 UB de batroxobina inmovilizada a aproximadamente 1,75 g (peso de gel húmedo) de agarosa. Se incuba el plasma a 37ºC durante 10-15 minutos después de lo cual se aumenta el pH a 7,4 mediante el agregado de hidróxido de sodio. Se produce la polimerización de la fibrina I casi instantáneamente. El polímero de fibrina I se separa por centrifugación a 3.500 rpm durante 10 minutos y se vuelve a disolver en 3-4 ml de acetato de sodio 0,2 M pH 4,0 que contienen cloruro de calcio 30 mM. Luego se pueden separar la agarosa-enzima de la fibrina por centrifugación o filtración. La fibrina I se vuelve a polimerizar para formar el sellante de fibrina mediante el agregado de 9 partes de la solución de fibrina I a 1 parte de carbonato /bicarbonato de sodio 0,75 M pH 10,0.

5.7. Sistema de captación de la enzima con biotina-avidina

La captación de la enzima se realiza por la biotinilización de la batroxobina y captando la biotina-enzima con avidina inmovilizada (avidina acoplada a agarosa reticulada al 6%).

La biotinilización de proteínas se puede lograr usando varios reactivos. En este ejemplo, se usa N-hidroxisuccinimida-biotina (insoluble en agua) (disponible comercialmente de Amersham). Se agrega NHS-biotina (50 \mul) a 1 mg de batroxobina pH 8,6 y se incuba la solución a la temperatura ambiente durante 1 hora. El exceso de reactivo de biotinilización se elimina por filtración en gel en una columna Sephadex G-25 con fosfato de potasio 0,1 M pH 7,5 como eluyente.

Se agrega el equivalente a 10 UB de biotina-batroxobina a 50 ml de plasma y se incuba a 37ºC durante 10 minutos. El polímero de fibrina I se separa por centrifugación (3.500 rpm durante 10 minutos) y se vuelve a disolver en 3-4 ml de acetato de sodio 0,2 M pH 4,0 con cloruro de calcio 30 mM. Se agrega avidina-agarosa (disponible comercialmente de Sigma Chemical Co.) a la fibrina I a razón de 0,2 g (gel húmedo) por ml de fibrina I. Se incuba la muestra a la temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifuga a 2.000 rpm durante 10 minutos. La fibrina I producida es sustancialmente libre de batroxobina. Se logra la repolimerización de la fibrina para formar el sellante de fibrina según lo descrito en el Ejemplo 5.6.

Claims

1. El uso de fibrina que es un monómero u oligómero de fibrina no dinámico en la preparación de una composición para formar un sellante de fibrina, en el que dicho sellante de fibrina se forma convirtiendo dicho monómero u oligómero de fibrina no dinámico en un polímero de fibrina simultáneamente cuando la composición se pone en contacto con el lugar deseado formando así un sellante de fibrina; y en el que "no dinámico" significa que dicho monómero u oligómero de fibrina no se reticula ni se polimeriza durante 1,5 minutos como mínimo después de la preparación de dicha composición.

2. El uso de fibrina, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho monómero de fibrina se elige de un grupo que consiste en fibrina I no reticulada, des-BB-fibrina y fibrina II no reticulada.

3. El uso de fibrina de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho monómero de fibrina es la fibrina I.

4. El uso de fibrina de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polímero de fibrina es el polímero de fibrina II.

5. El uso de fibrina de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polímero de fibrina es reticulado.

6. El uso de fibrina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el monómero de fibrina no dinámico está sustancialmente libre de cualquier enzima exógena que cataliza la formación de fibrina a partir del fibrinógeno.

7. El uso de fibrina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores a partir de una fuente elegida en un grupo que consiste en sangre, fibrinógeno recombinante y cultivos celulares que segregan fibrinógeno.

8. El uso de fibrina de acuerdo con la reivindicación 7 en el que dicha fuente es la sangre.

9. El uso de fibrina de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 en el que dicha sangre es sangre autóloga.

10. El uso de fibrina de acuerdo con la reivindicación 9 en el que dicha composición comprende, además, protrombina, activadores de la protrombina y factor XIII.

11. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicho paso de conversión se lleva a cabo mediante un tampón alcalino o agua destilada, que se agrega a dicho monómero de fibrina.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11 en el que dicho tampón alcalino o agua destilada comprenden, además, una fuente de iones calcio.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12 en el que dicho tampón alcalino se elige de un grupo que consiste en hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, tampones bicarbonato, sales trimetálicas del ácido cítrico, sales del ácido acético y sales del ácido sulfúrico.

14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 11-13 en el que dicho tampón alcalino se elige de un grupo que consiste en carbonato/bicarbonato de sodio 0,5-0,75 M, pH 10-10,5; bicarbonato de sodio/NaOH 0,5-0,75 M, pH 10,0; Glicina/NaOH 1,5 M pH 10,0; ácido bis-hidroxietilaminoetanosulfónico (BES) 0,5-1,0 M, pH 7,5; ácido hidroxietilpiperacinapropanosulfónico (EPPS) 1 M pH 8,5; tricina 0,5 M pH 8,5; ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS) 1 M, pH 8,0; ácido trishidroximetilaminoetanosulfónico (TES) 1M pH 8,0 ácido ciclohexilaminoetanosulfónico (CHES) 0,5 M pH 10,0.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 en el que dicho tampón alcalino se elige de un grupo formado por carbonato/bicarbonato de sodio 0,5-0,75 M pH 10-10,5; ácido bis-hidroxietilaminoetanosulfónico (BES) 0,5-1,0 M pH 7,5; ácido hidroxietilpiperacinpropanosulfónico (EPPS) 1 M pH 8,5 y ácido trishidroximetilaminoetanosulfónico (TES) 1 M pH 8,0.

16. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en el que dicho paso de contacto se lleva a cabo mediante una jeringa de doble cañón, en la que un cañón contiene dicha composición y el otro contiene dicho tampón alcalino o agua destilada.

17. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicho lugar deseado está en un mamífero.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17 en el que dicho mamífero es un ser humano.

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19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18 en el que el lugar deseado se elige de un grupo formado por piel, sistema cardiovascular, sistema linfático, sistema pulmonar, oído, nariz, garganta, ojo, hígado, bazo, cráneo, espina dorsal, maxilofacial, hueso, tendón, páncreas, aparato genitourinario y aparato digestivo.